JP4861659B2 - 組換え微生物 - Google Patents
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Description
Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997 Bacillus subtilis and its closest relative, ASM press, Washington D.C., Ed. by A.L. Sonenshein, p313, 2002
また、枯草菌のオペロンrrnDには、http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/、2001年4月26日更新のデータベースにおいて、塩基番号946030から947583からなるrrnD-16S遺伝子(BG00096)が含まれ;塩基番号947751から950679からなるrrnD-23S遺伝子(BG00046)が含まれ;塩基番号950791から950906からなるrrnD-5S遺伝子(BG00047)が含まれ;塩基番号950916から952631の領域に16種類のtrnD遺伝子(BG00048、BG00049、BG00050、BG00051、BG00052、BG00053、BG00054、BG00055、BG00056、BG00057、BG00058、BG00059、BG00060、BG00061、BG00062、BG00063)が含まれる(図1)。
枯草菌のオペロンrrnHには、http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/、2001年4月26日更新のデータベースにおいて、塩基番号166498から168051からなるrrnH-16S遺伝子(BG00044)が含まれ;塩基番号168217から171140からなるrrnH-23S遺伝子(BG00107)が含まれ;塩基番号171196から171307からなるrrnH-5S遺伝子(BG00101)が含まれる(図1)。
枯草菌のオペロンrrnGには、http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/、2001年4月26日更新のデータベースにおいて、塩基番号171497から173046からなるrrnG-16S遺伝子(BG00102)が含まれ;塩基番号176196から176307からなるrrnG-23S遺伝子(BG00105)が含まれ;塩基番号173213から176140からなるrrnG-5S遺伝子(BG00106)が含まれる(図1)。
枯草菌のオペロンrrnOには、http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/、2001年4月26日更新のデータベースにおいて、塩基番号9809から11361からなるrrnO-16S遺伝子(BG00005)が含まれ;塩基番号11707から14634からなるrrnO-23S遺伝子(BG00008)が含まれ;塩基番号14690から14801からなるrrnO-5S遺伝子(BG00009)が含まれ;塩基番号11462から11538からなるtrnO-Ile遺伝子(BG00006)および塩基番号11550から11625からなるtrnO-Ala遺伝子(BG00007)が含まれる(図1)。
また、本発明のオペロンに相当するオペロンとしては、例えば、オペロンに含まれるrrn-16S遺伝子、rrn-23S遺伝子、rrn-5S遺伝子、作動遺伝子及びtrn遺伝子から選ばれる1以上が、オペロンrrnA、rrnD、rrnH、rrnG又はrrnOに含まれる遺伝子と、塩基配列において90%以上、好ましくは95%、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するものであるオペロンが挙げられる。このうち、オペロンに含まれるrrn-16S遺伝子、rrn-23S遺伝子、rrn-5S遺伝子及び作動遺伝子が、いずれも上記同一性を有するものであるオペロンが好ましい。
また、上記オペロンの不活性化は、当該オペロン中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該オペロンに含まれる遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的オペロンを物理的に欠失させる方がより望ましい。
本実施例では、枯草菌168株を野生株としてゲノム上のリボソームRNA(rrn)オペロンを欠失させた変異株を構築し、これらを宿主として用いた際の異種タンパク質の分泌生産性を評価した。
実施例 1 rrnH-rrnGオペロンの欠失1(薬剤耐性マーカーとの置換)
枯草菌168株のゲノム上で隣接して存在し、オペロン中にtRNA遺伝子(trn領域)を含まないものであるrrnHオペロン及びrrnGオペロンを以下の方法によって一括して欠失させた。まず、図2に示す様に168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したrrnHG-AFWプライマーとrrnHG-ARV、及びrrnHG-BFWとrrnHG-BRVの各プライマーセットを用いてrrnHオペロンの上流側に隣接する約0.7 kb断片(A)及びrrnGオペロンの下流に隣接する約0.5 kb断片(B)をそれぞれPCR法により増幅させ調製した。断片(A)及び断片(B)を、それぞれ制限酵素EcoRVとBamHI、及び制限酵素BamHIとSalIで処理した後、制限酵素EcoRVとSalIによって処理したプラスミドpBR322とのリガーゼ結合反応を行い、BamHI認識配列を介して断片(A)(B)が結合し、pBR322に挿入されたプラスミドptRNAを構築した。更に、本プラスミドをBamHIで切断後、プラスミドpCBB31(J Bacteriol., 186, 5450, 2004)を BglII/BamHI処理して得られたクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子断片(約1.0 kb、 Staphylococcus aureusのプラスミドpC194由来、J. Bacteriol., 158, 543, 1984)との結合反応を行い、断片(A)(B)間にcat遺伝子断片(C)が挿入されたプラスミドptRNA-catを構築した。本プラスミドをNdeIで処理した後、コンピテント法による枯草菌168株に導入し、クロラムフェニコール50 ppmを含む寒天培地上に生育する形質転換体を分離した。得られた形質転換体のゲノムを鋳型としてPCR法により、rrnHオペロン及びrrnGオペロンからなるrrnH-rrnGオペロンがゲノム上から欠失し、CAT遺伝子断片に置換していることを確認した。本菌株をΔrrnHG-cat株と命名した。
実施例1において構築したプラスミドptRNAをNdeIで切断し、これによって同じく実施例1で得られたΔrrnHG-cat株の形質転換処理を行った。プラスミドptRNAに由来する(A)(B)断片による相同組換え(二重交差)によって、ΔrrnH-rrnG-cat株ゲノムに挿入されたCAT遺伝子断片が欠失してクロラムフェニコール感受性となった株の存在比を高めるため、以下に示すアンピシリン法(Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970))による濃縮処理を行った。即ち、形質転換処理後の培養液をLB培地に600nmにおける濁度(OD600)が0.03になるように接種した。37℃にて約3時間培養後、終濃度50 ppmのクロラムフェニコールを添加して培養を継続し、更にその30分後に終濃度1000 ppmとなる様にアンピシリンナトリウムを添加して更に3時間培養した。培養終了後、菌体を遠心洗浄し、LB寒天培地に塗沫した。37℃にて約15時間インキュベーションし、生育した菌株のうち、cat遺伝子断片の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となったものを分離した。分離菌株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによってrrnH-rrnGオペロンとCAT遺伝子断片の欠失を確認した。得られた菌株をΔrrnHG株と命名した。
実施例2において構築したΔrrnHG株から、以下の方法により更にrrnOオペロンを欠失させた(図3)。まず、168株のゲノムを鋳型として表2に示したrrnO-DFWプライマーとrrnX-DRV/cat、及びrrnX-EFW/catとrrnO-ERVの各プライマーセットを用いてrrnOオペロンの上流側に隣接する約1.2 kb断片(D)及びrrnOオペロンの下流に隣接する約1.0 kb断片(E)をそれぞれPCR法により調製した。尚、用いたプライマーrrnX-DRV/cat及びrrnX-EFW/catには、それぞれcat遺伝子断片(約0.7 kb、 Staphylococcus aureusのプラスミドpC194(J. Bacteriol., 158, 543, 1984)を鋳型とし、catpt1FW(cactttagataaaaatttaggagg:配列番号32)、catpt1RV(ctcatattataaaagccagtcat:配列番号33)両プライマーを用いてPCRにより調製)の下流側及び上流側との相同配列が付加されており、この結果、調製された断片(D)の下流末端及び断片(E)の上流末端にはcat遺伝子断片との相同配列が存在する。次に(D)(E)両断片、及び、cat遺伝子断片(F)を鋳型とし、表2に示したrrnO-DFWプライマーとrrnO-ERVプライマーを用いてSOE-PCR法によって3断片が(D)(F)(E)の順に結合した約2.9 kb断片(G)を調製した。本断片を用いてコンピテント法によりΔrrnHG株の形質転換処理を行った後、クロラムフェニコール50ppmを含む寒天培地上に生育する形質転換体を分離した。得られた形質転換体のゲノムを鋳型としてPCR法によって、rrnOオペロンがゲノム上から欠失し、CAT遺伝子断片に置換していることを確認した(ΔrrnHGO-cat株)。
引き続き、cat遺伝子断片の除去を以下の様に行った。上記と同様に168株のゲノムを鋳型として表2に示したrrnO-DFWプライマーとrrnX-DRV/E、及びrrnX-EFWとrrnO-ERVの各プライマーセットを用いてrrnOオペロンの上流側に隣接する約1.2 kb断片(H)及びrrnOオペロンの下流に隣接する約1.0 kb断片(I)をそれぞれPCR法により調製し、更に(H)(I)両断片を鋳型とし、rrnO-DFW及びrrnO-ERVのプライマーセットを用いてSOE-PCRによって両断片が結合した約2.2 kb断片(J)を調製した。本断片(J)によってΔrrnHGO-cat株の形質転換処理を行った後、実施例2と同様にしてアンピシリン濃縮処理を行って、rrnH、rrnG及びrrnO各オペロンが欠失、かつcat遺伝子断片を含まないΔrrnHGO株を構築した。
表3に示したrrnD-DFWプライマーとrrnX-DRV/cat、及びrrnX-EFW/catとrrnD-ERVの各プライマーセットを用いてプライマーセットを用い、実施例3と同様の方法によりΔrrnHGO株から更にrrnDオペロンを欠失させてcat遺伝子断片に置換したΔrrnHGOD-cat株を構築し、更に表3に示したrrnD-DFWプライマーとrrnX-DRV/E、及びrrnX-EFWとrrnD-ERVの各プライマーセットを用いて実施例3と同様にしてrrnH、rrnG、rrnO及びrrnD各オペロンが欠失、かつcat遺伝子断片を含まないΔrrnHGOD株を構築した。
実施例3において構築したΔrrnHGO株から、更にrrnAオペロンを欠失させた。rrnAオペロンにおいては16S rRNA遺伝子(以下、rrnA16S rRNA遺伝子ともいう)と23S rRNA遺伝子(以下、rrnA23S rRNA遺伝子ともいう)の間にtRNA遺伝子(以下、rrnA tRNA遺伝子ともいう)が存在するため、第1段階として16S rRNA遺伝子の欠失を行い、第2段階で23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子の欠失を行うことによってtRNA遺伝子を残し、rRNA遺伝子の欠失を行った(図4)。まず、第1段階として、表4に示したrrnA-KFWとrrnA-KRV/cat及びrrnA-LFW/catとrrnA-LRVのプライマーセットを用いてrrnA 16S rRNA遺伝子の上流に隣接する約1.2 kb断片(K)及びrrnA 16S rRNA遺伝子下流領域からrrnA 23S rRNA遺伝子上流領域までの約0.8 kb断片(L)をそれぞれ調製した。次に(K)(L)両断片並びに実施例3と同様に調製したcat遺伝子断片(M)を鋳型とし、rrnA-KFWとrrnA-LRVのプライマーセットを用いたSOE-PCRによって、3断片が(K)(M)(L)の順で結合した約2.7 kb断片(N)を調製した。本断片(N)により実施例3と同様にして168株の形質転換を行い、rrnA 16S rRNA遺伝子の大部分がcat遺伝子断片と置換したΔrrnA16S-cat株を得た。第2段階としてΔrrnA16S-cat株のゲノムDNAを鋳型とし、rrnA-KFWとrrnA-LRV及びrrnA-OFW/NとrrnA-ORVの各プライマーセットを用いて、それぞれ前述の(N)断片及びrrnA 5S rRNA遺伝子の下流に隣接する約1.5 kbの断片(O)を調製した。断片(O)の上流末端にはrrnA-OFW/Nプライマーに由来する断片(N)下流末端との相同領域が存在しており、(N)(O)両断片を鋳型とし、rrnA-KFWとrrnA-ORVプライマーセットを用いたSOE-PCRによって、(N)(O)両断片が結合した約4.2 kb断片(P)を得た。本断片(P)によって実施例3で構築したΔrrnHGO株の形質転換を行い、rrnA 16S rRNA遺伝子の大部分がcat遺伝子断片と置換し、更にrrnA 23S及び5S rRNA遺伝子が欠失したΔrrnHGOA-cat株を得た。更に最終段階としてΔrrnHGOA-cat株からcat遺伝子断片の除去を以下の様に行った。すなわち、まずΔrrnHGOA-cat株のゲノムを鋳型とし、rrnA-KFWとrrnA-KRV/R、rrnA-OFW/NとrrnA-ORV及びrrnA-RFWとrrnA-RRVのプライマーセットを用いてrrnA 16S rRNA遺伝子の上流に隣接する約1.2 kb断片(Q)、rrnA 5S rRNA遺伝子の下流に隣接する約1.5 kbの断片(O)及びrrnA 16S rRNA遺伝子の下流領域からrrnA 23S rRNA遺伝子の上流末端までの約0.4 kb断片(R)をそれぞれ調製した。断片(Q)及び断片(R)のそれぞれ下流及び上流末端には用いたプライマーrrnA-KRV/R及びrrnA-OFW/Nに由来する断片(R)の上流及び下流末端との相同配列が付加されており、(Q)(O)(R)各断片を鋳型とし、rrnA-KFWとrrnA-ORVをプライマーとするSOE-PCRによって3断片が(Q)(O)(R)の順で結合した約3.1 kbの断片(S)を調製した。断片(S)によってΔrrnHGOA-cat株を形質転換し、さらにアンピシリン濃縮を行うことによって、rrnH、rrnG、rrnO及びrrnA各オペロンが欠失、かつcat遺伝子断片を含まないΔrrnHGOA株を構築した。
実施例1−5で作製した本発明に係るrrnオペロン欠失変異株を宿主とした異種タンパク質分泌生産性の評価を行った。本例ではrrnオペロン欠失変異株に導入する異種タンパク質として、アルカリセルラーゼを使用した。
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)断片(3.1 kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM パラニトロフェニル-β-セロトリオシド(p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside、生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
表5に示す様に、ΔrrnHGOD株及びΔrrnHGOA株を宿主として用いた場合、野生株を宿主とした場合を上回るセルラーゼの分泌生産が認められた。一方、宿主としてΔrrnHGO株を用いた場合の生産性は野生株を用いた際と同等以下であった。ΔrrnHGOD株及びΔrrn HGOA株との比較から、rrnDオペロン、或いはrrnAオペロンの欠失、或いは両欠失とrrnHオペロン、rrnGオペロン及びrrnOオペロンの欠失の組合わせがタンパク質生産性向上に有効であるものと考えられた。
Claims (7)
- 枯草菌のオペロンrrnA、rrnH、rrnG及びrrnOが欠失又は不活性化された微生物株、又は枯草菌のオペロンrrnD、rrnH、rrnG及びrrnOが欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項1記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか1以上の領域を結合した請求項1又は2記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した請求項3記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項3又は4記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項3〜5のいずれか1項記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の組換えバチルス(Bacillus)属細菌を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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