JP5796951B2 - タンパク質又はポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
(1) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、当該枯草菌のmalP遺伝子の発現量を、23SrRNAに対して0.4×10-5〜2.5×10-5のレベルに調節することを特徴とする、前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
(2) 前記調節が、枯草菌のmalP遺伝子の発現量を、親株におけるmalP遺伝子の発現量に対して5〜29%のレベルに調節することによりなされる、上記(1)記載の製造方法。
(3) malP遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結することにより、malP遺伝子の発現量を調節する、上記(1)又は(2)記載の製造方法。
(4) malP遺伝子へ異種プロモーターを作動可能に連結し、更に前記異種プロモーターの活性を制御することにより、malP遺伝子の発現量を調節する、上記(1)又は(2)記載の製造方法。
(5) 前記異種プロモーターが、発現誘導物質の添加によりその活性が制御される発現誘導型プロモーターである、上記(3)又は(4)記載の製造方法。
(6) 前記発現誘導型プロモーターが、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターである、上記(5)記載の製造方法。
(7) 前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Pspacプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、上記(6)記載の製造方法。
(8) 前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、上記(6)記載の製造方法。
(9) キシロースを最終濃度0〜0.008%(w/v)で添加する、上記(8)記載の製造方法。
(10) 前記枯草菌が、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノム構造を有する、上記(1)から(9)のいずれか1項記載の製造方法。
(11) 更に、ybbU−ybfI領域、ydjM−cotA領域、yefA−yesX領域、yfiB−yfiX領域、yhcE−yhcU領域、yhaU−yhaL領域、yjbX−yjlB領域、xkdA−ykcC領域、bpr−ylmA領域、flgB−cheD領域、ynfF−ppsA領域、yoxC−yobO領域、spoVAF−spoIIAA領域、spoIIIAH−yqhV領域、ytvB−ytqB領域、yteA−ytaB領域、yuaJ−yugO領域、yusJ−mrgA領域、gerAA−yvrI領域、yvaM−yvbK領域、araE−yveK領域、yvdE−yvcP領域、gerBA−ywsC領域、ywrK−ywqM領域、spoIIID−ywoB領域、slp−ylaF領域、licH−sigY領域、yqeF−yrhK領域、yuzE−yukJ領域及びyncM−yndN領域のうちの1つ又は2つ以上が欠失したゲノム構造を有する、上記(10)記載の製造方法。
(12) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域が作動可能に連結されている、上記(1)から(11)のいずれか1項記載の製造方法。
(13) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が作動可能に連結されている、上記(12)記載の製造方法。
(14) 前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、上記(12)又は(13)記載の製造方法。
(15) 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号4で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である、上記(13)記載の製造方法。
(16) 前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、上記(1)から(15)のいずれか1項記載の製造方法。
(17) 前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号4で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるDNA断片である、上記(16)記載の製造方法。
(18) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のmalP遺伝子の上流に異種プロモーターが作動可能に連結されており、それにより当該malP遺伝子の発現量が、23SrRNAに対して0.4×10-5〜2.5×10-5のレベルに調節される、前記枯草菌。
(19) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のmalP遺伝子の上流に異種プロモーターが作動可能に連結されており、更に当該異種プロモーターの活性を制御することにより、当該malP遺伝子の発現量が、23SrRNAに対して0.4×10-5〜2.5×10-5のレベルに調節される、前記枯草菌。
(20) 前記調節が、malP遺伝子の発現量を、親株におけるmalP遺伝子の発現量に対して5〜29%のレベルに調節することによりなされる、前記枯草菌。
(21) 前記異種プロモーターが、発現誘導物質の添加によりその活性が制御される発現誘導型プロモーターである、上記(18)から(20)のいずれか1項記載の枯草菌。
(22) 前記発現誘導型プロモーターが、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御されるプロモーターである、上記(21)記載の枯草菌。
(23) 前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Pspacプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、上記(22)記載の枯草菌。
(24) 前記発現誘導型プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、上記(22)記載の枯草菌。
マルトース特異的透過酵素MalPをコードする遺伝子malPの欠失株は以下の方法により構築した。枯草菌MGB874株(Biotech.Appl.Biochem.46:169−178,2007)(DNA research 15,73−81 2008)から抽出したゲノムDNAを鋳型として表3に示すプライマーmalP.FWとmalP/Nm.R、及びmalP/Nm.FとmalP.RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のmalP遺伝子領域(配列番号1の塩基番号64から1244)の上流に隣接する1.0kbp断片(A)、及び下流に隣接する1.4kbp断片(B)をそれぞれ調製した。また、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpUB110(Plasmid 15:93−103.(1986))を鋳型として、表3に示すneof及びneorのプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、malP.FW2とmalP.RV2のプライマーを用いてSOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene,77,61,1989)を行ない、3断片が(A)−(C)−(B)の順となるよう結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いて、コンピテントセル法により枯草菌MGB874株の形質転換を行い、ネオマイシン(10mg/L)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として単離した。得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによって、malP遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子と置換されていることを確認した。以上のようにして得られた変異株を874ΔmalP株とした。
malPの発現制御可能な株の構築は、図2を参考として以下の方法により行った。図2は、キシロースによる発現制御領域及びmalP遺伝子を枯草菌ゲノム上のamyE部位に挿入するDNA断片の調製方法を模式的に示したものである(図中のamyEはα−アミラーゼ、xylA’はキシロースイソメラーゼの一部、xylRはxylA転写抑制因子、catはクロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、malAは6‐ホスホ‐α‐グルコシダーゼ、glvRはmalA転写抑制因子、malPはマルトース特異的透過酵素をそれぞれコードする遺伝子である。また、PxylAはxylAプロモーター領域、TmalPはmalPターミネーター領域を示す。)。
実施例2にて構築したmalP制御株(874Pxyl−malP株)は、枯草菌ゲノム上のamyE遺伝子の内部にキシロースによる発現制御領域等が挿入されており、amyE遺伝子自体の機能は失われている。そこで、874Pxyl−malP株の比較対照株として874ΔmalP株のamyE遺伝子を欠失させた株(874ΔmalPΔamyE株)を構築した。まず、枯草菌874ΔmalP株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表5に示すamyE.FWとamyE/CmFW.R、及びamyE/CmRV.FとamyE.RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のamyE遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片(A)、及び下流に隣接する1.3kbp断片(B)をそれぞれ調製した。更に、表5に示すCmFW及びCmRVのプライマーセットを用いて、プラスミドpC194(J.Bacteriol.150(2),815(1982))のクロラムフェニコール耐性遺伝子(C)を増幅した。次に、得られた(A)(B)(C)の3断片を混合して鋳型とし、amyE.FW2とamyE.RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、3断片を(A)−(C)−(B)の順となるよう連結させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いて、コンピテントセル法により実施例1にて作製した874ΔmalP株の形質転換を行い、クロラムフェニコール(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってamyE遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認した。以上のようにして874ΔmalPΔamyE株を構築した。
実施例1から実施例3にて構築した874ΔmalP株、874Pxyl−malP株、874ΔmalPΔamyE株及び枯草菌MGB874株に、アルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌 KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のS237セルラーゼ(特開2000−210081号公報参照)(配列番号6)をコードするDNA断片(3.1kb;配列番号5の塩基番号13〜3124)を鋳型として、表6に示されるプライマーEgl−S237.F及びプライマーEgl−S237.Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
リアルタイムPCRを行い、MGB874株及び874Pxyl−malP株のmalP発現量を測定した。まず、実施例4に示す方法でMGB874株及び874Pxyl−malP株にアルカリセルラーゼ遺伝子を導入した後、実施例4と同様の方法にて培養を行い、培養1日目の菌体を遠心集菌により分離・回収した。R.Losickらの論文(J.Mol.Biol.191:615−624,1986)に記載された方法と同様の手法にて菌体よりRNAを抽出後、cDNAへの逆転写反応を行った。The AffinityScript QPCR cDNA Synthesis kit(Stratagene社製)を用い、抽出したRNA 5μgを含む50μLの反応溶液(1×first strand master mix,15ng/μL random primers及び2.5μL AffinityScript RT/RNase Block enzyme mixture)を、25℃で5分間、42℃で45分間、95℃で5分間反応させ、逆転写反応を行った。DNAの混入を測定する目的で、全てのRNAサンプルでは逆転写酵素であるAffinityScript RT/RNase Block enzyme mixtureを含まない状態で同様の反応を行った。反応後の溶液を必要に応じて希釈し、定量解析に用いた。
Claims (15)
- 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、当該枯草菌のmalP遺伝子の発現量を、23SrRNAに対して0.4×10-5〜2.5×10-5のレベルに調節することを特徴とし、
前記malP遺伝子が、五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御される異種プロモーターに作動可能に連結され、
前記異種プロモーターが、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、アラビノース誘導性プロモーター又はラムノース誘導性プロモーターであり、
前記調節が、前記五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体を適宜添加して、枯草菌のmalP遺伝子の発現量を、親株におけるmalP遺伝子の発現量に対して5〜29%のレベルに調節することによりなされる、
前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。 - 前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Pspacプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、請求項1記載の製造方法。
- 前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、請求項1記載の製造方法。
- キシロースを最終濃度0〜0.008%(w/v)で添加する、請求項3記載の製造方法。
- 前記枯草菌が、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノム構造を有する、請求項1から4のいずれか1項記載の製造方法。
- 更に、ybbU−ybfI領域、ydjM−cotA領域、yefA−yesX領域、yfiB−yfiX領域、yhcE−yhcU領域、yhaU−yhaL領域、yjbX−yjlB領域、xkdA−ykcC領域、bpr−ylmA領域、flgB−cheD領域、ynfF−ppsA領域、yoxC−yobO領域、spoVAF−spoIIAA領域、spoIIIAH−yqhV領域、ytvB−ytqB領域、yteA−ytaB領域、yuaJ−yugO領域、yusJ−mrgA領域、gerAA−yvrI領域、yvaM−yvbK領域、araE−yveK領域、yvdE−yvcP領域、gerBA−ywsC領域、ywrK−ywqM領域、spoIIID−ywoB領域、slp−ylaF領域、licH−sigY領域、yqeF−yrhK領域、yuzE−yukJ領域及びyncM−yndN領域のうちの1つ又は2つ以上が欠失したゲノム構造を有する、請求項5記載の製造方法。
- 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域が作動可能に連結されている、請求項1から6のいずれか1項記載の製造方法。
- 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が作動可能に連結されている、請求項7記載の製造方法。
- 前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、請求項7又は8記載の製造方法。
- 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号4で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列からなるDNA断片である、請求項8記載の製造方法。
- 前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、請求項1から10のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号4で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である、請求項11記載の製造方法。
- 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌であって、当該枯草菌のmalP遺伝子の上流に五炭糖若しくは六炭糖又はそれらの誘導体の添加によりその活性が制御される異種プロモーターが作動可能に連結されており、前記異種プロモーターが、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、アラビノース誘導性プロモーター又はラムノース誘導性プロモーターである、前記枯草菌。
- 前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーター、Pspacプロモーター又はアラビノース誘導性プロモーターである、請求項13記載の枯草菌。
- 前記異種プロモーターが、キシロース誘導性プロモーターである、請求項13記載の枯草菌。
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