JP5828634B2 - 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
(1) mprF、ugtP、ywnE及びywjE遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
(2) 前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、前記(1)記載の製造方法。
(3) 前記宿主微生物がバチルス属細菌である、前記(2)記載の製造方法。
(4) 前記宿主微生物が枯草菌である、前記(3)記載の製造方法。
(5) 前記目的タンパク質が、前記宿主微生物から分泌される、前記(1)から(4)のいずれか1つに記載の製造方法。
(6) 前記目的タンパク質が、セルラーゼ又はアミラーゼである、前記(1)から(5)のいずれか1つに記載の製造方法。
(7) mprF、ugtP、ywnE及びywjE遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3 領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659 の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696 の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと80%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片である組換え微生物。
mprF欠失株の構築:
SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,(1989))によって調製したDNA断片を用いた二重交差法によりmprF欠失株の構築を行なった。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したmprF+1F−PtuaとmprF+521R−Cm及びmprF+1221F−CmとmprF+1787Rの各プライマーセットを用いて、配列番号7に示すmprF遺伝子の5’末端側の521bp断片(A)、及び3’末端側の567bp断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J.Bacteriol.150(2),815(1982))のDNAを鋳型とし、CmFW、CmRV(表2)のプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子領域を増幅した(C)。得られた(A)、(B)及び(C)のDNA断片を混合して鋳型とし、mprF+1F−PtuaとmprF+1787Rプライマーを用いてSOE−PCR法により、(A)−(C)−(B)の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコール(5μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってmprFが欠失してクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のmprFが欠失した菌株を構築し、ΔmprF株と命名した。
表2に示したypfP−337FとypfP+201R及びypfP+827FとypfP+529Rの各プライマーセットを用いて、配列番号9に示すugtP遺伝子の上流を含む5’末端側の504bp断片(A)、及びugtP遺伝子の下流を含む3’末端側の823bp断片(B)をそれぞれ調製した。得られた断片(A)はSphI及びSalI、(B)はBamHI及びScaI処理した。一方、プラスミドpDG780(Gene,167,335,(1995))のSalI及びSmaI制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出した(C)。次に、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に、pUC119(TAKARA)に(A)はSphI及びSalI、(C)はSalI及びBamHI、(B)はBamHI及びSmaI制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドDNAを制限酵素ScaIで処理して直鎖状DNAにし、形質転換用の供与体DNAとした(図2参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、カナマイシン(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってugtP遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域の(A)及び(B)のDNA配列についてシーケンスを行った。(A)領域でugtP遺伝子上流−9bpのTがCに置換されていたが、ugtP遺伝子の上流metA遺伝子及び下流cspD遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。以上の様にして、枯草菌のugtP遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔugtP株と命名した。
SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,(1989))によって調製したDNA断片を用いた二重交差法によりpssA欠失株の構築を行なった。配列番号11に示すpssA遺伝子はpssA−ybfM−psdの順でオペロン構造をとっており、またYbfMのスタートコドンはPssAのC末端とオーバーラップしている。下流遺伝子のybfM遺伝子及びpsd遺伝子の転写にできるだけ影響を及ぼさないようにpssA欠失株を構築した。すなわち、pssA遺伝子の+1から+501bp(ybfM遺伝子のSD配列上流まで)をエリスロマイシン耐性遺伝子に置き換え、またエリスロマイシン耐性遺伝子はターミーネーターを含まず、遺伝子配列はpssA遺伝子と同方向になるようにした。以下に具体的な構築方法を記載した。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したpssA−545FとPssA−1Rem及びYbfM−23FemとYbfM+457Rの各プライマーセットを用いて、pssA遺伝子の上流の545bp断片(A)、及び3’末端側の497bp断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpMUTIN4(Microbiology 144:3097−3104(1998))のDNAを鋳型とし、Em−F5とEm−R6(表2)のプライマーセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子領域を増幅した(C)。得られた(A)、(B)及び(C)のDNA断片を混合して鋳型とし、pssA−545FとYbfM+457Rプライマーを用いてSOE−PCR法により、(A)−(C)−(B)の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、エリスロマイシン(0.3μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってpssA遺伝子が欠失してエリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域(A)及び(B)のDNA配列に変異がないことをシーケンスにて確認した。以上の様にして、枯草菌のpssA遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔpssA株と命名した。
SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,(1989))によって調製したDNA断片を用いた二重交差法によりpsd欠失株の構築を行なった。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したpssA+518FとPsd+63Rem及びPsd+640FemとPsd+1144Rの各プライマーセットを用いて、配列番号13に示すpsd遺伝子の上流ybfM遺伝子を含む5’末端側の567bp断片(A)、及び下流ybfN遺伝子を含む3’末端側の505bp断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpMUTIN4(Microbiology 144:3097−3104(1998))のDNAを鋳型とし、Em−F5とEm−R5(表2)のプライマーセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子領域を増幅した(C)。得られた(A)、(B)及び(C)のDNA断片を混合して鋳型とし、pssA+518FとPsd+1144Rプライマーを用いてSOE−PCR法により、(A)−(C)−(B)の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、エリスロマイシン(0.3μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってpsd遺伝子が欠失してエリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域(A)及び(B)のDNA配列に変異がないことをシーケンスにて確認した。以上の様にして、枯草菌のpsd遺伝子が欠失した菌株を構築し、Δpsd株と命名した。
SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,(1989))によって調製したDNA断片を用いた二重交差法によりywnE欠失株の構築を行なった。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したywnE+1F−PtuaとywnE+522RSp及びywnE+889FSpとywnE+1455Rの各プライマーセットを用いて、配列番号15に示すywnE遺伝子の5’末端側の522bp断片(A)、及び3’末端側の567bp断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpDG1727(Gene,167,335,(1995))のEcoRI制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、pUC119(TAKARA)にEcoRI制限酵素切断点に挿入し、pUCSpを構築した。pUCSpのDNAを鋳型とし、PB−M13−20、PB−M13Rev(表2)のプライマーセットを用いてスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を増幅した(C)。得られた(A)、(B)及び(C)のDNA断片を混合して鋳型とし、ywnE+1F−PtuaとywnE+1455Rプライマーを用いてSOE−PCR法により、(A)−(C)−(B)の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン(100μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってywnEが欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のywnEが欠失した菌株を構築し、ΔywnE株と命名した。
SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,(1989))によって調製したDNA断片を用いた二重交差法によりywjE欠失株の構築を行なった。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したywjE−9FとywjE+499Rkm及びywjE+686FkmとywjE+1188Rの各プライマーセットを用いて、配列番号17に示すywjE遺伝子の5’末端側の508bp断片(A)、及び3’末端側の503bp断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpDG873(Gene,167,335,(1995))のEcoRI制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、pUC119(TAKARA)にEcoRI制限酵素切断点に挿入し、pUCKmを構築した。pUCKmのDNAを鋳型とし、PB−M13−20、PB−M13Rev(表2)のプライマーセットを用いてカナマイシン耐性遺伝子領域を増幅した(C)。得られた(A)、(B)及び(C)のDNA断片を混合して鋳型とし、ywjE−9FとywjE+1188Rプライマーを用いてSOE−PCR法により、(A)−(C)−(B)の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、カナマイシン(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってywjEが欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のywjEが欠失した菌株を構築し、ΔywjE株と命名した。
既に構築したΔywnE株を親株として、ywjE欠失株構築の際に作製した遺伝子欠失用DNA断片を用いて、コンピテントセル形質転換法による形質転換を行った。カナマイシン(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離し、PCRによってywjEが欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のywnE及びywjEが欠失した菌株を構築し、ΔywnEΔywjE株と命名した。
実施例1にて構築したΔmprF株、ΔugtP株、ΔpssA株、Δpsd株、ΔywnE株、ΔywjE株、ΔywnEΔywjE株及び親株である168株にアルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌 KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のS237セルラーゼ(特開2000−210081号公報参照)(配列番号2)をコードするDNA断片(3.1kb;配列番号1の塩基番号13〜3124)を鋳型として、表3に示されるプライマーEgl−S237.F及びプライマーEgl−S237.Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
実施例1にて構築したΔmprF株及び親株である168株にアルカリアミラーゼ遺伝子を導入した。
Claims (5)
- mprF、ugtP、ywnE及びywjE遺伝子、及びそれらの遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有し、且つ各遺伝子と同様の機能を有する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属細菌(yfiB−yfiX領域を欠失したゲノム構造を有するバチルス属細菌を除く)に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域が結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である組換え微生物を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
- 前記バチルス属細菌が枯草菌である、請求項1記載の製造方法。
- 前記目的タンパク質が、前記バチルス属細菌から分泌される、請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記目的タンパク質が、セルラーゼ又はアミラーゼである、請求項1から3のいずれか1項記載の製造方法。
- mprF、ugtP、ywnE及びywjE遺伝子、及びそれらの遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有し、且つ各遺伝子と同様の機能を有する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属細菌(yfiB−yfiX領域を欠失したゲノム構造を有するバチルス属細菌を除く)に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域が結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である組換え微生物。
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