CN113366113A - 同源折叠酶共表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过与目的异源多肽同源的折叠酶共表达，来优化革兰氏阳性宿主细胞中目的异源多肽表达的手段和方法。

Description

同源折叠酶共表达
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及通过与目的异源多肽同源的折叠酶共表达，来优化革兰氏阳性宿主细胞中目的异源多肽表达的手段和方法。
背景技术
在工业生物技术中，持续需要提高生产产率，从而在酶和其他工业相关蛋白质的生产中提高利润率。一个成功的策略是使用过表达编码靶蛋白的基因的生产宿主细胞，例如通过使用包含几个基因拷贝的多拷贝菌株或通过修改其控制序列来增强基因的活性。为了充分利用基因过表达的有利作用，需要增加生产宿主细胞的分泌能力，以克服分泌机制中的任何瓶颈。
折叠酶是协助其他蛋白质折叠的蛋白质。在生产宿主细胞中折叠酶的过表达可以提供给定目的蛋白质的增强折叠，这进而可能使正确折叠的目的蛋白质的分泌增强，从而提高生产产率。
PrsA是一种胞质外折叠酶，发现存在于包括工业相关的地衣芽孢杆菌在内的多种革兰氏阳性细菌中。PrsA以二聚体脂蛋白质的形式存在，锚定在细胞膜的外小叶(outerleaflet)中，在此处它有助于通过保守的SecA-YEG途径分泌的蛋白质的折叠。
已表明，与PrsA的共表达可提高革兰氏阳性宿主细胞中多肽的表达(WO 1994/019471)。
发明内容
本发明基于令人惊讶的和创造性的发现，即培养共表达目的异源多肽和与目的异源多肽同源的折叠酶的革兰氏阳性宿主细胞提供了与相同的目的异源多肽和非同源折叠酶的共表达相比，相当或改进的目的异源多肽的表达、以及相当或减少的分泌应激。
在第一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
在第二方面，本发明涉及一种表达载体，其包含根据第一方面所述的核酸构建体。
在第三方面，本发明涉及一种革兰氏阳性宿主细胞，该革兰氏阳性宿主细胞在其基因组中包含根据第一方面所述的核酸构建体和/或根据第二方面所述的表达载体。
在第四方面，本发明涉及一种生产目的多肽的方法，该方法包括：
a)提供根据第三方面所述的革兰氏阳性宿主细胞；
b)在有利于该折叠酶和该目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地
c)回收该目的多肽。
附图说明
图1显示了用于在菌株AN2的pel基因座中整合prsA基因(例如来自地衣芽孢杆菌的PrsA示例的)的DNA构建体的示意图。
图2显示了用于在枯草芽孢杆菌的amyE基因座中整合淀粉酶基因(例如来自地衣芽孢杆菌的AmyL示例的)的DNA构建体的示意图。
图3显示了用于在枯草芽孢杆菌的xyl基因座中整合PhtrA-lacZ盒的DNA构建体的示意图。
定义
折叠酶：术语“折叠酶”意指具有折叠酶活性的酶。折叠酶是促进多肽折叠成功能性三维结构和/或防止未折叠多肽聚集成非功能性结构和任何随后的蛋白质降解的蛋白质。PrsA是革兰氏阳性细菌中的折叠酶一个实例。PrsA是由形成两个结构域的两个单体组成的二聚体；肽基脯氨酰异构酶(PPIase，E.C.5.2.1.8)结构域用于肽基脯氨酰键的顺式和反式异构体的相互转换，而分子伴侣结构域辅助多肽折叠(Jakob等人，2015,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]290(6):3278-3292)。在地衣芽孢杆菌PrsA单体中，PPIase结构域由SEQ IDNO:9的氨基酸115至205组成，分子伴侣结构域由SEQ ID NO:9的267个氨基酸中的1至114和206组成。Jakob等人(同上)提供了来自枯草芽孢杆菌的PrsA的晶体结构。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
同源：术语“同源”意指来自相同物种。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供以用于其表达的控制序列。
异源：术语“异源”意指外来的，即来自不同的基因或来自不同的生物体。
在本发明的上下文中，术语“目的异源多肽”意指对于表达目的多肽的宿主细胞是外来的(即，来自不同物种)的目的多肽。
在本发明的上下文中，术语“异源启动子”意指对与其可操作地连接的多核苷酸是外源(即，来自不同基因)的启动子。
在本发明的上下文中，术语“与革兰氏阳性宿主细胞异源”意指对革兰氏阳性宿主细胞是外来的(即，来自不同物种)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使该控制序列指导该编码序列的表达。
分泌应激：术语“分泌应激”意指在目的异源多肽与同源于目的异源多肽的折叠酶共表达时，革兰氏阳性宿主细胞所经受的应激。如以下实例5-7中所述，分泌应激可通过分泌应激诱导型启动子HtrA(PHtrA)的活性来确定。可以通过相对于相同物种的革兰氏阳性宿主细胞(目的异源多肽与非同源于目的异源多肽的折叠酶共表达)所经受的分泌应激，来确定分泌应激的减少。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比，计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比，计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指与相应的亲本多肽相比，在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；以及插入意指邻近于占据某一位置的氨基酸添加一个或多个(例如，几个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。
产率：术语“产率”意指根据本发明所述的方法，在目的异源多肽与同源于目的异源多肽的折叠酶共表达时，该目的异源多肽的表达产率或活性产率。目的多肽的α-淀粉酶活性产率可根据以下实例4确定。对于其他酶活性，活性测定法是本领域已知的并且技术人员容易实现的。
术语“提高的产率”意指与在革兰氏阳性宿主细胞中当目的异源多肽与非同源于该目的异源多肽的折叠酶共表达时，该目的异源多肽的表达产率或活性产率相比，在相同物种的革兰氏阳性宿主细胞中当目的异源多肽与同源于该目的异源多肽的折叠酶共表达时，相同目的异源多肽的表达产率或活性产率的相对提高。在一个实施例中，产率相当或提高，例如提高至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高。
序列表：
SEQ ID NO:1：解淀粉芽孢杆菌PrsA的DNA序列。
SEQ ID NO:2：解淀粉芽孢杆菌PrsA，包括信号肽。
SEQ ID NO:3：解淀粉芽孢杆菌PrsA成熟多肽。
SEQ ID NO:4：解淀粉芽孢杆菌淀粉酶(AmyQ)的DNA序列。
SEQ ID NO:5：解淀粉芽孢杆菌淀粉酶，包括信号肽。
SEQ ID NO:6：解淀粉芽孢杆菌淀粉酶成熟多肽。
SEQ ID NO:7：地衣芽孢杆菌PrsA的DNA序列。
SEQ ID NO:8：地衣芽孢杆菌PrsA，包括信号肽。
SEQ ID NO:9：地衣芽孢杆菌PrsA成熟多肽。
SEQ ID NO:10：地衣芽孢杆菌淀粉酶(AmyL)的DNA序列。
SEQ ID NO:11：地衣芽孢杆菌淀粉酶，包括信号肽。
SEQ ID NO:12：地衣芽孢杆菌淀粉酶成熟多肽。
SEQ ID NO:13：芽孢杆菌属物种NSP9.1 PrsA的DNA序列。
SEQ ID NO:14：芽孢杆菌属物种NSP9.1 PrsA，包括信号肽。
SEQ ID NO:15：芽孢杆菌属物种NSP9.1 PrsA成熟多肽。
SEQ ID NO:16：芽孢杆菌属物种NSP9.1淀粉酶的DNA序列。
SEQ ID NO:17：芽孢杆菌属物种NSP9.1淀粉酶，包括信号肽。
SEQ ID NO:18：芽孢杆菌属物种NSP9.1淀粉酶成熟多肽。
SEQ ID NO:19：索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)L12 PrsA的DNA序列。
SEQ ID NO:20：索诺拉沙漠芽孢杆菌L12 PrsA，包括信号肽。
SEQ ID NO:21：索诺拉沙漠芽孢杆菌L12 PrsA成熟多肽。
SEQ ID NO:22：索诺拉沙漠芽孢杆菌L12淀粉酶的DNA序列。
SEQ ID NO:23：索诺拉沙漠芽孢杆菌L12淀粉酶，包括信号肽。
SEQ ID NO:24：索诺拉沙漠芽孢杆菌L12淀粉酶成熟多肽。
SEQ ID NO:25：枯草芽孢杆菌PrsA的DNA序列。
SEQ ID NO:26：枯草芽孢杆菌PrsA，包括信号肽。
SEQ ID NO:27：枯草芽孢杆菌PrsA成熟多肽。
SEQ ID NO:28：枯草芽孢杆菌淀粉酶(AmyE)的DNA序列。
SEQ ID NO:29：枯草芽孢杆菌淀粉酶，包括信号肽。
SEQ ID NO:30：枯草芽孢杆菌淀粉酶成熟多肽。
SEQ ID NO:31：sigF基因的DNA序列。
SEQ ID NO:32：sigFΔ297bp的DNA序列。
SEQ ID NO:33：SOE PCR产物，用于在AN2、AQG91的pel基因座中整合编码来自地衣芽孢杆菌的PrsA的基因。
SEQ ID NO:34：SOE PCR产物，用于在AN2、AQG91的amyE基因座中整合编码来自地衣芽孢杆菌的AmyL的基因。
SEQ ID NO:35：SOE PCR产物，用于在枯草芽孢杆菌的xyl基因座中整合PhtrA-lacZ盒。
具体实施方式
本发明涉及优化异源多肽在革兰氏阳性宿主细胞中表达的手段和方法。
本发明基于令人惊讶的和创造性的发现，即培养共表达目的异源多肽与折叠酶(例如与目的异源多肽同源的PrsA)的革兰氏阳性宿主细胞，可提供相当或甚至改进的目的异源多肽的表达。此外，与目的异源多肽与非同源折叠酶的共表达相比，目的异源多肽与同源折叠酶的共表达还提供了相当或减少的分泌应激。因此，目的异源多肽与同源折叠酶的共表达为优化革兰氏阳性宿主细胞中的多肽表达提供了迄今未知的选择，这在工业生物技术中是非常需要的。
核酸构建体
在第一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
本发明的核酸构建体包含至少一种(即，一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)编码目的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，本发明的核酸构建体包含两个或更多个编码两种或更多种目的多肽的多核苷酸，其中所述两种或更多种目的多肽是相同或不同的目的多肽。
目的多肽可以是任何多肽。优选地，分泌出目的多肽。
在优选的实施例中，目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，目的多肽是淀粉酶。
本发明的核酸构建体包含编码折叠酶和目的多肽的多核苷酸，其中所述折叠酶和所述目的多肽选自相同的革兰氏阳性物种。在优选的实施例中，折叠酶和目的多肽选自芽孢杆菌属的同一物种；优选地，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
尽管该折叠酶和目的多肽选自相同物种，但技术人员应承认相同物种内的多核苷酸和多肽序列天然存在序列变异。
在优选的实施例中，折叠酶与SED ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌。优选地，目的多肽是淀粉酶；更优选地，目的多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。最优选地，目的多肽包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
在优选的实施例中，折叠酶与SED ID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌。优选地，目的多肽是淀粉酶；更优选地，目的多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。最优选地，目的多肽包含SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
在优选的实施例中，折叠酶与SED ID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1。优选地，目的多肽是淀粉酶；更优选地，目的多肽与SEQ ID NO:18具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。最优选地，目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
在优选的实施例中，折叠酶与SED ID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12。优选地，目的多肽是淀粉酶；更优选地，目的多肽与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。最优选地，目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
在优选的实施例中，折叠酶与SED ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌。优选地，目的多肽是淀粉酶；更优选地，目的多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。最优选地，目的多肽包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
本发明的核酸构建体与一个或多个控制序列可操作地连接，在与控制序列相容的条件下，所述控制序列指导多核苷酸在合适的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,MolecularMicrobiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteinsfrom recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
优选地，第一异源启动子和第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。该前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。
还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。
多核苷酸
本发明还涉及编码折叠酶的多核苷酸和编码目的多肽的多核苷酸，如本文所述。在实施例中，已分离出编码折叠酶和目的多肽的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],AcademicPress[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
编码本发明的折叠酶或目的多肽的多核苷酸的修饰对于合成与所述多肽基本上类似的多肽可能是必需的。术语与该多肽“基本上类似”意指多肽的非天然存在形式。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多核苷酸的表达。将包含该多核苷酸的核酸构建体和/或表达载体引入宿主细胞中，这样使该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是有用于重组产生本发明目的多肽的任何细胞，例如革兰氏阳性细胞。
革兰氏阳性宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细胞。革兰氏阳性宿主细胞包括但不限于：任何芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属细胞。
革兰氏阳性宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。优选地，革兰氏阳性宿主细胞是选自由以下组成的组的芽孢杆菌属的细胞：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
革兰氏阳性宿主细胞也可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。
革兰氏阳性宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。
将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。
将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(naturalcompetence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。
然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
在优选的实施例中，本发明的革兰氏阳性宿主细胞在其基因组中包含核酸构建体，该核酸构建体包含(a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子和(b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子，其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
在替代实施例中，至少一种编码折叠酶的多核苷酸和至少一种编码目的多肽的多核苷酸与操纵子中的相同异源启动子可操作地连接。
产生方法
本发明还涉及生产目的多肽的方法，该方法包括：
a)提供本发明的革兰氏阳性宿主细胞，该革兰氏阳性宿主细胞包含本发明的核酸构建体和/或表达载体；
b)在有利于该折叠酶和该目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地
c)回收该目的多肽。
在一个方面，本发明涉及一种生产目的多肽的方法，该方法包括：
I)提供革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含：
1)核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
和/或
2)表达载体，其包含所述核酸构建体；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种，并且与该革兰氏阳性宿主细胞异源；
II)在有利于该折叠酶和该目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地
III)回收该目的多肽。
在实施例中，革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。在另一方面，革兰氏阳性宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
本发明的方法提供了目的多肽的相当或提高的产率和/或相当或减少的分泌应激。因此，本发明的方法在不增加施加于宿主细胞上的分泌应激量的同时保持或提高产率，这对于大规模多肽生产非常有利。
在实施例中，目的多肽的产率相当或提高，例如提高至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高。在优选的实施例中，产率提高，例如提高超过100％，例如至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高。
在实施例中，革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激是相当的或减少的。在优选的实施例中，分泌应激减少。最优选地，分泌应激减少至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％或更多。
在实施例中，目的多肽的产率提高，并且革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激相当或减少。
在实施例中，目的多肽的产率相当，并且革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少。
在实施例中，目的多肽的产率提高，并且革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少。
使用本领域已知的方法将革兰氏阳性宿主细胞在适合产生目的多肽的营养培养基中进行培养。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果分泌出目的多肽到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收目的多肽。如果未分泌目的多肽，那么可以从细胞裂解液中回收目的多肽。
可以使用特异性针对该目的多肽的本领域已知的方法来检测该目的多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶分析法来测定目的多肽的活性。
可以使用本领域中已知的方法回收该目的多肽。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含该目的多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化该目的多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
在一个替代性方面，不回收该目的多肽，而是将表达该目的多肽的本发明的宿主细胞用作该目的多肽的来源。
发酵液制剂和细胞组合物
在其他方面，本发明还涉及包含目的多肽的发酵液制剂或细胞组合物。该发酵液产物还包含发酵过程中使用的附加成分，例如像细胞(包括含有编码用于产生目的多肽的多核苷酸的基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”意指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在实施例中，发酵液制剂和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液制剂或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液制剂和细胞组合物可以通过WO 1990/15861或WO2010/096673中所述的方法来产生。
优选的实施例
1)一种核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
2)根据实施例1所述的核酸构建体，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
3)根据前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中分泌出该目的多肽。
4)根据前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，目的多肽是淀粉酶。
5)根据前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶和该目的多肽选自芽孢杆菌属的同一物种；优选地，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
6)根据前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
7)根据实施例1-5中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
8)根据实施例1-5中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:18具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
9)根据实施例1-5中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:24具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
10)根据实施例1-5中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自枯草芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
11)一种表达载体，该表达载体包含核酸构建体，该核酸构建体包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
12)根据实施例10所述的表达载体，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
13)根据实施例11-12中任一项所述的表达载体，其中分泌出该目的多肽。
14)根据实施例11-13中任一项所述的表达载体，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，该目的多肽是淀粉酶。
15)根据实施例11-14中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶和该目的多肽选自芽孢杆菌属的同一物种；优选地，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
16)根据实施例11-15中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶与SED ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
17)根据实施例11-15中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶与SED ID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
18)根据实施例11-15中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶与SED ID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:18具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
19)根据实施例11-15中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶与SED ID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:24具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
20)根据实施例11-15中任一项所述的表达载体，其中该折叠酶与SED ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自枯草芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
21)一种革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含：
1)核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
和/或
2)表达载体，其包含所述核酸构建体；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种，并且与该革兰氏阳性宿主细胞异源。
22)根据实施例21所述的革兰氏阳性宿主细胞，其是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
23)根据实施例21-22中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
24)根据实施例21-23中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中分泌出该目的多肽。
25)根据实施例21-24中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，该目的多肽是淀粉酶。
26)根据实施例21-25中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该折叠酶与SEDID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQID NO:6具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
27)根据实施例21-25中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该折叠酶与SEDID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:12具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
28)根据实施例21-25中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该折叠酶与SEDID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:18具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
29)根据实施例21-25中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该折叠酶与SEDID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
30)根据实施例21-25中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该折叠酶与SEDID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自枯草芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ IDNO:30具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
31)一种生产目的多肽的方法，该方法包括：
I)提供革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含：
1)核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码该目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
和/或
2)表达载体，其包含所述核酸构建体；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种，并且与该革兰氏阳性宿主细胞异源；
II)在有利于该折叠酶和该目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地
III)回收该目的多肽。
32)根据实施例31所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
33)根据实施例31-32中任一项所述的方法，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
34)根据实施例31-33中任一项所述的方法，其中分泌出该目的多肽。
35)根据实施例31-34中任一项所述的方法，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，该目的多肽是淀粉酶。
36)根据实施例31-35中任一项所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激相当或减少；优选地，该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少；最优选地，该分泌应激减少至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％或更多。
37)根据实施例31-36中任一项所述的方法，其中该折叠酶与SED ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
38)根据实施例31-36中任一项所述的方法，其中该折叠酶与SED ID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
39)根据实施例31-36中任一项所述的方法，其中该折叠酶与SED ID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:18具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
40)根据实施例31-36中任一项所述的方法，其中该折叠酶与SED ID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
41)根据实施例31-36中任一项所述的方法，其中该折叠酶与SED ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且该目的多肽来自枯草芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
42)根据实施例31-41中任一项所述的方法，其中该目的多肽的产率相当或提高，例如提高至少100％、至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高，优选地，产率提高例如超过100％，例如至少101％、至少102％、至少103％、至少104％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％或更高。
43)根据实施例31-42中任一项所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激相当或减少；优选地该分泌应激减少；最优选地，该分泌应激减少至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％或更多。
44)根据实施例31-43中任一项所述的方法，其中该目的多肽的产率提高，并且该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激相当或减少。
45)根据实施例31-44中任一项所述的方法，其中该目的多肽的产率相当，并且该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少。
46)根据实施例31-45中任一项所述的方法，其中该目的多肽的产率提高，并且该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
材料与方法
材料
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
使用标准教科书程序，采用商业热循环仪和来自商业供应商的Ready-To-Go PCRbeads，Phusion聚合酶或RED-TAQ聚合酶进行PCR扩增。
LB琼脂：参见EP 0 506 780。
LBPSG琼脂板含有LB琼脂，补充有磷酸盐(0.01M K3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)；参见EP 0 805 867B1。
TY(液体肉汤培养基)：参见WO 94/14968,第16页。
寡核苷酸引物获自欧陆集团(Eurofins)(奥尔胡斯，丹麦)。用可商购的试剂盒和试剂，使用标准教科书程序进行DNA操作(质粒和基因组DNA制备、限制性消化、纯化、连接、DNA测序)。
使用两步式程序(Yasbin等人,1975,J.Bacteriol.[细菌学杂志]121:296-304)或一步式程序将DNA引入到枯草芽孢杆菌经提炼的天然感受态细胞中，其中将来自琼脂板的细胞材料再悬浮于Spizisen 1培养基(12ml)(WO 2014/052630)中，在37℃以200rpm振荡约4小时，将DNA添加至400微升等分试样中，并且在选择性琼脂板上铺板之前，将这些等分试样在所希望的温度下，以150rpm振荡另外1小时。
实例中描述的所有构建都是从基因艺术-赛默飞世尔科技公司(GeneArt-ThermoFisher Scientific)订购的合成DNA片段组装而成。如实例中所述，片段通过序列重叠延伸(SOE)进行组装。
使用来自凯杰公司(Qiagen)的市售QIAamp DNA血液试剂盒，从所有相关分离物中制备基因组DNA。
标准微孔板分批发酵
Figure BDA0003147677990000311
是一种微发酵系统，可在线监测常规发酵参数，例如生物量、pH值、氧饱和度和荧光。它包含一个带有单个微孔板的温度和湿度受控的孵化室。可以通过在平板下方移动的光纤对发酵过程进行连续监测。在这项工作中，使用
Figure BDA0003147677990000312
(m2p-Labs，Baesweiler，德国)测量散射光和GFP荧光。在48孔
Figure BDA0003147677990000313
(M2p-labs)中以1000rpm振动频率、37℃和85％的湿度在LB培养基中进行培养，用减少蒸发的密封箔(M2p-Labs)覆盖微孔板。以生物学上平行三份发酵24小时，收集上清液用于随后的淀粉酶活性测量。
淀粉酶活性测定
发酵24小时后，将
Figure BDA0003147677990000314
在4℃以3500rpm离心20分钟。将20ul上清液以技术上平行两份转移至96孔板中。将随BAN淀粉酶(0-500UCF/ul，诺维信公司(Novozymes)内部产品)浓度增加的校准曲线样品添加至每个96孔板中。将AmyL(罗氏/日立)试剂1(66mL)和试剂2(16mL)混合，并将180ul的混合物加入微孔板中。在Cytation5酶标仪中在405nm、23℃下测量比色反应，每分钟测量一次吸光度，共测量6分钟。
菌株
Figure BDA0003147677990000315
Figure BDA0003147677990000321
实例1.枯草芽孢杆菌宿主AN2的构建
如以下实例中所述，枯草芽孢杆菌AN2用作表达prsA和淀粉酶基因的宿主菌株。AN2是枯草芽孢杆菌168的孢子形成缺陷型衍生物，因为sigF基因中缺失了297bp(sigF序列作为SEQ ID NO:31提供，包含缺失的非活性版本作为SEQ ID NO:32提供)。
实例2.异源prsA基因表达盒的构建和这些基因在枯草芽孢杆菌AN2中的染色体整合
枯草芽孢杆菌菌株AN2用作插入prsA基因异源拷贝的表达盒的宿主菌株。PrsA表达盒被整合到pel基因座中，由合成启动子PconsSD后跟prsA基因和枯草芽孢杆菌prsA天然终止子组成。用于整合的DNA可通过合成DNA的PCR扩增进行组装，合成DNA由以下DNA组分组成：pel 5'区+ermC(对红霉素产生抗性)+带有SD序列的合成共有启动子(PconsSD)+带有终止子的prsA可读框+pel 3'区。将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用重叠延伸基因剪接(SOE)方法(Horton RM 1989)和Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默科技公司(Thermo Scientific))生成单个线性DNA，如下所示。PCR扩增反应混合物含有凝胶纯化的PCR产物每种50ng，使用热循环仪组装和扩增DNA。所得SOE产物直接用于对枯草芽孢杆菌宿主AN2的转化。同源重组可促进染色体整合，并在含有1μg/ml红霉素的LB琼脂板上选择发生双重交换事件的细胞。用于将prsA基因整合到AN2中的线性DNA产物的示意图如图1所示，用于将来自地衣芽孢杆菌的prsA基因整合到AN2中从而产生菌株AQG91的DNA序列列于SEQ IDNO:33(地衣芽孢杆菌prsA DNA序列是SEQ ID NO:7)。通过类似的方法构建了来自解淀粉芽孢杆菌(AQG92，SEQ ID NO:1)、芽孢杆菌属物种NSP9.1(AQG159，SEQ ID NO:13)、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12(AQG162，SEQ ID NO:19)和枯草芽孢杆菌(AGQ34，SEQ ID NO:25)表达PrsA的AN2衍生物。
实例3：异源α-淀粉酶基因表达盒的构建和这些基因在枯草芽孢杆菌AN2、AQG91、AQG34、AQG92、AQG159和AQG162中的染色体整合
将α-淀粉酶表达盒整合到枯草芽孢杆菌AN2、AQG91、AQG34、AQG92、AQG159和AQG162的amyE基因座中，该表达盒由合成启动子PconsSD后跟一个α-淀粉酶基因和解淀粉芽孢杆菌amyQ终止子组成。amyE基因在此过程中失活。用于整合的DNA可通过合成DNA的PCR扩增进行组装，合成DNA由以下DNA组分组成：amyE 5'区+带有SD序列的合成共有启动子(PconsSD)+α-淀粉酶可读框+解淀粉芽孢杆菌amyQ终止子+cat基因(对氯霉素产生抗性)+amyE 3'区。本实例中使用的编码α-淀粉酶的基因是SEQ ID NO:4(编码解淀粉芽孢杆菌AmyQ)、SEQ ID NO:10(编码地衣芽孢杆菌AmyL)、SEQ ID NO:16(编码芽孢杆菌属物种NSP9.1 Amy9.1)、SEQ ID NO:22(编码索诺拉沙漠芽孢杆菌L12 AmyL12)和SEQ ID NO:28(编码枯草芽孢杆菌AmyE)。将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用实例2中描述的SOE方法生成单个线性DNA。所得SOE产物直接用于转化实例2中描述的枯草芽孢杆菌菌株，此类DNA产物(用于在AQG91中整合amyL基因)的示意图如图2所示，DNA序列列于SEQ ID NO:34中。通过一系列平行整合过程，将SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:28中的每个序列整合到枯草芽孢杆菌菌株AN2、AQG92、AQG91、AQG159、AQG162和AQG34的每个amyE基因座中，如本实例中先前对amyL所述。所得菌株列于下表1中：
表1：
Figure BDA0003147677990000341
Figure BDA0003147677990000351
实例4.α-淀粉酶在具有实例3中描述的枯草芽孢杆菌菌株的分批培养中的表达。
如上所述，对实例3中构建的枯草芽孢杆菌菌株在分批培养中的α-淀粉酶生产率进行了测试。对于分批培养，我们使用
Figure BDA0003147677990000352
微发酵系统，该系统包含温度和湿度受控的孵化室，并在线监测常规的发酵参数。以生物学上平行三份培养24小时，之后收集上清液用于随后的淀粉酶活性测量，如上所述。表2显示了在来自共表达特定淀粉酶和各种异源prsA基因的各系列菌株的上清液中测量的淀粉酶活性，如实例3中所述。每个系列中的值是相对于从amyE基因座表达淀粉酶的菌株设置的，而不是相对于从pel基因座共表达任何PrsA的菌株设置的。
该表表明，当异源淀粉酶与其同源PrsA在枯草芽孢杆菌中共表达时，在绝大多数情况下获得了最高的淀粉酶活性。除了淀粉酶和prsA基因的同源组合外，也观察到了其他基因使淀粉酶活性增加，但这些基因均不优于同源对(表2)。
表2：在枯草芽孢杆菌168ΔsigF共表达异源淀粉酶和异源prsA基因的生长培养基中的相对细胞外淀粉酶活性。值计算为至少三次测定的平均值，以不添加prsA基因的表达每种淀粉酶的菌株的淀粉酶活性水平进行归一化。(*在线监测培养物中产生的生物量，除了表达来自芽孢杆菌属物种NSP9.1的PrsA的那些外，所有生物的生长都相似。这些培养物的光密度比表达另一种PrsA的培养物光密度低约40％(很可能是由于稳定期细胞裂解增加)。然而，淀粉酶活性水平仍与其他培养物相当，表明芽孢杆菌属物种NSP9.1PrsA与其他表达的同源物相比，在支持淀粉酶分泌方面可能特别好。)
Figure BDA0003147677990000361
实例5.构建用作分泌应激指标的PhtrA-lacZ表达盒。
作为淀粉酶生产对前面实例中描述的枯草芽孢杆菌菌株施加的分泌应激的指标，我们采用了分泌应激诱导型htrA启动子(PhtrA)和lacZ基因之间的启动子融合。通过SOEPCR使用以下合成DNA组分组装在htrA启动子的控制下并靶向xyl基因座的LacZ表达盒：5′xyl区+spc基因(对大观霉素产生抗性)+天然枯草芽孢杆菌htrA启动子+lacZ基因+3′xyl区。将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用实例2中描述的SOE方法生成单个线性DNA。用于将PhtrA-lacZ盒整合到枯草芽孢杆菌xyl基因座中的线性DNA产物的示意图如图3所示，该DNA序列列于SEQ ID NO:35。
实例6.PhtrA-lacZ表达盒在AQG77、AQG97、AGQ98、AQG126、AQG174和AQG657中的整合产生菌株AN2370和AN2372。
实例5中描述的SOE产物直接用于转化枯草芽孢杆菌菌株AQG77、AQG97、AGQ98、AQG126、AQG174和AQG657，产生菌株AN2370、AN2372、AN2368、AN2376、AN2373和AN2377。同源重组可促进染色体整合，并在含有120μg/ml大观霉素的LB琼脂板上选择发生双重交换事件的细胞。
Figure BDA0003147677990000371
实例7.β-半乳糖苷酶在具有枯草芽孢杆菌AN2370和AN2372的分批培养物中的表达。
对实例6中构建的枯草杆菌菌株在分批培养中的β-半乳糖苷酶生产力进行了测试。以生物学上平行三份培养24小时，之后收集上清液用于随后的β-半乳糖苷酶活性测量，如上所述。下表列出了在枯草芽孢杆菌AN2370、AN2372、AN2368、AN2376、AN2373和AN2377的24小时培养物中测量的β-半乳糖苷酶活性。该表表明，目的异源多肽与同源折叠酶的共表达不仅使α-淀粉酶活性增加，而且使htrA启动子活性显著降低。因此，地衣芽孢杆菌PrsA的共表达在实例6中描述的产生AmyL的AN2衍生物AN2372中提供了最高程度的分泌应激缓解。
总之，与异源多肽与非同源PrsA的共表达相比，相同异源多肽与同源PrsA的共表达降低了分泌应激。
Figure BDA0003147677990000381
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 同源折叠酶共表达
<130> 14958-WO-PCT
<160> 35
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 858
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(855)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(57)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (58)..(855)
<400> 1
atg aag aaa atc gcg ata gca act att acg gca acg agc gtc ctc gct 48
Met Lys Lys Ile Ala Ile Ala Thr Ile Thr Ala Thr Ser Val Leu Ala
-15 -10 -5
ctc agc gca tgc agc agc ggc gac aac gac gtg att gcc aag acg gat 96
Leu Ser Ala Cys Ser Ser Gly Asp Asn Asp Val Ile Ala Lys Thr Asp
-1 1 5 10
gcc ggc aat gtg aca aaa ggc gag ctc tac acg aac atg aaa aaa acc 144
Ala Gly Asn Val Thr Lys Gly Glu Leu Tyr Thr Asn Met Lys Lys Thr
15 20 25
gcg ggc gca agt gtg ctg aca cag ctc gta caa gaa aaa gta tta gcc 192
Ala Gly Ala Ser Val Leu Thr Gln Leu Val Gln Glu Lys Val Leu Ala
30 35 40 45
aaa aaa tac aaa gta tcg gat aaa gaa att gat aac aag ctg aaa gag 240
Lys Lys Tyr Lys Val Ser Asp Lys Glu Ile Asp Asn Lys Leu Lys Glu
50 55 60
tac aaa act cag ctc ggc gac cag tac agc gcc ctt aaa cag cag tac 288
Tyr Lys Thr Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Ser Ala Leu Lys Gln Gln Tyr
65 70 75
ggc gaa gat tac ctg aaa gat cag gtg aaa tac gaa ctg ctt gcc caa 336
Gly Glu Asp Tyr Leu Lys Asp Gln Val Lys Tyr Glu Leu Leu Ala Gln
80 85 90
aaa gcg gcg aaa gac aac atc aaa gtc act gac tcc gac acg aaa gaa 384
Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Ser Asp Thr Lys Glu
95 100 105
tat tac gac ggc tta aaa ggt aaa atc cgt gcg agc cac atc ctt gtc 432
Tyr Tyr Asp Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
gct gat aaa aag aca gct gac gaa gtg gag aaa aag ctg aaa aaa ggc 480
Ala Asp Lys Lys Thr Ala Asp Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
gag aag ttt gaa acg ctt gcg aaa gaa tac tca act gac agc tca aaa 528
Glu Lys Phe Glu Thr Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Lys
145 150 155
gac aac ggc ggc gac ctt ggc tgg ttc gat aaa aaa tca atg gat gag 576
Asp Asn Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Asp Lys Lys Ser Met Asp Glu
160 165 170
aca ttc agc aaa gct gca ttc ggc ttg aaa gtc gga caa gtc agc gat 624
Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Gly Leu Lys Val Gly Gln Val Ser Asp
175 180 185
ccg gtc aaa aca aaa ttc ggt tat cat atc atc aaa aag acg gaa gaa 672
Pro Val Lys Thr Lys Phe Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu
190 195 200 205
cgc ggc aaa tat gat gac atg aaa aaa gaa ctg aaa gaa gaa gtt ctt 720
Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu
210 215 220
aaa cag aag cta aac gac aac tca gct gta cag gca gcg att caa aaa 768
Lys Gln Lys Leu Asn Asp Asn Ser Ala Val Gln Ala Ala Ile Gln Lys
225 230 235
gtc atg aag aaa gct gac gta aaa gtt gaa gac aaa gac tta aaa gac 816
Val Met Lys Lys Ala Asp Val Lys Val Glu Asp Lys Asp Leu Lys Asp
240 245 250
acg ttt aac act tca gct tca aca tct tct gaa tct aaa taa 858
Thr Phe Asn Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Glu Ser Lys
255 260 265
<210> 2
<211> 285
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 2
Met Lys Lys Ile Ala Ile Ala Thr Ile Thr Ala Thr Ser Val Leu Ala
-15 -10 -5
Leu Ser Ala Cys Ser Ser Gly Asp Asn Asp Val Ile Ala Lys Thr Asp
-1 1 5 10
Ala Gly Asn Val Thr Lys Gly Glu Leu Tyr Thr Asn Met Lys Lys Thr
15 20 25
Ala Gly Ala Ser Val Leu Thr Gln Leu Val Gln Glu Lys Val Leu Ala
30 35 40 45
Lys Lys Tyr Lys Val Ser Asp Lys Glu Ile Asp Asn Lys Leu Lys Glu
50 55 60
Tyr Lys Thr Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Ser Ala Leu Lys Gln Gln Tyr
65 70 75
Gly Glu Asp Tyr Leu Lys Asp Gln Val Lys Tyr Glu Leu Leu Ala Gln
80 85 90
Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Ser Asp Thr Lys Glu
95 100 105
Tyr Tyr Asp Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
Ala Asp Lys Lys Thr Ala Asp Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
Glu Lys Phe Glu Thr Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Lys
145 150 155
Asp Asn Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Asp Lys Lys Ser Met Asp Glu
160 165 170
Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Gly Leu Lys Val Gly Gln Val Ser Asp
175 180 185
Pro Val Lys Thr Lys Phe Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu
190 195 200 205
Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu
210 215 220
Lys Gln Lys Leu Asn Asp Asn Ser Ala Val Gln Ala Ala Ile Gln Lys
225 230 235
Val Met Lys Lys Ala Asp Val Lys Val Glu Asp Lys Asp Leu Lys Asp
240 245 250
Thr Phe Asn Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Glu Ser Lys
255 260 265
<210> 3
<211> 266
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 3
Cys Ser Ser Gly Asp Asn Asp Val Ile Ala Lys Thr Asp Ala Gly Asn
1 5 10 15
Val Thr Lys Gly Glu Leu Tyr Thr Asn Met Lys Lys Thr Ala Gly Ala
20 25 30
Ser Val Leu Thr Gln Leu Val Gln Glu Lys Val Leu Ala Lys Lys Tyr
35 40 45
Lys Val Ser Asp Lys Glu Ile Asp Asn Lys Leu Lys Glu Tyr Lys Thr
50 55 60
Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Ser Ala Leu Lys Gln Gln Tyr Gly Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Asp Gln Val Lys Tyr Glu Leu Leu Ala Gln Lys Ala Ala
85 90 95
Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Ser Asp Thr Lys Glu Tyr Tyr Asp
100 105 110
Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val Ala Asp Lys
115 120 125
Lys Thr Ala Asp Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly Glu Lys Phe
130 135 140
Glu Thr Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asp Asn Gly
145 150 155 160
Gly Asp Leu Gly Trp Phe Asp Lys Lys Ser Met Asp Glu Thr Phe Ser
165 170 175
Lys Ala Ala Phe Gly Leu Lys Val Gly Gln Val Ser Asp Pro Val Lys
180 185 190
Thr Lys Phe Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu Arg Gly Lys
195 200 205
Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu Lys Gln Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Asn Ser Ala Val Gln Ala Ala Ile Gln Lys Val Met Lys
225 230 235 240
Lys Ala Asp Val Lys Val Glu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Thr Phe Asn
245 250 255
Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Glu Ser Lys
260 265
<210> 4
<211> 1545
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1542)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(93)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (94)..(1542)
<400> 4
atg att caa aaa cga aag cgg aca gtt tcg ttc aga ctt gtg ctt atg 48
Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met
-30 -25 -20
tgc acg ctg tta ttt gtc agt ttg ccg att aca aaa aca tca gcc gta 96
Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Val
-15 -10 -5 -1 1
aat ggc acg ctg atg cag tat ttt gaa tgg tat acg ccg aac gac ggc 144
Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp Gly
5 10 15
cag cat tgg aaa cga ttg cag aat gat gcg gaa cat tta tcg gat atc 192
Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp Ile
20 25 30
gga atc act gcc gtc tgg att cct ccc gca tac aaa gga ttg agc caa 240
Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Gln
35 40 45
tcc gat aac gga tac gga cct tat gat ttg tat gat tta gga gaa ttc 288
Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe
50 55 60 65
cag caa aaa ggg acg gtc aga acg aaa tac ggc aca aaa tca gag ctt 336
Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu Leu
70 75 80
caa gat gcg atc ggc tca ctg cat tcc cgg aac gtc caa gta tac gga 384
Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr Gly
85 90 95
gat gtg gtt ttg aat cat aag gct ggt gct gat gca aca gaa gat gta 432
Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val
100 105 110
act gcc gtc gaa gtc aat ccg gcc aat aga aat cag gaa act tcg gag 480
Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser Glu
115 120 125
gaa tat caa atc aaa gcg tgg acg gat ttt cgt ttt ccg ggc cgt gga 528
Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg Gly
130 135 140 145
aac acg tac agt gat ttt aaa tgg cat tgg tat cat ttc gac gga gcg 576
Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Ala
150 155 160
gac tgg gat gaa tcc cgg aag atc agc cgc atc ttt aag ttt cgt ggg 624
Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg Gly
165 170 175
gaa gga aaa gcg tgg gat tgg gaa gta tca agt gaa aac ggc aac tat 672
Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn Tyr
180 185 190
gac tat tta atg tat gct gat gtt gac tac gac cac cct gat gtc gtg 720
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gca gag aca aaa aaa tgg ggt atc tgg tat gcg aat gaa ctg tca tta 768
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gac ggc ttc cgt att gat gcc gcc aaa cat att aaa ttt tca ttt ctg 816
Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu
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cgt gat tgg gtt cag gcg gtc aga cag gcg acg gga aaa gaa atg ttt 864
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acg gtt gcg gag tat tgg cag aat aat gcc ggg aaa ctc gaa aac tac 912
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ttg aat aaa aca agc ttt aat caa tcc gtg ttt gat gtt ccg ctt cat 960
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aca gtc caa act tgg ttt aaa ccg ctt gca tac gcc ttt att ttg aca 1152
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Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe
55 60 65
His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu
70 75 80
Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly
85 90 95
Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val
100 105 110 115
Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Thr Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly
120 125 130
Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg Gly
135 140 145
Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr
150 155 160
Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly
165 170 175
Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr
180 185 190 195
Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu
200 205 210
Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly
215 220 225
Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp
230 235 240
Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val
245 250 255
Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn
260 265 270 275
Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln
280 285 290
Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu
295 300 305
Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe
310 315 320
Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val
325 330 335
Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu
340 345 350 355
Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly
360 365 370
Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile
375 380 385
Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe
390 395 400
Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val
405 410 415
Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala
420 425 430 435
Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp
440 445 450
Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp
455 460 465
Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg
470 475 480
<210> 12
<211> 483
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 12
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Thr Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 13
<211> 861
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(858)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(57)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (58)..(858)
<400> 13
atg aag aaa att gca att gcg gcg ata aca gca aca agc gtg ctg gct 48
Met Lys Lys Ile Ala Ile Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ser Val Leu Ala
-15 -10 -5
ctc agc gca tgt tca ggt ggc gac tct caa gta gtt gcg gag aca aaa 96
Leu Ser Ala Cys Ser Gly Gly Asp Ser Gln Val Val Ala Glu Thr Lys
-1 1 5 10
gct ggc aac atc aca aag gag gac ctt tac cag act ctt aag gag aac 144
Ala Gly Asn Ile Thr Lys Glu Asp Leu Tyr Gln Thr Leu Lys Glu Asn
15 20 25
gca ggt gcg gac gct ctt aac atg ctt gtt caa aag aag gta ctt gac 192
Ala Gly Ala Asp Ala Leu Asn Met Leu Val Gln Lys Lys Val Leu Asp
30 35 40 45
gac aag tac gac gta aca gac aag gag atc gac aag aag ctt aac gag 240
Asp Lys Tyr Asp Val Thr Asp Lys Glu Ile Asp Lys Lys Leu Asn Glu
50 55 60
tac aag aag agc atg ggc gac cag ctt gac tca ctt atc aag cag aag 288
Tyr Lys Lys Ser Met Gly Asp Gln Leu Asp Ser Leu Ile Lys Gln Lys
65 70 75
ggc gag gac tac gtt aag gac caa atc aag tac gag ctt ctt atg aag 336
Gly Glu Asp Tyr Val Lys Asp Gln Ile Lys Tyr Glu Leu Leu Met Lys
80 85 90
aaa gct gcg aag gac aac atc aag gtt aca gac gac gac gtt aag gag 384
Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Asp Asp Val Lys Glu
95 100 105
tac tac gac tca ctt aag ggc aag att cgt gcg agc cac atc ctt gtt 432
Tyr Tyr Asp Ser Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
aag gac aag aag act gcg gaa gag gtt gag aag aag ctt aag aag ggc 480
Lys Asp Lys Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
gag aag ttc gag gac ctt gcg aag gag tac tct aca gac ggc aca gcc 528
Glu Lys Phe Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Gly Thr Ala
145 150 155
gag aaa ggt ggc gac ctt ggc tgg ttc gct aag gag ggc gag atg gac 576
Glu Lys Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Glu Met Asp
160 165 170
aag aca ttc tct aaa gct gcg ttc gca ctt aag aca ggc gag gtt tct 624
Lys Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Ala Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser
175 180 185
gag cca gtt aag act gac tac ggc tac cat atc atc aag aag acg gag 672
Glu Pro Val Lys Thr Asp Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu
190 195 200 205
gaa cgt ggc aag tac gac gac atg aag aag gag ctt aag aaa gag gtt 720
Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Lys Glu Val
210 215 220
gag gag caa aag ctt aac gac cag act gag ctt cag agc gta atc gac 768
Glu Glu Gln Lys Leu Asn Asp Gln Thr Glu Leu Gln Ser Val Ile Asp
225 230 235
aag ctt gtt aag gac gcg gac ctt aag gtt aag gac aag gag ctt aag 816
Lys Leu Val Lys Asp Ala Asp Leu Lys Val Lys Asp Lys Glu Leu Lys
240 245 250
aag caa atc gac caa tct caa act aac act aac tca aac tct taa 861
Lys Gln Ile Asp Gln Ser Gln Thr Asn Thr Asn Ser Asn Ser
255 260 265
<210> 14
<211> 286
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<400> 14
Met Lys Lys Ile Ala Ile Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ser Val Leu Ala
-15 -10 -5
Leu Ser Ala Cys Ser Gly Gly Asp Ser Gln Val Val Ala Glu Thr Lys
-1 1 5 10
Ala Gly Asn Ile Thr Lys Glu Asp Leu Tyr Gln Thr Leu Lys Glu Asn
15 20 25
Ala Gly Ala Asp Ala Leu Asn Met Leu Val Gln Lys Lys Val Leu Asp
30 35 40 45
Asp Lys Tyr Asp Val Thr Asp Lys Glu Ile Asp Lys Lys Leu Asn Glu
50 55 60
Tyr Lys Lys Ser Met Gly Asp Gln Leu Asp Ser Leu Ile Lys Gln Lys
65 70 75
Gly Glu Asp Tyr Val Lys Asp Gln Ile Lys Tyr Glu Leu Leu Met Lys
80 85 90
Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Asp Asp Val Lys Glu
95 100 105
Tyr Tyr Asp Ser Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
Lys Asp Lys Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
Glu Lys Phe Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Gly Thr Ala
145 150 155
Glu Lys Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Glu Met Asp
160 165 170
Lys Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Ala Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser
175 180 185
Glu Pro Val Lys Thr Asp Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu
190 195 200 205
Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Lys Glu Val
210 215 220
Glu Glu Gln Lys Leu Asn Asp Gln Thr Glu Leu Gln Ser Val Ile Asp
225 230 235
Lys Leu Val Lys Asp Ala Asp Leu Lys Val Lys Asp Lys Glu Leu Lys
240 245 250
Lys Gln Ile Asp Gln Ser Gln Thr Asn Thr Asn Ser Asn Ser
255 260 265
<210> 15
<211> 267
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<400> 15
Cys Ser Gly Gly Asp Ser Gln Val Val Ala Glu Thr Lys Ala Gly Asn
1 5 10 15
Ile Thr Lys Glu Asp Leu Tyr Gln Thr Leu Lys Glu Asn Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Ala Leu Asn Met Leu Val Gln Lys Lys Val Leu Asp Asp Lys Tyr
35 40 45
Asp Val Thr Asp Lys Glu Ile Asp Lys Lys Leu Asn Glu Tyr Lys Lys
50 55 60
Ser Met Gly Asp Gln Leu Asp Ser Leu Ile Lys Gln Lys Gly Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Val Lys Asp Gln Ile Lys Tyr Glu Leu Leu Met Lys Lys Ala Ala
85 90 95
Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Asp Asp Val Lys Glu Tyr Tyr Asp
100 105 110
Ser Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val Lys Asp Lys
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly Glu Lys Phe
130 135 140
Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Gly Thr Ala Glu Lys Gly
145 150 155 160
Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Glu Met Asp Lys Thr Phe
165 170 175
Ser Lys Ala Ala Phe Ala Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser Glu Pro Val
180 185 190
Lys Thr Asp Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu Arg Gly
195 200 205
Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Lys Glu Val Glu Glu Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Gln Thr Glu Leu Gln Ser Val Ile Asp Lys Leu Val
225 230 235 240
Lys Asp Ala Asp Leu Lys Val Lys Asp Lys Glu Leu Lys Lys Gln Ile
245 250 255
Asp Gln Ser Gln Thr Asn Thr Asn Ser Asn Ser
260 265
<210> 16
<211> 1548
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1545)
<220>
<221> sig
<222> (1)..(1545)
<220>
<221> sig
<222> (1)..(90)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (91)..(1545)
<400> 16
atg ctg gga aaa aac aaa cgg ttt ttc aca tgg atg gtt tcg ttt ttc 48
Met Leu Gly Lys Asn Lys Arg Phe Phe Thr Trp Met Val Ser Phe Phe
-30 -25 -20 -15
gtc acg ctc atg ttc ctg gtt ccg ccg cct aaa gca agt gcg gaa agc 96
Val Thr Leu Met Phe Leu Val Pro Pro Pro Lys Ala Ser Ala Glu Ser
-10 -5 -1 1
att aac ggc aca ttg atg cag tat ttt gag tgg tat ttg ccc aat gat 144
Ile Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asn Asp
5 10 15
ggc caa cat tgg aag cgt tta caa aac gac gcg gca tat tta tca gat 192
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Ala Tyr Leu Ser Asp
20 25 30
ctc ggc gtc acc gct gta tgg att ccg ccg gcc tac aag gga acg agt 240
Leu Gly Val Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser
35 40 45 50
cag tct gat gtc ggt tat ggc gcc tat gat ttg tat gat tta gga gag 288
Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
55 60 65
ttt cag caa aaa ggg acg gtg cga acg aaa tac gga aca aaa ggt gag 336
Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu
70 75 80
ctt caa tct gcg atc ggc aat ctt cat tcc cgt aat att cac gtc tac 384
Leu Gln Ser Ala Ile Gly Asn Leu His Ser Arg Asn Ile His Val Tyr
85 90 95
ggg gat gtc gtc atc aat cat aaa gga gga gct gat ggg acg gaa gac 432
Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Asp
100 105 110
gtc acc gct gtt gaa gtc aat ccg ggg gac agg aat cag gaa acg tcc 480
Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Gly Asp Arg Asn Gln Glu Thr Ser
115 120 125 130
ggg gag cag cga atc aaa gcg tgg aca gcg ttt cat ttt cca gga cgc 528
Gly Glu Gln Arg Ile Lys Ala Trp Thr Ala Phe His Phe Pro Gly Arg
135 140 145
gga agc acc tac agc ggt ttt aag tgg cat tgg tat cat ttt gat gga 576
Gly Ser Thr Tyr Ser Gly Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
150 155 160
aca gat tgg gac gag tcc cgg aaa ttg aac cgc atc tat aag ttt cgc 624
Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Arg
165 170 175
gga gag ggc aag gca tgg gat tgg gag gtt tca agc gaa aac ggc aac 672
Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
tat gac tac ctg atg tat gct gat att gat tac aac cat ccc gat gtc 720
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asn His Pro Asp Val
195 200 205 210
gtg gca gaa ttg aaa aaa tgg gga aca tgg tat gcc aat gaa ctg aac 768
Val Ala Glu Leu Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Asn
215 220 225
ttg gac ggt ttt cgg ctc gat gcc gtg aaa cat att aaa ttt tca ttt 816
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
230 235 240
ttg cgg gat tgg ctg aaa tca gtc agg gaa tcg acg ggg aag gat atg 864
Leu Arg Asp Trp Leu Lys Ser Val Arg Glu Ser Thr Gly Lys Asp Met
245 250 255
ttt gcg gta gct gag tat tgg cgg aat gac cag ggc gcc ctt gaa aat 912
Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Arg Asn Asp Gln Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
tac ttg aag aaa acc gat ttt caa cat tcg gta ttc gat gtt ccg ctc 960
Tyr Leu Lys Lys Thr Asp Phe Gln His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285 290
cac tac aat ttg cat gcc gca tca tcg caa ggg ggc ggc tat gat atg 1008
His Tyr Asn Leu His Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
295 300 305
agg caa ttg ctg aac ggt act gtc gta tcc aaa tat ccg gaa aag gcg 1056
Arg Gln Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys Tyr Pro Glu Lys Ala
310 315 320
gtc aca ttt gtt gat aat cat gat aca cag cct gga caa tcg ctt gag 1104
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
tcc act gtc gaa cca tgg ttt aaa ccg ctt gcc tat tgt ttc att atg 1152
Ser Thr Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Cys Phe Ile Met
340 345 350
aca agg aag tcc ggc tac ccg cag gtt ttc tac gga gat ctg tat ggg 1200
Thr Arg Lys Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Leu Tyr Gly
355 360 365 370
aca aag ggt tct aca tca cgg gaa att cca gtg ctt aaa aac aaa ctc 1248
Thr Lys Gly Ser Thr Ser Arg Glu Ile Pro Val Leu Lys Asn Lys Leu
375 380 385
gag ccg att tta aaa gcg cgc aaa cat tat gca tat ggc gcc cag cac 1296
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys His Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
390 395 400
gac tat ttc gac cat cat gat atc atc ggc tgg acg agg gaa ggt gac 1344
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
agt tcg att cag aag tcc ggt cta gct gca tta ata aca gac gga ccc 1392
Ser Ser Ile Gln Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
ggc gga tca aag cgt atg tat gtc gga cgt gag aat gcg ggt gaa acg 1440
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Glu Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445 450
tgg tat gac atc acg ggg aac cgt tca gac tcc gtc gcg atc gat tcg 1488
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Ser Val Ala Ile Asp Ser
455 460 465
aac ggc tgg gga gaa ttc cgt gtg aac ggc ggt tcg gtt tcc att tat 1536
Asn Gly Trp Gly Glu Phe Arg Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
470 475 480
gtt cag agg tag 1548
Val Gln Arg
485
<210> 17
<211> 515
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<400> 17
Met Leu Gly Lys Asn Lys Arg Phe Phe Thr Trp Met Val Ser Phe Phe
-30 -25 -20 -15
Val Thr Leu Met Phe Leu Val Pro Pro Pro Lys Ala Ser Ala Glu Ser
-10 -5 -1 1
Ile Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asn Asp
5 10 15
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Ala Tyr Leu Ser Asp
20 25 30
Leu Gly Val Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser
35 40 45 50
Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
55 60 65
Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu
70 75 80
Leu Gln Ser Ala Ile Gly Asn Leu His Ser Arg Asn Ile His Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Asp
100 105 110
Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Gly Asp Arg Asn Gln Glu Thr Ser
115 120 125 130
Gly Glu Gln Arg Ile Lys Ala Trp Thr Ala Phe His Phe Pro Gly Arg
135 140 145
Gly Ser Thr Tyr Ser Gly Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
150 155 160
Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Arg
165 170 175
Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asn His Pro Asp Val
195 200 205 210
Val Ala Glu Leu Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Asn
215 220 225
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
230 235 240
Leu Arg Asp Trp Leu Lys Ser Val Arg Glu Ser Thr Gly Lys Asp Met
245 250 255
Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Arg Asn Asp Gln Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Lys Lys Thr Asp Phe Gln His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285 290
His Tyr Asn Leu His Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
295 300 305
Arg Gln Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys Tyr Pro Glu Lys Ala
310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Cys Phe Ile Met
340 345 350
Thr Arg Lys Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Leu Tyr Gly
355 360 365 370
Thr Lys Gly Ser Thr Ser Arg Glu Ile Pro Val Leu Lys Asn Lys Leu
375 380 385
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys His Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Ile Gln Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Glu Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445 450
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Ser Val Ala Ile Asp Ser
455 460 465
Asn Gly Trp Gly Glu Phe Arg Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
470 475 480
Val Gln Arg
485
<210> 18
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种NSP9.1
<400> 18
Glu Ser Ile Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Ala Tyr Leu
20 25 30
Ser Asp Leu Gly Val Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Gly Asn Leu His Ser Arg Asn Ile His
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Gly Asp Arg Asn Gln Glu
115 120 125
Thr Ser Gly Glu Gln Arg Ile Lys Ala Trp Thr Ala Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Gly Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Arg Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn
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Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asn His Pro
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Asp Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Arg Asn Asp Gln Gly Ala Leu
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Glu Asn Tyr Leu Lys Lys Thr Asp Phe Gln His Ser Val Phe Asp Val
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Pro Leu His Tyr Asn Leu His Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr
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Gly Asp Ser Ser Ile Gln Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
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Met Lys Lys Ile Thr Ile Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ser Leu Leu Ala
-15 -10 -5
ctc agc gcg tgc agc ggg gga gat tct gaa gtt gtc gca gaa aca aaa 96
Leu Ser Ala Cys Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Val Ala Glu Thr Lys
-1 1 5 10
gca gga aat gta aca aaa gaa gag ctt tat caa aca tta aaa gaa aac 144
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gcc gga gcg gac gcg ctt aac atg ctt gtt cag caa aaa gta ctc gat 192
Ala Gly Ala Asp Ala Leu Asn Met Leu Val Gln Gln Lys Val Leu Asp
30 35 40 45
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Asp Lys Tyr Lys Ala Ser Asp Lys Glu Ile Asp Lys Lys Leu Asn Glu
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tac aag aaa acc gca ggc gac cag atc aac gcg ctg att gat caa aaa 288
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aaa gcc gca aag gat aac ata aaa gta aca gac aaa gac gtg aaa gaa 384
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tat tat gac ggc ctc aaa ggc aaa atc cgc gcg agc cac att ctc gtc 432
Tyr Tyr Asp Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
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aaa gat aag aaa acc gct gaa gaa gtt gag aaa aag ctg aaa aaa ggc 480
Lys Asp Lys Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
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Glu Lys Phe Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Gly Thr Ala
145 150 155
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Glu Lys Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Gly Lys Thr Glu Met Asp Lys
160 165 170
tca ttc acc aaa gcg gcc ttc gct ctg aaa aca ggc gaa atc agc ggc 624
Ser Phe Thr Lys Ala Ala Phe Ala Leu Lys Thr Gly Glu Ile Ser Gly
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cct gtc aaa tca caa tgg ggc tac cac atc att aag aaa aca gaa gaa 672
Pro Val Lys Ser Gln Trp Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu
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cgc ggc aaa tac gat gac atg aaa aac gat ctg aaa aaa ctg cta ata 720
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Glu Gln Lys Gln Ser Asp Thr Thr Glu Leu Gln Ser Val Met Asn Lys
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Leu Val Lys Asp Ala Asp Met Lys Val Lys Asp Lys Glu Leu Lys Lys
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caa gtc gaa caa agc cag tca tct gca caa aca aac agc aac agc taa 864
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195 200 205
Tyr Asp Asp Met Lys Asn Asp Leu Lys Lys Leu Leu Ile Glu Gln Lys
210 215 220
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-10 -5 -1 1 5
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ctt aat cat aag gct ggg gcg gat ctg acg gag gat gtc acc gcg gtt 432
Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Leu Thr Glu Asp Val Thr Ala Val
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act ggg aac cgt tca gat tcc gtc gtg atc aat tcg gac ggc tgg gga 1488
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gag ttt tat gta aac ggc ggt tcg gtt tcg att tat gtc caa cga tag 1536
Glu Phe Tyr Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg
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Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Gly Tyr Leu Ser Asp Ile Gly Ile Thr
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Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln Ala Asp Val
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ggc aaa gat tac ctg aaa gaa caa gta aaa tat gaa ttg ctg aca caa 336
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95 100 105
tac tgg gaa ggc tta aaa ggc aaa atc cgt gca agc cac atc ctt gtt 432
Tyr Trp Glu Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
gct gat aaa aag aca gct gaa gaa gta gag aaa aag ctg aaa aaa ggc 480
Ala Asp Lys Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
gag aag ttt gaa gac ctt gcg aaa gaa tac tca aca gac agc tct gct 528
Glu Lys Phe Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Ala
145 150 155
tca aaa ggc ggg gat ctt ggc tgg ttc gca aaa gaa ggc caa atg gac 576
Ser Lys Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Gln Met Asp
160 165 170
gaa aca ttc agc aaa gct gca ttc aaa tta aaa aca ggt gaa gtc agt 624
Glu Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Lys Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser
175 180 185
gat cct gtc aaa acg caa tac ggc tac cat atc att aaa aag aca gaa 672
Asp Pro Val Lys Thr Gln Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu
190 195 200 205
gaa cgc ggc aaa tat gat gat atg aaa aaa gaa ctg aaa tct gaa gtg 720
Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Ser Glu Val
210 215 220
ctt gaa caa aaa tta aat gac aac gca gct gtt cag gaa gct gtt caa 768
Leu Glu Gln Lys Leu Asn Asp Asn Ala Ala Val Gln Glu Ala Val Gln
225 230 235
aaa gtc atg aag aag gct gac atc gaa gta aaa gat aaa gat ctg aaa 816
Lys Val Met Lys Lys Ala Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Asp Leu Lys
240 245 250
gac aca ttt aat aca tct tca aca agc aac agc act tct tca tct tca 864
Asp Thr Phe Asn Thr Ser Ser Thr Ser Asn Ser Thr Ser Ser Ser Ser
255 260 265
agc aat tct aaa taa 879
Ser Asn Ser Lys
270
<210> 26
<211> 292
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 26
Met Lys Lys Ile Ala Ile Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ser Ile Leu Ala
-15 -10 -5
Leu Ser Ala Cys Ser Ser Gly Asp Lys Glu Val Ile Ala Lys Thr Asp
-1 1 5 10
Ala Gly Asp Val Thr Lys Gly Glu Leu Tyr Thr Asn Met Lys Lys Thr
15 20 25
Ala Gly Ala Ser Val Leu Thr Gln Leu Val Gln Glu Lys Val Leu Asp
30 35 40 45
Lys Lys Tyr Lys Val Ser Asp Lys Glu Ile Asp Asn Lys Leu Lys Glu
50 55 60
Tyr Lys Thr Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Gln Tyr
65 70 75
Gly Lys Asp Tyr Leu Lys Glu Gln Val Lys Tyr Glu Leu Leu Thr Gln
80 85 90
Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Ala Asp Ile Lys Glu
95 100 105
Tyr Trp Glu Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val
110 115 120 125
Ala Asp Lys Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly
130 135 140
Glu Lys Phe Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Ala
145 150 155
Ser Lys Gly Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Gln Met Asp
160 165 170
Glu Thr Phe Ser Lys Ala Ala Phe Lys Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser
175 180 185
Asp Pro Val Lys Thr Gln Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu
190 195 200 205
Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Ser Glu Val
210 215 220
Leu Glu Gln Lys Leu Asn Asp Asn Ala Ala Val Gln Glu Ala Val Gln
225 230 235
Lys Val Met Lys Lys Ala Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Asp Leu Lys
240 245 250
Asp Thr Phe Asn Thr Ser Ser Thr Ser Asn Ser Thr Ser Ser Ser Ser
255 260 265
Ser Asn Ser Lys
270
<210> 27
<211> 273
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 27
Cys Ser Ser Gly Asp Lys Glu Val Ile Ala Lys Thr Asp Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Thr Lys Gly Glu Leu Tyr Thr Asn Met Lys Lys Thr Ala Gly Ala
20 25 30
Ser Val Leu Thr Gln Leu Val Gln Glu Lys Val Leu Asp Lys Lys Tyr
35 40 45
Lys Val Ser Asp Lys Glu Ile Asp Asn Lys Leu Lys Glu Tyr Lys Thr
50 55 60
Gln Leu Gly Asp Gln Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Gln Tyr Gly Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Glu Gln Val Lys Tyr Glu Leu Leu Thr Gln Lys Ala Ala
85 90 95
Lys Asp Asn Ile Lys Val Thr Asp Ala Asp Ile Lys Glu Tyr Trp Glu
100 105 110
Gly Leu Lys Gly Lys Ile Arg Ala Ser His Ile Leu Val Ala Asp Lys
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Glu Val Glu Lys Lys Leu Lys Lys Gly Glu Lys Phe
130 135 140
Glu Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Asp Leu Gly Trp Phe Ala Lys Glu Gly Gln Met Asp Glu Thr Phe
165 170 175
Ser Lys Ala Ala Phe Lys Leu Lys Thr Gly Glu Val Ser Asp Pro Val
180 185 190
Lys Thr Gln Tyr Gly Tyr His Ile Ile Lys Lys Thr Glu Glu Arg Gly
195 200 205
Lys Tyr Asp Asp Met Lys Lys Glu Leu Lys Ser Glu Val Leu Glu Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Asn Ala Ala Val Gln Glu Ala Val Gln Lys Val Met
225 230 235 240
Lys Lys Ala Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Asp Leu Lys Asp Thr Phe
245 250 255
Asn Thr Ser Ser Thr Ser Asn Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser
260 265 270
Lys
<210> 28
<211> 1980
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1977)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(99)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (100)..(1977)
<400> 28
atg ttt gca aaa cga ttc aaa acc tct tta ctg ccg tta ttc gct gga 48
Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly
-30 -25 -20
ttt tta ttg ctg ttt cat ttg gtt ctg gca gga ccg gcg gct gcg agt 96
Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser
-15 -10 -5
gct gaa acg gcg aac aaa tcg aat gag ctt aca gca ccg tcg atc aaa 144
Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys
-1 1 5 10 15
agc gga acc att ctt cat gca tgg aat tgg tcg ttc aat acg tta aaa 192
Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys
20 25 30
cac aat atg aag gat att cat gat gca gga tat aca gcc att cag aca 240
His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr
35 40 45
tct ccg att aac caa gta aag gaa ggg aat caa gga gat aaa agc atg 288
Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met
50 55 60
tcg aac tgg tac tgg ctg tat cag ccg aca tcg tat caa att ggc aac 336
Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn
65 70 75
cgt tac tta ggt act gaa caa gaa ttt aaa gaa atg tgt gca gcc gct 384
Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala
80 85 90 95
gaa gaa tat ggc ata aag gtc att gtt gac gcg gtc atc aat cat acc 432
Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr
100 105 110
acc agt gat tat gcc gcg att tcc aat gag gtt aag agt att cca aac 480
Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn
115 120 125
tgg aca cat gga aac aca caa att aaa aac tgg tct gat cga tgg gat 528
Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp
130 135 140
gtc acg cag aat tca ttg ctc ggg ctg tat gac tgg aat aca caa aat 576
Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn
145 150 155
aca caa gta cag tcc tat ctg aaa cgg ttc tta gac agg gca ttg aat 624
Thr Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn
160 165 170 175
gac ggg gca gac ggt ttt cga ttt gat gcc gcc aaa cat ata gag ctt 672
Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu
180 185 190
cca gat gat ggc agt tac ggc agt caa ttt tgg ccg aat atc aca aat 720
Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn
195 200 205
aca tct gca gag ttc caa tac gga gaa atc ctg cag gat agt gcc tcc 768
Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser
210 215 220
aga gat gct gca tat gcg aat tat atg gat gtg aca gcg tct aac tat 816
Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr
225 230 235
ggg cat tcc ata agg tcc gct tta aag aat cgt aat ctg ggc gtg tcg 864
Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser
240 245 250 255
aat atc tcc cac tat gca tct gat gtg tct gcg gac aag cta gtg aca 912
Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr
260 265 270
tgg gta gag tcg cat gat acg tat gcc aat gat gat gaa gag tcg aca 960
Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr
275 280 285
tgg atg agc gat gat gat atc cgt tta ggc tgg gcg gtg ata gct tct 1008
Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser
290 295 300
cgt tca ggc agt acg cct ctt ttc ttt tcc aga cct gag gga ggc gga 1056
Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly
305 310 315
aat ggt gtg agg ttc ccg ggg aaa agc caa ata ggc gat cgc ggg agt 1104
Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser
320 325 330 335
gct tta ttt gaa gat cag gct atc act gcg gtc aat aga ttt cac aat 1152
Ala Leu Phe Glu Asp Gln Ala Ile Thr Ala Val Asn Arg Phe His Asn
340 345 350
gtg atg gct gga cag cct gag gaa ctc tcg aac ccg aat gga aac aac 1200
Val Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn
355 360 365
cag ata ttt atg aat cag cgc ggc tca cat ggc gtt gtg ctg gca aat 1248
Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser His Gly Val Val Leu Ala Asn
370 375 380
gca ggt tca tcc tct gtc tct atc aat acg gca aca aaa ttg cct gat 1296
Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp
385 390 395
ggc agg tat gac aat aaa gct gga gcg ggt tca ttt caa gtg aac gat 1344
Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp
400 405 410 415
ggt aaa ctg aca ggc acg atc aat gcc agg tct gta gct gtg ctt tat 1392
Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr
420 425 430
cct gat gat att gca aaa gcg cct cat gtt ttc ctt gag aat tac aaa 1440
Pro Asp Asp Ile Ala Lys Ala Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Lys
435 440 445
aca ggt gta aca cat tct ttc aat gat caa ctg acg att acc ttg cgt 1488
Thr Gly Val Thr His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Ile Thr Leu Arg
450 455 460
gca gat gcg aat aca aca aaa gcc gtt tat caa atc aat aat gga cca 1536
Ala Asp Ala Asn Thr Thr Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Pro
465 470 475
gag acg gcg ttt aag gat gga gat caa ttc aca atc gga aaa gga gat 1584
Glu Thr Ala Phe Lys Asp Gly Asp Gln Phe Thr Ile Gly Lys Gly Asp
480 485 490 495
cca ttt ggc aaa aca tac acc atc atg tta aaa gga acg aac agt gat 1632
Pro Phe Gly Lys Thr Tyr Thr Ile Met Leu Lys Gly Thr Asn Ser Asp
500 505 510
ggt gta acg agg acc gag aaa tac agt ttt gtt aaa aga gat cca gcg 1680
Gly Val Thr Arg Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Val Lys Arg Asp Pro Ala
515 520 525
tcg gcc aaa acc atc ggc tat caa aat ccg aat cat tgg agc cag gta 1728
Ser Ala Lys Thr Ile Gly Tyr Gln Asn Pro Asn His Trp Ser Gln Val
530 535 540
aat gct tat atc tat aaa cat gat ggg agc cga gta att gaa ttg acc 1776
Asn Ala Tyr Ile Tyr Lys His Asp Gly Ser Arg Val Ile Glu Leu Thr
545 550 555
gga tct tgg cct gga aaa cca atg act aaa aat gca gac gga att tac 1824
Gly Ser Trp Pro Gly Lys Pro Met Thr Lys Asn Ala Asp Gly Ile Tyr
560 565 570 575
acg ctg acg ctg cct gcg gac acg gat aca acc aac gca aaa gtg att 1872
Thr Leu Thr Leu Pro Ala Asp Thr Asp Thr Thr Asn Ala Lys Val Ile
580 585 590
ttt aat aat ggc agc gcc caa gtg ccc ggt cag aat cag cct ggc ttt 1920
Phe Asn Asn Gly Ser Ala Gln Val Pro Gly Gln Asn Gln Pro Gly Phe
595 600 605
gat tac gtg cta aat ggt tta tat aat gac tcg ggc tta agc ggt tct 1968
Asp Tyr Val Leu Asn Gly Leu Tyr Asn Asp Ser Gly Leu Ser Gly Ser
610 615 620
ctt ccc cat taa 1980
Leu Pro His
625
<210> 29
<211> 659
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 29
Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly
-30 -25 -20
Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser
-15 -10 -5
Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys
-1 1 5 10 15
Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys
20 25 30
His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr
35 40 45
Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met
50 55 60
Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn
65 70 75
Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala
80 85 90 95
Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr
100 105 110
Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn
115 120 125
Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp
130 135 140
Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn
145 150 155
Thr Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn
160 165 170 175
Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu
180 185 190
Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn
195 200 205
Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser
210 215 220
Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr
225 230 235
Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser
240 245 250 255
Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr
260 265 270
Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr
275 280 285
Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser
290 295 300
Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly
305 310 315
Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser
320 325 330 335
Ala Leu Phe Glu Asp Gln Ala Ile Thr Ala Val Asn Arg Phe His Asn
340 345 350
Val Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn
355 360 365
Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser His Gly Val Val Leu Ala Asn
370 375 380
Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp
385 390 395
Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp
400 405 410 415
Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr
420 425 430
Pro Asp Asp Ile Ala Lys Ala Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Gly Val Thr His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Ile Thr Leu Arg
450 455 460
Ala Asp Ala Asn Thr Thr Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Pro
465 470 475
Glu Thr Ala Phe Lys Asp Gly Asp Gln Phe Thr Ile Gly Lys Gly Asp
480 485 490 495
Pro Phe Gly Lys Thr Tyr Thr Ile Met Leu Lys Gly Thr Asn Ser Asp
500 505 510
Gly Val Thr Arg Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Val Lys Arg Asp Pro Ala
515 520 525
Ser Ala Lys Thr Ile Gly Tyr Gln Asn Pro Asn His Trp Ser Gln Val
530 53 5 540
Asn Ala Tyr Ile Tyr Lys His Asp Gly Ser Arg Val Ile Glu Leu Thr
545 550 555
Gly Ser Trp Pro Gly Lys Pro Met Thr Lys Asn Ala Asp Gly Ile Tyr
560 565 570 575
Thr Leu Thr Leu Pro Ala Asp Thr Asp Thr Thr Asn Ala Lys Val Ile
580 585 590
Phe Asn Asn Gly Ser Ala Gln Val Pro Gly Gln Asn Gln Pro Gly Phe
595 600 605
Asp Tyr Val Leu Asn Gly Leu Tyr Asn Asp Ser Gly Leu Ser Gly Ser
610 615 620
Leu Pro His
625
<210> 30
<211> 626
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 30
Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys His
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Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr Ser
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50 55 60
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Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala Glu
85 90 95
Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr
100 105 110
Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn Trp
115 120 125
Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp Val
130 135 140
Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn Thr
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Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn Asp
165 170 175
Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu Pro
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Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn Thr
195 200 205
Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser Arg
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Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr Gly
225 230 235 240
His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser Asn
245 250 255
Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr Trp
260 265 270
Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr Trp
275 280 285
Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser Arg
290 295 300
Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asn
305 310 315 320
Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser Ala
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Leu Phe Glu Asp Gln Ala Ile Thr Ala Val Asn Arg Phe His Asn Val
340 345 350
Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln
355 360 365
Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser His Gly Val Val Leu Ala Asn Ala
370 375 380
Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Asp Asp Ile Ala Lys Ala Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
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450 455 460
Asp Ala Asn Thr Thr Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Pro Glu
465 470 475 480
Thr Ala Phe Lys Asp Gly Asp Gln Phe Thr Ile Gly Lys Gly Asp Pro
485 490 495
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500 505 510
Val Thr Arg Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Val Lys Arg Asp Pro Ala Ser
515 520 525
Ala Lys Thr Ile Gly Tyr Gln Asn Pro Asn His Trp Ser Gln Val Asn
530 535 540
Ala Tyr Ile Tyr Lys His Asp Gly Ser Arg Val Ile Glu Leu Thr Gly
545 550 555 560
Ser Trp Pro Gly Lys Pro Met Thr Lys Asn Ala Asp Gly Ile Tyr Thr
565 570 575
Leu Thr Leu Pro Ala Asp Thr Asp Thr Thr Asn Ala Lys Val Ile Phe
580 585 590
Asn Asn Gly Ser Ala Gln Val Pro Gly Gln Asn Gln Pro Gly Phe Asp
595 600 605
Tyr Val Leu Asn Gly Leu Tyr Asn Asp Ser Gly Leu Ser Gly Ser Leu
610 615 620
Pro His
625
<210> 31
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sigF
<400> 31
atggatgtgg aggttaagaa aaacggcaaa aacgctcagc tgaaggatca tgaagtaaag 60
gaattaatca aacaaagcca aaatggcgac cagcaggcaa gagacctcct catagaaaaa 120
aacatgcgtc ttgtttggtc tgtcgtacag cggtttttaa acagaggata tgagcctgac 180
gatctcttcc agatcggctg catcgggctg ttaaaatctg ttgacaaatt tgatttaacc 240
tatgatgtgc gtttttcaac gtatgcagtg ccgatgatta tcggagaaat ccaacgattt 300
atccgtgatg acggaaccgt aaaggtatca cggtcattaa aagagcttgg aaacaaaatc 360
cggcgcgcga aggatgagct ttcgaaaaca ctgggcagag tgccgacggt gcaggagatc 420
gctgaccatt tggagattga agctgaggat gttgtactgg cccaagaggc ggtaagggct 480
ccatcttcga ttcacgaaac cgtttatgaa aatgacggag atccgattac cctgcttgat 540
caaatcgctg acaactcaga agaaaaatgg tttgacaaaa ttgcgctgaa agaagcgatc 600
agcgatttgg aggaaaggga aaaactaatc gtctatctca gatattataa agaccagaca 660
cagtccgagg tggctgagcg gctcgggatc tctcaggtgc aggtttccag gcttgaaaag 720
aaaatattaa aacagatcaa ggttcaaatg gatcatacgg atggctag 768
<210> 32
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sigF Δ297bp
<400> 32
atggatgtgg aggttaagaa aaacggcaaa aacgctcagc tgaaggatca tgaagtaaag 60
gaattaatca aacaaagcca aaatggcgac cagcaggcaa gagacctcct catagaaaaa 120
aacatgcgtc ttgtttggtc tgtcgtacag cggtttttaa acagaggata tgagcctgac 180
gatctcttcc agatcggctg catcgggctg gaaaatgacg gagatccgat taccctgctt 240
gatcaaatcg ctgacaactc agaagaaaaa tggtttgaca aaattgcgct gaaagaagcg 300
atcagcgatt tggaggaaag ggaaaaacta atcgtctatc tcagatatta taaagaccag 360
acacagtccg aggtggctga gcggctcggg atctctcagg tgcaggtttc caggcttgaa 420
aagaaaatat taaaacagat caaggttcaa atggatcata cggatggcta g 471
<210> 33
<211> 17422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOE PCR产物，用于在AN2、AQG91的pel基因座中整合编码来自地衣芽孢杆菌的PrsA的基因
<400> 33
gtctcacttc cttactgcgt ctggttgcaa aaacgaagaa gcaaggattc ccctcgcttc 60
tcatttgtcc tatttattat acactttttt aggcacatct ttggcgcttg tttcactaga 120
cttgatgcct ctgaatcttg tccaagtgtc acggtccgca tcatagactt gtccattttt 180
caccgctttg agatttttcc agagcgggtt cgttttccac tcatctacaa tggttttgcc 240
ttcgttggct gagatgaaca aaatatcagg atcgattttg ctcaattgct caaggctgac 300
ctcttgatag gcgttatctg acttcacagc gtgtgtaaag cctagcattt taaagatttc 360
tccgtcatag gatgatgatg tatgaagctg gaaggaatcc gctcttgcaa cgccgagaac 420
gatgttgcgg ttttcatctt tcggaagttc ggcttttaga tcgttgatga cttttatgtg 480
ctcggcaagc ttttcttttc cttcatcttc tttatttaat gctttagcaa tggtcgtaaa 540
gctgtcgatc gtttcgtcat atgtcgcttc acggcttttt aattcaatcg tcggggcgat 600
ttttttcagc tgtttataaa tgtttttatg gcgctcagcg tcagcgatga ttaaatcagg 660
cttcaaggaa ctgatgacct caagattggg ttcgctgcgt gtgcctacag atgtgtaatc 720
aatggagctg ccgacaagct ttttaatcat atcttttttg ttgtcatctg cgatgcccac 780
cggcgtaatg ccgagattgt gaacggcatc caagaatgaa agctcaagca caaccacccg 840
ctaaggtgtg ccgcttactg tcgtttttcc ttcttcgtca tggatcactc tggaatcctt 900
agactcgctt ttgccgcttc cgttgttatt ctggcttgat gaacagccgg atacaatgag 960
gcaggcgagc aataaaacac tcatgatggc aatcaacttg ttagaatagg tgcgcatgtc 1020
attcttcctt ttttcagatt tagtaatgag aatcattatc acatgtaaca ctataatagc 1080
atggcttatc atgtcaatat ttttttagta aagaaagctg cgtttttact gctttctcat 1140
gaaagcatca tcagacacaa ataagtggta tgcagcgtta ccgtgtcttc gagacaaaaa 1200
cgcatgggcg ttggctttag aggtttcgaa catatcagca gtgacataag gaaggagagt 1260
gctgagataa ccggacaatt tcttttctat ttcatctgtt agtgcaaatt caatgtcgcc 1320
gatattcatg ataatcgaga aaacaaagtc gatatcgata tgaaaatgtt cctcggcaaa 1380
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taaatcactc acaatccaag cattgtattg ctgttctggt gaaaagtatt gcattagaca 1500
tacctcctgc tcgtacggat aaaggcagcg tttcatggtc gtgtgctccg tgcagcggct 1560
tctccttaat tttgattttt ctgaaaatag gtcccgttcc tatcacttta ccatggacgg 1620
aaaacaaata gctactacca ttcctcctgt ttttctcttc aatgttctgg aatctgtttc 1680
aggtacagac gatcgggtat gaaagaaata tagaaaacat gaaggaggaa tatcgacatg 1740
aaaccagttg taaaagagta tacaaatgac gaacagctca tgaaagatgt agaggaattg 1800
cagaaaatgg gtgttgcgaa agaggatgta tacgtcttag ctcacgacga tgacagaacg 1860
gaacgcctgg ctgacaacac gaacgccaac acgatcggag ccaaagaaac aggttttaag 1920
cacgcggtgg gaaatatctt caataaaaaa ggagacgagc tccgcaataa aattcacgaa 1980
atcggttttt ctgaagatga agccgctcaa tttgaaaaac gcttagatga aggaaaagtg 2040
cttctctttg tgacagataa cgaaaaagtg aaagcttggg cataaagcaa ggaaaaaacc 2100
aaaaggccaa tgtcggcctt ttggtttttt tgcggtcttt gcggtgggat tttgcagaat 2160
gccgcaatag gatagcggaa cattttcggt tctgaatgtc cctcaatttg ctattatatt 2220
tttgtgataa attggaataa aatctcacaa aatagaaaat gggggtacat agtggatgaa 2280
aaaagtgatg ttagctacgg ctttgttttt aggattgact ccagctggcg cgaacgcagc 2340
tgatttaggc caccagacgt tgggatccaa tgatggctgg ggcgcgtact cgaccggcac 2400
gacaggcgga tcaaaagcac cctcctcaaa tgtgtatacc gtcagcaaca gaaaccagct 2460
tgtctcggca ttagggaaag aaacgaacac aacgccaaaa atcatttata tcaagggaac 2520
gattgacatg aacgtggatg acaatctgaa gccgcttggc ctaaatgact ataaagatcc 2580
ggagtatgat ttggacaaat atttgaaagc ctatgatcct agcacatggg gcaaaaaaga 2640
gccgtcggga acacaagaag aagcgagagc acgctctcag aaaaaccaaa aagcacgggt 2700
catggtggat atccctgcaa acacgacgat cgtcggttca gggactaacg ctaaagtcgt 2760
gggaggaaac ttccaaatca agagtgataa cgtcattatt cgcaacattg aattccagga 2820
tgcctatgac tattttccgc aatggttgta aaacgacggc cagtgaattc tgatcaaatg 2880
gttcagtgag agcgaagcga acacttgatt ttttaatttt ctatctttta taggtcatta 2940
gagtatactt atttgtccta taaactattt agcagcataa tagatttatt gaataggtca 3000
tttaagttga gcgtattaga ggaggaaaat cttggagaaa tatttgaaga acccgaacgc 3060
gtataataaa gaataataat aaatctgtag acaaattgtg aaaggatgta cttaaacgct 3120
aacggtcagc tttattgaac agtaatttaa gtatatgtcc aatctagggt aagtaaattg 3180
agtatcaata taaactttat atgaacataa tcaacgaggt gaaatcatga acgagaaaaa 3240
tataaaacac agtcaaaact ttattacttc aaaacataat atagataaaa taatgacaaa 3300
tataagatta aatgaacatg ataatatctt tgaaatcggc tcaggaaaag gccattttac 3360
ccttgaatta gtaaagaggt gtaatttcgt aactgccatt gaaatagacc ataaattatg 3420
caaaactaca gaaaataaac ttgttgatca cgataatttc caagttttaa acaaggatat 3480
attgcagttt aaatttccta aaaaccaatc ctataaaata tatggtaata taccttataa 3540
cataagtacg gatataatac gcaaaattgt ttttgatagt atagctaatg agatttattt 3600
aatcgtggaa tacgggtttg ctaaaagatt attaaataca aaacgctcat tggcattact 3660
tttaatggca gaagttgata tttctatatt aagtatggtt ccaagagaat attttcatcc 3720
taaacctaaa gtgaatagct cacttatcag attaagtaga aaaaaatcaa gaatatcaca 3780
caaagataaa caaaagtata attatttcgt tatgaaatgg gttaacaaag aatacaagaa 3840
aatatttaca aaaaatcaat ttaacaattc cttaaaacat gcaggaattg acgatttaaa 3900
caatattagc tttgaacaat tcttatctct tttcaatagc tataaattat ttaataagta 3960
ggctaatttt attgcaataa caggtgctta cttttaaaac tactgattta ttgataaata 4020
ttgaacaatt tttgggaaga ataaagcgtc ctcttgtgaa attagagaac gctttattac 4080
tttaatttag tgaaacaatt tgtaactatt gaaaatagaa agaaattgtt ccttcgatag 4140
tttattaata ttagtggagc tcagtgagag cgaagcgaac acttgatttt ttaattttct 4200
atcttttata ggtcattaga gtatacttat ttgtcctata aactatttag cagcataata 4260
gatttattga ataggtcatt taagttgagc atattagggg aggaaaatct tggagaaata 4320
tttgaagaac ccgagatcta gatcaggtac ctcaggatga ttgatcaccc gcggtgtaaa 4380
aaataggaat aaaggggggt tgacattatt ttactgatat gtataatata atttgtataa 4440
gaaaatgaga gggagaggaa acatgaagaa gattgcaatt gcggcgatta cagcgacaag 4500
cgtgctggct ctcagcgcat gcagcggggg agattctgag gttgttgcgg aaacaaaagc 4560
tggaaatatt acaaaagaag acctttatca aacattaaaa gacaatgccg gagcggacgc 4620
actgaacatg cttgttcagc aaaaagtact cgatgataaa tacgatgtct ccgacaaaga 4680
aatcgacaaa aagctgaacg agtacaaaaa atcaatgggt gaccagctca accagctcat 4740
tgaccaaaaa ggcgaagact tcgtcaaaga acagatcaaa tacgaacttc tgatgcaaaa 4800
agccgcaaag gataacataa aagtaaccga tgatgacgta aaagaatatt atgacggcct 4860
gaaaggcaaa atccacttaa gccacattct tgtgaaagaa aagaaaacgg ctgaagaagt 4920
tgagaaaaag ctgaaaaaag gcgaaaaatt cgaagacctt gcaaaagagt attcaactga 4980
cggtacagcc gaaaaaggcg gcgacctcgg ctgggtcggc aaagacgata acatggacaa 5040
ggatttcgtc aaagcggcat ttgctttgaa aaccggcgaa atcagcggac ctgtgaaatc 5100
ccaattcggc tatcacatca ttaaaaaaga cgaagaacgc ggcaaatatg aagacatgaa 5160
aaaagagctt aaaaaagaag tccaagaaca aaagcaaaat gatcaaactg aactgcaatc 5220
cgtcattgac aaacttgtca aagatgctga tttaaaagta aaagacaaag agttgaaaaa 5280
acaagtcgac cagcgtcaag ctcagacaag cagcagcagc tgataaaaaa agctgtgcgg 5340
ctcattgagc cgcacagctt tttttatgcg atggaatggt tttgattttc ttcttcatgc 5400
tgctgagaac tgcgcggttc gcgtccggac agcacatcac cgaaatatta tggaagaaaa 5460
tatcagcacc atgacggcca aacggatgct tccaacggtg ctaactatat cgcgatgtcc 5520
tacaactatt atcacgatca tgataaaagc cccattttcg gatcaagtga cagcaaaacc 5580
tccgatgacg gcaaattaaa aattacgctg catcataacc gctataaaaa tattgtccag 5640
cgcgcgccga gagtccgctt cgggcaagtg cacgtataca acaactatta tgaaggaagc 5700
acaagctctt caagttatcc ttttagctat gcatggggaa tcggaaagtc atctaaaatc 5760
tatgcccaaa acaatgtcat tgacgtaccg ggactgtcag ctgctaaaac gatcagcgta 5820
ttcagcgggg gaacggcttt atatgactcc ggcacgttgc tgaacggcac acagatcaac 5880
gcatcggctg caaacgggct gagctcttct gtcggctgga cgccgtctct gcatggatcg 5940
attgatgctt ctgctaatgt gaaatcaaat gttataaatc aagcgggtgc gggtaaatta 6000
aattaagaaa gtgaaaaaca caaagggtgc taacctttgt gttttttaat taattaaaat 6060
gtttattaac ttagttaagg agtagaatgg aaaaggggat cggaaaacaa gtatatagga 6120
ggagacctat ttatggcttc agaaaaagac gcaggaaaac agtcagcagt aaagcttgtt 6180
ccattgctta ttactgtcgc tgtgggacta atcatctggt ttattcccgc tccgtccgga 6240
cttgaaccta aagcttggca tttgtttgcg atttttgtcg caacaattat cggctttatc 6300
tccaagccct tgccaatggg tgcaattgca atttttgcat tggcggttac tgcactaact 6360
ggaacactat caattgagga tacattaagc ggattcggga ataagaccat ttggcttatc 6420
gttatcgcat tctttatttc ccggggattt atcaaaaccg gtctcggtgc gagaatttcg 6480
tatgtattcg ttcagaaatt cggaaaaaaa acccttggac tttcttattc actgctattc 6540
agtgatttaa tactttcacc tgctattcca agtaatacgg cgcgtgcagg aggcattata 6600
tttcctatta tcagatcatt atccgaaaca ttcggatcaa gcccggcaaa tggaacagag 6660
agaaaaatcg gtgcattctt attaaaaacc ggttttcagg ggaatctgat cacatctgct 6720
atgttcctga cagcgatggc ggcgaacccg ctgattgcca agctggccca tgatgtcgca 6780
ggggtggact taacatggac aagctgggca attgccgcga ttgtaccggg acttgtaagc 6840
ttaatcatca cgccgcttgt gatttacaaa ctgtatccgc cggaaatcaa agaaacaccg 6900
gatgcggcga aaatcgcaac agaaaaactg aaagaaatgg gaccgttcaa aaaatcggag 6960
ctttccatgg ttatcgtgtt tcttttggtg cttgtgctgt ggatttttgg cggcagcttc 7020
aacatcgacg ctaccacaac cgcattgatc ggtttggccg ttctcttatt atcacaagtt 7080
ctgacttggg atgatatcaa gaaagaacag ggcgcttggg atacgctcac ttggtttgcg 7140
gcgcttgtca tgctcgccaa cttcttgaat gaattaggca tggtgtcttg gttcagtaat 7200
gccatgaaat catccgtatc agggttctct tggattgtgg cattcatcat tttaattgtt 7260
gtgtattatt actctcacta tttctttgca agtgcgacag cccacatcag tgcgatgtat 7320
tcagcatttt tggctgtcgt cgtggcagcg ggcgcaccgc cgcttttagc agcgctgagc 7380
ctcgcgttca tcagcaacct gttcgggtca acgactcact acggttctgg agcggctccg 7440
gtcttcttcg gagcaggcta catcccgcaa ggcaaatggt ggtccatcgg atttatcctg 7500
tcgattgttc atatcatcgt atggcttgtg atcggcggat tatggtggaa agtactagga 7560
atatggtaga aagaaaaagg cagacgcggt ctgccttttt ttattttcac tccttcgtaa 7620
gaaaatggat tttgaaaaat gagaaaattc cctgtgaaaa atggtatgat ctaggtagaa 7680
aggacggctg gtgctgtggt gaaaaagcgg ttccattttt ccctgcaaac aaaaataatg 7740
gggctgattg cggctctgct ggtctttgtc attggtgtgc tgaccattac gttagccgtt 7800
cagcatacac agggagaacg gagacaggca gagcagctgg cggttcaaac ggcgagaacc 7860
atttcctata tgccgccggt taaagagctc attgagagaa aagacggaca tgcggctcag 7920
acgcaagagg tcattgaaca aatgaaagaa cagactggtg cgtttgccat ttatgttttg 7980
aacgaaaaag gagacattcg cagcgcctct ggaaaaagcg gattaaagaa actggagcgc 8040
agcagagaaa ttttgtttgg cggttcgcat gtttctgaaa caaaagcgga tggacgaaga 8100
gtgatcagag ggagcgcgcc gattataaaa gaacagaagg gatacagcca agtgatcggc 8160
agcgtgtctg ttgattttct gcaaacggag acagagcaaa gcatcaaaaa gcatttgaga 8220
aatttgagtg tgattgctgt gcttgtactg ctgctcggat ttattggcgc cgccgtgctg 8280
gcgaaaagca tcagaaagga tacgctcggg cttgaaccgc atgagatcgc ggctctatat 8340
cgtgagagga acgcaatgct tttcgcgatt cgagaaggga ttattgccac caatcgtgaa 8400
ggcgtcgtca ccatgatgaa cgtatcggcg gccgagatgc tgaagctgcc cgagcctgtg 8460
atccatcttc ctatagatga cgtcatgccg ggagcagggc tgatgtctgt gcttgaaaaa 8520
ggagaaatgc tgccgaacca ggaagtaagc gtcaacgatc aagtgtttat tatcaatacg 8580
aaagtgatga atcaaggcgg gcaggcgtat gggattgtcg tcagcttcag ggagaaaaca 8640
gagctgaaga agctgatcga cacattgaca gaggttcgca aatattcaga ggatctcagg 8700
gcgcagactc agtctcactt ccttactgcg tctggttgca aaaacgaaga agcaaggatt 8760
cccctcgctt ctcatttgtc ctatttatta tacacttttt taggcacatc tttggcgctt 8820
gtttcactag acttgatgcc tctgaatctt gtccaagtgt cacggtccgc atcatagact 8880
tgtccatttt tcaccgcttt gagatttttc cagagcgggt tcgttttcca ctcatctaca 8940
atggttttgc cttcgttggc tgagatgaac aaaatatcag gatcgatttt gctcaattgc 9000
tcaaggctga cctcttgata ggcgttatct gacttcacag cgtgtgtaaa gcctagcatt 9060
ttaaagattt ctccgtcata ggatgatgat gtatgaagct ggaaggaatc cgctcttgca 9120
acgccgagaa cgatgttgcg gttttcatct ttcggaagtt cggcttttag atcgttgatg 9180
acttttatgt gctcggcaag cttttctttt ccttcatctt ctttatttaa tgctttagca 9240
atggtcgtaa agctgtcgat cgtttcgtca tatgtcgctt cacggctttt taattcaatc 9300
gtcggggcga tttttttcag ctgtttataa atgtttttat ggcgctcagc gtcagcgatg 9360
attaaatcag gcttcaagga actgatgacc tcaagattgg gttcgctgcg tgtgcctaca 9420
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acaaccaccc gctaaggtgt gccgcttact gtcgtttttc cttcttcgtc atggatcact 9600
ctggaatcct tagactcgct tttgccgctt ccgttgttat tctggcttga tgaacagccg 9660
gatacaatga ggcaggcgag caataaaaca ctcatgatgg caatcaactt gttagaatag 9720
gtgcgcatgt cattcttcct tttttcagat ttagtaatga gaatcattat cacatgtaac 9780
actataatag catggcttat catgtcaata tttttttagt aaagaaagct gcgtttttac 9840
tgctttctca tgaaagcatc atcagacaca aataagtggt atgcagcgtt accgtgtctt 9900
cgagacaaaa acgcatgggc gttggcttta gaggtttcga acatatcagc agtgacataa 9960
ggaaggagag tgctgagata accggacaat ttcttttcta tttcatctgt tagtgcaaat 10020
tcaatgtcgc cgatattcat gataatcgag aaaacaaagt cgatatcgat atgaaaatgt 10080
tcctcggcaa aaaccgcaag ctcgtgaatt cctggtgaac atccggcacg cttatggaaa 10140
atctgtttga ctaaatcact cacaatccaa gcattgtatt gctgttctgg tgaaaagtat 10200
tgcattagac atacctcctg ctcgtacgga taaaggcagc gtttcatggt cgtgtgctcc 10260
gtgcagcggc ttctccttaa ttttgatttt tctgaaaata ggtcccgttc ctatcacttt 10320
accatggacg gaaaacaaat agctactacc attcctcctg tttttctctt caatgttctg 10380
gaatctgttt caggtacaga cgatcgggta tgaaagaaat atagaaaaca tgaaggagga 10440
atatcgacat gaaaccagtt gtaaaagagt atacaaatga cgaacagctc atgaaagatg 10500
tagaggaatt gcagaaaatg ggtgttgcga aagaggatgt atacgtctta gctcacgacg 10560
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caggttttaa gcacgcggtg ggaaatatct tcaataaaaa aggagacgag ctccgcaata 10680
aaattcacga aatcggtttt tctgaagatg aagccgctca atttgaaaaa cgcttagatg 10740
aaggaaaagt gcttctcttt gtgacagata acgaaaaagt gaaagcttgg gcataaagca 10800
aggaaaaaac caaaaggcca atgtcggcct tttggttttt ttgcggtctt tgcggtggga 10860
ttttgcagaa tgccgcaata ggatagcgga acattttcgg ttctgaatgt ccctcaattt 10920
gctattatat ttttgtgata aattggaata aaatctcaca aaatagaaaa tgggggtaca 10980
tagtggatga aaaaagtgat gttagctacg gctttgtttt taggattgac tccagctggc 11040
gcgaacgcag ctgatttagg ccaccagacg ttgggatcca atgatggctg gggcgcgtac 11100
tcgaccggca cgacaggcgg atcaaaagca ccctcctcaa atgtgtatac cgtcagcaac 11160
agaaaccagc ttgtctcggc attagggaaa gaaacgaaca caacgccaaa aatcatttat 11220
atcaagggaa cgattgacat gaacgtggat gacaatctga agccgcttgg cctaaatgac 11280
tataaagatc cggagtatga tttggacaaa tatttgaaag cctatgatcc tagcacatgg 11340
ggcaaaaaag agccgtcggg aacacaagaa gaagcgagag cacgctctca gaaaaaccaa 11400
aaagcacggg tcatggtgga tatccctgca aacacgacga tcgtcggttc agggactaac 11460
gctaaagtcg tgggaggaaa cttccaaatc aagagtgata acgtcattat tcgcaacatt 11520
gaattccagg atgcctatga ctattttccg caatggttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 11580
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gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttttcaatag ctataaatta 12660
tttaataagt aggctaattt tattgcaata acaggtgctt acttttaaaa ctactgattt 12720
attgataaat attgaacaat ttttgggaag aataaagcgt cctcttgtga aattagagaa 12780
cgctttatta ctttaattta gtgaaacaat ttgtaactat tgaaaataga aagaaattgt 12840
tccttcgata gtttattaat attagtggag ctcagtgaga gcgaagcgaa cacttgattt 12900
tttaattttc tatcttttat aggtcattag agtatactta tttgtcctat aaactattta 12960
gcagcataat agatttattg aataggtcat ttaagttgag catattaggg gaggaaaatc 13020
ttggagaaat atttgaagaa cccgagatct agatcaggta cctcaggatg attgatcacc 13080
cgcggtgtaa aaaataggaa taaagggggg ttgacattat tttactgata tgtataatat 13140
aatttgtata agaaaatgag agggagagga aacatgaaga agattgcaat tgcggcgatt 13200
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gaaacaaaag ctggaaatat tacaaaagaa gacctttatc aaacattaaa agacaatgcc 13320
ggagcggacg cactgaacat gcttgttcag caaaaagtac tcgatgataa atacgatgtc 13380
tccgacaaag aaatcgacaa aaagctgaac gagtacaaaa aatcaatggg tgaccagctc 13440
aaccagctca ttgaccaaaa aggcgaagac ttcgtcaaag aacagatcaa atacgaactt 13500
ctgatgcaaa aagccgcaaa ggataacata aaagtaaccg atgatgacgt aaaagaatat 13560
tatgacggcc tgaaaggcaa aatccactta agccacattc ttgtgaaaga aaagaaaacg 13620
gctgaagaag ttgagaaaaa gctgaaaaaa ggcgaaaaat tcgaagacct tgcaaaagag 13680
tattcaactg acggtacagc cgaaaaaggc ggcgacctcg gctgggtcgg caaagacgat 13740
aacatggaca aggatttcgt caaagcggca tttgctttga aaaccggcga aatcagcgga 13800
cctgtgaaat cccaattcgg ctatcacatc attaaaaaag acgaagaacg cggcaaatat 13860
gaagacatga aaaaagagct taaaaaagaa gtccaagaac aaaagcaaaa tgatcaaact 13920
gaactgcaat ccgtcattga caaacttgtc aaagatgctg atttaaaagt aaaagacaaa 13980
gagttgaaaa aacaagtcga ccagcgtcaa gctcagacaa gcagcagcag ctgataaaaa 14040
aagctgtgcg gctcattgag ccgcacagct ttttttatgc gatggaatgg ttttgatttt 14100
cttcttcatg ctgctgagaa ctgcgcggtt cgcgtccgga cagcacatca ccgaaatatt 14160
atggaagaaa atatcagcac catgacggcc aaacggatgc ttccaacggt gctaactata 14220
tcgcgatgtc ctacaactat tatcacgatc atgataaaag ccccattttc ggatcaagtg 14280
acagcaaaac ctccgatgac ggcaaattaa aaattacgct gcatcataac cgctataaaa 14340
atattgtcca gcgcgcgccg agagtccgct tcgggcaagt gcacgtatac aacaactatt 14400
atgaaggaag cacaagctct tcaagttatc cttttagcta tgcatgggga atcggaaagt 14460
catctaaaat ctatgcccaa aacaatgtca ttgacgtacc gggactgtca gctgctaaaa 14520
cgatcagcgt attcagcggg ggaacggctt tatatgactc cggcacgttg ctgaacggca 14580
cacagatcaa cgcatcggct gcaaacgggc tgagctcttc tgtcggctgg acgccgtctc 14640
tgcatggatc gattgatgct tctgctaatg tgaaatcaaa tgttataaat caagcgggtg 14700
cgggtaaatt aaattaagaa agtgaaaaac acaaagggtg ctaacctttg tgttttttaa 14760
ttaattaaaa tgtttattaa cttagttaag gagtagaatg gaaaagggga tcggaaaaca 14820
agtatatagg aggagaccta tttatggctt cagaaaaaga cgcaggaaaa cagtcagcag 14880
taaagcttgt tccattgctt attactgtcg ctgtgggact aatcatctgg tttattcccg 14940
ctccgtccgg acttgaacct aaagcttggc atttgtttgc gatttttgtc gcaacaatta 15000
tcggctttat ctccaagccc ttgccaatgg gtgcaattgc aatttttgca ttggcggtta 15060
ctgcactaac tggaacacta tcaattgagg atacattaag cggattcggg aataagacca 15120
tttggcttat cgttatcgca ttctttattt cccggggatt tatcaaaacc ggtctcggtg 15180
cgagaatttc gtatgtattc gttcagaaat tcggaaaaaa aacccttgga ctttcttatt 15240
cactgctatt cagtgattta atactttcac ctgctattcc aagtaatacg gcgcgtgcag 15300
gaggcattat atttcctatt atcagatcat tatccgaaac attcggatca agcccggcaa 15360
atggaacaga gagaaaaatc ggtgcattct tattaaaaac cggttttcag gggaatctga 15420
tcacatctgc tatgttcctg acagcgatgg cggcgaaccc gctgattgcc aagctggccc 15480
atgatgtcgc aggggtggac ttaacatgga caagctgggc aattgccgcg attgtaccgg 15540
gacttgtaag cttaatcatc acgccgcttg tgatttacaa actgtatccg ccggaaatca 15600
aagaaacacc ggatgcggcg aaaatcgcaa cagaaaaact gaaagaaatg ggaccgttca 15660
aaaaatcgga gctttccatg gttatcgtgt ttcttttggt gcttgtgctg tggatttttg 15720
gcggcagctt caacatcgac gctaccacaa ccgcattgat cggtttggcc gttctcttat 15780
tatcacaagt tctgacttgg gatgatatca agaaagaaca gggcgcttgg gatacgctca 15840
cttggtttgc ggcgcttgtc atgctcgcca acttcttgaa tgaattaggc atggtgtctt 15900
ggttcagtaa tgccatgaaa tcatccgtat cagggttctc ttggattgtg gcattcatca 15960
ttttaattgt tgtgtattat tactctcact atttctttgc aagtgcgaca gcccacatca 16020
gtgcgatgta ttcagcattt ttggctgtcg tcgtggcagc gggcgcaccg ccgcttttag 16080
cagcgctgag cctcgcgttc atcagcaacc tgttcgggtc aacgactcac tacggttctg 16140
gagcggctcc ggtcttcttc ggagcaggct acatcccgca aggcaaatgg tggtccatcg 16200
gatttatcct gtcgattgtt catatcatcg tatggcttgt gatcggcgga ttatggtgga 16260
aagtactagg aatatggtag aaagaaaaag gcagacgcgg tctgcctttt tttattttca 16320
ctccttcgta agaaaatgga ttttgaaaaa tgagaaaatt ccctgtgaaa aatggtatga 16380
tctaggtaga aaggacggct ggtgctgtgg tgaaaaagcg gttccatttt tccctgcaaa 16440
caaaaataat ggggctgatt gcggctctgc tggtctttgt cattggtgtg ctgaccatta 16500
cgttagccgt tcagcataca cagggagaac ggagacaggc agagcagctg gcggttcaaa 16560
cggcgagaac catttcctat atgccgccgg ttaaagagct cattgagaga aaagacggac 16620
atgcggctca gacgcaagag gtcattgaac aaatgaaaga acagactggt gcgtttgcca 16680
tttatgtttt gaacgaaaaa ggagacattc gcagcgcctc tggaaaaagc ggattaaaga 16740
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aagtgatcgg cagcgtgtct gttgattttc tgcaaacgga gacagagcaa agcatcaaaa 16920
agcatttgag aaatttgagt gtgattgctg tgcttgtact gctgctcgga tttattggcg 16980
ccgccgtgct ggcgaaaagc atcagaaagg atacgctcgg gcttgaaccg catgagatcg 17040
cggctctata tcgtgagagg aacgcaatgc ttttcgcgat tcgagaaggg attattgcca 17100
ccaatcgtga aggcgtcgtc accatgatga acgtatcggc ggccgagatg ctgaagctgc 17160
ccgagcctgt gatccatctt cctatagatg acgtcatgcc gggagcaggg ctgatgtctg 17220
tgcttgaaaa aggagaaatg ctgccgaacc aggaagtaag cgtcaacgat caagtgttta 17280
ttatcaatac gaaagtgatg aatcaaggcg ggcaggcgta tgggattgtc gtcagcttca 17340
gggagaaaac agagctgaag aagctgatcg acacattgac agaggttcgc aaatattcag 17400
aggatctcag ggcgcagact ca 17422
<210> 34
<211> 9518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOE PCR产物，用于在AN2、AQG91的amyE基因座中整合编码来自地衣芽孢杆菌的AmyL的基因
<400> 34
gcattaacgt gcccaatgcc attgtcatat gtgaatcgtg tccgcaggaa tggttggcgc 60
gaaatgtgcc gttaacctcc tgccacagcg cgtcaatatc agcgcgtacc gctacaacag 120
gtgagcctga gccgatttcg ccgacaaccc cggtgcagtc tgaaaacgtg cgcgtccggc 180
accctaaatc ctcaagcttt tgtttcaaaa atgaagttgt ctcatattcc ttccagctga 240
cttcagggtt cgcgtgcaga tgctcgaaga tgtccataat ggtttgtttc atttcttctg 300
aaagcttttg catggtaaga aatacctcct tctatcagaa tgaattttta ccttctttac 360
tttatttata ttgaaacagg aagataggct gtatataata tagcacatat tgctactatt 420
cagaataatt aatattttca aacagagggg atggatcgaa atatgagtat gccagcagcc 480
gaaacacagc ctaagaaaaa acgtatgaca tttaaaatgc ctgacgccta tgtcctctta 540
tttatgattg ctttcatttg cgcaatcgct tcatatattg tgccggcagg tgaatttgac 600
cgcgtgacaa agggggatgt cacgaccgct gttccgggaa gctatcattc aattgaacag 660
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ccgtcaccgc tcggtttatc acaatcaatc gcggagctcc ctcttttctc aggaatcggc 1080
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ggaaagcttc tcgatactgt cgtcaatgct ttggcttcac ttttggatgg attcagcccg 1560
attgctgggg caatcggcat gtatatcgcc agtgcgctgc ttcattttct catctcttca 1620
ggttctggcg aagccgttgt atttattcca atcctggcgc cgctcgctga tttgatggga 1680
atcacgagac aggttgcggt tgaagcggtt atgcttggag aaggggtcgt caactgtgtg 1740
aacccgacat ccggcgttct catggcggtg cttgccgcca gcggtattcc gtatgtcaag 1800
tggctgcggt ttatggtgcc gcttgctctg atttggttct tgatcgggct tgtctttatc 1860
gtgatcggag tcatgatcaa ttgggggccg ttttaacgat tgctgcccgc cggcttgtac 1920
ggcgggcttt tgagttattc attgcagaag cgcaggctgt tattgtaaca tgtaagccat 1980
aagccattcg taaaagtgcg ggaggaaggt catgaataat ctgcgtaata gactttcagg 2040
cgtgaatggg aaaaataaga gagtaaaaga aaaagaacaa aaaatctggt cggagaatgg 2100
gatgatagcg ggagcagttg ctctgcctga tgtgatcatc cgcggcatta tgtttgaatt 2160
tccgtttaaa gaatggtctg caagccttgt gtttttgttc atcattatct tatattactg 2220
catcagggct gcggcatccg gaatgctcat gccgagaata gacaccaaag aagaactgca 2280
aaaacgggtg aagcagcagc gaatagaatc aattgcttgc gcctttgcgg tagtggtgct 2340
tacgatgtac gacaggggga ttccccatac attcttcgct tggctgaaaa tgattcttct 2400
ttttatcgtc tgcggcggcg ttctgtttct gcttcggtat gtgattgtga agctggctta 2460
cagaagagcg gtaaaagaag aaataaaaaa gaaatcatct tttttgtttg gaaagcgagg 2520
gaagcgttca cagtttcggg cagctttttt tataggaaca ttgatttgta ttcactctgc 2580
caagttgttt tgatagagtg attgtgataa ttttaaatgt aagcgttaac aaaattctcc 2640
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ccgaagtaag tcttcaaaaa atcaaataag gagtgtcaag aatgtttgca aaacgattca 2760
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gtaatcaaat aggctgtagc tatttaatag ctacagccta tttgcaactt tctaagtttt 2880
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tttactgata tgtataatat aatttgtata agaaaatgag agggagagga aacatgaaac 3000
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ctcattctgc agcagcggcg gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt 3120
acatgcccaa tgacggccaa cattggaggc gtttgcaaaa cgactcggca tatttggctg 3180
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acattaacgt ttacggggat gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag 3420
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taattaaagc ctggacacat tttcattttc cggggcgcgg cagcacatac agcgatttta 3540
aatggcattg gtaccatttt gacggaaccg attgggacga gtcccgaaag ctgaaccgca 3600
tctataagtt tcaaggaaag gcttgggatt gggaagtttc caatgaaaac ggcaactatg 3660
attatttgat gtatgccgac atcgattatg accatcctga tgtcgcagca gaaattaaga 3720
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aacacattaa attttctttt ttgcgggatt gggttaatca tgtcagggaa aaaacgggga 3840
aggaaatgtt tacggtagct gaatattggc agaatgactt gggcgcgctg gaaaactatt 3900
tgaacaaaac aaattttaat cattcagtgt ttgacgtgcc gcttcattat cagttccatg 3960
ctgcatcgac acagggaggc ggctatgata tgaggaaatt gctgaacggt acggtcgttt 4020
ccaagcatcc gttgaaatcg gttacatttg tcgataacca tgatacacag ccggggcaat 4080
cgcttgagtc gactgtccaa acatggttta agccgcttgc ttacgctttt attctcacaa 4140
gggaatctgg ataccctcag gttttctacg gggatatgta cgggacgaaa ggagactccc 4200
agcgcgaaat tcctgccttg aaacacaaaa ttgaaccgat cttaaaagcg agaaaacagt 4260
atgcgtacgg agcacagcat gattatttcg accaccatga cattgtcggc tggacaaggg 4320
aaggcgacag ctcggttgca aattcaggtt tggcggcatt aataacagac ggacccggtg 4380
gggcaaagcg aatgtatgtc ggccggcaaa acgccggtga gacatggcat gacattaccg 4440
gaaaccgttc ggagccggtt gtcatcaatt cggaaggctg gggagagttt cacgtaaacg 4500
gcgggtcggt ttcaatttat gttcaaagat agtaaggtaa taaaaaaaca cctccaagct 4560
gagtgcgggt atcagcttgg aggtgcgttt attttttcag ccgtatgaca aggtcggcat 4620
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tgctaaatag tttataggac aaataagtat actctaatga cctataaaag atagaaaatt 4800
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tattataaaa gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat 4980
cctgcatgat aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt 5040
gaattacctt tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta 5100
ttattgatat ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa 5160
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gagaatgttt tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa 5340
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gtcactaaga aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat 5460
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ttaaatatct cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat 5580
gcctcctaaa tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta 5640
gaatcaatcc ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata agtatatatt ttaaaaatat 5700
ccacggttct tcaaatattt ccccaagatt ttcctcctct aatatgctca acttaatgac 5760
ctattcaata aatctattat gctgctaaat agtttatagg acaaataagt atactctaat 5820
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cgtctaacta tgggcattcc ataaggtccg ctttaaagaa tcgtaatctg ggcgtgtcga 6300
atatctccca ctatgcatct gatgtgtctg cggacaagct agtgacatgg gtagagtcgc 6360
atgatacgta tgccaatgat gatgaagagt cgacatggat gagcgatgat gatatccgtt 6420
taggctgggc ggtgatagct tctcgttcag gcagtacgcc tcttttcttt tccagacctg 6480
agggaggcgg aaatggtgtg aggttcccgg ggaaaagcca aataggcgat cgcgggagtg 6540
ctttatttga agatcaggct atcactgcgg tcaatagatt tcacaatgtg atggctggac 6600
agcctgagga actctcgaac ccgaatggaa acaaccagat atttatgaat cagcgcggct 6660
cacatggcgt tgtgctggca aatgcaggtt catcctctgt ctctatcaat acggcaacaa 6720
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cattttaaaa cctcattttg cagaacaaaa agtcaactaa ccgcaacttt agagtaaagg 8580
gctgattgtc aatgtgggag cagttgtatg atccgtttgg aaacgagtat gtgagcgcac 8640
ttgtggcgct cactccgatt ctcttttttc ttttggcttt aactgttttg aaaatgaaag 8700
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ttgcgattag tgcggcgctg ctcgtcgaac ttggttttaa accgttaaaa gcggcggcgc 9060
tctgcttgat tgcaaacgct gcctccggag cctttggggc gattgggatt cctgtcatca 9120
caggggcgca gattggtgat ttgtctgctc ttgagctgtc tcggacatta atgtggacac 9180
tgccgatgat ctcattttta ataccattcc tgcttgtatt cttattagac cgaatgaaag 9240
gaatcaaaca gacatggccc gctcttctgg ttgtgagcgg tgggtataca gcggttcaga 9300
cactgacaat ggcggtgctc gggccggaat tagcaaacat tttggcggcc ttattcagca 9360
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gggccggcga tgctggtgag aaaaaggcat accgtgccgc tgacattgcg agagcgtggt 9480
ctcctttcta cattttaact gcggcgatca ccatctgg 9518
<210> 35
<211> 10158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOE PCR产物，用于在枯草芽孢杆菌的xyl基因座中整合PhtrA-lacZ盒。
<400> 35
tcttggggga cttgtcgttg cattttttgt tcccttactg gctgcttatt taagcgatac 60
ttccggcaac gagtctcttg gctggcaact aaccatgggt attttgggaa tgataggcgg 120
gtgcctttta atcttttgtt ttaaaagcac aaaagagcgg gtcactcttc aaaaatccga 180
agagaaaatt aaatttacgg atatatttga gcagtttcgt gttaatcgtc cacttgttgt 240
attaagtatt ttctttatta ttatttttgg agtgaattcc atcagtaatt cggttggcat 300
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tggtatggcc ttaggaggag ttgttccggg tctggttctt gataagtttg gatatgtagc 720
aaatcaggca caaaccccgg cggccttaat ggggatttta attacaacaa ccattattcc 780
cgtgttcttg cttgttctag ctttaattga tattaatttc tataacttag atgagaaaaa 840
atataaaaac atggttcgag aattagagaa tagagacaaa gtttatttgg atcatattga 900
tgatttcaag gcttaaaaaa gaaaataaac tgaggaggag tcccaaatga agattaccaa 960
tcccgtactt aaaggattca atcccgatcc aagtatttgt agagcaggag aggattatta 1020
tatcgctgta tctacatttg agtggtttcc gggagtccag atacaccact caaaagattt 1080
agtaaattgg cacttagttg cacatccatt acagagagtt tcacaattag acatgaaagg 1140
aaacccaaat tcaggtggag tttgggcacc atgtttaagc tatagtgatg ggaagttttg 1200
gctgatctat acggatgtta aggtagtaga tggcgcatgg aaagattgtc acaattattt 1260
agttacttgt gaaacgatta atggtgattg gagtgagccg attaaattaa atagctcggg 1320
gtttgatgct tctttgttcc atgatacgga tggaaaaaag tatttattaa atatgttatg 1380
ggatcaccgt attgatcggc actcatttgg aggaattgtt atacaggaat attctgataa 1440
agagcaaaaa ttaatcggta aaccaaaagt tatatttgaa ggaactgata gaaaactgac 1500
agaagctccg catctttatc atatcgggaa ctattattat ttattaactg cagaaggagg 1560
aacacggtac gaacatgctg ctacaattgc tcgttctgca aatattgagg ggccatatga 1620
agttcatccc gataatccaa ttttaacgtc atggcatgac ccaggaaatc cattgcaaaa 1680
atgtggtcat gcatccattg ttcaaacaca tacagatgag tggtatttag ctcatttaac 1740
gggacgtcct attcatcctg acgatgattc aatttttcag cagagaggat actgtccttt 1800
gggcagagaa acagctattc aaaaacttta ctggaaagat gaatggccct atgtagtagg 1860
tggaaaagaa ggaagcttgg aggtagatgc accttctata cccgaaacaa tatttgaagc 1920
aacgtacccg gaagttgatg aatttgagga ttcaacatta aatataaatt ttcaaacttt 1980
aaggattcca ttcacgaatg aattaggttc attgactcaa gcgccaaatc atttacgatt 2040
attcggtcat gaatcattga cctcgacatt tactcaggca tttgtagcca gacgctggca 2100
aagtctccat tttgaagccg aaactgctgt tgagttttat ccggaaaatt ttcaacaagc 2160
cgctgggttg gtgaattact acaatacaga gaactggacg gctcttcaag tcacgcatga 2220
tgaagaactt gggcgcattc ttgaattaac aatatgtgac aacttttctt tttcacagcc 2280
attaaataat aaaattgtta ttcctcgtga agtaaagtat gtatatttaa gagtaaatat 2340
tgaaaaggac aaatattatt atttctattc ttttaacaaa gaagattggc acaaaattga 2400
cattgcactg gaatcgaaaa aattatcaga tgattatatc cgtgggggag gattcttcac 2460
aggggccttt gtagggatgc aatgccaaga taccagtggt aatcatattc cggccgactt 2520
tagatatttt cgttataaag aaaaataatt tgcacatgaa aaaggagatt tctattttag 2580
aactcctttt tcatatgaga aggtgccatg tcactattgc ttcagaaata ctcctagaat 2640
aaaaaaactc atctttaaag atgagctgtc cattccataa aaaattacat tgtaatcatg 2700
tccagaaaat gatcaatcac aatggaggac attcctaatg ccggtgcatt ctgtcctaag 2760
gaagatggca ataattcata gctattgcct aattgggaat aaacccttga tgatacttca 2820
cttctcattg aatttaaaac cataggatgc gattcaatta tgctatttct taaaattacg 2880
gcttgtgggt tgaaagtatt tagaatattg gtaaggccta ttcctaaata gaatccaaaa 2940
ttttgtaatg catttaaggt tccgatatca ttcagatggg cgaggtttat gatatcagca 3000
gcataataga tttattgaat aggtcattta agttgagcgt attagaggag gaaaatcttg 3060
gagaaatatt tgaagaaccc gaacgcgtat aataaagaat aataataaat ctgtagacaa 3120
attgtgaaag gatgtactta aacgctaacg gtcagcttta ttgaacagta atttaagtat 3180
atgtccaatc tagggtaagt aaattgagta tcaatataaa ctttatatga acataatcaa 3240
cgaggtgaaa tcatgagcaa tttgattaac ggaaaaatac caaatcaagc gattcaaaca 3300
ttaaaaatcg taaaagattt atttggaagt tcaatagttg gagtatatct atttggttca 3360
gcagtaaatg gtggtttacg catttacagc gatgtagatg ttctagtcgt cgtgaatcat 3420
agtttacctc aattaactcg aaaaaaacta acagaaagac taatgactat atcaggaaag 3480
attggaaata cggattctgt tagaccactt gaagttacgg ttataaatag gagtgaagtt 3540
gtcccttggc aatatcctcc aaaaagagaa tttatatacg gtgagtggct caggtgtgga 3600
tttgagaatg gacaaattca ggaaccaagc tatgatcctg atttggctat tgttttagca 3660
caagcaagaa agaatagtat ttctctattt ggtcctgatt cttcaagtat acttgtctcc 3720
gtacctttga cagatattcg aagagcaatt aaggattctt tgccagaact aattgagggg 3780
ataaaaggtg atgagcgtaa tgtaatttta accctagctc gaatgtggca aacagtgact 3840
actggtgaaa ttacctcgaa agatgtcgct gcggaatggg ctatacctct tttacctaaa 3900
gagcatgtaa ctttactgga tatagccaga aaaggctatc ggggagagtg tgatgataag 3960
tgggaaggac tatattcaaa ggtgaaagca ctcgttaagt atatgaaaaa ttctatagaa 4020
acttctctca attaggctaa ttttattgca ataacaggtg cttactttta aaactactga 4080
tttattgata aatattgaac aatttttggg aagaataaag cgtcctcttg tgaaattaga 4140
gaacgccgac tcagtccttt catatacaat atgaagtgta ccgttttccg cactttttca 4200
caatttccca taatcttttc atttttatcc cacagttttt gtttatgata aactcaagtc 4260
ataaacctat caatataaat agacatgtga aaatagagaa acggagtgaa catgatgacc 4320
atgattacgg attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 4380
acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 4440
gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc 4500
tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc 4560
gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc 4620
aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt 4680
tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt 4740
atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac 4800
ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa 4860
aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat 4920
atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa 4980
atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag 5040
gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg 5100
cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag 5160
cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg 5220
agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg 5280
ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg 5340
ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct 5400
ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag 5460
aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg 5520
tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg 5580
ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg 5640
cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa 5700
tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc 5760
cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg 5820
atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa 5880
aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg 5940
atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt 6000
ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac 6060
ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc 6120
tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa 6180
caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa 6240
tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag 6300
ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa 6360
ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg 6420
caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt 6480
ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc 6540
accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag 6600
tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc 6660
gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt 6720
gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg 6780
ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg 6840
tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt 6900
ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg 6960
attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg 7020
ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca 7080
ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg 7140
cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc 7200
tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc 7260
acatggctga atatcgacgg tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg 7320
tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt 7380
caaaaataat tttttatgga atggacagct cgaagatcgt gtgtttgaag atgtgattca 7440
acatcgttac cgcagcttta ctgaagggat tggtcttgaa attatagaag gaagagctaa 7500
tttccacaca cttgagcaat atgcgctaaa tcataaatca attaaaaacg aatctggaag 7560
acaggagaaa ttaaaagcga tattgaacca atacatttta gaagtataac aggataagct 7620
ccagatcctg ctatcaatac caagtcactg aattacccgt catgattcct ttcctattgc 7680
ttgttgttat gacgggtaac ttctataatt aggatttatt tagagtgaat ggttttttaa 7740
aagggcaagg agtgaaaaaa tgaagtatgt cattggaata gatcttggaa cgagtgctgt 7800
taaaaccatt ttagttaacc aaaacggcaa ggtttgtgca gaaacgtcca aaaggtatcc 7860
gctcatccaa gagaaggcgg gatatagtga gcaaaatcct gaagactggg ttcagcaaac 7920
aattgaagca ttggctgaat tggtttctat atccaatgtt caagccaagg atattgacgg 7980
gataagctat tcgggacaaa tgcatggatt agtactgctt gaccaagatc gtcaggtgtt 8040
acgtaatgca attctttgga atgataccag aacaacgcct caatgtataa ggatgaccga 8100
gaaatttggc gatcatcttc ttgacatcac aaaaaaccgt gttttagaag ggtttacatt 8160
acctaaaatg ttatgggtaa aggaacatga acctgaactt tttaaaaaaa ctgctgtgtt 8220
tttgcttccg aaagactacg tgcgattccg tatgaccggt gtcattcaca ccgaatactc 8280
cgatgcagca ggaactttac ttttacatat tactcgcaag gagtggagca atgatatttg 8340
caatcaaatt ggtatttctg cagatatttg tcctccgctt gttgaatctc atgattgtgt 8400
aggatcgctg cttccgcacg ttgccgcgaa gaccgggcta ttagaaaaaa caaaagtgta 8460
cgctggggga gcagataatg cttgcggcgc tattggagca ggtatccttt cttccggaaa 8520
aacattatgc agtattggga cgtcaggggt catactttcc tacgaagaag aaaaagaaag 8580
agactttaaa gggaaagtcc acttttttaa tcatggaaaa aaggattctt tttatacgat 8640
gggcgtcacg ctcgctgcag gatacagctt ggactggttt aaaagaacgt ttgcaccaaa 8700
cgaatcgttt gagcaattat tgcagggggt ggaagctatt ccgataggag ccaatggact 8760
gctatacact ccttatttgg ttggtgaaag aacgccgcat gctgattctt ctattcgggg 8820
aagcttgatc ggaatggatg gagcccataa tagaaagcat tttttgaggg caataatgga 8880
aggtatcaca ttctctttac atgaatcaat tgagctattc cgcgaagcgg gaaaatcagt 8940
tcatactgtt gtttctattg gtgggggagc taaaaatgat acgtggctgc aaatgcaagc 9000
tgatattttc aatacgaggg taattaagtt agaaaatgaa caagggccag ctatgggggc 9060
tgcaatgctg gctgcctttg gaagcggttg gtttgaatca cttgaagaat gtgcagagca 9120
gttcattcgt gaggctgctg cattttatcc aaaggcgcaa aatgttcaaa aatataaaac 9180
actatttgat ttgtataaga acatttacac tcacacaaag gatctcaata cagctttgaa 9240
gagctttcga aaaaactaat gatgttattg tctggagatc aaccgaagaa caattaatga 9300
tcaatcatca tcaaaggcct ttgataacat ggctgccttc ttttgaaaag atggtgagaa 9360
taaggtatcg caacctttaa acagtattgg agtatccagc agacaaaacg aacgagtgga 9420
accgtatttt gtcagcgaac acttcaagaa gtggggaagc ttaggaatgc caatgggtaa 9480
gatgtatgaa accgcgctaa cgacggtaga gggatctctt gatttatgaa gaaataggaa 9540
ggatgttaac acacaaataa cccctcacat tgacgtgaag gggtgttttt tattgttact 9600
atacagcgga aattttacag gctagttgca tgattttagc ttgttaagca gaatggaact 9660
agactctcca tcatctcttt ctcattcttt ggaaactgca ttctgctagg tttgctgctt 9720
tttttaacaa acagtgtttt tctatttcac acagccatta aatcctctgt tcgtcacata 9780
accgctctta ctccaaattg acagtttatc tgattttgct tcttgctcat ctagtctgaa 9840
ttggtctatg tattttgtgt taggctcata tacatatgct actctggcca atccctcttt 9900
caataatgtc tcttgaacag atttgccgtc aacataaacg tatgctaaca gtcttccata 9960
cttatctctg cgatcgcctt tatcaaattc cagctgtagc ttaccgctgt tgaccaattc 10020
tttatttcgt ttcgacgcat cctcaccgta tggttgaaca caagaatttg gtttcttcgt 10080
ctcaggtgta tcaacgagca agtagcgaac tgtgtctttc tttccgttgt aaataacctt 10140
aatcgtatct ccatctat 10158

Claims (16)

1.一种核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同异源启动子的相同拷贝。
3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，该目的多肽是淀粉酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶和该目的多肽选自相同的芽孢杆菌属物种；优选地，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:3具有至少80％的序列同一性，并且该目的多肽来自解淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:9具有至少80％的序列同一性，并且该目的多肽来自地衣淀粉芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:15具有至少80％的序列同一性，并且该目的多肽来自芽孢杆菌属物种NSP9.1；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:18具有至少80％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:21具有至少80％的序列同一性，并且该目的多肽来自索诺拉沙漠芽孢杆菌L12；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:24具有至少80％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中该折叠酶与SED ID NO:27具有至少80％的序列同一性，并且该目的多肽来自枯草芽孢杆菌；优选地，该目的多肽是淀粉酶；更优选地，该目的多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％的序列同一性；最优选地，该目的多肽包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。
10.一种表达载体，该表达载体包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体。
11.一种革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含：
1)核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
和/或
2)表达载体，其包含所述核酸构建体；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种，并且与该革兰氏阳性宿主细胞异源。
12.根据权利要求11所述的革兰氏阳性宿主细胞，该革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
13.一种生产目的多肽的方法，该方法包括：
I)提供革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含：
1)核酸构建体，其包含：
a)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及
b)与至少一种编码该目的多肽的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；
和/或
2)表达载体，其包含所述核酸构建体；
其中该折叠酶和该目的多肽来自相同的革兰氏阳性物种，并且与该革兰氏阳性宿主细胞异源；
II)在有利于该折叠酶和该目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地
III)回收该目的多肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞；最优选地，芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种NSP9.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌L12和枯草芽孢杆菌。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白质水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶；最优选地，该目的多肽是淀粉酶。
16.根据权利要求13-15中的任一项所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激相当或减少；优选地，该革兰氏阳性宿主细胞所经受的分泌应激减少；最优选地，该分泌应激减少至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％或更多。
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