JP4676848B2 - 組換え微生物 - Google Patents
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以下の表1に、abh、abrB、alsR、ccpB、comK、cspD、exuR、fnr、fur、gerE、glcR、glpP、gutR、hutP、iolR、lytR、lytT、pksA、soj、splA、ybgA、ydeS、ydgG、yfiK、yfmP、yhjM、yjdC、yofA、yozG、ytzE、yusT、yuxN、yvfI、ywfK、ywqM、ywtF、yclE、yitD、ylbL、yqhP、yqhS、yqiZ、yrhM、yvoE、yvoF、ywoE、yyaA、yycI、yodC及びyxiF遺伝子の名称、番号及び機能を示す。これらは、Kunstらによって報告され(Nature,390,249-256,1997)、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。
また、上記遺伝子の不活性化は、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。
斯かるセルラーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、cspD、fur、gerE、hutP、lytR、pksA、soj、ybgA、ydeS、yhjM、yofA、ytzE、yuxN、ywtF、yqhP、yqhS、yrhM、yvoF、yyaA及びyodCのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。
斯かるα−アミラーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、abrB、alsR、ccpB、fnr、glpP、gutR、lytR、soj、splA、ydeS、yfmP、yhjM、yofA、yozG、yusT、yuxN、ywfK、ywqM、ywtF、ylbL、yqhP、yqiZ、yrhM及びyyaAのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。
斯かるプロテアーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、abh、abrB、alsR、ccpB、comK、exuR、fnr、fur、gerE、glcR、glpP、gutR、hutP、lytR、lytT、pksA、soj、ydeS、ydgG、yfiK、yfmP、yhjM、yjdC、yofA、ytzE、yuxN、yvfI、ywfK、ywtF、yclE、yitD、ylbL、yqhP、yqhS、yqiZ、yrhM、yvoE、yvoF、ywoE、yyaA、yycI、yodC及びyxiFのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。
斯かるCATの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、ccpB、exuR、fur、glpP、gutR、hutP、iolR、lytR、soj、ybgA、ytzE、ywfK、ylbL、yqhS、yqiZ、yvoE、yyaA及びyycIのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表に示したabh-AFとabh-A/CmR、及びabh-B/CmFとabh-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のabh遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片(A)、及び下流に隣接する0.6kb断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982))のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドpUC18のXbaI−BamHI切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型とし、表2に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む1kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表2に記載のプライマーabh-AFとabh-BRを用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に結合させ、2.2kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってabh遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。
一方、実施例1と同様に、表2に示した各遺伝子-AF、各遺伝子-A/CmR、各遺伝子-B/CmF、各遺伝子-BR、CmF、CmRのプライマーセットにより調製した欠失用DNA断片を用いて、ゲノム上のabrB、alsR、ccpB、comK、cspD、exuR、fnr、fur、gerE、glcR、glpP、gutR、hutP、iolR、lytR、lytT、pksA、soj、splA、ybgA、ydeS、ydgG、yfiK、yfmP、yhjM、yjdC、yofA、yozG、ytzE、yusT、yuxN、yvfI、ywfK、ywqM及びywtFが欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株をそれぞれ分離した。
また、表2に示した遺伝子-AF、遺伝子-A/Cm2R、遺伝子-B/Cm2F、遺伝子-BR、Cm2F、Cm2Rのプライマーセットにより、実施例2と同様に調製した欠失用DNA断片を用いて、ゲノム上のyclE、yitD 、ylbL 、yqhP 、yqhS 、yqiZ 、yrhM 、yvoE 、yvoF 、ywoE 、yyaA およびyycI 、遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株を分離した。
更に、表2に示した遺伝子-AF、遺伝子-A/Cm4R、遺伝子-B/Cm4F、遺伝子-BR、遺伝子-A/Cm4F、遺伝子-B/Cm4Rのプライマーセットにより、実施例2と同様に調製した欠失用DNA断片を用いて、ゲノム上のyodCおよびyxiF、遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株をそれぞれ分離した。
実施例1−4にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株に、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)をコードするDNA断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表3に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株を用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表Xに示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ(特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001)をコードする配列番号5で示される塩基配列のうちアルカリアミラーゼ成熟酵素領域1.6kbのDNA断片(D)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表Xに示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号1で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片(E)を増幅した。次いで、得られた(D)(E)の2断片を混合して鋳型とし、表4に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.2 kbのDNA断片(F)を得た。得られた2.2kbのDNA断片(F)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
バチルス クラウジイ(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERM BP-3376)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表6に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリプロテアーゼ(特許第3026111、Kobayashi, T., Hakamada, Y., Adachi, S., Hitomi, J., Yoshimatsu, T., Koike, K., Kawai, S. and Ito, S. (1995) Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16. Appl Microbiol Biotechnol., 43 (3) : 473-81.)をコードする配列番号7で示される塩基配列のうちアルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片(G)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表6に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号1で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片(H)を増幅した。次いで、得られた(G)(H)の2断片を混合して鋳型とし、表6に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、アルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域が連結した1.8kbのDNA断片(I)を得た。得られた1.8kbのDNA断片(I)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。
プラスミドpC194を鋳型として、表Zに示されるSP64sCATm-FとCATm-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む0.7kbのDNA断片(J)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表8に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64sCATm-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号1で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域およびシグナル配列の一部をコードする0.6kbのDNA断片(K)を増幅した。次いで、得られた(J)(K)の2断片を混合して鋳型とし、表8に示されるS237ppp-F2(BamHI)とCATm-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域およびシグナル配列の一部をコードする領域の下流に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素領域が連結した1.3 kbのDNA断片(L)を得た。得られた1.3kbのDNA断片(L)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ生産性評価用プラスミドpHYCAT(S237pSP64s)を構築した。
Claims (6)
- 遺伝子alsR、soj、splA及びyhjMのいずれか1以上が欠失又は不活性化された枯草菌株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる3領域が結合されており、
当該目的のタンパク質又はポリペプチドがアミラーゼである、
組換え微生物。 - 遺伝子ccpB、glcR、gutR、ydeS、yvfI、yqhP、yycI及びyodCのいずれか1以上が欠失又は不活性化された枯草菌株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる3領域が結合されており、
当該目的のタンパク質又はポリペプチドがプロテアーゼである、
組換え微生物。 - 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項1又は2記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項1〜3のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 請求項1記載の組換え微生物を用いるアミラーゼの製造方法。
- 請求項2記載の組換え微生物を用いるプロテアーゼの製造方法。
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