CN113939588A

CN113939588A - 温度敏感性的rna指导的内切核酸酶

Info

Publication number: CN113939588A
Application number: CN202080033070.0A
Authority: CN
Inventors: B.科布曼; M.D.拉斯穆森; C.安德森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2022-01-14
Also published as: WO2020229191A1; EP3969576A1; US20220275354A1

Abstract

本发明涉及RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，编码所述变体的多核苷酸，包含编码所述变体的多核苷酸的核酸构建体和表达载体，表达所述变体的宿主细胞，使用所述变体瞬时抑制和表达一个或多个DNA靶序列的方法以及所述变体、多核苷酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞和方法的用途。

Description

温度敏感性的RNA指导的内切核酸酶

序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。

技术领域

本发明涉及RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，编码所述变体的多核苷酸，包含编码所述变体的多核苷酸的核酸构建体和表达载体，表达所述变体的宿主细胞，使用所述变体表达和抑制一个或多个DNA靶序列的方法以及所述变体、多核苷酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞和方法的用途。

背景技术

所谓的CRISPR基因组编辑系统已被广泛用作一种工具来修饰多种生物的基因组。CRISPR系统的力量在于其简单性，可在特异性目的基因中靶向和编辑单个碱基对。该系统依赖于CRISPR相关蛋白(Cas)(其是RNA指导的内切核酸酶)以及所谓的指导RNA(gRNA)分子(其能与内切核酸酶形成复合物并且将核酸酶活性指导至特定DNA序列)。通过改变gRNA的核苷酸序列以匹配靶DNA序列来选择DNA靶序列。当与gRNA分子复合时，内切核酸酶可以识别并结合其靶DNA序列，形成内切核酸酶-gRNA-DNA复合物，并使用其一个或多个催化结构域产生双链断裂。

出于基因组编辑的目的，最广泛使用的CRISPR相关蛋白是2类的那些蛋白，其包括衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(II型Cas)和衍生自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)或毛螺菌科(Lachnospiraceae)的Cpf1(V型Cas)。RNA指导的内切核酸酶的另一实例是分离自直肠真杆菌(Eubacterium rectale)的Mad7。尽管Mad7和Cpf1之间存在一些结构相似性，但是在氨基酸水平上Mad7与来自氨基酸球菌属物种的Cpf1仅仅是31％保守的。

除了其在基因组编辑中使用外，CRISPR系统还可用于控制基因表达。该应用，通常被称为CRISPR干扰或CRISPRi，允许基因的序列特异性抑制或激活。CRISPR干扰利用了一种可通过在负责内切核酸酶活性的催化结构域中引入氨基酸突变来获得的无催化活性的(“死”)内切核酸酶变体(例如，Mad7d)。在与gNRA缔和时，所得复合物保留了与靶DNA序列结合的能力，但不会在DNA链中引入任何断裂。只要无催化活性的内切核酸酶结合至靶DNA序列，该靶序列的表达就被抑制。通过改变gRNA序列，可以控制靶DNA序列，并从而调节任何生物中几乎任何基因的表达。

发明内容

本发明提供了RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体、编码所述变体的多核苷酸、包含编码所述变体的多核苷酸的核酸构建体和表达载体、表达所述变体的宿主细胞、使用所述变体表达和抑制一个或多个DNA靶序列的方法以及所述变体、多核苷酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞和方法的用途。

本发明基于以下令人惊讶的发现：在RNA指导的内切核酸酶Mad7中引入特异性氨基酸改变产生了温度敏感性Mad7变体(tsMad7)。当体内与适合的gRNA和靶DNA序列一起采用这些温度敏感性变体时，初始变体-gRNA复合物以及变体-gRNA-DNA复合物变得对温度敏感。因此，温度敏感性变体的gRNA和DNA结合特性可以通过向上和/或向下转换温度来控制，其取决于所希望的温度。

因此，在第一方面中，本发明涉及一种RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入。

在第二方面中，本发明涉及编码第一方面所述的变体的多核苷酸。

在第三方面中，本发明涉及包含第二方面所述的多核苷酸的核酸构建体。

在第四方面中，本发明涉及一种包含第三方面所述的核酸构建体和/或第二方面所述的多核苷酸的表达载体。

在第五方面中，本发明涉及一种包含如第一方面所定义的变体，如第二方面所定义的多核苷酸，如第三方面所定义的核酸构建体，和/或如第四方面所定义的表达载体的宿主细胞。

在第六方面中，本发明涉及一种诱导一个或多个目的DNA靶序列表达的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供第五方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步包含一个或多个gRNA和一个或多个DNA靶序列；

b)在该变体的许可温度下并在有利于该变体表达的条件下，培养该宿主细胞，由此该变体与该一个或多个gRNA和该一个或多个DNA靶序列在该宿主细胞中形成复合物，并且由此抑制该一个或多个DNA靶序列的表达；以及随后

c)将温度升高到该变体的限制性温度并培养该宿主细胞，由此该形成的复合物解离并且诱导该一个或多个DNA靶序列的表达。

在第七方面中，本发明涉及一种抑制一个或多个目的DNA靶序列的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供根据第五方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步包含一个或多个gRNA和一个或多个DNA靶序列；

b)在该变体的限制性温度下并在有利于该变体表达的条件下，培养该宿主细胞，其中该一个或多个DNA靶序列被表达；以及随后

c)将温度降低至该变体的许可温度并培养该宿主细胞，由此该变体、该一个或多个gRNA和该一个或多个DNA靶序列在该宿主细胞中形成复合物，并且由此抑制该一个或多个DNA靶序列的表达。

本发明还涉及根据第一方面所述的变体，根据第二方面所述的多核苷酸，根据第三方面所述的核酸构建体，根据第四方面所述的表达载体，根据第五方面所述的宿主细胞，和/或根据第六方面和第七方面所述的方法的用途。

附图说明

图1显示了两个反平行amyL基因拷贝插入到实例1中提及的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SJ4671菌株中的示意图。这些拷贝间隔大约2.5Kb，其来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)染色体(SEQ ID NO:4)的非功能性DNA。

图2显示了实例1中SJ4671菌株中的在xyl基因座(SEQ ID NO:4)处插入的amyL基因的另外的拷贝的示意图。

图3显示了实例1中在gnt基因座(SEQ ID NO:5)处插入以形成菌株SJ6026的amyL基因的另外的拷贝的示意图。

图4显示了实例1中在mprL基因座(SEQ ID NO:6)处插入以形成菌株MOL2173的prsA基因的示意图。

图5显示了实例2中所述的质粒pBKQ3825(SEQ ID NO:7)的示意图，该质粒用于从地衣芽孢杆菌的forD基因座中的Pq启动子表达的mad7d和gDNA(P4199)的染色体整合。

图6显示了实例2中的表达盒(SEQ ID NO:8)的示意图，该表达盒由整合在forD基因座处并从forD启动子表达的mad7d基因、从PamyQsc启动子转录的gDNA(P4199)和赋予氯霉素抗性的cat基因组成。

图7a和7b分别显示了两个地衣芽孢杆菌菌株PP5007和BKQ3934的图示。

图8显示了来自地衣芽孢杆菌菌株的分批给料实验的结果，这些菌株含有从P4199启动子表达的淀粉酶的四个拷贝。菌株PP5007不含有Mad7d，而菌株BKQ3934含有wt Mad7d和gDNA(P4199)。培养物在接种后在30℃或42℃下孵育两天。然后将温度分别转换到42℃和30℃，并且培养物再继续生长三天。取样测量淀粉酶活性。

图9显示了实例4中在amyE基因座处插入的DNA片段的示意图，其中编码绿色荧光蛋白的gfp基因从amyL变体启动子P4199表达。此外，从PamyQ共有启动子(PamyQsc)表达gDNA(gfp)。显示了整合后amyE基因座的最终图谱。

图10显示了在实例5中在具有编码Mad7d蛋白的mad7d基因的pel基因座处插入的表达盒的示意图。

图11显示了实例5中构建的菌株MOL3268的示意图。

图12显示了在30℃、34℃、37℃和42℃的温度下测试实例8中不同变体克隆的GFP荧光的实例。JA1343(A)＝阴性对照，无GFP的菌株；PP5625(B)＝GFP菌株，无Mad7d抑制；MOL3268(C)＝GFP菌株，具有wt Mad7d抑制；TS1至TS11＝GFP菌株，具有Mad7d变体抑制，将菌株放置在第1列中的相同位置，只是处于不同的温度下，如所示：30℃、34℃、37℃和42℃(在第2列中设置相同)。

图13显示了在含有gfp和Mad7d变体的枯草芽孢杆菌菌株中的GFP荧光，这些枯草芽孢杆菌菌株在液体TY培养基中在不同的温度下培养，如实例9中所述。

图14a显示了结合至GFP基因的CRISPRi复合物(MAD7d+gRNA(GFP))的示意图。该抑制剂复合物用于在实例5、8、9和10中筛选TS变体。

图14b显示了与启动子P4199的启动子区域结合以抑制与P4199启动子可操作地连接的基因表达的CRISPRi复合物(MAD7d+gRNA(P4199))的示意图。

图15显示了地衣芽孢杆菌菌株的分批给料实验，这些菌株含有Mad7d的温度敏感性变体、gDNA(P4199)和从P4199启动子表达的淀粉酶的四个拷贝。培养物在接种后在30℃或42℃下孵育两天。然后将温度分别转换到42℃和30℃，并且培养物再继续生长三天。取样测量淀粉酶活性。

图16显示了地衣芽孢杆菌菌株的分批给料实验，这些菌株含有Mad7d的温度敏感性变体TS6、gDNA(P4199)和从P4199启动子表达的淀粉酶的四个拷贝。培养物在接种后在42℃下孵育两天。然后将温度从42℃转换到30℃、34℃和39℃，或维持在42℃。培养物再继续生长三天。取样测量淀粉酶活性。

图17显示了含有从P4199启动子表达的4C amyL和Mad7d的温度敏感性变体以及gDNA(P4199)的地衣芽孢杆菌菌株在液体TY培养基中在30℃、34℃、37℃、和42℃下孵育后淀粉酶活性的测量。

图18显示了参与DNA的内切核苷酸切割的三种不同Cpf1蛋白的相关区域的比对。蛋白质序列来自如下生物：毛螺菌科细菌(LbCpf1)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)(FnCpf1)和直肠真杆菌(Mad7)。Zetsche等人,2015,Cell[细胞]163,759-771中描述了，来自土拉热弗朗西斯氏菌的FnCpf1的RuvC样结构域具有保守区域，其中位置917的一个氨基酸从Asp(D)改变为Ala(A)使核酸酶活性完全失活。Mad7中相应的氨基酸发生了变化(D877A)并且也被证明是无活性的。

序列表

SEQ ID NO:1：编码来自直肠真杆菌的Mad7的多核苷酸序列，针对地衣芽孢杆菌进行了密码子优化。

SEQ ID NO:2：来自直肠真杆菌的Mad7的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：MOL2212-amyL基因座，图1。

SEQ ID NO:4：MOL2212-xyl基因座，图2。

SEQ ID NO:5：MOL2212-gntP基因座，图3。

SEQ ID NO:6：MOL2212-prsA基因座，图4。

SEQ ID NO:7：质粒pBKQ3825，图5(在forD侧翼之间插入mad7d的质粒)。

SEQ ID NO:8：forD：mad7d-cat，图6(BKQ3934)。

SEQ ID NO:9：amyE：GFP-gDNA(gfp)-spc，图9(PP5625)。

SEQ ID NO:10：pel：mad7d，图10(MOL3268)。

SEQ ID NO:11：gDNA(gfp)。

SEQ ID NO:12：gDNA(P4199)。

SEQ ID NO:13：图14A上的靶DNA序列(GFP)的一段。

SEQ ID NO:14：图14A上的gRNA(GFP)。

SEQ ID NO:15：图14B上的靶DNA序列(P4199)的一段。

SEQ ID NO:16：图14B上的gRNA(P4199)。

SEQ ID NO:17：图18上的LbCpf1氨基酸序列的一段。

SEQ ID NO:18：图18上的FnCpf1氨基酸序列的一段。

SEQ ID NO:19：图18上所示的Mad7氨基酸序列的一段。

定义

无催化活性的：术语“无催化活性的”用于描述内切核酸酶活性被破坏的RNA指导的内切核酸酶及其变体。无催化活性的内切核酸酶可结合至其靶DNA序列，但是不会在靶DNA序列中引入任何断裂。术语“无催化活性的”、“核酸酶无效”和“死”(缩写为“d”，例如，Mad7d)在本文中可互换使用。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，提高物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

许可温度：术语“许可温度”意指温度或温度范围，其中温度敏感性变体表现为其野生型亲本。许可温度是变体能够与一个或多个gRNA和相应的一个或多个DNA靶序列形成复合物，并且在催化活性变体的情况下剪切靶序列，在切口酶变体的情况下切割靶序列，或在无催化活性的变体的情况下保持与靶序列结合的温度或温度范围。许可温度或温度范围主要由宿主细胞的选择、特定温度敏感性变体以及所应用的一个或多个gRNA定义。

限制性温度：术语“限制性温度”意指其中本发明的温度敏感性变体不能与一个或多个gRNA和相应的一个或多个目的DNA靶序列形成复合物的温度或温度范围。

RNA指导的内切核酸酶：术语“RNA指导的内切核酸酶”意指具有内切核酸酶活性的多肽，其中该内切核酸酶活性受到一个或多个gRNA的控制，该gRNA与RNA指导的内切核酸酶形成复合物并且将内切核酸酶活性指导至与该一个或多个gRNA互补并且能够与该一个或多个gRNA杂交的靶DNA序列。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”或“序列互补性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个核苷酸序列之间的序列同一性(或相应的序列互补性)。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

为了确定两个互补序列的互补性百分比，需要将两个序列中的一个转换为其互补序列，然后可以使用上述提及的算法将互补性百分比计算为第一序列和第二转换序列之间的同一性百分比。

(蛋白质)稳定性：术语“稳定性”和“蛋白质稳定性”在本文中可互换使用以描述本发明的温度敏感性变体的稳定性以及本发明的这些变体、一个或多个gRNA、和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性。蛋白质(包括本发明的变体)的稳定性可定义为力的净平衡，其决定了蛋白质将处于其天然折叠构象(即，稳定且通常是有活性的)或处于变性、未折叠或伸展的状态(即，不稳定和通常是无活性的)。在大多数情况下，本发明的变体在等于或低于其许可温度下将是稳定的并且在等于或高于其限制性温度下将是不稳定的。这进一步适用于本发明的变体、一个或多个gRNA和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物。

变体：本发明涉及SEQ ID NO:2的多肽的温度敏感性变体，这些变体包含在一个或多个(例如，几个)位置处的至少一个氨基酸改变，即，至少一个取代、缺失和/或插入。在实施例中，引入SEQ ID NO:2的多肽中的改变的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。改变包括保守取代，其中氨基酸被另一个具有类似理化特性的氨基酸取代；非保守取代，其中氨基酸被另一个具有不同理化特性的氨基酸取代；典型地1-30个氨基酸的小插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸)。常见的取代包括但不限于Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

在温度敏感性蛋白变体的上下文中，保守取代也可以被定义为在变体的许可温度下对蛋白质稳定性没有不利影响的取代。

变体命名惯例

出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:2中披露的多肽来确定另一种RNA指导的内切核酸酶中的相应的氨基酸残基。将另一种RNA指导的内切核酸酶的氨基酸序列与SEQ IDNO:2中披露的多肽进行比对，并且基于比对，可以使用如在EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

可以通过使用几个计算机程序，使用其相应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种RNA指导的内切核酸酶中的相对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic Acids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他RNA指导的内切核酸酶与SEQ ID NO:2的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序诸如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入：对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变：包含多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变：在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr，Glu”和R170Y，E代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”，

“Tyr167Gly+Arg170Ala”，

“Tyr167Ala+Arg170Gly”，和

“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

温度敏感性变体

在第一方面中，本发明涉及一种RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入。

本发明的温度敏感性变体可以是切口酶或核酸酶无效变体。优选地，本发明的核酸酶无效变体包含在对应于SEQ ID NO:2的位置877的位置处的另外的氨基酸改变。更优选地，此类变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体可以获得自任何亲本RNA指导的内切核酸酶。优选地，该亲本RNA指导的内切核酸酶是2类CRISPR相关蛋白。更优选地，该亲本RNA指导的内切核酸酶是II型或V型的2类CRISPR相关蛋白。

该亲本RNA指导的内切核酸酶可以获得自任何微生物。优选地，该亲本RNA指导的内切核酸酶获得自原核生物例如细菌或古细菌。最优选地，该亲本RNA指导的内切核酸酶来自真杆菌属物种，例如直肠真杆菌。

在优选的实施例中，该亲本RNA指导的内切核酸酶与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性。最优选地，该亲本RNA指导的内切核酸酶包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成。

编码直肠真杆菌RNA指导的内切核酸酶(称为Mad7(SEQ ID NO:2))的DNA序列作为SEQ ID NO:1提供，该DNA序列已针对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)进行了密码子优化。然而，本领域技术人员将认识到该亲本RNA指导的内切核酸酶及其温度敏感性变体在与地衣芽孢杆菌不同的宿主细胞中的表达可能需要该DNA序列针对所述宿主细胞进行密码子优化。因此，在优选的实施例中，本发明的温度敏感性变体由与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性的多核苷酸编码。

在一方面，本发明涉及RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，这些变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，几个)位置处的氨基酸改变：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、699、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1094、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213，其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，并且其中这些变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。

在实施例中，本发明的变体中的改变的数目是1-25个，例如，1-20、1-15、1-10和1-5个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个改变。

在实施例中，这些变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，几个)位置处的取代：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、699、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1094、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

在实施例中，这些变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，几个)位置处的缺失：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、699、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1094、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

在实施例中，这些变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，几个)位置处的插入：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、699、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1094、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

优选地，该至少一个改变发生在RNA指导的内切核酸酶序列内的位置处，即该至少一个改变不是N-末端或C-末端延伸、插入或融合。

本发明的温度敏感性变体在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个gRNA和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处包含至少一个改变。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

优选地，该至少一个改变发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处。此类位置包括但不限于对应于以下的位置：SEQ IDNO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个gRNA和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的该至少一个改变可以是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

优选地，该至少一个改变是发生在对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处的取代并且选自由以下组成的组：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

优选地，该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

优选地，该至少一个改变选自由以下组成的组：W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

优选地，该至少一个改变包括I57S。

优选地，该至少一个改变包括M58S。

优选地，该至少一个改变包括L70S。

优选地，该至少一个改变包括L132P。

优选地，该至少一个改变包括G220D。

优选地，该至少一个改变包括L520A。

优选地，该至少一个改变包括F522Y。

优选地，该至少一个改变包括W531A。

优选地，该至少一个改变包括L669P。

优选地，该至少一个改变包括D708Y。

优选地，该至少一个改变包括N732S。

优选地，该至少一个改变包括K734N。

优选地，该至少一个改变包括L738A。

优选地，该至少一个改变包括E897S。

优选地，该至少一个改变包括Q898A。

优选地，该至少一个改变包括F901A。

优选地，该至少一个改变包括C1029A。

优选地，该至少一个改变包括F1031S。

优选地，该至少一个改变P1043L。

优选地，该至少一个改变包括D1213N。

优选地，该至少一个改变包括W531A+P1043L。

优选地，该至少一个改变包括N732S+K734N+L738A+D1213N。

优选地，该至少一个改变包括L70S+D708Y。

优选地，该至少一个改变包括C1029A+F1031S。

优选地，该至少一个改变包括N732S+K734N+L738A。

优选地，该至少一个改变包括：L520A+F522Y+E897S+Q898A+F901A。

优选地，该至少一个改变包括I57S+M58S+N732S+K734N+L738A。

优选地，该至少一个改变包括N732S+K734N+L738A+E897S+Q898A+F901A。

优选地，该至少一个改变包括G220D+N732S+K734N+L738A。

优选地，该至少一个改变包括I57S+M58S。

优选地，该至少一个改变包括F65A+L70S。

优选地，该至少一个改变包括E194N+F197S。

优选地，该至少一个改变包括K455N+A451N+E448S。

优选地，该至少一个改变包括L520A+N521A。

优选地，该至少一个改变包括L520A+N521A+P525G。

优选地，该至少一个改变包括L520A+F522Y。

优选地，该至少一个改变包括P525G+W531A。

优选地，该至少一个改变包括P574Q+P756G。

优选地，该至少一个改变包括P586G+P588S。

优选地，该至少一个改变包括D681H+W682A。

优选地，该至少一个改变包括N707A+K709N+L713A+L715A。

优选地，该至少一个改变包括N732S+K734N+L738A。

优选地，该至少一个改变包括L740A+L747S。

优选地，该至少一个改变包括I876A+A877H+R878S。

优选地，该至少一个改变包括I876Y+A877L+R878Q。

优选地，该至少一个改变包括E897S+Q898A+F901A。

优选地，该至少一个改变包括E929S+I930S。

优选地，该至少一个改变包括E929S+I930S+K932N。

优选地，该至少一个改变包括N1004A+Y1011A。

优选地，该至少一个改变包括N1004K+Y1011H。

优选地，该至少一个改变包括C1029A+F1031S。

优选地，该至少一个改变包括P1196G+K1197N+D1200S。

本发明的温度敏感性变体的特征在于许可温度或温度范围，其中该变体表现为野生型蛋白并且能够与一个或多个gRNA和一个或多个目的DNA靶序列形成复合物，并且特征在于限制性温度或温度范围，其中该变体呈现突变表型并且不能与一个或多个gRNA和一个或多个目的DNA靶序列形成复合物。在大多数情况下，限制性温度或温度范围高于许可温度或温度范围。

许可温度和限制性温度或温度范围取决于本发明的给定变体的温度敏感性和给定宿主细胞的温度要求。通常，许可温度和限制性温度在从25℃至45℃的范围内。优选地，许可温度和限制性温度或温度范围应分开至少1℃。可替代地，许可温度和限制性温度范围可以重叠。

取决于宿主细胞，许可温度可以是等于或低于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-31℃、26℃-32℃、27℃-33℃、28℃-34℃、29℃-35℃、30℃-36℃、31℃-37℃、32℃-38℃、33℃-39℃、34℃-40℃、35℃-41℃、36℃-42℃、37℃-43℃、38℃-44℃和39℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-32℃、26℃-33℃、27℃-34℃、28℃-35℃、29℃-36℃、30℃-37℃、31℃-38℃、32℃-39℃、33℃-40℃、34℃-41℃、35℃-42℃、36℃-43℃、37℃-44℃和38℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-33℃、26℃-34℃、27℃-35℃、28℃-36℃、29℃-37℃、30℃-38℃、31℃-39℃、32℃-40℃、33℃-41℃、34℃-42℃、35℃-43℃、36℃-44℃和37℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-34℃、26℃-35℃、27℃-36℃、28℃-37℃、29℃-38℃、30℃-39℃、31℃-40℃、32℃-41℃、33℃-42℃、34℃-43℃、35℃-44℃和36℃-45℃。

许可温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-35℃、26℃-36℃、27℃-37℃、28℃-38℃、29℃-39℃、30℃-40℃、31℃-41℃、32℃-42℃、33℃-43℃、34℃-44℃和35℃-45℃。

许可温度范围可以选自25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、30℃-32℃、30℃-33℃、29℃-32℃、30℃-34℃、29℃-33℃、30℃-35℃、29℃-34℃、30℃-36℃、28℃-34℃、31℃-35℃、28℃-35℃、26℃-34℃和27℃-34℃。

优选地，许可温度范围选自25℃-27℃、26℃-28℃、27℃-30℃、28℃-30℃、29℃-31℃、30℃-32℃、29.5℃-32.5℃、29℃-33℃、28.5℃-33.5℃、28℃-34℃、27.5℃-34.5℃、27℃-35℃、26.5℃-35.5℃和26℃-36℃。

优选地，许可温度范围选自26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、28.5℃-33.5℃、28℃-34℃、27.5℃-34.5℃和27℃-35℃。

优选地，许可温度范围选自26℃-32℃、27℃-33℃、28℃-34℃和29℃-35℃。

在优选的方面，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

取决于宿主细胞，限制性温度可以是等于或高于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-31℃、26℃-32℃、27℃-33℃、28℃-34℃、29℃-35℃、30℃-36℃、31℃-37℃、32℃-38℃、33℃-39℃、34℃-40℃、35℃-41℃、36℃-42℃、37℃-43℃、38℃-44℃和39℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-32℃、26℃-33℃、27℃-34℃、28℃-35℃、29℃-36℃、30℃-37℃、31℃-38℃、32℃-39℃、33℃-40℃、34℃-41℃、35℃-42℃、36℃-43℃、37℃-44℃和38℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-33℃、26℃-34℃、27℃-35℃、28℃-36℃、29℃-37℃、30℃-38℃、31℃-39℃、32℃-40℃、33℃-41℃、34℃-42℃、35℃-43℃、36℃-44℃和37℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-34℃、26℃-35℃、27℃-36℃、28℃-37℃、29℃-38℃、30℃-39℃、31℃-40℃、32℃-41℃、33℃-42℃、34℃-43℃、35℃-44℃和36℃-45℃。

限制性温度还可以是选自以下的温度范围：25℃-35℃、26℃-36℃、27℃-37℃、28℃-38℃、29℃-39℃、30℃-40℃、31℃-41℃、32℃-42℃、33℃-43℃、34℃-44℃和35℃-45℃。

优选地，限制性温度范围选自由以下组成的组：38℃-40℃、38℃-41℃、37℃-40℃、38℃-42℃、37℃-41℃、37℃-42℃、36℃-40℃、36℃-41℃、42 36℃-42℃、35℃-43℃、34℃-44℃、33℃-45℃、25℃-43℃。

优选地，限制性温度范围选自39℃-40℃、38.5℃-41.5℃、38℃-42℃、37.5℃-42℃、38℃-42.5℃、37℃-42℃、37℃-42.5℃、36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃和36℃-43℃。

优选地，限制性温度范围选自38℃-℃、37.5℃-42℃、38℃-42.5℃、36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃、37℃-42℃、37℃-42.5℃、36℃-43℃和36℃-44℃。

优选地，限制性温度范围选自36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃、37℃-42℃、和37℃-42.5℃。

在优选的方面，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置57的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置57的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代I57S，或由SEQ IDNO:2的取代I57S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置58的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置58的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代M58S，或由SEQ IDNO:2的取代M58S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置70的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置70的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代L70S，或由SEQ IDNO:2的取代L70S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置132的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置132的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Pro取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代L132P，或由SEQID NO:2的取代L132P组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置220的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置220的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Asp取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代G220D，或由SEQID NO:2的取代G220D组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置520的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置520的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代L520A，或由SEQID NO:2的取代L520A组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置522的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置522的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Tyr取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代F522Y，或由SEQID NO:2的取代F522Y组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置531的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置531的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代W531A，或由SEQID NO:2的取代W531A组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置669的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置669的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Pro取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代L669P，或由SEQID NO:2的取代L669P组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置708的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置708的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Tyr取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代D708Y，或由SEQID NO:2的取代D708Y组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置732的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置732的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代N732S，或由SEQID NO:2的取代N732S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置734的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置734的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Asn取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代K734N，或由SEQID NO:2的取代K734N组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置738的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置738的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代L738L，或由SEQID NO:2的取代L738L组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置897的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置897的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代E897S，或由SEQID NO:2的取代E897S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置898的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置898的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代Q898A，或由SEQID NO:2的取代Q898A组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置901的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置901的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代F901A，或由SEQID NO:2的取代F901A组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置1029的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置1029的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代C1029A，或由SEQID NO:2的取代C1029A组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置1031的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置1031的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ser取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代F1031S，或由SEQID NO:2的取代F1031S组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置1043的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置1043的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Leu取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代P1043L，或由SEQID NO:2的取代P1043L组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

在一方面，本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置1213的位置处包含改变(优选地取代)，或由改变(优选地取代)组成，其中该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置1213的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Asn取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代D1213N，或由SEQID NO:2的取代D1213N组成。在优选的实施例中，变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。优选地，变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、和45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃。优选地，限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。优选地，限制性温度高于许可温度。

温度敏感性变体的制备

本发明还涉及用于获得RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的方法，所述方法包括：(a)在对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个gRNA和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的一个或多个(例如，几个)位置处，向亲本RNA指导的内切核酸酶中引入至少一个改变，并任选地(b)回收变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序(例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等)来制备本发明的变体。

定点诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，几个)突变的技术。

通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。

可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程与PCR技术组合。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的多核苷酸。在优选的实施例中，编码本发明的变体的多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。

本发明还涉及编码RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的分离的多核苷酸。用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达文库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自真杆菌属菌株(优选地，直肠真杆菌)或相关生物，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

编码本发明的温度敏感性变体的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于这种变体的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用多种方式操纵多核苷酸以提供多肽的表达。取决于构建体或载体，在多核苷酸插入核酸构建体或表达载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。

酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其提高该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区的实例从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的提高的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明的变体、多核苷酸、核酸构建体和/或表达载体的重组宿主细胞。本发明的多核苷酸可操作地连接至指导本发明的变体的产生的一个或多个控制序列。将包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。

术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

该宿主细胞可以是在本发明的上下文中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、以及脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。在优选的实施例中，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何乳杆菌属细胞，包括但不限于：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus(para)casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(L.delbrueckii subsp.lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、禾口鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何乳球菌属细胞，包括但不限于：韩中大乳球菌(Lactococcus chungangensis)、福尔摩沙乳球菌(Lactococcus formosensis)、富士山乳球菌(Lactococcus fujiensis)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鱼乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、和台湾乳球菌(Lactococcustaiwanensis)。

细菌宿主细胞还可以是任何埃希氏杆菌属细胞。在优选的实施例中，细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。对于真核宿主细胞，本发明的温度敏感性变体必须包含至少一个融合到变体的核定位序列(NLS)，以确保其在细胞的核中的定位；优选地，猴病毒40(SV40)T抗原核定位信号(NLS)融合到变体的N-末端和/或C-末端。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由以下所定义的：Hawksworth等人,于：Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典],第8版,1995,CABInternational[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社]，英国剑桥)。

真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

诱导或抑制表达的方法

本发明还涉及诱导或抑制一个或多个目的DNA靶序列的表达的方法。优选地，该一个或多个DNA靶序列是一个或多个基因组靶序列，即，为生物的基因组的部分的DNA序列。技术人员将理解，DNA靶序列应该是如下的DNA靶序列，即，与适合用于指导本发明的变体的结合和/或核酸酶活性的gRNA互补并能与该gRNA杂交的DNA靶序列。

在优选的方面，本发明涉及一种抑制一个或多个DNA靶序列的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供根据权利要求18所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步包含一个或多个gRNA和一个或多个DNA靶序列；

该方法还可包括以下另外的步骤：

d)将温度升高到该变体的限制性温度并培养该宿主细胞，由此该形成的复合物解离并且诱导该一个或多个DNA靶序列的表达。

优选地，其中该许可温度是等于或低于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，该限制性温度是等于或高于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，并且该限制性温度高于该许可温度。

在另一优选的方面，本发明涉及一种抑制一个或多个DNA靶序列的方法，该方法包括以下步骤：

该方法还可包括以下另外的步骤：

优选地，该许可温度是等于或低于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，该限制性温度是等于或高于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，并且该限制性温度高于该许可温度。

对于诱导或抑制表达的方法，宿主细胞优选地为芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，宿主细胞是芽孢杆菌属细胞，其选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞；更优选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

对于芽孢杆菌属宿主细胞，许可温度是选自以下的范围：30℃-32℃、30℃-33℃、29℃-32℃、30℃-34℃、29℃-33℃、30℃-35℃、29℃-34℃、30℃-36℃、28℃-34℃、31℃-35℃、28℃-35℃、26℃-34℃和27℃-34℃。优选地，许可温度范围选自：30℃-32℃、29.5℃-32.5℃、29℃-33℃、28.5℃-33.5℃、28℃-34℃、27.5℃-34.5℃、27℃-35℃、26.5℃-35.5℃和26℃-36℃。更优选地，许可温度范围选自：29℃-33℃、28.5℃-33.5℃、28℃-34℃、27.5℃-34.5℃和27℃-35℃。甚至更优选地，许可温度范围选自：28.5℃-33.5℃、28℃-34℃和27.5℃-34.5℃。最优选地，许可温度范围是28℃-34℃。

对于芽孢杆菌属宿主细胞，限制性温度是选自以下的范围：38℃-40℃、38℃-41℃、37℃-40℃、38℃-42℃、37℃-41℃、37℃-42℃、36℃-40℃、36℃-41℃、36℃-42℃和35℃-43℃。优选地，限制性温度范围选自：39℃-40℃、38.5℃-41.5℃、38℃-42℃、37.5℃-42℃、38℃-42.5℃、36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃、37℃-42℃、37℃-42.5℃和36℃-43℃。更优选地，限制性温度范围选自：38℃-42℃、37.5℃-42℃、38℃-42.5℃、36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃、37℃-42℃、37℃-42.5℃、36℃-43℃和36℃-44℃。甚至更优选地，限制性温度范围选自：36.5℃-41.5℃、36.5℃-42℃、37℃-42℃和37℃-42.5℃。最优选地，限制性温度范围是37℃-42℃。

在优选的实施例中，许可温度是28℃-34℃，并且限制性温度是37℃-42℃。

指导RNA

CRISPR基因组编辑中的gRNA构成了可重复编程的部分，使得系统如此通用。在天然酿脓链球菌系统中，gRNA实际上是两种RNA多核苷酸的复合物，第一crRNA含有约20个核苷酸，其确定了RNA指导的内切核酸酶(称为Cas9)的特异性和与crRNA杂交以形成与Cas9相互作用的RNA复合物的tracr RNA(参见Jinek等人,2012,A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[在自适应细菌免疫中的可编程双重-RNA-指导的DNA内切核酸酶],Science[科学]337:816-821)。在本文中术语crRNA和tracrRNA与术语tracr配对RNA和tracr RNA可互换地使用。

由于CRISPR-Cas9系统的发现，单一多核苷酸gRNA已经被开发并成功应用，与天然两部分gRNA复合物一样有效。

在优选的实施例中，该一个或多个gRNA是单一gRNA或RNA复合物，该单一gRNA或RNA复合物包含第一RNA，该第一RNA包含与该一个或多个DNA靶序列至少85％互补并且能够与该一个或多个DNA靶序列杂交的20个或更多个核苷酸；优选地，该20个或更多个核苷酸与该一个或多个DNA靶序列至少90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％互补并且能够与该一个或多个DNA靶序列杂交。

在另一个优选的实施例中，本发明的宿主细胞包含单一gRNA，该单一gRNA包含单个多核苷酸形式的第一和第二RNA，并且其中当彼此杂交时，tracr配对序列和tracr序列形成茎环结构。

DNA靶序列

该一个或多个DNA靶序列应该是如下的DNA靶序列，即，与适合用于指导本发明的变体的结合和/或核酸酶活性的gRNA互补并能与该gRNA杂交的DNA靶序列。

优选地，该一个或多个DNA靶序列的长度是至少20个核苷酸，以允许其与该一个或多个gRNA的对应的至少20个核苷酸的序列杂交。该一个或多个DNA靶序列可以位于基因组中的任何位置，但通常位于编码序列或可读框内。

在优选的实施例中，该一个或多个DNA靶序列包含多核苷酸，该多核苷酸包含与该一个或多个gRNA至少85％互补并且能够与该一个或多个gRNA杂交的20个或更多个核苷酸；优选地，该20个或更多个核苷酸与该一个或多个gRNA至少90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％互补并且能够与该一个或多个gRNA杂交。

该一个或多个DNA靶序列应侧接针对本发明的变体的功能性PAM序列。有关PAM序列的综述，参见，例如，Shah等人,2013,Protospacer recognition motifs[原型间隔子识别基序],RNA Biol.[RNA生物学]10(5):891-899。

优选地，该一个或多个DNA靶序列包含在编码多肽的可读框中或包含在启动子区域中。还优选地，一个或多个DNA靶序列编码一个或多个选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，一个或多个酶是α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。

优选地，该一个或多个DNA靶序列编码绿色荧光蛋白，其变体的片段。

优选地，如果本发明的宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞，待抑制的该一个或多个DNA靶序列包含mecA和/或yjbH基因或其同源物。待抑制的其他优选的目的DNA靶序列包含蛋白酶编码基因，尤其是如果表达，则可以降解重组产生的多肽的细胞溶质、分泌或膜结合蛋白酶。

产生温度敏感性变体的方法

本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在适合用于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。

可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCHPublishers[纽约VCH出版社],1989)。

在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

无催化活性的RNA指导的内切核酸酶

在本发明的一些方面，本发明的温度敏感性变体是无催化活性的。这些变体基于无催化活性的亲本RNA指导的内切核酸酶，即，该内切核酸酶可以结合至其靶DNA序列但是不会在该靶DNA序列中引入任何断裂。

在一个方面，本发明涉及RNA指导的内切核酸酶的核酸酶无效变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含在对应于SEQ ID NO:2的位置877的位置处的氨基酸的改变。在实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置877的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Ala取代。在另一实施例中，变体包含SEQ ID NO:2的取代D877A，或由SEQ ID NO:2的取代D877A组成。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

材料与方法

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

使用标准教科书程序，采用商业热循环仪和来自商业供应商的Ready-To-Go PCRbeads，Phusion聚合酶或RED-TAQ聚合酶进行PCR扩增。

LB琼脂：参见EP 0 506 780。

LBPSG琼脂板含有LB琼脂，补充有磷酸盐(0.01M K3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)；参见EP 0 805 867B1。

TY(液体肉汤培养基；参见WO 94/14968,第16页。

寡核苷酸引物获得自DNA技术公司(DNA technology)(奥尔胡斯，丹麦)或西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(丹麦)。用可商购的试剂盒和试剂，使用标准教科书程序进行DNA操作(质粒和基因组DNA制备、限制性消化、纯化、连接、DNA测序)。

在一些情况下，使用来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的TempliPhi试剂盒，在等温滚环扩增反应中扩增连接混合物。

使用两步式程序(Yasbin等人,1975,J.Bacteriol.[细菌学杂志]121:296-304)或一步式程序将DNA引入到枯草芽孢杆菌经提炼的天然感受态细胞中，其中将来自琼脂板的细胞材料再悬浮于Spizisen 1培养基(12ml)(WO 2014/052630)中，在37℃以200rpm振荡大约4小时，将DNA添加至400微升等分试样中，并且在选择性琼脂板上铺板之前，将这些等分试样在所希望的温度下，以150rpm振荡另外1小时。

使用含有pLS20的经修饰的枯草芽孢杆菌供体菌株BKQ2527，基本上如前所述的(EP 2029732 B1)，通过来自枯草芽孢杆菌的接合，将DNA引入到地衣芽孢杆菌中，其中甲基化酶基因M.bli1904II(US 20130177942)从在amyE基因座处的三联启动子表达，pBC16衍生的orfβ和枯草芽孢杆菌comS基因(和卡那霉素抗性基因)从在alr基因座处的三联启动子表达(使得需要D-丙氨酸菌株)，并且枯草芽孢杆菌comK基因从在xylA基因座处的甘露糖诱导型启动子表达。

枯草芽孢杆菌JA1343：JA1343是PL1801的孢子形成阴性衍生物(WO 2005042750)。部分spollAC基因已经被删除，以获得孢子形成阴性表型。

实例中描述的所有构建都是从基因艺术-赛默飞世尔科技公司(GeneArt-ThermoFisher Scientific)订购的合成DNA片段组装而成。如实例中所述，片段通过序列重叠延伸(SOE)进行组装。对于质粒构建，主要使用了延长的重叠延伸PCR(POE-PCR)，其产生了多聚体质粒，如前所述(You等人2012.Simple cloning via direct transformation ofPCR product(DNA multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.[通过将PCR产物(DNA多聚体)直接转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌进行简单克隆]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]78(5):1593-1595)。

根据先前描述的方法(美国专利号5,843,720)，通过染色体整合与切割将本专利中使用的温度敏感性质粒并入地衣芽孢杆菌的基因组中。含质粒的地衣芽孢杆菌转化体在50℃在具有红霉素的LBPG选择性培养基上生长，以迫使载体在相同的序列处整合到染色体上。基于其在50℃、在LBPG+红霉素选择性培养基上生长的能力来选择所希望的整合体。然后，使整合体于34℃无选择性地生长在LBPG板上，以允许切割整合的质粒。然后使细胞在液体LBPG培养基中在37℃生长持续6-8小时。然后将培养物铺在LBPG板上并且针对红霉素-敏感性进行筛选。检查敏感性克隆是否正确整合了所需的构建体。

通过使用来自凯杰公司(Qiagen)的可商购的QIAamp DNA血液试剂盒，从以上几种红霉素敏感的分离物中制备基因组DNA。

标准分批给料培养程序

所有生长培养基通过本领域中已知的方法进行灭菌。除非另外描述，使用自来水。在下面的配方中提及的成分浓度是任何接种之前的浓度。

第一接种物培养基：SSB4琼脂。大豆蛋白胨SE50MK(DMV)10g/l；蔗糖10g/l；磷酸氢二钠，2H₂O 5g/l；磷酸二氢钾2g/l；柠檬酸0.2g/l；维生素(硫胺盐酸盐1 1,4mg/l；核黄素0.95mg/l；烟酰胺7.8mg/l；D-泛酸钙9.5mg/l；盐酸吡哆醛1.9mg/l；D-生物素0.38mg/l；叶酸2.9mg/l)；痕量金属(MnSO₄，H₂O 9.8mg/l；FeSO₄，7H₂O 39.3mg/l；CuSO₄，5H₂O 3.9mg/l；ZnSO₄，7H₂O 8.2mg/l)；琼脂25g/l。使用去离子水。使用NaOH将pH调节至pH 7.3至7.4。

转移缓冲液。M-9缓冲液(使用去离子水)：磷酸氢二钠，2H20 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁，7H20 0.2g/l。

接种物摇瓶培养基(浓度是接种之前的浓度)：PRK-50：10g/l大豆粒；磷酸氢二钠，2H₂O 5g/l；在灭菌之前，使用NaOH/H₃PO₄将pH调节至8.0。

组成培养基(浓度是接种之前的浓度)：胰蛋白胨(来自Difco的酪蛋白水解物)30g/l；硫酸镁，7H₂O 4g/l；磷酸氢二钾7g/l；磷酸氢二钠，2H₂O 7g/l；硫酸二铵4g/l；硫酸钾5g/l；柠檬酸0.78g/l；维生素(硫胺盐酸盐34.2mg/l；核黄素2.8mg/l；烟酰胺23.3mg/l；D-泛酸钙28.4mg/l；盐酸吡哆醛5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；叶酸2.5mg/l)；痕量金属(MnSO₄，H₂O 39.2mg/l；FeSO₄，7H₂O 157mg/l；CuS04，5H₂O 15.6mg/l；ZnSO₄，7H₂O 32.8mg/l)；消泡剂(SB2121)1.25ml/l；在灭菌之前，使用NaOH/H3P04将pH调节至6.0。

补料培养基：蔗糖708g/l；

接种步骤：首先，在37℃下，使菌株在SSB-4琼脂斜面上生长1天。然后，使用M-9缓冲液洗涤琼脂，并且在650nm处测量所得细胞悬浮液的光密度(OD)。使用OD(650nm)x ml细胞悬浮液＝0.1的接种物来接种接种物摇瓶(PRK-50)。将摇瓶在37℃下、在300rpm处孵育20小时。通过用来自该摇瓶的生长培养物接种主发酵罐来开始主发酵罐(发酵器)中的发酵。接种体积是制备培养基的11％(对于720ml制备培养基而言，是80ml)。

使用配备以下项的标准实验室发酵罐：温度控制系统，使用氨水和磷酸的pH控制，用于贯穿整个发酵过程测量氧饱和度的溶氧电极。

发酵参数：温度：30℃-42℃；使用氨水和磷酸将pH保持在6.8与7.2之间；对照：6.8(氨水)；7.2磷酸；

通气：1.5升/min/kg培养液重量。

搅拌：1500rpm。

补料策略：0hr。接种之后，0.05g/min/kg初始培养液；8hr。接种之后，0.156g/min/kg初始培养液；结束：接种之后，0.156g/min/kg初始培养液。

实验装置：在恒定搅拌下将培养运行五天，并且在此时期，在线跟踪氧张力。并排比较不同菌株。

通过标准技术使用来自罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH)/日立公司(Hitachi)的AMYL试剂盒(参考号11876473)进行淀粉酶活性的测量。

在全培养液细胞培养物上进行GFP荧光测量。将培养物稀释并在来自分子仪器公司(Molecular Devices)的SpectraMax M2上直接测量。

菌株

PL1801：这种菌株是具有分别编码碱性蛋白酶和中性蛋白酶的破坏的aprE和nprE基因的枯草芽孢杆菌DN 1885(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,

C.(1990)Cloning of aldB,which encodes alpha-acetolactatedecarboxylase,an exoenzyme from Bacillus brevis.[aldB的克隆，该aldB编码α-乙酰乳酸脱羧酶，一种来自短芽孢杆菌的胞外酶]J.Bacteriol.[细菌学杂志],172,4315-4321)。

JA1343：这种菌株是具有破坏的spollAC基因(sigF)的枯草芽孢杆菌PL1801。该基因型是：aprE，nprE，amyE，spollAC。

PP2307：这种枯草芽孢杆菌菌株是JA1343，其具有插入pel基因的表达盒，该pel基因含有驱动comS的P3启动子和卡那霉素标记。

PP5625：这种菌株是枯草芽孢杆菌菌株JA1343，其具有插入pel基因座处的gfp基因、gDNA(gfp)和spec标记。

MOL3268：这种菌株是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入amyE基因座处的mad7d基因和cat标记。

AEB1517：这种菌株是用于接合地衣芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌供体菌株，如在几个专利(US 5695976 A、US 5733753 A、US 5843720 A、US 5882888 A、WO 2006042548 A1)中所述。该菌株含有pLS20并且该甲基化酶基因M.bli1904II(US 20130177942)从在amyE基因座处的三联启动子表达，pBC16衍生的orfβ和枯草芽孢杆菌comS基因(和卡那霉素抗性基因)从在alr基因座处的三联启动子表达(使得需要D-丙氨酸菌株)。

BKQ2284：这种菌株是枯草芽孢杆菌AEB1517，其具有插入xylA基因座处的表达盒，该表达盒含有驱动comK表达的甘露醇诱导型启动子和氯霉素标记。

BKQ2527：这种枯草芽孢杆菌菌株是缺失了氯霉素标记的BKQ2284。

SJ4671：这种地衣芽孢杆菌菌株具有两个在染色体上的原始amyL基因座处整合的amyL基因拷贝。两个拷贝以相反的方向插入，使得两个拷贝的转录是反向平行的。这些拷贝间隔大约2.5kb，其来源于枯草芽孢杆菌染色体(US 6100063)的非功能性DNA。

SJ6026：这种地衣芽孢杆菌菌株有四个在amyL、xyl和gnt基因座处整合的amyL基因拷贝。

MOL2173：这种地衣芽孢杆菌菌株有四个在amyL、xyl和gnt基因座处整合的amyL基因拷贝和一个在mprL基因座处插入的另外的prsA基因。

MOL2212：这种地衣芽孢杆菌菌株是MOL2173利福平抗性分离株。

PP5007：这是地衣芽孢杆菌菌株MOL2212，其中天然catL基因是失活的。该菌株是氯霉素敏感性的。

BKQ3716：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS1和cat标记。

BKQ3717：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS2和cat标记。

BKQ3718：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS3和cat标记。

BKQ3775：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS4和cat标记。

BKQ3776：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS5和cat标记。

BKQ3777：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS6和cat标记。

BKQ3778：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS7和cat标记。

BKQ3801：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS8和cat标记。

BKQ3803：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS9和cat标记。

BKQ3805：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS10和cat标记。

BKQ3809：这是枯草芽孢杆菌菌株PP5625，其具有插入pel基因座处的温度敏感性mad7d基因变体TS11和cat标记。

BKQ3934：这是地衣芽孢杆菌菌株PP5007，其中在forD基因座处插入含有mad7d基因、gDNA(P4199)和cat的表达盒。

BKQ3913：这是地衣芽孢杆菌菌株PP5007，其中在forD基因座处插入含有mad7d变体TS6、gDNA(P4199)和cat的表达盒。

BKQ3917：这种地衣芽孢杆菌菌株是PP5007，其中在forD基因座处插入含有mad7d变体TS7、gDNA(P4199)和cat的表达盒。

BKQ3948：这种地衣芽孢杆菌菌株是PP5007，其中在forD基因座处插入含有mad7d变体TS5、gDNA(P4199)和cat的表达盒。

质粒

pC194：从金黄色葡萄球菌中分离的质粒(Horinouchi和Weisblum,1982)。

pE194：从金黄色葡萄球菌中分离的质粒(Horinouchi和Weisblum,1982)。

pUB110：分离的质粒来自(McKenzie等人,1986)

pBKQ3825：具有温度敏感来源和编码红霉素抗性的erm基因的质粒。该质粒包含地衣芽孢杆菌的forD的侧翼区，这使得染色体能够整合到forD基因座中。在侧翼区之间插入了mad7d基因、从PamyQsc启动子表达的gDNA(P4199)和赋予氯霉素抗性的cat基因。

实例1.地衣芽孢杆菌宿主MOL2212的构建

MOL2212的完整构建是在几个连续步骤中通过如下所述的顺序质粒整合而进行的。通过PCR扩增合成DNA来组装用于整合的质粒。将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用剪接重叠PCR(SOE)使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默科技公司(ThermoScientific))如下产生单个质粒。PCR扩增反应混合物含有六种凝胶纯化的PCR产物各50ng，并用热循环仪来组装和扩增质粒。将所得的SOE产物直接用于转化枯草芽孢杆菌宿主JA1343，以建立质粒，这些质粒随后用作运载体将DNA转移和整合到地衣芽孢杆菌染色体上的特定基因座。

地衣芽孢杆菌菌株SJ4671(US 6100063)被用作宿主菌株用于插入α-淀粉酶基因amyL的另外的拷贝。SJ4671菌株已经具有两个在染色体上的原始amyL基因座处整合的amyL基因拷贝。两个拷贝以相反的方向插入，使得两个拷贝的转录是反向平行的。这些拷贝间隔大约2.5kb，其来源于枯草芽孢杆菌染色体(图1和SEQ ID NO:4)的非功能性DNA。

SJ4671菌株与质粒接合用于进一步插入两个以上的amyL基因拷贝；在xyl基因座(图2和SEQ ID NO:4)处插入一个拷贝，并在gnt基因座(图3和SEQ ID NO:5)处插入一个拷贝。这种中间菌株命名为SJ6026，并含有稳定整合到地衣芽孢杆菌的染色体中的α-淀粉酶基因amyL的四个拷贝。

SJ6026菌株通过插入编码来自地衣芽孢杆菌分子伴侣的prsA基因的另外的拷贝进一步进行了工程化。PrsA分子伴侣的过表达描述于文献中以进一步提高α-淀粉酶的生产率。另外的prsA基因被插入mprL基因座处。这种插入导致来自地衣芽孢杆菌的PrsA分子伴侣的过表达和mprL产物金属蛋白酶(图4和SEQ ID NO:6)的敲除。这种四拷贝amyL且两拷贝prsA的菌株命名为MOL2173。

最终菌株命名为MOL2212，是MOL2173的衍生物，其中rpoB基因中的自发突变被分离为一个利福平抗性菌株。

实例2.Mad7d的构建

Mad7中内切核酸酶活性的催化位点的失活是基于在近亲的FnCpf1中发现了活性位点的同源序列(Zetsche等人,2015,Cell[细胞]163,759-771)。该文章描述了Cpf1的RuvC样结构域保留了该内切核酸酶家族的所有催化残基，并因此被预测为活性内切核酸酶。证明了RuvC样结构域FnCpf1(D917A)中的一个氨基酸变化使核酸酶活性完全失活。通过将蛋白质的一部分与两种其他密切相关的蛋白质进行多重比对(用MUSCLE算法获得比对)，在Mad7中鉴定了相应的保守区域。图18显示这些蛋白质的一部分的多重比对。这些蛋白质序列来自如下生物：毛螺菌科细菌(LbCpf1)、土拉热弗朗西斯氏菌(FnCpf1)和直肠真杆菌(Mad7)并显示了在RuvC1区域中具有同一性的区域，其中Asp(D)可改变为Ala(A)。氨基酸取代D877A导致Mad7中核酸酶活性的催化位点的失活。在SOE反应中通过两个重叠引物引入氨基酸变化，随后如实例6中所述进行克隆。

实例3.地衣芽孢杆菌菌株PP5007和BKQ3934的构建。

将MOL2212菌株用作转化质粒(用于失活天然catL基因)的宿主菌株。分离到氯霉素敏感性克隆，并保存为PP5007。

PP5007菌株通过转化整合在forD基因座处并插入表达盒(由从forD启动子表达的mad7d基因、从PamyQsc启动子转录的gDNA(P4199)(SEQ ID NO:12)和赋予氯霉素抗性的cat基因组成)(图6和SEQ ID NO:8)的质粒pBKQ3825(图5，SEQ ID NO:7)进一步工程化。gDNA(P4199)被转录成gRNA(P4199)，该gRNA(P4199)指导Mad7d至P4199启动子并抑制转录。最终菌株BKQ3934中的所有四个amyL基因拷贝均表达自P4199启动子，并且Mad7d-gRNA复合物可以通过与P4199靶的强相互作用潜在地结合并且抑制α-淀粉酶的表达。图7中显示了两株地衣芽孢杆菌菌株PP5007和BKQ3934的图示。图14b中显示了与P4199启动子区域结合的CRISPRi复合物的图示。

实例4.使用PP5007和BKQ3934菌株-温度转换表达α-淀粉酶。

如上所述，对于实例3中所述的地衣芽孢杆菌菌株在30℃和42℃的温度下在分批给料培养中的α-淀粉酶生产率进行了测试。PP5007菌株具有来自四个拷贝的淀粉酶的完全表达，不具有来自Mad7d复合物的抑制并可以用作BKQ3934(其中Mad7d复合物被克隆并具有活性)的阳性对照。图8清楚地显示，无论培养温度在30℃或42℃，PP5007菌株具有淀粉酶的完全表达。相反，当菌株BKQ3934在30℃或42℃培养时，淀粉酶的生产率接近于零，这显示通过gRNA(P4199)形成的Mad7d复合物和Mad7d可以非常有效地抑制在30℃到42℃的温度区间下染色体上所有四个拷贝的淀粉酶的表达。

当PP5007分批给料发酵的温度从30℃转换为42℃时，在接下来的24-36小时观察到淀粉酶表达降低，这可能与热休克反应有关。当温度从42℃转换为30℃时，观察到淀粉酶表达降低，这是预期的，因为该淀粉酶在42℃时的表达高于30℃时的表达。

本实例中的实验显示，即使在42℃的相对较高的温度下，也不足以阻止Mad7d复合物的形成和抑制。因此，在用于嗜常温的芽孢杆菌属生物的生长的生理相容温度内不能使Mad7d复合物失活。有了这些信息，我们想筛选出去稳定的Mad7d定点变体，这些变体比当前的Mad7d蛋白具有适合的温度诱导曲线。因此，筛选对温度敏感的Mad7d蛋白有两个目标：

1)在比野生型Mad7d更低的温度下获得阻止CRISPRi复合物形成(Mad7d-gRNA)的去稳定的Mad7d蛋白。在这种情况下，这将使温度范围更适合芽孢杆菌属生物培养过程中的生理。就芽孢杆菌属而言，在30℃-33℃下完全抑制(功能性CRISPRi复合物)和在37℃下完全诱导(非功能性CRISPRi复合物)可以是对上述当前已知野生型(wt)Mad7d所示实验的一个有吸引力的替代方案。对于其他生物和过程，可替代的温度范围可以是有吸引力的并且可能是通过定点诱变Mad7d来设计。

2)Mad7d蛋白变体的获得允许通过改变温度立即去稳定和去抑制。当前的Mad7d分子与gRNA和靶DNA形成复合物，该复合物一旦建立就具有更高的温度稳定性。筛选Mad7d变体是非常有价值的，即使它已经与gRNA和DNA靶点复合在一起，也可以去稳定。此类Mad7d变体将例如使得温度诱导系统被设置，其中在培养过程中细胞生物质能在CRISPRi抑制基因表达的温度下积累，并且然后通过将温度升高到CRISPRi复合物去稳定的水平来诱导表达。

实例5.枯草芽孢杆菌中gfp和gDNA(gfp)的染色体整合

构建DNA片段以插入枯草芽孢杆菌amyE基因座处，其中编码绿色荧光蛋白GFP的gfp基因从由WO 1993010249中先前描述的amyL变体启动子P4199表达。此外，从US 6255076中描述的PamyQ共有启动子(PamyQsc)表达gDNA(gfp)(SEQ ID NO:11)。gDNA(gfp)表达具有间隔序列的gRNA(gfp)，该gRNA将Mad7d复合物指导至gfp基因上的编码靶序列。图14a中显示了与gfp基因结合的CRISPRi复合物的图示。

还包括大观霉素抗性标记来对整合进行选择。用于整合的DNA作为合成DNA订购(基因艺术-赛默飞世尔科技公司)，并克隆到如材料和方法部分所述的整合载体中。在图9中显示了amyE基因座的最终图谱。该基因座的核苷酸序列可在SEQ ID NO:9中找到。

用于PCR扩增的条件如下：使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默科技公司)通过PCR扩增对应的DNA片段。PCR扩增反应混合物含有1ul(大约0.1ug)的模板DNA、2ul的正义引物(20pmol/ul)、2ul的反义引物(20pmol/ul)、10ul的5X PCR缓冲液(具有7,5mM MgCl₂)、8ul的dNTP混合物(各1.25mM)、37ul水和0.5ul(2U/ul)DNA聚合酶混合物。使用热循环仪来扩增片段。根据制造商的说明书，使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen,Inc.)，加利福尼亚州巴伦西亚(Valencia,CA))，用1x TBE缓冲液从1.2％琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。

将PCR产物用于随后的PCR反应中，以通过剪接重叠PCR(SOE)使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默科技公司)如下产生单个片段。PCR扩增反应混合物含有两种凝胶纯化的PCR产物和合成片段各50ng，并用热循环仪组装DNA进行整合。所得到的SOE产物直接用于转化枯草芽孢杆菌宿主PP2307，通过大观霉素选择而建立整合。

最终的构建体具有从P4199启动子表达的gfp基因和从染色体(amyE基因座)上的PamyQsc启动子表达的gDNA(gfp)。将该菌株命名为PP5625(图9)。

实例6.mad7d在枯草芽孢杆菌中的染色体整合

将表达盒插入pel基因座处，其中编码Mad7d蛋白的mad7d基因从P4199*启动子表达，该启动子是P4199启动子(WO 1993010249)的具有从G到A的单个碱基变化的变体。还包括氯霉素抗性标记来选择正确的整合。用于整合的DNA作为合成DNA订购(基因艺术-赛默飞世尔科技公司)，并克隆到如材料和方法部分所述的整合载体中。在图10中显示了pel基因座的最终图谱。该基因座的核苷酸序列可在SEQ ID NO:10中找到。

PCR产物如实例1中所述制备并用于随后的PCR反应中，以通过剪接重叠PCR(SOE)使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默科技公司)如下产生单个片段。PCR扩增反应混合物含有两种凝胶纯化的PCR产物和合成片段各50ng，并用热循环仪组装并扩增DNA进行整合。将所得到的SOE产物直接用于对枯草芽孢杆菌PP5625的转化。通过对氯霉素抗性的选择，将含有mad7d基因和cat基因的DNA片段插入pel基因座处(图10)。

这种菌株命名为MOL3268，并表达Mad7d蛋白、GFP蛋白和gRNA(gfp)。在图11中说明了GFP表达如何被gfp基因内的CRISPR抑制所阻断。由于CRISPRi复合物(Mad7d-gRNA)抑制GFP的表达，菌株MOL3268在低于42℃的温度下无色。

图14a中显示了与gfp基因结合的CRISPRi复合物的图示。

实例7.影响Mad7-gRNA-DNA复合物热稳定性的氨基酸改变的鉴定

基于Cpf1内切核酸酶(PDB:5MGA)的结构从直肠真杆菌(refseq WP_055225123.1)产生了Mad7(SEQ ID NO:2)的蛋白质结构模型，而在新的结构模型中使用了指导RNA(gRNA)和来自Cas12内切核酸酶结构(PDB:5NFV)的DNA片段，以获得内切核酸酶、gRNA和DNA片段的复合物。使用PyMOL^TM分子图形系统(薛定谔有限责任公司(Schrodinger,LLC.))在计算机中分析该3D结构复合物，以鉴定对这种复合物的热稳定性具有关键重要性的氨基酸。这些氨基酸的变化将导致Mad7中去稳定的结构域-结构域相互作用、离子位点、半胱氨酸桥、柔性区(例如具有高b因子、盐桥、氢键和疏水区域)。其他氨基酸的变化会使与gRNA的相互作用以及与DNA的相互作用去稳定。

当应用选择性筛选系统时，这些变化可以单独引入，或作为选项包括在一个或多个文库中。Mad7是由1263个氨基酸组成的大分子，并且因此只有通过同时引入几个取代，才可能对于一些生物系统而言充分的去稳定。

不同概念内的氨基酸改变可以在表1-3中发现。

位于短距离内的去稳定取代组合的实例。这些可以进一步组合以使Mad7-gRNA-DNA复合物的两个或更多个区域去稳定。

I57S+M58S

F65A+L70S

E194N+F197S

K455N+A451N

K455N+A451N+E448S

L520A+N521A

L520A+N521A+P525G

L520A+F522Y

P525G+W531A

P574Q+P756G

P586G+P588S

D681H+W682A

N707A+K709N+L713A+L715A

N732S+K734N+L738A

L740A+L747S

I876A+A877H+R878S

I876Y+A877L+R878Q

E897S+Q898A+-F901A

E929S+I930S

E929S+I930S+K932N

N1004A+Y1011A

N1004K+Y1011H

C1029A+F1031S

P1196G+K1197N+D1200S

实例8.枯草芽孢杆菌中温度敏感性mad7d变体文库

如前所述，在pel基因座处插入了与实例6中所述的表达盒相同的表达盒的文库。Mad7d蛋白的不同定点变体是基于实例7中进一步描述的对Mad7结构的提议的修饰构建的。如WO 2006042548中先前描述，通过SOE-PCR引入定点变体，并克隆为DNA片段，这些DNA片段具有与枯草芽孢杆菌中的pel基因座相同的侧翼DNA。如实例6中所述，通过转化进入感受态PP5625而引入不同变体的库。pel基因座的最终图谱已如图10所示，其唯一的区别是Mad7d中不同的氨基酸变化。在42℃筛选转化体文库中的绿色荧光，以鉴定在对芽孢杆菌属生物的生理相容和相关温度区间内的温度敏感变体。随后取消选择在30℃下具有完全去抑制的菌株。表4中描述了在Mad7d中鉴定的定点氨基酸取代。

实例9.通过GFP荧光在枯草芽孢杆菌中筛选Mad7d文库

在不同温度下测试了表4中列出的不同定点Mad7d变体文库的绿色荧光。图12显示了板及其GFP荧光的实例。列出了不同变体的定性数据的表可见于表5中，其中荧光水平评分从零到四。评分零对应无荧光，并且评分四为最高荧光。

作为阴性对照，无GFP和Mad7d的菌株JA1343在所有温度下显示评分均为0。作为阳性对照，菌株PP5625在所有温度下均显示出全荧光，评分为四。具有wt Mad7d蛋白的MOL3268菌株在高达42℃时显示出对GFP荧光的完全抑制。具有五种Mad7d变体BKQ3716(TS1)、BKQ3717(TS2)、BKQ3718(TS3)、BKQ3775(TS4)和BKQ3805(TS10)的菌株在30℃下已经显示轻微去抑制。具有两种Mad7d变体BKQ3778(TS7)、BKQ3803(TS9)的菌株在34℃下开始显示去抑制，并且该具有变体BKQ3777(TS6)和BKQ3809(TS11)的两种菌株在37℃开始显示去抑制。最后，变体BKQ3776(TS5)在42℃开始显示轻微去抑制。

表中的所有Mad7d变体都显示了作为对温度的反应的去抑制模式，这与原始Mad7d序列非常不同。这将允许Mad7d的特定设计，该设计与抑制和诱导将在温度敏感性Mad7d变体和针对靶DNA的功能性gRNA的存在下发生的生物和过程相匹配。

实例10.在液体培养物中测试温度敏感性Mad7d变体。

在实例9中筛选Mad7d变体的枯草芽孢杆菌菌株也在液体培养物中进行了测试，以确定是否可以如板上的固体培养基所证明观察到对温度的反应。将两株对照菌株PP5625和MOL3268以及单独的11个变体克隆首先接种于新鲜的TY培养基中并在30℃、34℃、和37℃孵育18小时。阳性对照菌株PP5625在所有温度下都显示预期的荧光。这种菌株没有整合在染色体处的Mad7d基因，并且不能形成CRISPRi复合物以沉默gfp基因。因此，无论生长和温度如何，该菌株都能表达GFP。具有wt mad7d基因的MOL3268菌株可以形成CRISPRi复合物，并在所有温度(图13)下抑制GFP荧光蛋白的表达。这与来自实例9(在固体琼脂培养基上测试相同的两种菌株PP5625和MOL3268)的结果非常一致。从MOL3268菌株的结果得出的结论是，wt Mad7d蛋白可以在液体培养基中在高达至少37℃的温度下形成稳定的CRISPRi复合物。在液体培养基中生长的十一个Mad7d变体也显示与在琼脂板上观察到的合理相当的模式。在该实验中，板上对温度最敏感的变体也去抑制，并且已经在30℃下显示升高的荧光，例如BKQ3718和BKQ3805中的变体。其他变体例如BKQ3716、BKQ3717、BKQ3775、BKQ3803和BKQ3809中的变体在34℃下显示轻微去抑制，而在BKQ3718和BKQ3805中的变体在34℃下显示中度去抑制。在37℃下，在BKQ3776、BKQ3777、BKQ3778和BKQ3801中的变体显示轻微去抑制，而对于剩余的变体，相比于34℃，在37℃下，去抑制提高。

该实验的结论是，十一个定点Mad7d变体均显示与原始Mad7d蛋白非常不同的稳定性特性。在固体培养基和流式培养物中，所有变体都显示不同程度的温度敏感性提高。

这一发现还显示，可以以改变Mad7d-gRNA抑制剂复合物的温度稳定性的方式来将Mad7d蛋白工程化。可采用改变的温度范围来通过温度的转换来控制Mad7d-gRNA复合物的可用性，该温度的转换适合所选的宿主生物和优选生长参数的生理条件。

实例11.具有温度敏感性变体TS5、TS6和TS7的地衣芽孢杆菌菌株的构建。

将在实例9和10中描述的枯草芽孢杆菌(TS5、TS6和TS7)的Mad7d的定点变体的子集转移到地衣芽孢杆菌菌株PP5007，以研究这种生物中的抑制曲线。mad7d的三种不同变体和靶向P4199启动子的gDNA(P4199)各自通过延长的重叠延伸PCR(POE-PCR)克隆到质粒上并转化到枯草芽孢杆菌BKQ2527。所得到的质粒通过接合分别引入地衣芽孢杆菌PP5007。由从forD启动子表达的mad7d基因、从PamyQsc启动子转录的gDNA(P4199)和赋予氯霉素抗性的cat基因组成的表达盒的染色体插入是通过同源重组获得的，从而产生如图6所示的染色体结构。gDNA(P4199)被转录成gRNA(P4199)，该gRNA(P4199)指导Mad7d至P4199启动子并抑制转录。所有四个amyL基因拷贝均表达自P4199启动子，并且Mad7d-gRNA复合物可以通过与P4199靶点的强相互作用潜在地结合并且抑制α-淀粉酶的表达，如图14b所说明。除了表6中所述的Mad7d中的氨基酸取代之外，所有三个菌株都与实例3中所述的BKQ3934相同。

实例12.地衣芽孢杆菌BKQ3913和BKQ3917在分批给料发酵-温度转换中的α-淀粉酶表达。

如上所述，对于实例11中所述的两种地衣芽孢杆菌菌株在不同温度下在分批给料培养中的α-淀粉酶生产率进行了测试。这些菌株在30℃或42℃下生长两天。然后将温度分别转换到42℃和30℃，以在10个小时的时间间隔内观察P4199启动子对淀粉酶表达的影响。每天取培养物样品测量淀粉酶活性。结果如图15所示，其显示了对温度转换的明显影响。当这些菌株在42℃下生长全部五天(图15)时，观察到全淀粉酶生产率，这显示两种变体的Mad7d抑制复合物的去抑制。两天后当温度降低到30℃时，淀粉酶的生产率明显降低，表示从P4199启动子的转录受到抑制。当这些菌株在30℃下生长前两天时，具有gRNA(P4199)的Mad7d变体的存在导致淀粉酶生产率的抑制，虽然发现表达Mad7d变体TS7的BKQ3917略微有漏洞。当温度升高至42℃时，淀粉酶的生产率开始提高，其中BKQ3917(TS7)>BKQ3913(TS6)。这些数据显示，当温度升高时，对从P4199启动子的转录的抑制被去抑制。这与枯草芽孢杆菌中相同Mad7d变体在板上所观察到的结果非常一致。淀粉酶表达的提高似乎仅在温度转换后24小时才开始的这一发现可能与温度休克反应有关，如实例4中针对PP5007(无Mad7d)所述。总之，培养的地衣芽孢杆菌菌株确认了所用的Mad7d变体在用于地衣芽孢杆菌适用的温度区间内的温度敏感性。

实例13.地衣芽孢杆菌BKQ3913中Mad7d变体TS6的α-淀粉酶表达曲线。

针对α-淀粉酶生产率和对分批给料培养中温度转换的反应，对地衣芽孢杆菌菌株BKQ3913进行了进一步测试。当菌株在42℃下在四个单独的发酵过程中的前两天生长时，观察到全淀粉酶生产率(图16)。然后，在三种发酵过程中，温度分别转换下调到30℃、34℃和39℃，而第四种发酵仍维持在42℃下。在图16中显示了转换下调到30℃有效地抑制淀粉酶的表达，而转换下调到34℃也抑制淀粉酶的表达，尽管没有那么有效。转换下调到39℃使得可以完全表达，这显示该温度足以使当前的Mad7d变体去稳定以使其对于沉默P4199启动子是非功能性的。

实例14.在流式培养物中在不同的温度下培养的含有TS5、TS6和TS7的地衣芽孢杆菌菌株中的α-淀粉酶表达。

还在液体培养物中测试了实例11中所述的三种地衣芽孢杆菌菌株以确定是否可以观察到对温度的反应，如在从P4199启动子表达淀粉酶基因amyL的地衣芽孢杆菌菌株中所证明的。首先将分别含有温度敏感性Mad7d变体TS7、TS6和TS5的地衣芽孢杆菌菌株和两种对照菌株PP5007(无Mad7D)和BKQ3934(wt Mad7d)接种在新鲜的TY培养基中并在30℃孵育18小时。次日，将这些培养物用于在四个10ml TY培养基中各自接种20μl的培养物。将这些培养物在30℃、34℃、37℃和42℃孵育持续20小时。孵育后，取出样品以如前所述测量淀粉酶活性。

不具有Mad7d的对照菌株PP5007在34℃、37℃和42℃下显示出良好的淀粉酶表达。由于这种菌株没有整合在染色体处的Mad7d基因，因此它不能形成抑制性CRISPRi复合物以沉默P4199启动子。因此，无论生长和温度如何，该菌株都能表达淀粉酶。相反，BKQ3934中wtMad7d的存在导致在所有测试温度下基因表达几乎完全沉默。在这种菌株中，可以形成一种非常有效的CRISPRi复合物，并且该复合物可以在所有温度下抑制来自P4199启动子的表达(图17)。

具有不同Mad7d变体的三种测试的地衣芽孢杆菌菌株显示出不同程度的P4199启动子的去抑制。在测试的变体中，温度敏感变体的程度排序为TS7>TS6>TS5，其中TS7和T6在34℃时已经显示出中度去抑制，而TS5仅在42℃时显示出完全去抑制。

该实验的结论是，在地衣芽孢杆菌中测试的Mad7d变体也显示出与原始Mad7d蛋白非常不同的稳定性特性。这些结果进一步支持了，可采用不同的Mad7d变体来通过温度的转换以控制Mad7d-gRNA复合物的可用性，该温度的转换适合所选的宿主生物和优选生长参数的生理条件。

优选的实施例

1)一种RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入。

2)根据第一实施例所述的变体，所述变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

3)根据实施例1-2中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

4)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

5)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

6)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

7)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

8)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

9)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

10)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

11)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

12)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

13)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

14)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

15)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

16)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

17)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

18)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

19)根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

20)根据前述实施例中任一项所述的变体，其具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

21)根据前述实施例中任一项所述的变体，其具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

22)根据前述实施例中任一项所述的变体，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

23)一种编码RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的多核苷酸，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入；优选地，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。

24)根据实施例23所述的多核苷酸，其中该变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

25)根据实施例23-24中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

26)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

27)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

28)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

29)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

30)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

31)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

32)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

33)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

34)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

35)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

36)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

37)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

38)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

39)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

40)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

41)根据实施例23-25中任一项所述的多核苷酸，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

42)根据实施例23-41中任一项所述的多核苷酸，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

43)根据实施例23-42中任一项所述的多核苷酸，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

44)根据实施例23-43中任一项所述的多核苷酸，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

45)一种核酸构建体，该核酸构建体包含编码RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的多核苷酸，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入；优选地，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。

46)根据实施例45所述的核酸构建体，其中该变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

47)根据实施例45-46中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

48)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

49)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

50)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

51)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

52)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

53)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

54)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

55)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

56)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

57)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

58)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

59)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

60)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

61)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

62)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

63)根据实施例45-47中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

64)根据实施例45-63中任一项所述的核酸构建体，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

65)根据实施例45-64中任一项所述的核酸构建体，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

66)根据实施例45-65中任一项所述的核酸构建体，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

67)一种表达载体，该表达载体包含：

一种编码RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的多核苷酸，其中该变体与SEQID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入；优选地，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性；和/或

一种包含所述多核苷酸的核酸构建体。

68)根据实施例67所述的表达载体，其中该变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

69)根据实施例67-68中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

70)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

71)根据实施例67-70中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

72)根据实施例67-71中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

73)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

74)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

75)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

76)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

77)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

78)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

79)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

80)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

81)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

82)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

83)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

84)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

85)根据实施例67-69中任一项所述的表达载体，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

86)根据实施例67-85中任一项所述的表达载体，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

87)根据实施例67-86中任一项所述的表达载体，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

88)根据实施例67-87中任一项所述的表达载体，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

89)一种宿主细胞，该宿主细胞包含：

一种RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入；和/或

一种编码所述变体的多核苷酸；优选地，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性；和/或

一种包含所述多核苷酸的核酸构建体；和/或

一种包含所述多核苷酸和/或所述核酸构建体的表达载体。

90)根据实施例89所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核或原核宿主细胞。

91)根据实施例89-90中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的微生物宿主细胞：细菌、真菌、酵母和古细菌宿主细胞。

92)根据实施例89-91中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的细菌宿主细胞：芽孢杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属细胞；优选地，该宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、淀粉乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、禾口鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、雷曼氏乳酸杆菌、唾液乳杆菌、韩中大乳球菌、福尔摩沙乳球菌、富士山乳球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌、台湾乳球菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞；更优选地，该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。

93)根据实施例89-91中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的丝状真菌宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞。

94)根据实施例89-92中的任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的酵母宿主细胞：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属和耶氏酵母属细胞；优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、和解脂耶氏酵母细胞。

95)根据实施例89-94中任一项所述的宿主细胞，其中该变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

96)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

97)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

98)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

99)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

100)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

101)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

102)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

103)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

104)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

105)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

106)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

107)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

108)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

109)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

110)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

111)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

112)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

113)根据实施例89-95中任一项所述的宿主细胞，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

114)根据实施例89-113中任一项所述的宿主细胞，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

115)根据实施例89-114中任一项所述的宿主细胞，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

116)一种诱导一个或多个目的DNA靶序列表达的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含：

一种编码无催化活性的RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体的多核苷酸，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入；优选地，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性；和/或

一种包含所述多核苷酸的核酸构建体；和/或

一种包含所述多核苷酸和/或所述核酸构建体的表达载体；

所述宿主细胞进一步包含一个或多个gRNA和一个或多个目的DNA靶序列；

117)根据实施例116所述的方法，其中该宿主细胞是真核或原核宿主细胞。

118)根据实施例116-117中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的微生物宿主细胞：细菌、真菌、酵母和古细菌宿主细胞。

119)根据实施例116-118中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的细菌宿主细胞：芽孢杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属细胞；优选地，该宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、淀粉乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、禾口鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、雷曼氏乳酸杆菌、唾液乳杆菌、韩中大乳球菌、福尔摩沙乳球菌、富士山乳球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌、台湾乳球菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞；更优选地，该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。

120)根据实施例116-118中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的丝状真菌宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞。

121)根据实施例116-118中的任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的酵母宿主细胞：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属和耶氏酵母属细胞；优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、和解脂耶氏酵母细胞。

122)根据实施例116-121中任一项所述的方法，其中该变体包含对应于SEQ IDNO:2的位置877的氨基酸的改变；优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

123)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

124)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

125)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

126)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

127)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

128)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

129)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

130)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

131)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

132)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

133)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

134)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

135)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

136)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

137)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

138)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

139)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

140)根据实施例116-122中任一项所述的方法，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

141)根据实施例116-140中任一项所述的方法，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

142)根据实施例116-141中任一项所述的方法，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

143)根据实施例116-141中任一项所述的方法，所述方法包括以下另外的步骤：

d)将温度降低至该变体的许可温度，其中该变体、该一个或多个gRNA和该一个或多个DNA靶序列在该宿主细胞中形成复合物，并培养该宿主细胞，由此抑制该一个或多个DNA靶序列的表达。

144)一种抑制一个或多个目的DNA靶序列的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含：

一种包含所述多核苷酸的核酸构建体；和/或

一种包含所述多核苷酸和/或所述核酸构建体的表达载体；

145)根据实施例144所述的方法，其中该宿主细胞是真核或原核宿主细胞。

146)根据实施例144-145中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的微生物宿主细胞：细菌、真菌、酵母和古细菌宿主细胞。

147)根据实施例144-146中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的细菌宿主细胞：芽孢杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属细胞；优选地，该宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、淀粉乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、禾口鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、雷曼氏乳酸杆菌、唾液乳杆菌、韩中大乳球菌、福尔摩沙乳球菌、富士山乳球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌、台湾乳球菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞；更优选地，该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。

148)根据实施例144-146中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的丝状真菌宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞。

149)根据实施例144-146中的任一项所述的方法，其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的酵母宿主细胞：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属和耶氏酵母属细胞；优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、和解脂耶氏酵母细胞。

150)根据实施例144-149中任一项所述的方法，其中该变体包含对应于SEQ IDNO:2的位置877的氨基酸的改变；优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

151)根据实施例144-150中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

152)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

153)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的707、708、709、723、833、834和836。

154)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、927、1118、1127、1128、1163和1167。

155)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、164、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、554、571、574、586、588、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

156)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、709、713、715、732、734、738、740、747、756、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

157)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个gRNA之间形成的复合物的稳定性和/或对于RNA指导的内切核酸酶和一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的位置处；优选地，该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的159、165、294、535、590、594、649、707、708、709、723、833、834、836、927、1118、1127、1128、1163和1167。

158)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

159)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的531和1034；699和1094；732、734、738和1213；70和708；132；1029和1031；732、734和738；520、522、897、898和901；57、58、732、734和738；732、734、738、897、898、901；以及220、732、734和738。

160)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

161)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H和Y836N。

162)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

163)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

164)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

165)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：R159K、R159H、R159Q、R159N、K165R、K165H、K165Q、K165N、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、K535R、K535H、K535Q、K535N、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H和R1167N。

166)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变是选自由以下组成的组的取代：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

167)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该至少一个改变包括W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

168)根据实施例144-151中任一项所述的方法，其中该变体具有等于或低于选自由以下组成的组的温度的许可温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更低、26℃或更低、27℃或更低、28℃或更低、29℃或更低、30℃或更低、31℃或更低、32℃或更低、33℃或更低、34℃或更低、35℃或更低、36℃或更低、37℃或更低、38℃或更低、39℃或更低、40℃或更低、41℃或更低、42℃或更低、43℃或更低、44℃或更低、和45℃或更低；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该许可温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

169)根据实施例144-168中任一项所述的方法，其中该变体具有等于或高于选自由以下组成的组的温度的限制性温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃或更高、26℃或更高、27℃或更高、28℃或更高、29℃或更高、30℃或更高、31℃或更高、32℃或更高、33℃或更高、34℃或更高、35℃或更高、36℃或更高、37℃或更高、38℃或更高、39℃或更高、40℃或更高、41℃或更高、42℃或更高、43℃或更高、44℃或更高、和45℃或更高；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-28℃、26℃-29℃、27℃-30℃、28℃-31℃、29℃-32℃、30℃-33℃、31℃-34℃、32℃-35℃、33℃-36℃、34℃-37℃、35℃-38℃、36℃-39℃、37℃-40℃、38℃-41℃、39℃-42℃、40℃-43℃、41℃-44℃和42℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-29℃、26℃-30℃、27℃-31℃、28℃-32℃、29℃-33℃、30℃-34℃、31℃-35℃、32℃-36℃、33℃-37℃、34℃-38℃、35℃-39℃、36℃-40℃、37℃-41℃、38℃-42℃、39℃-43℃、40℃-44℃、41℃-45℃；优选地，该限制性温度是选自由以下组成的组的温度范围：25℃-30℃、26℃-31℃、27℃-32℃、28℃-33℃、29℃-34℃、30℃-35℃、31℃-36℃、32℃-37℃、33℃-38℃、34℃-39℃、35℃-40℃、36℃-41℃、37℃-42℃、38℃-42℃、39℃-44℃和40℃-45℃。

170)根据实施例144-169中任一项所述的方法，其中该变体具有高于该许可温度的限制性温度。

171)根据实施例144-149中任一项所述的方法，所述方法包括以下另外的步骤：

172)根据权利要求116-171中任一项所述的方法，其中该一个或多个DNA靶序列包含至少20个核苷酸并进一步包含或侧接针对根据权利要求1-7中任一项所述的变体的功能性PAM序列；优选地，该一个或多个DNA靶序列包含在编码多肽的可读框中或包含在启动子区域中。

173)根据实施例116-172中任一项所述的方法，其中该一个或多个目的DNA靶序列编码一个或多个选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该一个或多个酶是α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。

174)根据实施例1-22中任一项所述的变体、根据实施例23-44中任一项所述的多核苷酸、根据实施例45-66中任一项所述的核酸构建体、根据实施例67-88中任一项所述的表达载体、根据实施例89-115中的任一项所述的宿主细胞、和/或根据实施例116-173中任一项所述的方法在药物或化妆品中的用途。

175)根据实施例1-22中任一项所述的变体、根据实施例23-44中任一项所述的多核苷酸、根据实施例45-66中任一项所述的核酸构建体、根据实施例67-88中任一项所述的表达载体、根据实施例89-115中的任一项所述的宿主细胞、和/或根据实施例116-173中的任一项所述的方法在医学或生物技术研究或生产中的用途。

176)根据实施例1-22中任一项所述的变体、根据实施例23-44中任一项所述的多核苷酸、根据实施例45-66中任一项所述的核酸构建体、根据实施例67-88中任一项所述的表达载体、根据实施例89-115中任一项所述的宿主细胞、和/或根据实施例116-173中任一项所述的方法在基因组编辑、基因表达的调节或CRISPR抑制中的用途。

177)根据实施例1-22中任一项所述的变体、根据实施例23-44中任一项所述的多核苷酸、根据实施例45-66中任一项所述的核酸构建体、根据实施例67-88中任一项所述的表达载体、根据实施例89-115的任一项所述的宿主细胞、和/或根据实施例116-173中任一项所述的方法在酶研究、开发和/或生产中的用途。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 温度敏感性的RNA指导的内切核酸酶

<130> 15037-WO-PCT

<160> 19

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 3792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mad7 DNA序列，针对地衣芽孢杆菌进行了密码子优化

<400> 1

atgaataatg gcacaaataa cttccagaac ttcattggca ttagcagcct gcaaaaaaca 60

ctgagaaatg cactgattcc gacagaaaca acacagcagt ttattgtcaa aaacggcatc 120

atcaaagagg atgaactgag aggcgaaaat cgccaaattc tgaaagatat catggacgac 180

tattaccgtg gctttatttc agaaacactg tccagcattg atgatatcga ttggacaagc 240

ctgttcgaga aaatggaaat ccaactgaaa aacggcgata acaaagacac gctgattaaa 300

gaacaaacgg aatatcgcaa agcgatccac aaaaagtttg caaatgatga ccgctttaaa 360

aacatgttca gcgcgaaact gattagcgat attctgccgg aatttgtcat ccacaataat 420

aactatagcg cgagcgagaa agaagaaaaa acacaggtca ttaaactgtt tagccgcttt 480

gccacaagct tcaaagacta tttcaaaaat cgcgcaaact gctttagcgc agatgatatt 540

tcatcatcaa gctgccatcg gattgtcaat gataatgcgg aaatcttttt tagcaacgca 600

ctggtctatc gcagaattgt taaatcattg agcaacgacg acatcaacaa aatctcaggc 660

gatatgaaag acagcctgaa agaaatgtca ctggaagaaa tctacagcta cgaaaaatac 720

ggcgaattta tcacacaaga aggcatcagc ttttacaacg atatttgcgg caaagtcaac 780

agctttatga atctgtattg ccagaaaaac aaagaaaaca aaaacctgta taaactgcag 840

aaactgcaca agcagattct gtgcattgca gatacatcat atgaagtccc gtacaaattt 900

gagagcgacg aagaagttta tcaaagcgtt aatggctttc tggataacat cagcagcaaa 960

catattgttg aacgcctgag aaaaattggc gataactata atggctacaa cctggacaaa 1020

atctacatcg tcagcaaatt ttacgaaagc gtcagccaaa aaacatatcg cgattgggaa 1080

acaattaata cagcgctgga aattcattat aacaacattc tgcctggcaa cggcaaaagc 1140

aaagcagata aagttaaaaa ggcggtcaaa aatgacctgc agaaaagcat tacagaaatc 1200

aatgaactgg tcagcaacta caaactgtgc tcagatgata atatcaaggc ggaaacgtac 1260

atccatgaaa ttagccatat cctgaacaac tttgaagcgc aagaactgaa atataacccg 1320

gaaatccatc tggttgaaag cgaactgaaa gcaagcgagc tgaaaaatgt tctggatgtc 1380

attatgaatg cgtttcattg gtgcagcgtc tttatgacag aagaactggt cgataaagat 1440

aacaactttt atgcggaact ggaagagatt tacgacgaaa tttatccggt catcagcctg 1500

tataatctgg ttcgcaatta tgtcacacag aaaccgtata gcacgaagaa aatcaaactg 1560

aactttggca ttccgacact ggcagatggc tggtcaaaat caaaagaata tagcaacaac 1620

gcgatcatcc tgatgcgcga taatctttat tatctgggca ttttcaacgc gaaaaacaag 1680

ccggacaaaa aaatcatcga aggcaatacg tcagagaaca aaggcgacta taaaaagatg 1740

atctataatc tgcttccggg accgaataaa atgatcccga aagtttttct gtcaagcaaa 1800

acaggcgtcg aaacatataa accgtcagcg tatattctgg aaggctacaa acagaacaaa 1860

cacatcaaaa gcagcaagga ctttgacatc acattttgcc atgatctgat cgactacttt 1920

aagaactgca ttgcaattca tccggaatgg aaaaacttcg gctttgattt ttcagacacg 1980

agcacgtatg aagatatcag cggcttttat agagaagttg aactgcaggg ctataaaatc 2040

gactggacat atatcagcga aaaggatatt gatctgctgc aagaaaaagg ccaactgtac 2100

ctgtttcaga tctacaacaa agacttcagc aaaaaaagca cgggcaatga taacctgcat 2160

acgatgtacc tgaaaaacct ttttagcgaa gagaacctga aagacattgt cctgaaactg 2220

aatggcgaag ccgaaatttt ctttcgcaaa tccagcatta aaaacccgat catccataaa 2280

aaaggcagca ttctggttaa ccgcacatat gaagcggaag aaaaagatca gtttggcaac 2340

attcagatcg tccgcaaaaa cattccggaa aacatttatc aagaactgta caaatacttt 2400

aacgataaaa gcgataaaga actgtccgac gaagcagcga aacttaaaaa tgttgttggc 2460

catcatgaag cggcaacaaa cattgttaaa gactatcgct atacgtacga taaatacttt 2520

ctgcatatgc cgatcacgat caacttcaaa gcaaataaaa cgggctttat caacgatcgc 2580

attctgcagt atattgccaa agaaaaggat ctgcatgtca tcggcattga tagaggcgaa 2640

cgcaatctga tttatgtcag cgttattgat acatgcggca acattgtcga acagaaaagc 2700

tttaacattg tcaacggcta tgactaccag atcaagctga aacagcaaga aggcgcaaga 2760

caaattgctc gcaaagaatg gaaagaaatc ggcaagatca aagaaattaa agagggctat 2820

ctgagcctgg tcattcatga aatttctaaa atggtcatca aatataacgc gattatcgcc 2880

atggaagatc tgtcatatgg ctttaagaaa ggccgtttta aagtcgaaag acaggtctac 2940

cagaaattcg aaacaatgct gattaacaaa ctgaattatc tggtgtttaa agacatcagc 3000

atcacggaaa atggcggact gctgaaaggc tatcaactga catatattcc ggataagctt 3060

aaaaacgtcg gccatcaatg cggctgcatc ttttatgttc cggcagcgta tacatcaaaa 3120

attgatccga caacaggctt tgtcaacatc ttcaaattca aagatctgac ggtcgatgcg 3180

aaacgcgaat tcattaagaa atttgacagc atccgctacg acagcgagaa aaatcttttc 3240

tgctttacgt tcgactacaa caactttatc acgcagaata cggttatgtc aaaaagcagc 3300

tggtcagtct atacatatgg cgttagaatt aaacgcagat ttgtgaacgg cagatttagc 3360

aatgaaagcg atacaatcga catcacgaaa gacatggaaa aaacgcttga aatgacggat 3420

attaactggc gtgatggaca tgatcttcgc caggatatta tcgattatga aatcgtccag 3480

cacatctttg aaatctttag actgacagtc caaatgcgca attcactgtc agaacttgaa 3540

gatagagatt atgatcgcct gatttctccg gtcctgaatg aaaataacat cttttacgat 3600

agcgcaaaag caggcgacgc actgccgaaa gatgcggatg caaatggcgc atattgcatt 3660

gcactgaaag gcctgtatga aatcaaacaa atcaccgaga attggaaaga ggacggcaaa 3720

ttttcacggg ataaactgaa aatcagcaac aaggactggt ttgacttcat ccaaaataag 3780

cgctacctgt aa 3792

<210> 2

<211> 1263

<212> PRT

<213> 直肠真杆菌（Eubacterium rectale）

<400> 2

Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln

20 25 30

Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly

35 40 45

Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly

50 55 60

Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser

65 70 75 80

Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp

85 90 95

Thr Leu Ile Lys Glu Gln Thr Glu Tyr Arg Lys Ala Ile His Lys Lys

100 105 110

Phe Ala Asn Asp Asp Arg Phe Lys Asn Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile

115 120 125

Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala

130 135 140

Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe

145 150 155 160

Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser

165 170 175

Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys His Arg Ile Val Asn Asp Asn

180 185 190

Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys

195 200 205

Ser Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys Ile Ser Gly Asp Met Lys Asp

210 215 220

Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys

245 250 255

Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu

260 265 270

Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Gln Lys Leu His Lys Gln Ile Leu Cys

275 280 285

Ile Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Val Pro Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Glu

290 295 300

Glu Val Tyr Gln Ser Val Asn Gly Phe Leu Asp Asn Ile Ser Ser Lys

305 310 315 320

His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr

325 330 335

Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser

340 345 350

Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile

355 360 365

His Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Gly Asn Gly Lys Ser Lys Ala Asp Lys

370 375 380

Val Lys Lys Ala Val Lys Asn Asp Leu Gln Lys Ser Ile Thr Glu Ile

385 390 395 400

Asn Glu Leu Val Ser Asn Tyr Lys Leu Cys Ser Asp Asp Asn Ile Lys

405 410 415

Ala Glu Thr Tyr Ile His Glu Ile Ser His Ile Leu Asn Asn Phe Glu

420 425 430

Ala Gln Glu Leu Lys Tyr Asn Pro Glu Ile His Leu Val Glu Ser Glu

435 440 445

Leu Lys Ala Ser Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Val Ile Met Asn Ala

450 455 460

Phe His Trp Cys Ser Val Phe Met Thr Glu Glu Leu Val Asp Lys Asp

465 470 475 480

Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Pro

485 490 495

Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro

500 505 510

Tyr Ser Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Gly Ile Pro Thr Leu Ala

515 520 525

Asp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Tyr Ser Asn Asn Ala Ile Ile Leu

530 535 540

Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys

545 550 555 560

Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp

565 570 575

Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile

580 585 590

Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro

595 600 605

Ser Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Tyr Lys Gln Asn Lys His Ile Lys Ser

610 615 620

Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe

625 630 635 640

Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp

645 650 655

Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys

675 680 685

Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile

725 730 735

Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser

740 745 750

Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg

755 760 765

Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln Phe Gly Asn Ile Gln Ile Val

770 775 780

Arg Lys Asn Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Phe

785 790 795 800

Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser Asp Glu Ala Ala Lys Leu Lys

805 810 815

Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala Thr Asn Ile Val Lys Asp Tyr

820 825 830

Arg Tyr Thr Tyr Asp Lys Tyr Phe Leu His Met Pro Ile Thr Ile Asn

835 840 845

Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile Asn Asp Arg Ile Leu Gln Tyr

850 855 860

Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu

865 870 875 880

Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile Asp Thr Cys Gly Asn Ile Val

885 890 895

Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile Lys

900 905 910

Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln Ile Ala Arg Lys Glu Trp Lys

915 920 925

Glu Ile Gly Lys Ile Lys Glu Ile Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Val

930 935 940

Ile His Glu Ile Ser Lys Met Val Ile Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala

945 950 955 960

Met Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Phe Lys Lys Gly Arg Phe Lys Val Glu

965 970 975

Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Thr Met Leu Ile Asn Lys Leu Asn

980 985 990

Tyr Leu Val Phe Lys Asp Ile Ser Ile Thr Glu Asn Gly Gly Leu Leu

995 1000 1005

Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Ile Pro Asp Lys Leu Lys Asn Val

1010 1015 1020

Gly His Gln Cys Gly Cys Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr

1025 1030 1035

Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Ile Phe Lys Phe

1040 1045 1050

Lys Asp Leu Thr Val Asp Ala Lys Arg Glu Phe Ile Lys Lys Phe

1055 1060 1065

Asp Ser Ile Arg Tyr Asp Ser Glu Lys Asn Leu Phe Cys Phe Thr

1070 1075 1080

Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Ile Thr Gln Asn Thr Val Met Ser Lys

1085 1090 1095

Ser Ser Trp Ser Val Tyr Thr Tyr Gly Val Arg Ile Lys Arg Arg

1100 1105 1110

Phe Val Asn Gly Arg Phe Ser Asn Glu Ser Asp Thr Ile Asp Ile

1115 1120 1125

Thr Lys Asp Met Glu Lys Thr Leu Glu Met Thr Asp Ile Asn Trp

1130 1135 1140

Arg Asp Gly His Asp Leu Arg Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Glu Ile

1145 1150 1155

Val Gln His Ile Phe Glu Ile Phe Arg Leu Thr Val Gln Met Arg

1160 1165 1170

Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Asp Arg Asp Tyr Asp Arg Leu Ile

1175 1180 1185

Ser Pro Val Leu Asn Glu Asn Asn Ile Phe Tyr Asp Ser Ala Lys

1190 1195 1200

Ala Gly Asp Ala Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr

1205 1210 1215

Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Thr Glu

1220 1225 1230

Asn Trp Lys Glu Asp Gly Lys Phe Ser Arg Asp Lys Leu Lys Ile

1235 1240 1245

Ser Asn Lys Asp Trp Phe Asp Phe Ile Gln Asn Lys Arg Tyr Leu

1250 1255 1260

<210> 3

<211> 9936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MOL2212-amyL基因座

<400> 3

tctagacctt ctttgtgctt ggaagcagag cccaatatta tcccgaaacg ataaaacgga 60

tgctgaagga aggaaacgaa gtcggcaacc attcctggga ccatccgtta ttgacaaggc 120

tgtcaaacga aaaagcgtat caggagatta acgacacgca agaaatgatc gaaaaaatca 180

gcggacacct gcctgtacac ttgcgtcctc catacggcgg gatcaatgat tccgtccgct 240

cgctttccaa tctgaaggtt tcattgtggg atgttgatcc ggaagattgg aagtacaaaa 300

ataagcaaaa gattgtcaat catgtcatga gccatgcggg agacggaaaa atcgtcttaa 360

tgcacgatat ttatgcaacg ttcgcagatg ctgctgaaga gattattaaa aagctgaaag 420

caaaaggcta tcaattggta actgtatctc agcgcatgca gcaggtagtt ctatcaaacc 480

gtgaattgac agtatataga gaagatattt ctcgcctggc tgatcaagaa cagcagacgc 540

tgattgatgc ttttatgact aaggatcggg aaaaaggatt tgatttgcaa aaagatcctt 600

taatgcgtct tgcccttttt gatagaggag acagccaata tacatgtgtc tggacacatc 660

accatatcat catggatggg tggtgtctcg gcattattct taaagagttt ttcagcatgt 720

atgattcgct caaaaataac tcacctgtac agcttggcag cacggtgccg tacagccgtt 780

atattgaatg gctcggagaa caagatcaag aagagactgc tgcctactgg agcgaatatt 840

tgaaggagta cggcaatact gcttctattc cccgaataaa gcgccgcacg gcagacggga 900

attataaagc cgaccaggtc agcttttcat tagcgccgga tatggttgag aaactgacag 960

aggctgccca aaactgggga gtgacattaa acacgctgtt tatgagtatt tggggcgtgc 1020

tgctccatcg atataatgct gcagatgatg ccgtttttgg ctccgtcatt tcgggacgcc 1080

cgtcagcgat tgacgggatt gaatcaatgg tcggtttgtt tatcaatact gttccagtgc 1140

gaatccgatc tgcggaaggc ataacatttt cttcgctggt caaagccgtg caggaggata 1200

ttttatcatc tgaacagcat gggtattatc cgctttatga gattcaaaac catagtccat 1260

tgaagcaagg gttgatcgat catatttttg tttttgaaaa ttaccctgta cagcttcatc 1320

aggcattaag cgtggagagt gaaaatgacg aaggcgctct gaagctgagt gacatttcaa 1380

tgtcggaaca aaccaattac gactttaata tcgttatcgt tccgggagaa tcattttata 1440

tcaaattcag ctacaacgca gacgtttacg agcgggagga gatgctgagg attcaggggc 1500

atctaaagca agcactggat tgcattttga caaatcccga tgttgccgtc agtgacatca 1560

atatcgtgcc gccggaggag caacaggtta tccaattgtt taacgaaact gagcgtcctt 1620

atgtgaacaa aacgataccc caattgtttg aggaacaagc tcacaaaaca cctgaagctg 1680

ctgcattgaa aatgggaaac gagtgctgga cctatcgcca gttacaagta agagccaatc 1740

agattgcgca cgccctgata gaaaaaggcg ttggatctgg ggatatcgtt gctgtaatga 1800

tgggccggtc aatggaaatg cctgcagctc tgcttgggat ttggaaagca ggcggcgctt 1860

atatgccgct tgatccacat tttccagcag aacgtctttc ttttcttctg aaggacagtc 1920

aagcggctca attgctgata gaagaagacc ttatttcctt gatccctccg tcctatgaag 1980

gaaatacgat aacgatagaa catacagaaa gttaccaaac agaagcgcca aatatgccgc 2040

caggtgatct agcctacttg atctatacgt cgggaacgac ggggcgccct aaaggggttt 2100

tagttgatca tcacggtatt gccaatacat tgcaatggag acgggaagag tatagcatga 2160

ccgaacagga tatatccctc catttgtttt cgtacgtgtt tgacggctgt gtaacgagct 2220

tatttacccc gcttttatct ggtgcgtgcg tactgctgac aacagatgac gaagcgaagg 2280

atgtgctggc ccttaagcga aaaatagccc gttataaggt cagccacatg atcattgttc 2340

cttccctgta cagggtgtta ttggaagtga tgactgctga cgatgcaaaa agtcttcgta 2400

ttgtgacatt tgcgggtgaa gcggtcacgc ctgatctgct tgagttgaat caaataattt 2460

gtccttctgc tgaactggca aatgaatacg ggcccacaga aaacagtgtg gcaacaacaa 2520

tattgcggca tctgaataaa aaagagagga tcacgatcgg acacccgatc agaaacacaa 2580

aagtatttgt tttgcacgga aatcaaatgc agccgatcgg cgcggcgggt gaactgtgta 2640

tttccggcgc gggtcttgcg agaggatact acaaacagca agagctgaca cagaaagcat 2700

tctccgatca tccattcctt gaaggggagc gtttataccg aacaggtgat gcaggccgct 2760

ttttgcctga tggaacgatt gaatatattg gacgttttga tgatcaagtg aaaattaggg 2820

gttatcgtat tgaactgaga gagattgaaa cagttcttcg acaagcaccg ggggtaaaag 2880

aagcagcggt actggcccgt gatgtttctg ctgaggaaaa ggagctcgtt gcttatatcg 2940

ttccggaaaa gggaaacagc ctcccagatt tgtatcagca tcttgccggg acattgccgt 3000

cctatatgat cccagcaagt attatcaaca tcagccagat gccattaaca tccagcggca 3060

gatcacccgc gataccgtca ttttcgacac atttctttct ttgctacatc agataacgtt 3120

gccatttcat ccccgcctta cctagggatt ctaaactgtc agcaatattc ctgagggctt 3180

atgacacttt gttaaaatta attataaaat gtaatcaacg aaatttataa gacgggcaaa 3240

ataaaaaaac ggatttcctt caggaaatcc gtcctctctg ctcttctatc tttgaacata 3300

aattgaaacc gacccgccgt ttacgtgaaa ctctccccag ccttccgaat tgatgacaac 3360

cggctccgaa cggtttccgg taatgtcatg ccatgtctca ccggcgtttt gccggccgac 3420

atacattcgc tttgccccac cgggtccgtc tgttattaat gccgccaaac ctgaatttgc 3480

aaccgagctg tcgccttccc ttgtccagcc gacaatgtca tggtggtcga aataatcatg 3540

ctgtgctccg tacgcatact gttttctcgc ttttaagatc ggttcaattt tgtgtttcaa 3600

ggcaggaatt tcgcgctggg agtctccttt cgtcccgtac atatccccgt agaaaacctg 3660

agggtatcca gattcccttg tgagaataaa agcgtaagca agcggcttaa accatgtttg 3720

gacagtcgac tcaagcgatt gccccggctg tgtatcatgg ttatcgacaa atgtaaccga 3780

tttcaacgga tgcttggaaa cgaccgtacc cttcagcaat ttcctcatat catagccgcc 3840

tccctgtgtc gatgcagcat ggaactgata atgaagcggc acgtcaaaca ctgaatgatt 3900

aaaatttgtt ttgttcaaat agttttccag cgcgcccaag tcattctgcc aatattcagc 3960

taccgtaaac atttccttcc ccgttttttc cctgacatga ttaacccaat cccgcaaaaa 4020

agaaaattta atgtgtttga cagcatcaag acggtttccg tccaattgca gttcattggc 4080

ataccaagtg ccccatctct taatttctgc tgcgacatca ggatggtcat aatcgatgtc 4140

ggcatacatc aaataatcat agttgccgtt ttcattggaa acttcccaat cccaagcctt 4200

tccttgaaac ttatagatgc ggttcagctt tcgggactcg tcccaatcgg ttccgtcaaa 4260

atggtaccaa tgccatttaa aatcgctgta tgtgctgccg gcccccggaa aatgaaaatg 4320

tgtccaggct ttaattaggt gttctcctga gattacgcgg ttgcggtcag cgggatcgac 4380

ttcaaccgcg gttacatctt cggtcgcatc agcgccgcct ttgtggttga tgaccacatc 4440

cccgtaaacg ttaatgtcgc gggaatgaag acttttgatc gcagattgca gctctccttt 4500

tgtgccgtac tttgtccgaa ccgtcccttt ttgatgaaac tcccctaaat cataaaggtc 4560

gtaagcaccg tagcccacat ccgcttggct cgttccctta tatgccgggg gaatccagac 4620

ggcagtaata ccgtgttcag ccaaatatgc cgagtcgttt tgcaaacgct tccaatgttg 4680

gccgtcattg ggcatgtacc attcaaaata ctgcatcagc gtcccattaa gatttgccgc 4740

cgctgctgca gaatgaggca gcaagaagat gagcgcaaat aacagcgtca gcaatcgggc 4800

gtaaagccgt ttttgttgtt tcatgattct cctccccttt caatgtgata catatgatat 4860

tgtataaata ttccgaattt ttaacaagta ccattttccc tatattttct tccaagatct 4920

gtcgaccgcg gctagagcgg ccgcacgcgt gctagccatg gcttttacaa tagaaggaaa 4980

agtcaccccg cagttttttc aaaacagcat caacgctctt gtagaaagac atgatatttt 5040

cagaacgatt tttatcagcc aaaatgtttc ctccccccag caggttgttc tgagagaacg 5100

aaatgtcatc gtactggaag aagacattac tcatttaaac gaggcggagc aatcacagtt 5160

tatcgagcaa tggaaagaaa aggaccggga ccgggggttt catttgcaaa aggatgtgct 5220

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tcatatcatg atggacggtt ggtgcctcag cattgtgcta aaggagtttc tgcatattta 5340

cgcatcttat gtaaatgcat ccccaataac attggagccg gtccagccat acggaaagta 5400

tatcaaatgg ctgatggagc aagacaaaga gcaggcggtt tcttattggg atcattatct 5460

ttccggccac gaacagcaaa ccgtgctccc gaagcagaaa aaaacaaagg gaaaaagcag 5520

gcaggaacac gttacatttt cattctctaa ggaagaaagc agcaggcttt cagagcttgc 5580

tgctagagaa gaagtgacac tcagtacgat ttttcatacc atttggggca ttctgctgca 5640

aaaatataat aataacgatg acgccgtatt cggttctgtc atttcaggaa gacccgcaga 5700

aatcgaaggc attgaacata tggtaggtct tttcattaat acgatgccgg ttcgggtgca 5760

gggggcaaaa acgccttttc ttcaacttat aaaagatatg caaaaagacc gtcttgccgc 5820

tgaagcgtac agctaccacc ctttatatga gattcaatcc cgctcagctg ttaagcaagg 5880

gctgattgat catattctcg tatttgaaaa ctatccggtg cagcaagaga ttcaaatgct 5940

gaacaaacag gaacatgctt ctgatctttt tcagattcat aatttcactg tcgcagatga 6000

aaccaactac agcttttatc ttatggtggc gccaggggaa gaaattcata tcaaaatgaa 6060

ctatgatgcg gagcagcacg atcggtcttt tgtgctctct gtcaaagagc atcttctgaa 6120

tgctgtatca caaatcttaa ataatccgaa tcttccacct gaagaaatcg atatcacgac 6180

agatactgaa aagcggcagc tgattggaga aatcacagat caaacaccag tttacgaaac 6240

catccatgcc atgtttgaaa agcaagcgga aaagacacca gatgctcatg ctgtaattga 6300

tcaagcctgc tcattaacat acagagaact gaataaagcg gctaacagat tggcacggca 6360

tttacgaatg aaaggcgttg tgagacagga acccgttgcg attatgatgg aacgctcagc 6420

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tccgcattac cctgctgaca gaatccgtta tattctgcat gattgcggct gttcgcatgt 6540

tgtttcacaa gcgcatcttc cctcatcgtt agaagacaat tacattatca ctcatccaga 6600

agatatcgaa agcaaagtag acggcagtaa cataaagtca gtcaacaatg ctgacgatct 6660

gctgtatatg atttatacat caggcacaac aggtaaacca aagggtgttc aatttgagca 6720

tcgaaacatg gctaacttgc tgaagttcga atatactcac tccggcattg actttgaagc 6780

agatgttctg caatttgcga cgccttcctt cgacgtctgc tatcaagaaa tattttctgc 6840

gcttctgaaa ggcggcacac tccacatcgt gccagaagcc ataaaaagag atgtgcctca 6900

gctgtttgca tttataaaca agcatcagac gaatattgtg tttctcccaa ctgcttttat 6960

caaaatgatt ttcagcgagc gagaacttgc gaactcgttt cctgatggcg tcaaacacct 7020

gatcgcagcc ggggaacaat taatgatttc agaccttttc caagatgtgt tgcgtaaacg 7080

cggcatacac ctgcacaatc attacggacc ttcagaaact catgtggtat ctacgtatac 7140

cattcatcct ggagacccta ttcctgagct tccgccaatc ggtaaaccga taggctgtac 7200

tgatctatat attttgaatc atcaaaaaca gcttcagcca tgcggcgtac caggcgaact 7260

ctatatttcc ggcgcaagtg ttgccagagg atatgtcaat cacgataaac tgacaagcga 7320

caaattttca tccgatccat tcaagcctga tgtgatcatg taccggacag gtgatttggc 7380

cagacggctt gaagacggca acatcgaata tatcggacgg gcagacaatc aagtgaaaat 7440

cagaggttat cgaattgagc cgcaagaaat cgaagtcacg ctaatgaatc atccggacat 7500

tagtgaggct gccattctca tctggcaaga tcaaaacggt gaacatgaat tatgcgctta 7560

ctattgcagt gtacaaaagc tgaacacaat agatttacgc agttatatgg ctagtgagct 7620

cccagaatac atgattccgg cgaaatggat atgggttgac agcatacctc ttaccccaaa 7680

cggaaaagta gatcgcgcag cacttccgga gccagatgct tcaatcagcg gaaacccata 7740

tactgcccct cgaaatctgt tagaggccat ggctagcacg cgtgcggccg ccgcggtcga 7800

cagatcttgg aagaaaatat agggaaaatg gtacttgtta aaaattcgga atatttatac 7860

aatatcatat gtatcacatt gaaaggggag gagaatcatg aaacaacaaa aacggcttta 7920

cgcccgattg ctgacgctgt tatttgcgct catcttcttg ctgcctcatt ctgcagcagc 7980

ggcggcaaat cttaatggga cgctgatgca gtattttgaa tggtacatgc ccaatgacgg 8040

ccaacattgg aagcgtttgc aaaacgactc ggcatatttg gctgaacacg gtattactgc 8100

cgtctggatt cccccggcat ataagggaac gagccaagcg gatgtgggct acggtgctta 8160

cgacctttat gatttagggg agtttcatca aaaagggacg gttcggacaa agtacggcac 8220

aaaaggagag ctgcaatctg cgatcaaaag tcttcattcc cgcgacatta acgtttacgg 8280

ggatgtggtc atcaaccaca aaggcggcgc tgatgcgacc gaagatgtaa ccgcggttga 8340

agtcgatccc gctgaccgca accgcgtaat ctcaggagaa cacctaatta aagcctggac 8400

acattttcat tttccggggg ccggcagcac atacagcgat tttaaatggc attggtacca 8460

ttttgacgga accgattggg acgagtcccg aaagctgaac cgcatctata agtttcaagg 8520

aaaggcttgg gattgggaag tttccaatga aaacggcaac tatgattatt tgatgtatgc 8580

cgacatcgat tatgaccatc ctgatgtcgc agcagaaatt aagagatggg gcacttggta 8640

tgccaatgaa ctgcaattgg acggaaaccg tcttgatgct gtcaaacaca ttaaattttc 8700

ttttttgcgg gattgggtta atcatgtcag ggaaaaaacg gggaaggaaa tgtttacggt 8760

agctgaatat tggcagaatg acttgggcgc gctggaaaac tatttgaaca aaacaaattt 8820

taatcattca gtgtttgacg tgccgcttca ttatcagttc catgctgcat cgacacaggg 8880

aggcggctat gatatgagga aattgctgaa gggtacggtc gtttccaagc atccgttgaa 8940

atcggttaca tttgtcgata accatgatac acagccgggg caatcgcttg agtcgactgt 9000

ccaaacatgg tttaagccgc ttgcttacgc ttttattctc acaagggaat ctggataccc 9060

tcaggttttc tacggggata tgtacgggac gaaaggagac tcccagcgcg aaattcctgc 9120

cttgaaacac aaaattgaac cgatcttaaa agcgagaaaa cagtatgcgt acggagcaca 9180

gcatgattat ttcgaccacc atgacattgt cggctggaca agggaaggcg acagctcggt 9240

tgcaaattca ggtttggcgg cattaataac agacggaccc ggtggggcaa agcgaatgta 9300

tgtcggccgg caaaacgccg gtgagacatg gcatgacatt accggaaacc gttcggagcc 9360

ggttgtcatc aattcggaag gctggggaga gtttcacgta aacggcgggt cggtttcaat 9420

ttatgttcaa agatagaaga gcagagagga cggatttcct gaaggaaatc cgttttttta 9480

ttttgcccgt cttataaatt tctttgatta cattttataa ttaattttaa caaagtgtca 9540

tcagccctca ggaaggactt gctgacagtt tgaatcgcat aggtaaggcg gggatgaaat 9600

ggcaacgtta tctgatgtag caaagaaagc aaatgtgtcg aaaatgacgg tatcgcgggt 9660

gatcaatcat cctgagactg tgacggatga attgaaaaag cttgttcatt ccgcaatgaa 9720

ggagctcaat tatataccga actatgcagc aagagcgctc gttcaaaaca gaacacaggt 9780

cgtcaagctg ctcatactgg aagaaatgga tacaacagaa ccttattata tgaatctgtt 9840

aacgggaatc agccgcgagc tggaccgtca tcattatgct ttgcagcttg tcacaaggaa 9900

atctctcaat atcggccagt gcgacggcat tattgc 9936

<210> 4

<211> 3276

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MOL2212-xyl基因座

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3139)..(3139)

<223> n是a、c、g或t

<400> 4

gaattcaaaa gccgcttccg ccctggcttt cgctttatcc aaaggatgtg tcagccggtt 60

ccacgcccgg aacatcgtcc cgtcgccgaa agggtctttc ccgtccgcat caaaggtatg 120

ccaatacgca acagcgaagc gaaggtgttc cttcatcgtt ttgccgccga caaattcatc 180

agggttgtaa tatttaaatg cgtaaggatt ttccgaatcg gccccttcat actcaatcat 240

tccgatattt ctaaaaaaca ttccgatctc ccccttcact tttccttgca aacgttaaaa 300

aacaatgttt gtttaaccat taaactaact tccttgtatg tattttacag gatcaattaa 360

tcgctttcaa tggaaatagc cgcggatcga tgctagcaga tcttggaaga aaatataggg 420

aaaatggtac ttgttaaaaa ttcggaatat ttatacaata tcatatgtat cacattgaaa 480

ggggaggaga atcatgaaac aacaaaaacg gctttacgcc cgattgctga cgctgttatt 540

tgcgctcatc ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg gcaaatctta atgggacgct 600

gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa cattggaagc gtttgcaaaa 660

cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc tggattcccc cggcatataa 720

gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac ctttatgatt taggggagtt 780

tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa ggagagctgc aatctgcgat 840

caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat gtggtcatca accacaaagg 900

cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc gatcccgctg accgcaaccg 960

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caatgaaaac ggcaactatg attatttgat gtatgccgac atcgattatg accatcctga 1200

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tgtcagggaa aaaacgggga aggaaatgtt tacggtagct gaatattggc agaatgactt 1380

gggcgcgctg gaaaactatt tgaacaaaac aaattttaat cattcagtgt ttgacgtgcc 1440

gcttcattat cagttccatg ctgcatcgac acagggaggc ggctatgata tgaggaaatt 1500

gctgaagggt acggtcgttt ccaagcatcc gttgaaatcg gttacatttg tcgataacca 1560

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ttacgctttt attctcacaa gggaatctgg ataccctcag gttttctacg gggatatgta 1680

cgggacgaaa ggagactccc agcgcgaaat tcctgccttg aaacacaaaa ttgaaccgat 1740

cttaaaagcg agaaaacagt atgcgtacgg agcacagcat gattatttcg accaccatga 1800

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tgattacatt ttataattaa ttttaacaaa gtgtcataag ccctcaggaa tattgctgac 2160

agtttagaat ccctaggtaa ggcggggatg aaatggcaac gttatctgat gtagcaaaga 2220

aagaaatgtg tcgaaaatga cggtatcgcg ggtgatctgc ggccgcacgc gtgtcgacag 2280

tactgaaata gaggaaaaaa taagttttca aaatttgtta tactataata aattcacagc 2340

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aacaaagccc tgatttttga gcagattatt gaaaacggac ccgtctcaag ggccaaactt 2460

tcggaaataa caggattaaa taaagcgacc gtttcctccc aagtgtcttc cctgcttcaa 2520

aaggacatca tttatgaaac cggccccggc gagtcaagcg gcggcagaag gcccgttatg 2580

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attgttgcgt taaccgacct tgaagggcat ttgattgaac aattcgaacg aacgcttgat 2700

gaagaagaca ttcaggcgac agaagaggca ttaatcgaat tgacggggct tgccgttgac 2760

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gacaacgaac ggcatgtagt ctttacgcca aataagccga tccatttgat tccgataaaa 2880

gaaaaactgg aagaaaggtt cggcgttccc attttaattg aaaacgaagc caacgccggc 2940

gccgttggcg agaaggaata cggggaaggc ggccagcttg agcatgccgt gtttgtcagc 3000

attaataccg ggatcggttt agggatttta atgaatggaa aattgtttag aggtgtgcaa 3060

ggtttttccg gagaagccgg gcacatgtcc attcactttg acggtccgtt atgccggtgc 3120

ggaaatagag gctgctggna gctctacgct tcagaaaaag ccgtcttctc tcactatgca 3180

gaagcttgca tgcctgcagg tcgattcaca aaaaataggc acacgaaaaa caagttaagg 3240

gatgcagttt atgcatccct taacttactt attaaa 3276

<210> 5

<211> 3521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MOL2212-gnt基因座

<400> 5

gcagcggttc gtttaatcgg gaatgcctcg acttcgatgg tcatctccct gttggtcgcg 60

atctatacga tggggatcgc cagaaagatc ccgatcaaac aagtgatgga ttcctgttca 120

accgccatta cacaaatcgg aatgatgctc ttgatcatcg ggggcggcgg cgccttcaaa 180

caagtcttga tcaatggcgg agtaggcgac tatgtagctg aattattcaa aggaacagcc 240

atgtcgccga tcttgctcgc ctgggtcatc gccgcaattc tgcgcatctc cttaggatcc 300

gcgacagttg ctgcattaag cacaaccgga ctcgttcttc cgatgctcgg acaaagcgat 360

gtcaatcttg cgctggttgt gcttgcaaca ggggccggaa gtgtaatcgc ttcccatgtc 420

aatgacgcag gcttctggat gttcaaagag tatttcggac taagcatgaa agagacattt 480

gccacctgga cactgcttga aaccattatc gcggtggccg gattaggatt tactttattg 540

ttaagcctat ttgtataaaa aagatcaccc gcgataccgt cattttcgac acatttcttt 600

ctttgctaca tcagataacg ttgccatttc atccccgcct tacctaggga ttctaaactg 660

tcagcaatat tcctgagggc ttatgacact ttgttaaaat taattataaa atgtaatcaa 720

cgaaatttat aagacgggca aaataaaaaa acggatttcc ttcaggaaat ccgtcctctc 780

tgctcttcta tctttgaaca taaattgaaa ccgacccgcc gtttacgtga aactctcccc 840

agccttccga attgatgaca accggctccg aacggtttcc ggtaatgtca tgccatgtct 900

caccggcgtt ttgccggccg acatacattc gctttgcccc accgggtccg tctgttatta 960

atgccgccaa acctgaattt gcaaccgagc tgtcgccttc ccttgtccag ccgacaatgt 1020

catggtggtc gaaataatca tgctgtgctc cgtacgcata ctgttttctc gcttttaaga 1080

tcggttcaat tttgtgtttc aaggcaggaa tttcgcgctg ggagtctcct ttcgtcccgt 1140

acatatcccc gtagaaaacc tgagggtatc cagattccct tgtgagaata aaagcgtaag 1200

caagcggctt aaaccatgtt tggacagtcg actcaagcga ttgccccggc tgtgtatcat 1260

ggttatcgac aaatgtaacc gatttcaacg gatgcttgga aacgaccgta cccttcagca 1320

atttcctcat atcatagccg cctccctgtg tcgatgcagc atggaactga taatgaagcg 1380

gcacgtcaaa cactgaatga ttaaaatttg ttttgttcaa atagttttcc agcgcgccca 1440

agtcattctg ccaatattca gctaccgtaa acatttcctt ccccgttttt tccctgacat 1500

gattaaccca atcccgcaaa aaagaaaatt taatgtgttt gacagcatca agacggtttc 1560

cgtccaattg cagttcattg gcataccaag tgccccatct cttaatttct gctgcgacat 1620

caggatggtc ataatcgatg tcggcataca tcaaataatc atagttgccg ttttcattgg 1680

aaacttccca atcccaagcc tttccttgaa acttatagat gcggttcagc tttcgggact 1740

cgtcccaatc ggttccgtca aaatggtacc aatgccattt aaaatcgctg tatgtgctgc 1800

cggcccccgg aaaatgaaaa tgtgtccagg ctttaattag gtgttctcct gagattacgc 1860

ggttgcggtc agcgggatcg acttcaaccg cggttacatc ttcggtcgca tcagcgccgc 1920

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tcgcagattg cagctctcct tttgtgccgt actttgtccg aaccgtccct ttttgatgaa 2040

actcccctaa atcataaagg tcgtaagcac cgtagcccac atccgcttgg ctcgttccct 2100

tatatgccgg gggaatccag acggcagtaa taccgtgttc agccaaatat gccgagtcgt 2160

tttgcaaacg cttccaatgt tggccgtcat tgggcatgta ccattcaaaa tactgcatca 2220

gcgtcccatt aagatttgcc gccgctgctg cagaatgagg cagcaagaag atgagcgcaa 2280

ataacagcgt cagcaatcgg gcgtaaagcc gtttttgttg tttcatgatt ctcctcccct 2340

ttcaatgtga tacatatgat attgtataaa tattccgaat ttttaacaag taccattttc 2400

cctatatttt cttccaagat cttccttcag gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt 2460

ctggtcaact ttccgactct gagaaacttc tggaatcgct agagaatttc tggaatggga 2520

ttcaggagtg gacagaacga cacggatata tagtggatgt gtcaaaacgc ataccatttt 2580

gaacgatgac ctctaataat tgttaatcat gttggagctc agtgagagcg aagcgaacac 2640

ttgatttttt aattttctat cttttatagg tcattagagt atacttattt gtcctataaa 2700

ctatttagca gcataataga tttattgaat aggtcattta agttgagcat attagaggag 2760

gaaaatcttg gagaaatatt tgaagaaccc gagaaaaatc tttcttatgg tcacagcagg 2820

caaaccggtt gattctgtta tcgactcgct cgttcctctg cttgaagaag gggatgtcat 2880

catggacggc ggcaactccc actacgaaga tacggaacga agatatgaca gtttgaaagc 2940

gaaaggtatc ggctacttgg gaatcggcat ttccggcggc gaagtcggcg ctttaaaagg 3000

cccatccatt atgcccggcg gagatcggga cgtctacgaa aaagcagctc cgattctcac 3060

aaaaatcgcc gcccaagtag aaggagatcc atgctgtgtc tacatcggtc caaaaggcgc 3120

ggggcatttt gttaaaatgg tgcacaacgg catcgaatac gcagacatgc agcttatcgc 3180

tgaagcgtat acatttttaa gagaaaagct tcttttgccg atagatgaaa tcgctgacat 3240

tttcgacacg tggaatcaag gagagctgaa aagctattta atcgaaatca cggcagagat 3300

cctgaggaaa aaggatgagc gaacgggcgc tccgctcatc gacgtcatcc tcgacaaaac 3360

cggccaaaaa ggcacgggca aatggacgag cctgcaggcc atcgacaacg gcattccatc 3420

atcaattatc acggaatccc tgtttgcccg ttacctgtca tcattaaaag acgaacggac 3480

agctgccgaa aacgtattgg ccgggcctga aacagaagaa c 3521

<210> 6

<211> 2323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MOL2212-prsA基因座

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1005)..(1005)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1390)..(1390)

<223> n是a、c、g或t

<400> 6

aattcattcc gccttttgaa gcggagtagt gaacattttt cggtctcgga atttgctgat 60

gaacgctgga tatattgagt atgcttcctt tcatgcggcg gtccgccata tattttaagg 120

cttcgcgtgc gcagagaaac gcaccggtta aattaacgtc gatcactttc tgccactcat 180

caagctcaag ttcgtgcgga aaggcgcccg cgccgttaaa tcctgaatta ttgaccataa 240

catcaagtga accaaagtgt tcaactgctg aattaatcag ctttttcacg tcctcttcgg 300

aagacacgtc agcttctatc gcaagggcgt ttccgcccgc tgcttgaata ttgtcgacgg 360

cttcccgtgc gcctccggga tcgctgtgat aattgacaac cacattcatc ttttcttttc 420

caaaccgttc tgcaaccgcc ttgcctatac cttttgaaga gccggtcaca attgctgttt 480

ttccttttaa atcactatac aacctaaaca cccctcaatt tcttttctcc atgtacatta 540

cccggtatca gctagcagat ccatgagtag aagcgccata tcggcgcttt tcttttggaa 600

gaaaatatag ggaaaatggt acttgttaaa aattcggaat atttatacaa tatcatatgt 660

tacacattga aaggggagga gaatcatgaa acaacaaaaa cggctttacg cccgattgtg 720

aattcataat tcccctctgt tgaaaatctt tttacagcat gtcagaatat gatatgatac 780

aattcaaagg aaagtttaaa ctgttatgat taggagtgtt tgcatttatg aagaagattg 840

caattgcggc gattacagcg acaagcgtgc tggctctcag cgcatgcagc gggggagatt 900

ctgaggttgt tgcggaaaca aaagctggaa atattacaaa agaagacctt tatcaaacat 960

taaaagacaa tgccggagcg gacgcactga acatgcttgt tcagnaaaaa gtactcgatg 1020

ataaatacga tgtctccgac aaagaaatcg acaaaaagct gaacgagtac aaaaaatcaa 1080

tgggtgacca gctcaaccag ctcattgacc aaaaaggcga agacttcgtc aaagaacaga 1140

tcaaatacga acttctgatg caaaaagccg caaaggataa cataaaagta accgatgatg 1200

acgtaaaaga atattatgac ggcctgaaag gcaaaatcca cttaagccac attcttgtga 1260

aagaaaagaa aacggctgaa gaagttgaga aaaagctgaa aaaaggcgaa aaattcgaag 1320

accttgcaaa agagtattca actgacggta cagccgaaaa aggcggcgac ctcggctggg 1380

tcggcaaagn cgataacatg gacaaggatt tcgtcaaagc ggcatttgct ttgaaaaccg 1440

gcgaaatcag cggacctgtg aaatcccaat tcggctatca catcattaaa aaagacgaag 1500

aacgcggcaa atatgaagac atgaaaaaag agcttaaaaa agaagtccaa gaacaaaagc 1560

aaaatgatca aactgaactg caatccgtca ttgacaaact tgtcaaagat gctgatttaa 1620

aagtaaaaga caaagagttg aaaaaacaag tcgaccagcg tcaagctcag acaagcagca 1680

gcagctgacg ccaaaaaagc tgtcctcccc tcgttggggt cggacagctt tttttatgcg 1740

atggaatggc tgtcagctgc aggtacccgg gtctagagtc gacgcggccg tatacttaat 1800

ttcctttaag cctgtacttt ttgccatcta ttgatatcgt gaaatttgaa ggaccgctga 1860

tcggcaaata atagacaagc tgaaactccg cttcctcacc aggtttaatg gttttccagc 1920

ttgatagagt cactctgatg cggtggaaat ctcctgtcag tccgccaatg ttcggtcccg 1980

tatgcccttt agaaatcact tcaacatgat cgccgctcca gcttctaaac cgaggggaag 2040

tggatgtcgg cgcatcaaat tcgataaaag aacctcccgt aatcgtgaca tcgctgttgt 2100

tgatcagctt catcaccggg tggatcgggt aattttgatc tcctaacgga aagttcgtca 2160

actctacttc tgcatctagt gattcatcag gcaaaggtga tgtgctgagt cgattatcgt 2220

atggtgttga tccgagaatt tatgatactc gttctcgtta aggtattgcc gataccgtat 2280

tctcctttac tgccgtttcg ttcgggatac cagtcataat cag 2323

<210> 7

<211> 10063

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pBKQ3825（在forD侧翼之间插入mad7d的

质粒）

<400> 7

gaattcgtac gagttcctcc acattcggag tatttctgaa tgatagagcc acacggtcca 60

cgttctcact ggctaaccgg atcaaatgat cttcaggagt cagcataata catccagttc 120

aggtagataa gatttgaatt tggtgacttg cttttgttct tcttctttca ttttctgact 180

aatccaaact ggaaaaagca ggtcttttaa cagattagga ggtttctgac atgcaccatt 240

cggtcactaa ccgaatgcag taaaggacac tgtggtgctt gccagccatt agggtattga 300

ggaggtgatc aaaatgctag gtgacagtat ttcgtcgaag tggacaagtc gtgaccaaat 360

gacctcggat cgagggttgg tcatggagga aaaaattgat gtctggtgac aaagaggagt 420

catgatcatg gcaccgccaa cgagggaaaa aactcttccc gcatcgacac ggtatgtggg 480

cggtgacaaa ctaacttata gagtaaattt attagtcgaa tgaaagacgc gctaaaaatg 540

aggagggaag cgaatgaata atggcacaaa taacttccag aacttcattg gcattagcag 600

cctgcaaaaa acactgagaa atgcactgat tccgacagaa acaacacagc agtttattgt 660

caaaaacggc atcatcaaag aggatgaact gagaggcgaa aatcgccaaa ttctgaaaga 720

tatcatggac gactattacc gtggctttat ttcagaaaca ctgtccagca ttgatgatat 780

cgattggaca agcctgttcg agaaaatgga aatccaactg aaaaacggcg ataacaaaga 840

cacgctgatt aaagaacaaa cggaatatcg caaagcgatc cacaaaaagt ttgcaaatga 900

tgaccgcttt aaaaacatgt tcagcgcgaa actgattagc gatattctgc cggaatttgt 960

catccacaat aataactata gcgcgagcga gaaagaagaa aaaacacagg tcattaaact 1020

gtttagccgc tttgccacaa gcttcaaaga ctatttcaaa aatcgcgcaa actgctttag 1080

cgcagatgat atttcatcat caagctgcca tcggattgtc aatgataatg cggaaatctt 1140

ttttagcaac gcactggtct atcgcagaat tgttaaatca ttgagcaacg acgacatcaa 1200

caaaatctca ggcgatatga aagacagcct gaaagaaatg tcactggaag aaatctacag 1260

ctacgaaaaa tacggcgaat ttatcacaca agaaggcatc agcttttaca acgatatttg 1320

cggcaaagtc aacagcttta tgaatctgta ttgccagaaa aacaaagaaa acaaaaacct 1380

gtataaactg cagaaactgc acaagcagat tctgtgcatt gcagatacat catatgaagt 1440

cccgtacaaa tttgagagcg acgaagaagt ttatcaaagc gttaatggct ttctggataa 1500

catcagcagc aaacatattg ttgaacgcct gagaaaaatt ggcgataact ataatggcta 1560

caacctggac aaaatctaca tcgtcagcaa attttacgaa agcgtcagcc aaaaaacata 1620

tcgcgattgg gaaacaatta atacagcgct ggaaattcat tataacaaca ttctgcctgg 1680

caacggcaaa agcaaagcag ataaagttaa aaaggcggtc aaaaatgacc tgcagaaaag 1740

cattacagaa atcaatgaac tggtcagcaa ctacaaactg tgctcagatg ataatatcaa 1800

ggcggaaacg tacatccatg aaattagcca tatcctgaac aactttgaag cgcaagaact 1860

gaaatataac ccggaaatcc atctggttga aagcgaactg aaagcaagcg agctgaaaaa 1920

tgttctggat gtcattatga atgcgtttca ttggtgcagc gtctttatga cagaagaact 1980

ggtcgataaa gataacaact tttatgcgga actggaagag atttacgacg aaatttatcc 2040

ggtcatcagc ctgtataatc tggttcgcaa ttatgtcaca cagaaaccgt atagcacgaa 2100

gaaaatcaaa ctgaactttg gcattccgac actggcagat ggctggtcaa aatcaaaaga 2160

atatagcaac aacgcgatca tcctgatgcg cgataatctt tattatctgg gcattttcaa 2220

cgcgaaaaac aagccggaca aaaaaatcat cgaaggcaat acgtcagaga acaaaggcga 2280

ctataaaaag atgatctata atctgcttcc gggaccgaat aaaatgatcc cgaaagtttt 2340

tctgtcaagc aaaacaggcg tcgaaacata taaaccgtca gcgtatattc tggaaggcta 2400

caaacagaac aaacacatca aaagcagcaa ggactttgac atcacatttt gccatgatct 2460

gatcgactac tttaagaact gcattgcaat tcatccggaa tggaaaaact tcggctttga 2520

tttttcagac acgagcacgt atgaagatat cagcggcttt tatagagaag ttgaactgca 2580

gggctataaa atcgactgga catatatcag cgaaaaggat attgatctgc tgcaagaaaa 2640

aggccaactg tacctgtttc agatctacaa caaagacttc agcaaaaaaa gcacgggcaa 2700

tgataacctg catacgatgt acctgaaaaa cctttttagc gaagagaacc tgaaagacat 2760

tgtcctgaaa ctgaatggcg aagccgaaat tttctttcgc aaatccagca ttaaaaaccc 2820

gatcatccat aaaaaaggca gcattctggt taaccgcaca tatgaagcgg aagaaaaaga 2880

tcagtttggc aacattcaga tcgtccgcaa aaacattccg gaaaacattt atcaagaact 2940

gtacaaatac tttaacgata aaagcgataa agaactgtcc gacgaagcag cgaaacttaa 3000

aaatgttgtt ggccatcatg aagcggcaac aaacattgtt aaagactatc gctatacgta 3060

cgataaatac tttctgcata tgccgatcac gatcaacttc aaagcaaata aaacgggctt 3120

tatcaacgat cgcattctgc agtatattgc caaagaaaag gatctgcatg tcatcggcat 3180

tgctagaggc gaacgcaatc tgatttatgt cagcgttatt gatacatgcg gcaacattgt 3240

cgaacagaaa agctttaaca ttgtcaacgg ctatgactac cagatcaagc tgaaacagca 3300

agaaggcgca agacaaattg ctcgcaaaga atggaaagaa atcggcaaga tcaaagaaat 3360

taaagagggc tatctgagcc tggtcattca tgaaatttct aaaatggtca tcaaatataa 3420

cgcgattatc gccatggaag atctgtcata tggctttaag aaaggccgtt ttaaagtcga 3480

aagacaggtc taccagaaat tcgaaacaat gctgattaac aaactgaatt atctggtgtt 3540

taaagacatc agcatcacgg aaaatggcgg actgctgaaa ggctatcaac tgacatatat 3600

tccggataag cttaaaaacg tcggccatca atgcggctgc atcttttatg ttccggcagc 3660

gtatacatca aaaattgatc cgacaacagg ctttgtcaac atcttcaaat tcaaagatct 3720

gacggtcgat gcgaaacgcg aattcattaa gaaatttgac agcatccgct acgacagcga 3780

gaaaaatctt ttctgcttta cgttcgacta caacaacttt atcacgcaga atacggttat 3840

gtcaaaaagc agctggtcag tctatacata tggcgttaga attaaacgca gatttgtgaa 3900

cggcagattt agcaatgaaa gcgatacaat cgacatcacg aaagacatgg aaaaaacgct 3960

tgaaatgacg gatattaact ggcgtgatgg acatgatctt cgccaggata ttatcgatta 4020

tgaaatcgtc cagcacatct ttgaaatctt tagactgaca gtccaaatgc gcaattcact 4080

gtcagaactt gaagatagag attatgatcg cctgatttct ccggtcctga atgaaaataa 4140

catcttttac gatagcgcaa aagcaggcga cgcactgccg aaagatgcgg atgcaaatgg 4200

cgcatattgc attgcactga aaggcctgta tgaaatcaaa caaatcaccg agaattggaa 4260

agaggacggc aaattttcac gggataaact gaaaatcagc aacaaggact ggtttgactt 4320

catccaaaat aagcgctacc tgtaatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga 4380

ataaaggggg gttgacatta ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatgg 4440

tcaaaagacc tttttaattt ctactcttgt agatacaagt accattttcc ctatagcggc 4500

cgcagatctg ggaccaataa taatgactag agaagaaaga atgaagattg ttcatgaaat 4560

taaggaacga atattggata aagtgggata tttttaaaat atatatttat gttacagtaa 4620

tattgacttt taaaaaagga ttgattctaa tgaagaaagc agacaagtaa gcctcctaaa 4680

ttcactttag ataaaaattt aggaggcata tcaaatgaac tttaataaaa ttgatttaga 4740

caattggaag agaaaagaga tatttaatca ttatttgaac caacaaacga cttttagtat 4800

aaccacagaa attgatatta gtgttttata ccgaaacata aaacaagaag gatataaatt 4860

ttaccctgca tttattttct tagtgacaag ggtgataaac tcaaatacag cttttagaac 4920

tggttacaat agcgacggag agttaggtta ttgggataag ttagagccac tttatacaat 4980

ttttgatggt gtatctaaaa cattctctgg tatttggact cctgtaaaga atgacttcaa 5040

agagttttat gatttatacc tttctgatgt agagaaatat aatggttcgg ggaaattgtt 5100

tcccaaaaca cctatacctg aaaatgcttt ttctctttct attattccat ggacttcatt 5160

tactgggttt aacttaaata tcaataataa tagtaattac cttctaccca ttattacagc 5220

aggaaaattc attaataaag gtaattcaat atatttaccg ctatctttac aggtacatca 5280

ttctgtttgt gatggttatc atgcaggatt gtttatgaac tctattcagg aattgtcaga 5340

taggcctaat gactggcttt tataatatga gataatgccg actggctagc atggcaagac 5400

ccagaaaagt tctgggagat cccgctttgc ataagcgtat tatagtggat gacgcgggct 5460

ttgttgttta cacttcttgc acctgctgac ggcaatcatc cctatctatg aaatcgagat 5520

ttcagcaggc cgttattttc gagagagtta aatctatatt cattgttttt attttggtaa 5580

ggacataccg gattttaggt ttggattacc ggtcgagtta gcttgtcttt tcgcccacta 5640

ccgtgtcgat gcgggagcaa tttaccagaa gcacttaccg attgatagtt ttttattccg 5700

gtgattgcaa agtttcataa acaagcttgc atgcctgcag gtcgattcac aaaaaatagg 5760

cacacgaaaa acaagttaag ggatgcagtt tatgcatccc ttaacttact tattaaataa 5820

tttatagcta ttgaaaagag ataagaattg ttcaaagcta atattgttta aatcgtcaat 5880

tcctgcatgt tttaaggaat tgttaaattg attttttgta aatattttct tgtattcttt 5940

gttaacccat ttcataacga aataattata cttttgttta tctttgtgtg atattcttga 6000

tttttttcta cttaatctga taagtgagct attcacttta ggtttaggat gaaaatattc 6060

tcttggaacc atacttaata tagaaatatc aacttctgcc attaaaagta atgccaatga 6120

gcgttttgta tttaataatc ttttagcaaa cccgtattcc acgattaaat aaatctcatt 6180

agctatacta tcaaaaacaa ttttgcgtat tatatccgta cttatgttat aaggtatatt 6240

accatatatt ttataggatt ggtttttagg aaatttaaac tgcaatatat ccttgtttaa 6300

aacttggaaa ttatcgtgat caacaagttt attttctgta gttttgcata atttatggtc 6360

tatttcaatg gcagttacga aattacacct ctttactaat tcaagggtaa aatggccttt 6420

tcctgagccg atttcaaaga tattatcatg ttcatttaat cttatatttg tcattatttt 6480

atctatatta tgttttgaag taataaagtt ttgactgtgt tttatatttt tctcgttcat 6540

tataaccctc tttaatttgg ttatatgaat tttgcttatt aacgattcat tataaccact 6600

tattttttgt ttggttgata atgaactgtg ctgattacaa aaatactaaa aatgcccata 6660

ttttttcctc cttataaaat tagtataatt atagcacgag ctctgataaa tatgaacatg 6720

atgagtgatc gttaaattta tactgcaatc ggatgcgatt attgaataaa agatatgaga 6780

gatttatcta atttcttttt tcttgtaaaa aaagaaagtt cttaaaggtt ttatagtttt 6840

ggtcgtagag cacacggttt aacgacttaa ttacgaagta aataagtcta gtgtgttaga 6900

ctttatgaaa tctatatacg tttatatata tttattatcc ggaggtgtag catgtctcat 6960

tcaattttga gggttgccag agttaaagga tcaagtaata caaacgggat acaaagacat 7020

aatcaaagag agaataaaaa ctataataat aaagacataa atcatgagga aacatataaa 7080

aattatgatt tgattaacgc acaaaatata aagtataaag ataaaattga tgaaacgatt 7140

gatgagaatt attcagggaa acgtaaaatt cggtcagatg caattcgaca tgtggacgga 7200

ctggttacaa gtgataaaga tttctttgat gatttaagcg gagaagaaat agaacgattt 7260

tttaaagata gcttggagtt tctagaaaat gaatacggta aggaaaatat gctgtatgcg 7320

actgtccatc tggatgaaag agtcccacat atgcactttg gttttgtccc tttaacagag 7380

gacgggagat tgtctgcaaa agaacagtta ggcaacaaga aagactttac tcaattacaa 7440

gatagattta atgagtatgt gaatgagaaa ggttatgaac ttgaaagagg cacgtccaaa 7500

gaggttacag aacgagaaca taaagcgatg gatcagtaca agaaagatac tgtatttcat 7560

aaacaggaac tgcaagaagt taaggatgag ttacagaagg caaataagca gttacagagt 7620

ggaatagagc atatgaggtc tacgaaaccc tttgattatg aaaatgagcg tacaggtttg 7680

ttctctggac gtgaagagac tggtagaaag atattaactg ctgatgaatt tgaacgcctg 7740

caagaaacaa tctcttctgc agaacggatt gttgatgatt acgaaaatat taagagcaca 7800

gactattaca cagaaaatca agaattaaaa aaacgtagag agagtttgaa agaagtagtg 7860

aatacatgga aagaggggta tcacgaaaaa agtaaagagg ttaataaatt aaagcgagag 7920

aatgatagtt tgaatgagca gttgaatgta tcagagaaat ttcaagctag tacagtgact 7980

ttatatcgtg ctgcgagggc gaatttccct gggtttgaga aagggtttaa taggcttaaa 8040

gagaaattct ttaatgattc caaatttgag cgtgtgggac agtttatgga tgttgtacag 8100

gataatgtcc agaaggtcga tagaaagcgt gagaaacagc gtacagacga tttagagatg 8160

tagaggtact tttatgccga gaaaactttt tgcgtgtgac agtccttaaa atatacttag 8220

agcgtaagcg aaagtagtag cgacagctat taactttcgg tttcaaagct ctaggatttt 8280

taatggacgc agcgcatcac acgcaaaaag gaaattggaa taaatgcgaa atttgagatg 8340

ttaattaaag acctttttga ggtctttttt tcttagattt ttggggttat ttaggggaga 8400

aaacataggg gggtactacg acctcccccc taggtgtcca ttgtccattg tccaaacaaa 8460

taaataaata ttgggttttt aatgttaaaa ggttgttttt tatgttaaag tgaaaaaaac 8520

agatgttggg aggtacagtg atggttgtag atagaaaaga agagaaaaaa gttgctgtta 8580

ctttaagact tacaacagaa gaaaatgaga tattaaatag aatcaaagaa aaatataata 8640

ttagcaaatc agatgcaacc ggtattctaa taaaaaaata tgcaaaggag gaatacggtg 8700

cattttaaac aaaaaaagat agacagcact ggcatgctgc ctatctatga ctaaattttg 8760

ttaagtgtat tagcaccgtt attatatcat gagcgaaaat gtaataaaag aaactgaaaa 8820

caagaaaaat tcaagaggac gtaattggac atttgtttta tatccagaat cagcaaaagc 8880

cgagtggtta gagtatttaa aagagttaca cattcaattt gtagtgtctc cattacatga 8940

tagggatact gatacagaag gtaggatgaa aaaagagcat tatcatattc tagtgatgta 9000

tgagggtaat aaatcttatg aacagataaa aataattaca gaagaattga atgcgactat 9060

tccgcagatt gcaggaagtg tgaaaggtct tgtgagatat atgcttcaca tggacgatcc 9120

taataaattt aaatatcaaa aagaagatat gatagtttat ggcggtgtag atgttgatga 9180

attattaaag aaaacaacaa cagatagata taaattaatt aaagaaatga ttgagtttat 9240

tgatgaacaa ggaatcgtag aatttaagag tttaatggat tatgcaatga agtttaaatt 9300

tgatgattgg ttcccgcttt tatgtgataa ctcggcgtat gttattcaag aatatataaa 9360

atcaaatcgg tataaatctg accgatagat tttgaattta ggtgtcacaa gacactcttt 9420

tttcgcacca gcgaaaactg gtttaagccg actgcgcaaa agacataatc gactctagag 9480

gatccccggg taccgagctc tgccttttag tccagctgat ttcacttttt gcattctaca 9540

aactgcataa ctcatatgta aatcgctcct ttttaggtgg cacaaatgtg aggcattttc 9600

gctctttccg gcaaccactt ccaagtaaag tataacacac tatactttat attcataaag 9660

tgtgtgctct gcgaggctgt cggcagtgcc gaccaaaacc ataaaacctt taagaccttt 9720

ctttttttta cgagaaaaaa gaaacaaaaa aacctgccct ctgccacctc agcaaagggg 9780

ggttttgctc tcgtgctcgt ttaaaaatca gcaagggaca ggtagtattt tttgagaaga 9840

tcactcaaaa aatctccacc tttaaaccct tgccaatttt tattttgtcc gttttgtcta 9900

gcttaccgaa agccagactc agcaagaata aaatttttat tgtctttcgg ttttctagtg 9960

taacggacaa aaccactcaa aataaaaaag atacaagaga ggtctctcgt atcttttatt 10020

cagcaatcgc gcccgattgc tgaacagatt aataatgagc tcg 10063

<210> 8

<211> 5722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> forD:mad7d-cat，图5（BKQ3934）

<400> 8

cgtacgagtt cctccacatt cggagtattt ctgaatgata gagccacacg gtccacgttc 60

tcactggcta accggatcaa atgatcttca ggagtcagca taatacatcc agttcaggta 120

gataagattt gaatttggtg acttgctttt gttcttcttc tttcattttc tgactaatcc 180

aaactggaaa aagcaggtct tttaacagat taggaggttt ctgacatgca ccattcggtc 240

actaaccgaa tgcagtaaag gacactgtgg tgcttgccag ccattagggt attgaggagg 300

tgatcaaaat gctaggtgac agtatttcgt cgaagtggac aagtcgtgac caaatgacct 360

cggatcgagg gttggtcatg gaggaaaaaa ttgatgtctg gtgacaaaga ggagtcatga 420

tcatggcacc gccaacgagg gaaaaaactc ttcccgcatc gacacggtat gtgggcggtg 480

acaaactaac ttatagagta aatttattag tcgaatgaaa gacgcgctaa aaatgaggag 540

ggaagcgaat gaataatggc acaaataact tccagaactt cattggcatt agcagcctgc 600

aaaaaacact gagaaatgca ctgattccga cagaaacaac acagcagttt attgtcaaaa 660

acggcatcat caaagaggat gaactgagag gcgaaaatcg ccaaattctg aaagatatca 720

tggacgacta ttaccgtggc tttatttcag aaacactgtc cagcattgat gatatcgatt 780

ggacaagcct gttcgagaaa atggaaatcc aactgaaaaa cggcgataac aaagacacgc 840

tgattaaaga acaaacggaa tatcgcaaag cgatccacaa aaagtttgca aatgatgacc 900

gctttaaaaa catgttcagc gcgaaactga ttagcgatat tctgccggaa tttgtcatcc 960

acaataataa ctatagcgcg agcgagaaag aagaaaaaac acaggtcatt aaactgttta 1020

gccgctttgc cacaagcttc aaagactatt tcaaaaatcg cgcaaactgc tttagcgcag 1080

atgatatttc atcatcaagc tgccatcgga ttgtcaatga taatgcggaa atctttttta 1140

gcaacgcact ggtctatcgc agaattgtta aatcattgag caacgacgac atcaacaaaa 1200

tctcaggcga tatgaaagac agcctgaaag aaatgtcact ggaagaaatc tacagctacg 1260

aaaaatacgg cgaatttatc acacaagaag gcatcagctt ttacaacgat atttgcggca 1320

aagtcaacag ctttatgaat ctgtattgcc agaaaaacaa agaaaacaaa aacctgtata 1380

aactgcagaa actgcacaag cagattctgt gcattgcaga tacatcatat gaagtcccgt 1440

acaaatttga gagcgacgaa gaagtttatc aaagcgttaa tggctttctg gataacatca 1500

gcagcaaaca tattgttgaa cgcctgagaa aaattggcga taactataat ggctacaacc 1560

tggacaaaat ctacatcgtc agcaaatttt acgaaagcgt cagccaaaaa acatatcgcg 1620

attgggaaac aattaataca gcgctggaaa ttcattataa caacattctg cctggcaacg 1680

gcaaaagcaa agcagataaa gttaaaaagg cggtcaaaaa tgacctgcag aaaagcatta 1740

cagaaatcaa tgaactggtc agcaactaca aactgtgctc agatgataat atcaaggcgg 1800

aaacgtacat ccatgaaatt agccatatcc tgaacaactt tgaagcgcaa gaactgaaat 1860

ataacccgga aatccatctg gttgaaagcg aactgaaagc aagcgagctg aaaaatgttc 1920

tggatgtcat tatgaatgcg tttcattggt gcagcgtctt tatgacagaa gaactggtcg 1980

ataaagataa caacttttat gcggaactgg aagagattta cgacgaaatt tatccggtca 2040

tcagcctgta taatctggtt cgcaattatg tcacacagaa accgtatagc acgaagaaaa 2100

tcaaactgaa ctttggcatt ccgacactgg cagatggctg gtcaaaatca aaagaatata 2160

gcaacaacgc gatcatcctg atgcgcgata atctttatta tctgggcatt ttcaacgcga 2220

aaaacaagcc ggacaaaaaa atcatcgaag gcaatacgtc agagaacaaa ggcgactata 2280

aaaagatgat ctataatctg cttccgggac cgaataaaat gatcccgaaa gtttttctgt 2340

caagcaaaac aggcgtcgaa acatataaac cgtcagcgta tattctggaa ggctacaaac 2400

agaacaaaca catcaaaagc agcaaggact ttgacatcac attttgccat gatctgatcg 2460

actactttaa gaactgcatt gcaattcatc cggaatggaa aaacttcggc tttgattttt 2520

cagacacgag cacgtatgaa gatatcagcg gcttttatag agaagttgaa ctgcagggct 2580

ataaaatcga ctggacatat atcagcgaaa aggatattga tctgctgcaa gaaaaaggcc 2640

aactgtacct gtttcagatc tacaacaaag acttcagcaa aaaaagcacg ggcaatgata 2700

acctgcatac gatgtacctg aaaaaccttt ttagcgaaga gaacctgaaa gacattgtcc 2760

tgaaactgaa tggcgaagcc gaaattttct ttcgcaaatc cagcattaaa aacccgatca 2820

tccataaaaa aggcagcatt ctggttaacc gcacatatga agcggaagaa aaagatcagt 2880

ttggcaacat tcagatcgtc cgcaaaaaca ttccggaaaa catttatcaa gaactgtaca 2940

aatactttaa cgataaaagc gataaagaac tgtccgacga agcagcgaaa cttaaaaatg 3000

ttgttggcca tcatgaagcg gcaacaaaca ttgttaaaga ctatcgctat acgtacgata 3060

aatactttct gcatatgccg atcacgatca acttcaaagc aaataaaacg ggctttatca 3120

acgatcgcat tctgcagtat attgccaaag aaaaggatct gcatgtcatc ggcattgcta 3180

gaggcgaacg caatctgatt tatgtcagcg ttattgatac atgcggcaac attgtcgaac 3240

agaaaagctt taacattgtc aacggctatg actaccagat caagctgaaa cagcaagaag 3300

gcgcaagaca aattgctcgc aaagaatgga aagaaatcgg caagatcaaa gaaattaaag 3360

agggctatct gagcctggtc attcatgaaa tttctaaaat ggtcatcaaa tataacgcga 3420

ttatcgccat ggaagatctg tcatatggct ttaagaaagg ccgttttaaa gtcgaaagac 3480

aggtctacca gaaattcgaa acaatgctga ttaacaaact gaattatctg gtgtttaaag 3540

acatcagcat cacggaaaat ggcggactgc tgaaaggcta tcaactgaca tatattccgg 3600

ataagcttaa aaacgtcggc catcaatgcg gctgcatctt ttatgttccg gcagcgtata 3660

catcaaaaat tgatccgaca acaggctttg tcaacatctt caaattcaaa gatctgacgg 3720

tcgatgcgaa acgcgaattc attaagaaat ttgacagcat ccgctacgac agcgagaaaa 3780

atcttttctg ctttacgttc gactacaaca actttatcac gcagaatacg gttatgtcaa 3840

aaagcagctg gtcagtctat acatatggcg ttagaattaa acgcagattt gtgaacggca 3900

gatttagcaa tgaaagcgat acaatcgaca tcacgaaaga catggaaaaa acgcttgaaa 3960

tgacggatat taactggcgt gatggacatg atcttcgcca ggatattatc gattatgaaa 4020

tcgtccagca catctttgaa atctttagac tgacagtcca aatgcgcaat tcactgtcag 4080

aacttgaaga tagagattat gatcgcctga tttctccggt cctgaatgaa aataacatct 4140

tttacgatag cgcaaaagca ggcgacgcac tgccgaaaga tgcggatgca aatggcgcat 4200

attgcattgc actgaaaggc ctgtatgaaa tcaaacaaat caccgagaat tggaaagagg 4260

acggcaaatt ttcacgggat aaactgaaaa tcagcaacaa ggactggttt gacttcatcc 4320

aaaataagcg ctacctgtaa tgctgtccag actgtccgct gtgtaaaaaa aaggaataaa 4380

ggggggttga cattatttta ctgatatgta taatataatt tgtataagaa aatggtcaaa 4440

agaccttttt aatttctact cttgtagata caagtaccat tttccctata gcggccgcag 4500

atctgggacc aataataatg actagagaag aaagaatgaa gattgttcat gaaattaagg 4560

aacgaatatt ggataaagtg ggatattttt aaaatatata tttatgttac agtaatattg 4620

acttttaaaa aaggattgat tctaatgaag aaagcagaca agtaagcctc ctaaattcac 4680

tttagataaa aatttaggag gcatatcaaa tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt 4740

ggaagagaaa agagatattt aatcattatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca 4800

cagaaattga tattagtgtt ttataccgaa acataaaaca agaaggatat aaattttacc 4860

ctgcatttat tttcttagtg acaagggtga taaactcaaa tacagctttt agaactggtt 4920

acaatagcga cggagagtta ggttattggg ataagttaga gccactttat acaatttttg 4980

atggtgtatc taaaacattc tctggtattt ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt 5040

tttatgattt atacctttct gatgtagaga aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca 5100

aaacacctat acctgaaaat gctttttctc tttctattat tccatggact tcatttactg 5160

ggtttaactt aaatatcaat aataatagta attaccttct acccattatt acagcaggaa 5220

aattcattaa taaaggtaat tcaatatatt taccgctatc tttacaggta catcattctg 5280

tttgtgatgg ttatcatgca ggattgttta tgaactctat tcaggaattg tcagataggc 5340

ctaatgactg gcttttataa tatgagataa tgccgactgg ctagcatggc aagacccaga 5400

aaagttctgg gagatcccgc tttgcataag cgtattatag tggatgacgc gggctttgtt 5460

gtttacactt cttgcacctg ctgacggcaa tcatccctat ctatgaaatc gagatttcag 5520

caggccgtta ttttcgagag agttaaatct atattcattg tttttatttt ggtaaggaca 5580

taccggattt taggtttgga ttaccggtcg agttagcttg tcttttcgcc cactaccgtg 5640

tcgatgcggg agcaatttac cagaagcact taccgattga tagtttttta ttccggtgat 5700

tgcaaagttt cataaacaag ct 5722

<210> 9

<211> 9200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> amyE:GFP-gDNA(gfp)-spc，图8（PP.5625）

<400> 9

aagcagtaca tgctgggcat gtactgcttt tttctattac actcctaatc ttgcaagagt 60

aaacgtccat atacaaatga tcaataacag aatcaggctg tacggcactg tccttttaaa 120

cagtttagat tccttgcctg tttggccgac cgctgcggca gcgatggcga tagattgagg 180

agaaacaagt ttcgccatga caccgcccgc cgtatttgcg gctaacagca aatctgaacc 240

cgcaccgatc tgcgctcccg tgacaacctg caaatggccg aacaaagcat tattgctgac 300

aacagaaccg gtgatgaaca cgccaatcca gccgagaaca ggactgacaa acgggaacag 360

gtctcctgtt ctcgccaatg ctaacccaat tgaagagctg agccctgcga agttggccag 420

attggcaaac cccatcacga agcagatcgt cataatcggc acccacagct cttttcccgt 480

ctccttcaag gaagcaaagg catcccgaga ggagaacttt ttgctgacca gccctgtcac 540

gatgaccgcc gctaaaatcg ctgtaccagt cgctgacagc agatcaactt taaagactgc 600

atctaacggc atggcagatg gcgcaatcgg cggcattttc ataatttgct gatgcagaaa 660

aggcattttg aacaggagcg ttgattgata taacagcccg ccttcttgga aaagcgcttt 720

gaaggcagga aggctccaga tggtgatcgc cgcagttaaa atgtagaaag gagaccacgc 780

tctcgcaatg tcagcggcac ggtatgcctt tttctcacca gcatcgccgg ccccttcctc 840

gcggtaaatc tctttcggct gccatttgcg gaggaagaag gcaagcccgc ccatgctgaa 900

taaggccgcc aaaatgtttg ctaattccgg cccgagcacc gccattgtca gtgtctgaac 960

cgctgtatac ccaccgctca caaccagaag agcgggccat gtctgtttga ttcctttcat 1020

tcggtctaat aagaatacaa gcaggaatgg tattaaaaat gagatcatcg gcagtgtcca 1080

cattaatgtc cgagacagct caagagcaga caaatcacca atctgcgccc ctgtgatgac 1140

aggaatccca atcgccccaa aggctccgga ggcagcgttt gcaatcaagc agagcgccgc 1200

cgcttttaac ggtttaaaac caagttcgac gagcagcgcc gcactaatcg caatcggaac 1260

accaaaaccg gccgcgcctt ctaaaaacgc gttaaaacaa aaaccaatta ataatagctg 1320

taatcgttgg tcaggcgaaa tgccggcaat gctggaccga ataatggtaa atttcccggt 1380

tttcacggcg attttataca gccacaccgc catcaggacg atgtagccaa tgggccacag 1440

cccgctcccg attcctaaca aaacagaaga aatcgctttt tcaaccggca tatgaaatgc 1500

ccaaacggag acgaagaaac tgacggctag ggtaagaaat gccgcaagaa tgcctttcat 1560

tttcaaaaca gttaaagcca aaagaaaaaa gagaatcgga gtgagcgcca caagtgcgct 1620

cacatactcg tttccaaacg gatcatacaa ctgctcccac attgacaatc agccctttac 1680

tctaaagttg cggttagttg actttttgtt ctgcaaaatg aggttttaaa atgtttttaa 1740

ggacgccggc gctgtgaagg aactgttctt tttctttctc atttaagttc agctcagtga 1800

tacctgcgat ccctccgcga ttcacgacag ccggcacacc gatgtacacg tcatctgcac 1860

cgtattgccc gtccaaatat gtgctgacag ttaatatgct gttttcatta tgaagaatgg 1920

cttttgtaat gcgagcaaga ctcatcgcaa ccccataata agtcgcgcct tttttctcaa 1980

tgatatggta agctgcgttt ttcacatcat ctacaatttg gtccagctcc tcttgtttgt 2040

acgcatcgtt tttctcaacg agttcactga ccggcacacc gccgacattc gcgtggctcc 2100

aaacaggaag ctctgtgtcg ccgtgctctc cgataatatg cgcgtgtacg ttttgaggcg 2160

ctgcgccaaa gtattcgctc agcatgaaac ggaatctcgc agaatcaagt gttgtgccgc 2220

ttccaatcac ccgctctttt ggcaggccgc tgaatttcca tgttgcgtaa gtcaggatat 2280

caaccggatt tgtcgcgact aagaaaatgc cgtcaaatcc gctcgccatg acttcactaa 2340

cgatgccttt gaaaatcttc aagttctttt ctactaattc aaggcgtgtc tcaccaggtt 2400

tttggtttgc tccggcgcaa atgcagacaa tatcagcatc cttgcagtct tcatatgttc 2460

cgtaagatgt tttgaccggt tgtagcccaa acgcctttcc gtggggtaaa tccatcacat 2520

cgcccattgc tttttcttta tttacatcaa tgaccacaag ctcatctgtg atcccttggt 2580

taattaacgc aaatgcataa ctgcttccaa caaaacccgc tccgattaaa gctactttat 2640

ttacatgttt gttcatcatt aatcatcctt gcagggtatg tttctctttg atgtcttttt 2700

gtttgtgaag tatttcacat ttatattgtg caacacttca caaacttttg caagagaaaa 2760

gttttgtctg atttatgaac aaaaaagaaa ccatcattga tggtttcttt cggtaagtcc 2820

cgtctagcct tgccctcaat ggggaagaga accgcttaag cccgagtcat tatataaacc 2880

atttagcacg taatcaaagc caggctgatt ctgaccgggc acttgggcgc tgccattatt 2940

aaaaatcact tttgcgttgg ttgtatccgt gtccgcaggc agcgtcagcg tgtaaattcc 3000

gtctgcattt ttagtcattg gttttccagg ccaagatccg gtcaattcaa ttactcggct 3060

cccatcatgt ttatagatat aagcatttac ctggctccaa tgattcggat tttgatagcc 3120

gatggttttg gccgacgctg gatctctttt aacaaaactg tatttctcgg tcctcgttac 3180

accatcactg ttcgttcctt ttaacatgat ggtgtatgtt ttgccaaatt ggatctcctt 3240

ttccgattgt gaattgatct ccatccttaa acgcctgtcg tctggtccat tattgatttg 3300

ataaacggct tttgttgtat tcgcatctgc acgcaaggta atcgtcagtt gatcattgaa 3360

agaatgtgtt acacctgttt tgtaattctc aaggaaaaca tgaggcgctt ttgcaatatc 3420

atcaggataa agcacagcta cagacctggc attgatcgtg cctgtcagtt taccatcgtt 3480

cacttgaaat gaacccgctc cagctttatt gtcatacctg ccatcaggca attttgttgc 3540

cgtattgata gagacagagg atgaacctgc atttgccagc acaacgccat gtgagccgcg 3600

ctgattcata aatatctggt tgtttccatt cgggttcgag agttcctcag gctgtccagc 3660

catcacattg tgaaatctat tgaccgcagt gatagcctga tcttcaaata aagcactccc 3720

gcgatcgcct atttggcttt tccccgggaa cctcacacca tttccgcctc cctcaggtct 3780

ggaaaagaaa agaggcgtac tgcctgaacg agaagctatc accgcccagc ctaaacggat 3840

atcatcatcg ctcatccatg tctgtagaca aattgtgaaa ggatgtactt aaacgctaac 3900

ggtcagcttt attgaacagt aatttaagta tatgtccaat ctagggtaag taaattgagt 3960

atcaatataa actttatatg aacataatca acgaggtgaa atcatgagca atttgattaa 4020

cggaaaaata ccaaatcaag cgattcaaac attaaaaatc gtaaaagatt tatttggaag 4080

ttcaatagtt ggagtatatc tatttggttc agcagtaaat ggtggtttac gcatttacag 4140

cgatgtagat gttctagtcg tcgtgaatca tagtttacct caattaactc gaaaaaaact 4200

aacagaaaga ctaatgacta tatcaggaaa gattggaaat acggattctg ttagaccact 4260

tgaagttacg gttataaata ggagtgaagt tgtcccttgg caatatcctc caaaaagaga 4320

atttatatac ggtgagtggc tcaggtgtgg atttgagaat ggacaaattc aggaaccaag 4380

ctatgatcct gatttggcta ttgttttagc acaagcaaga aagaatagta tttctctatt 4440

tggtcctgat tcttcaagta tacttgtctc cgtacctttg acagatattc gaagagcaat 4500

taaggattct ttgccagaac taattgaggg gataaaaggt gatgagcgta atgtaatttt 4560

aaccctagct cgaatgtggc aaacagtgac tactggtgaa attacctcga aagatgtcgc 4620

tgcggaatgg gctatacctc ttttacctaa agagcatgta actttactgg atatagccag 4680

aaaaggctat cggggagagt gtgatgataa gtgggaagga ctatattcaa aggtgaaagc 4740

actcgttaag tatatgaaaa attctataga aacttctctc aattaggcta attttattgc 4800

aataacaggt gcttactttt aaaactactg atttattgat aaatattgaa caatttttgg 4860

gaagaataaa gcgtcctctt gtgaaattag agaacgcttt attactttaa tttagtgaaa 4920

caatttgtaa ctattgaaaa tagaaagaaa ttgttccttc gatagtttat taatattagt 4980

ggagctcagt gagagcgaag cgaacacttg attttttaat tttctatctt ttataggtca 5040

ttagagtata cttatttgtc ctataaacta tttagcagca taatagattt attgaatagg 5100

tcatttaagt tgagcatatt aggggaggaa aatcttggag aaatatttga agaacccgag 5160

atctagatca ggtaccgcaa cgttcgcaga tgctgctgaa gagattatta aaaagctgaa 5220

agcaaaaggc tatcaattgg taactgtatc tcagcttgaa gaagtgaaga agcagagagg 5280

ctattgaata aatgagtaga aagcgccata tcggcgcttt tcttttggaa gaaaatatag 5340

ggaaaatggt acttgttaaa aattcggaat atttatacaa tatcatatgt atcacattga 5400

aaggaggagg gaagctttat gagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt 5460

cttgttgaat tagatggcga tgttaatggg caaaaattct ctgttagtgg agagggtgaa 5520

ggtgatgcaa catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg gaagctacct 5580

gttccatggc caacgcttgt cactactctc acttatggtg ttcaatgctt ttctagatac 5640

ccagatcata tgaaacagca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag 5700

gaaagaacta tattttacaa agatgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt 5760

gaaggtgata cccttgttaa tagaatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga 5820

aacattcttg gacacaaaat ggaatacaat tataactcac ataatgtata catcatggca 5880

gacaaaccaa agaatggcat caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat taaagatgga 5940

agcgttcaat tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt 6000

ttaccagaca accattacct gtccacgcaa tctgcccttt ccaaagatcc caacgaaaag 6060

agagatcaca tgatccttct tgagtttgta acagctgctg ggattacaca tggcatggat 6120

gaactataca aataatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga ataaaggggg 6180

gttgacatta ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatgg tcaaaagacc 6240

tttttaattt ctactcttgt agatactgga gttgtcccaa ttcttattga cactaaaggg 6300

atccagaagc ggcaacacgc taatcaataa aaaaacgctg tgcggttaaa gggcacagcg 6360

ttttttgtgt atgaatcgaa aaagagaaca gatcgcaggt ctcaaaaatc gagcgtaaag 6420

ggctgatccg cggccgcgcg tcaacaatga cctttatgcc atattcttca gcggctgcac 6480

acatttcttt aaattcttgt tcagtaccta agtaacggtt gccaatttga tacgatgtcg 6540

gctgatacag ccagtaccag ttcgacatgc ttttatctcc ttgattccct tcctttactt 6600

ggttaatcgg agatgtctga atggctgtat atcctgcatc atgaatatcc ttcatattgt 6660

gttttaacgt attgaacgac caattccatg catgaagaat ggttccgctt ttgatcgacg 6720

gtgctgtaag ctcattcgat ttgttcgccg tttcagcact cgcagccgcc ggtcctgcca 6780

gaaccaaatg aaacagcaat aaaaatccag cgaataacgg cagtaaagag gttttgaatc 6840

gttttgcaaa cattcttgac actccttatt tgattttttg aagacttact tcggagtcaa 6900

aaatccctct tacttcattc ttccgcttcc tcctttcaaa ccgatgtgaa gactggagaa 6960

ttttgttaac gcttacattt aaaattatca caatcactct atcaaaacaa cttggcagag 7020

tgaatacaaa tcaatgttcc tataaaaaaa gctgcccgaa actgtgaacg cttccctcgc 7080

tttccaaaca aaaaagatga tttctttttt atttcttctt ttaccgctct tctgtaagcc 7140

agcttcacaa tcacataccg aagcagaaac agaacgccgc cgcagacgat aaaaagaaga 7200

atcattttca gccaagcgaa gaatgtatgg ggaatccccc tgtcgtacat cgtaagcacc 7260

actaccgcaa aggcgcaagc aattgattct attcgctgct gcttcacccg tttttgcagt 7320

tcttctttgg tgtctattct cggcatgagc attccggatg ccgcagccct gatgcagtaa 7380

tataagataa tgatgaacaa aaacacaagg cttgcagacc attctttaaa cggaaattca 7440

aacataatgc cgcggatgat cacatcaggc agagcaactg ctcccgctat catcccattc 7500

tccgaccaga ttttttgttc tttttctttt actctcttat ttttcccatt cacgcctgaa 7560

agtctattac gcagattatt catgaccttc ctcccgcact tttacgaatg gcttatggct 7620

tacatgttac aataacagcc tgcgcttctg caatgaataa ctcaaaagcc cgccgtacaa 7680

gccggcgggc agcaatcgtt aaaacggccc ccaattgatc atgactccga tcacgataaa 7740

gacaagcccg atcaagaacc aaatcagagc aagcggcacc ataaaccgca gccacttgac 7800

atacggaata ccgctggcgg caagcaccgc catgagaacg ccggatgtcg ggttcacaca 7860

gttgacgacc ccttctccaa gcataaccgc ttcaaccgca acctgtctcg tgattcccat 7920

caaatcagcg agcggcgcca ggattggaat aaatacaacg gcttcgccag aacctgaaga 7980

gatgagaaaa tgaagcagcg cactggcgat atacatgccg attgccccag caatcgggct 8040

gaatccatcc aaaagtgaag ccaaagcatt gacgacagta tcgagaagct ttccattttc 8100

aaggataacg gaaatgcttc gtgccatccc gacaatcagc gccccgtata caagactttg 8160

gcagcccgta atgaaggttt tggcaatatc gttcgccgca agcccgccta ttaaaccggc 8220

aaggacagaa ataaaaataa atgtcgcagc catttgggaa tctgaccagc caagcttcaa 8280

agcgccgtat aaaaatccga caagtgagag tcccgccaca gccaaaatca gcttatggcg 8340

aacggtaaac ggcactgact gatcttcttc tttaccggct tcgcccattc ctgccgcagg 8400

gaaccaatct gttcctaaca cactggcatc ttttgatttt tttaattttc tcgtatacaa 8460

atagatataa ataatagaag acagcaaaaa gcatatgtat atcacaactc gcaggccgat 8520

tcctgagaaa agagggagct ccgcgattga ttgtgataaa ccgagcggtg acggtgataa 8580

tatggtggag ttaaatccag cgtagcagcc gatgtatata acagcggctc ccgcgactgc 8640

gtcccatttt aaggatcgtg ccacaatgag gccgatgggg atacaaccga taactgaatt 8700

cacgacaatc ccggttgttc cgagaatgga gaacaatgcg ccgacaatac aaatacataa 8760

taattgcttt gtgcggaatt tgctgatgac attgtaaatc aggccattga tggcacccgt 8820

tttttctaga atagcaatgg tgccgcctgt gaataaaatc agaaagatga tgggtgctga 8880

tccaaccatt ccatcctgta gagaagtaaa aaagctgatc aatctgaccg gagactgttc 8940

aattgaatga tagcttcccg gaacagcggt cgtgacatcc ccctttgtca cgcggtcaaa 9000

ttcacctgcc ggcacaatat atgaagcgat tgcgcaaatg aaagcaatca taaataagag 9060

gacataggcg tcaggcattt taaatgtcat acgttttttc ttaggctgtg tttcggctgc 9120

tggcatactc atatttcgat ccatcccctc tgtttgaaaa tattaattat tctgaatagt 9180

agcaatatgt gctatattaa 9200

<210> 10

<211> 8704

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pel:mad7d，图9（MOL3268）

<400> 10

ttactgcttt ctcatgaaag catcatcaga cacaaataag tggtatgcag cgttaccgtg 60

tcttcgagac aaaaacgcat gggcgttggc tttagaggtt tcgaacatat cagcagtgac 120

ataaggaagg agagtgctga gataaccgga caatttcttt tctatttcat ctgttagtgc 180

aaattcaatg tcgccgatat tcatgataat cgagaaaaca aagtcgatat cgatatgaaa 240

atgttcctcg gcaaaaaccg caagctcgtg aattcctggt gaacatccgg cacgcttatg 300

gaaaatctgt ttgactaaat cactcacaat ccaagcattg tattgctgtt ctggtgaaaa 360

gtattgcatt agacatacct cctgctcgta cggataaagg cagcgtttca tggtcgtgtg 420

ctccgtgcag cggcttctcc ttaattttga tttttctgaa aataggtccc gttcctatca 480

ctttaccatg gacggaaaac aaatagctac taccattcct cctgtttttc tcttcaatgt 540

tctggaatct gtttcaggta cagacgatcg ggtatgaaag aaatatagaa aacatgaagg 600

aggaatatcg acatgaaacc agttgtaaaa gagtatacaa atgacgaaca gctcatgaaa 660

gatgtagagg aattgcagaa aatgggtgtt gcgaaagagg atgtatacgt cttagctcac 720

gacgatgaca gaacggaacg cctggctgac aacacgaacg ccaacacgat cggagccaaa 780

gaaacaggtt tcaagcacgc ggtgggaaat atcttcaata aaaaaggaga cgagctccgc 840

aataaaattc acgaaatcgg tttttctgaa gatgaagccg ctcaatttga aaaacgctta 900

gatgaaggaa aagtgcttct ctttgtgaca gataacgaaa aagtgaaagc ttgggcataa 960

agcaaggaaa aaaccaaaag gccaatgtcg gccttttggt ttttttgcgg tctttgcggt 1020

gggattttgc agaatgccgc aataggatag cggaacattt tcggttctga atgtccctca 1080

atttgctatt atatttttgt gataaattgg aataaaatct cacaaaatag aaaatggggg 1140

tacatagtgg atgaaaaaag tgatgttagc tacggctttg tttttaggat tgactccagc 1200

tggcgcgaac gcagctgatt taggccacca gacgttggga tccaatgatg gctggggcgc 1260

gtactcgacc ggcacgacag gcggatcaaa agcatcctcc tcaaatgtgt ataccgtcag 1320

caacagaaac cagcttgtct cggcattagg gaaggaaacg aacacaacgc caaaaatcat 1380

ttatatcaag ggaacgattg acatgaacgt ggatgacaat ctgaagccgc ttggcctaaa 1440

tgactataaa gatccggagt atgatttgga caaatatttg aaagcctatg atcctagcac 1500

atggggcaaa aaagagccgt cgggaacaca agaagaagcg agagcacgct ctcagaaaaa 1560

ccaaaaagca cgggtcatgg tggatatccc tgcaaacacg acgatcgtcg gttcagggac 1620

taacgctaaa gtcgtgggag gaaacttcca aatcaagagt gataacgtca ttattcgcaa 1680

cattgaattc caggatgcct atgactattt tccgcaatgg ttgtaaaacg acggccagtg 1740

aattctgatc aaatggttca gtgagagcga agcgaacact tgatttttta attttctatc 1800

ttttataggt cattagagta tacttatttg tcctataaac tatttagcag cataatagat 1860

ttattgaata ggtcatttaa gttgagcata ttagaggagg aaaatcttgg agaaatattt 1920

gaagaacccg aggatctaga tcaggtaccg caacgttcgc agatgctgct gaagagatta 1980

ttaaaaagct gaaagcaaaa ggctatcaat tggtaactgt atctcagctt gaagaagtga 2040

agaagcagag aggctattga ataaatgagt agaaagcgcc atatcggcgc ttttcttttg 2100

gaagaaaata tagggaaaat ggtacttgtt aaaaattcga aatatttata caatatcata 2160

tgtatcacat tgaaagggga ggagaatcat gaataatggc acaaataact tccagaactt 2220

cattggcatt agcagcctgc aaaaaacact gagaaatgca ctgattccga cagaaacaac 2280

acagcagttt attgtcaaaa acggcatcat caaagaggat gaactgagag gcgaaaatcg 2340

ccaaattctg aaagatatca tggacgacta ttaccgtggc tttatttcag aaacactgtc 2400

cagcattgat gatatcgatt ggacaagcct gttcgagaaa atggaaatcc aactgaaaaa 2460

cggcgataac aaagacacgc tgattaaaga acaaacggaa tatcgcaaag cgatccacaa 2520

aaagtttgca aatgatgacc gctttaaaaa catgttcagc gcgaaactga ttagcgatat 2580

tctgccggaa tttgtcatcc acaataataa ctatagcgcg agcgagaaag aagaaaaaac 2640

acaggtcatt aaactgttta gccgctttgc cacaagcttc aaagactatt tcaaaaatcg 2700

cgcaaactgc tttagcgcag atgatatttc atcatcaagc tgccatcgga ttgtcaatga 2760

taatgcggaa atctttttta gcaacgcact ggtctatcgc agaattgtta aatcattgag 2820

caacgacgac atcaacaaaa tctcaggcga tatgaaagac agcctgaaag aaatgtcact 2880

ggaagaaatc tacagctacg aaaaatacgg cgaatttatc acacaagaag gcatcagctt 2940

ttacaacgat atttgcggca aagtcaacag ctttatgaat ctgtattgcc agaaaaacaa 3000

agaaaacaaa aacctgtata aactgcagaa actgcacaag cagattctgt gcattgcaga 3060

tacatcatat gaagtcccgt acaaatttga gagcgacgaa gaagtttatc aaagcgttaa 3120

tggctttctg gataacatca gcagcaaaca tattgttgaa cgcctgagaa aaattggcga 3180

taactataat ggctacaacc tggacaaaat ctacatcgtc agcaaatttt acgaaagcgt 3240

cagccaaaaa acatatcgcg attgggaaac aattaataca gcgctggaaa ttcattataa 3300

caacattctg cctggcaacg gcaaaagcaa agcagataaa gttaaaaagg cggtcaaaaa 3360

tgacctgcag aaaagcatta cagaaatcaa tgaactggtc agcaactaca aactgtgctc 3420

agatgataat atcaaggcgg aaacgtacat ccatgaaatt agccatatcc tgaacaactt 3480

tgaagcgcaa gaactgaaat ataacccgga aatccatctg gttgaaagcg aactgaaagc 3540

aagcgagctg aaaaatgttc tggatgtcat tatgaatgcg tttcattggt gcagcgtctt 3600

tatgacagaa gaactggtcg ataaagataa caacttttat gcggaactgg aagagattta 3660

cgacgaaatt tatccggtca tcagcctgta taatctggtt cgcaattatg tcacacagaa 3720

accgtatagc acgaagaaaa tcaaactgaa ctttggcatt ccgacactgg cagatggctg 3780

gtcaaaatca aaagaatata gcaacaacgc gatcatcctg atgcgcgata atctttatta 3840

tctgggcatt ttcaacgcga aaaacaagcc ggacaaaaaa atcatcgaag gcaatacgtc 3900

agagaacaaa ggcgactata aaaagatgat ctataatctg cttccgggac cgaataaaat 3960

gatcccgaaa gtttttctgt caagcaaaac aggcgtcgaa acatataaac cgtcagcgta 4020

tattctggaa ggctacaaac agaacaaaca catcaaaagc agcaaggact ttgacatcac 4080

attttgccat gatctgatcg actactttaa gaactgcatt gcaattcatc cggaatggaa 4140

aaacttcggc tttgattttt cagacacgag cacgtatgaa gatatcagcg gcttttatag 4200

agaagttgaa ctgcagggct ataaaatcga ctggacatat atcagcgaaa aggatattga 4260

tctgctgcaa gaaaaaggcc aactgtacct gtttcagatc tacaacaaag acttcagcaa 4320

aaaaagcacg ggcaatgata acctgcatac gatgtacctg aaaaaccttt ttagcgaaga 4380

gaacctgaaa gacattgtcc tgaaactgaa tggcgaagcc gaaattttct ttcgcaaatc 4440

cagcattaaa aacccgatca tccataaaaa aggcagcatt ctggttaacc gcacatatga 4500

agcggaagaa aaagatcagt ttggcaacat tcagatcgtc cgcaaaaaca ttccggaaaa 4560

catttatcaa gaactgtaca aatactttaa cgataaaagc gataaagaac tgtccgacga 4620

agcagcgaaa cttaaaaatg ttgttggcca tcatgaagcg gcaacaaaca ttgttaaaga 4680

ctatcgctat acgtacgata aatactttct gcatatgccg atcacgatca acttcaaagc 4740

aaataaaacg ggctttatca acgatcgcat tctgcagtat attgccaaag aaaaggatct 4800

gcatgtcatc ggcattgcta gaggcgaacg caatctgatt tatgtcagcg ttattgatac 4860

atgcggcaac attgtcgaac agaaaagctt taacattgtc aacggctatg actaccagat 4920

caagctgaaa cagcaagaag gcgcaagaca aattgctcgc aaagaatgga aagaaatcgg 4980

caagatcaaa gaaattaaag agggctatct gagcctggtc attcatgaaa tttctaaaat 5040

ggtcatcaaa tataacgcga ttatcgccat ggaagatctg tcatatggct ttaagaaagg 5100

ccgttttaaa gtcgaaagac aggtctacca gaaattcgaa acaatgctga ttaacaaact 5160

gaattatctg gtgtttaaag acatcagcat cacggaaaat ggcggactgc tgaaaggcta 5220

tcaactgaca tatattccgg ataagcttaa aaacgtcggc catcaatgcg gctgcatctt 5280

ttatgttccg gcagcgtata catcaaaaat tgatccgaca acaggctttg tcaacatctt 5340

caaattcaaa gatctgacgg tcgatgcgaa acgcgaattc attaagaaat ttgacagcat 5400

ccgctacgac agcgagaaaa atcttttctg ctttacgttc gactacaaca actttatcac 5460

gcagaatacg gttatgtcaa aaagcagctg gtcagtctat acatatggcg ttagaattaa 5520

acgcagattt gtgaacggca gatttagcaa tgaaagcgat acaatcgaca tcacgaaaga 5580

catggaaaaa acgcttgaaa tgacggatat taactggcgt gatggacatg atcttcgcca 5640

ggatattatc gattatgaaa tcgtccagca catctttgaa atctttagac tgacagtcca 5700

aatgcgcaat tcactgtcag aacttgaaga tagagattat gatcgcctga tttctccggt 5760

cctgaatgaa aataacatct tttacgatag cgcaaaagca ggcgacgcac tgccgaaaga 5820

tgcggatgca aatggcgcat attgcattgc actgaaaggc ctgtatgaaa tcaaacaaat 5880

caccgagaat tggaaagagg acggcaaatt ttcacgggat aaactgaaaa tcagcaacaa 5940

ggactggttt gacttcatcc aaaataagcg ctacctgtaa acgcgttaat cgcatgttca 6000

atccgctcca taatcggtcg acgcggcggt tcgcgtccgg acagcacatc accgaaatat 6060

ttcgacggcc cagccggcta gcgcgttaat ccgcggatat atagcggccg cagatctggg 6120

accaataata atgactagag aaaaagaatg aagattgttc atgaaattaa ggaacgaata 6180

ttggataaag tgggatattt ttaaaatata tatttatgtt acagtaatat tgacttttaa 6240

aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc tcctaaattc actttagata 6300

aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacaa ttggaagaga 6360

aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt ttagtataac cacagaaatt 6420

gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat ataaatttta ccctgcattt 6480

attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc 6540

gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt atacaatttt tgatggtgta 6600

tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat 6660

ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct 6720

atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga cttcatttac tgggtttaac 6780

ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt 6840

aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat 6900

ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac 6960

tggcttttat aatatgagat aatgccgact gtacttttta cagtcggttt tctaacgata 7020

cattaatagg tacgaaaaag caactttttt tgcgcttaaa accagtcata ccaataactt 7080

aagggtaact agcctcgccg gaaagagcga aaatgcctca catttgtgcc acctaaaaag 7140

gagcgattta catatgagtt atgcagtttg tagaatgcaa aaagtgaaat cagctggact 7200

aaaaggggcc gcagagtaga atggaaaagg ggatcggaaa acaagtatat aggaggagac 7260

ctatttatgg cttcagaaaa agacgcagga aaacagtcag cagtaaagct tgttccattg 7320

cttattactg tcgctgtggg actaatcatc tggtttattc ccgctccgtc cggacttgaa 7380

cctaaagctt ggcatttgtt tgcgattttt gtcgcaacaa ttatcggctt tatctccaag 7440

cccttgccaa tgggtgcaat tgcaattttt gcattggcgg ttactgcact aactggaaca 7500

ctatcaattg aggatacatt aagcggattc gggaataaga ccatttggct tatcgttatc 7560

gcattcttta tttcccgggg atttatcaaa accggtctcg gtgcgagaat ttcgtatgta 7620

ttcgttcaga aattcggaaa aaaaaccctt ggactttctt attcactgct attcagtgat 7680

ttaatacttt cacctgctat tccaagtaat acggcgcgtg caggaggcat tatatttcct 7740

attatcagat cattatccga aacattcgga tcaagcccgg caaatggaac agagagaaaa 7800

atcggtgcat tcttattaaa aaccggtttt caggggaatc tgatcacatc tgctatgttc 7860

ctgacagcga tggcggcgaa cccgctgatt gccaagctgg cccatgatgt cgcaggggtg 7920

gacttaacat ggacaagctg ggcaattgcc gcgattgtac cgggacttgt aagcttaatc 7980

atcacgccgc ttgtgattta caaactgtat ccgccggaaa tcaaagaaac accggatgcg 8040

gcgaaaatcg caacagaaaa actgaaagaa atgggaccgt tcaaaaaatc ggagctttcc 8100

atggttatcg tgtttctttt ggtgcttgtg ctgtggattt ttggcggcag cttcaacatc 8160

gacgctacca caaccgcatt gatcggtttg gccgttctct tattatcaca agttctgact 8220

tgggatgata tcaagaaaga acagggcgct tgggatacgc tcacttggtt tgcggcgctt 8280

gtcatgctcg ccaacttctt gaatgaatta ggcatggtgt cttggttcag taatgccatg 8340

aaatcatccg tatcagggtt ctcttggatt gtggcattca tcattttaat tgttgtgtat 8400

tattactctc actatttctt tgcaagtgcg acagcccaca tcagtgcgat gtattcagca 8460

tttttggctg tcgtcgtggc agcgggcgca ccgccgcttt tagcagcgct gagcctcgcg 8520

ttcatcagca acctgttcgg gtcaacgact cactacggtt ctggagcggc tccggtcttc 8580

ttcggagcag gctacatccc gcaaggcaaa tggtggtcca tcggatttat cctgtcgatt 8640

gttcatatca tcgtatggct tgtgatcggc ggattatggt ggaaagtact aggaatatgg 8700

taga 8704

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gDNA（gfp）

<400> 11

gtcaaaagac ctttttaatt tctactcttg tagatactgg agttgtccca attctt 56

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gDNA（P4199）

<400> 12

gtcaaaagac ctttttaatt tctactcttg tagatacaag taccattttc cctata 56

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 图14A上的靶DNA序列（GFP）的一段

<400> 13

ggaggaggga agctttatga gtaaaggaga agaacttttc actggagttg tcccaattct 60

tgttgaatta gatggcgatg ttaa 84

<210> 14

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 图14A上的gRNA（GFP）

<400> 14

aagaauuggg acaacuccag uuagaugucu ucaucuuuaa 40

<210> 15

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 图14B上的靶DNA序列（P4199）的一段

<400> 15

ctcctttcaa tgtgatacat atgatattgt ataaatattc cgaattttta acaagtacca 60

ttttccctat attttcttcc aaaagaaaa 89

<210> 16

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 图14B上的gRNA（P4199）

<400> 16

uauagggaaa augguacuug uuagaugucu ucaucuuuaa 40

<210> 17

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 图18上的LbCpf1氨基酸序列的一段

<400> 17

Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu

1 5 10 15

His Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln

20 25 30

Ile Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu

35 40 45

Lys Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn

50 55 60

Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val

65 70 75 80

Tyr Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro

85 90 95

Ile Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu

100 105 110

Val Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile

115 120 125

Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys

130 135 140

Gly Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe

145 150 155 160

Asn Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys

165 170 175

Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn

180 185 190

<210> 18

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 图18上的FnCpf1氨基酸序列的一段

<400> 18

Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg Pro Asn Leu

1 5 10 15

His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu Gln Asp

20 25 30

Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Lys Gln

35 40 45

Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala Ile Ala Asn

50 55 60

Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu Tyr Asp Leu

65 70 75 80

Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe His Cys Pro

85 90 95

Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe Asn Asp Glu

100 105 110

Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His Ile Leu Ser

115 120 125

Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu Val Asp Gly

130 135 140

Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile Gly Asn Asp

145 150 155 160

Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile Glu Lys Asp

165 170 175

Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

180 185

<210> 19

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 图18上所示的Mad7氨基酸序列的一段

<400> 19

Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu

1 5 10 15

His Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp

20 25 30

Ile Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser

35 40 45

Ser Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn

50 55 60

Arg Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln Phe Gly Asn Ile Gln Ile

65 70 75 80

Val Arg Lys Asn Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr

85 90 95

Phe Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser Asp Glu Ala Ala Lys Leu

100 105 110

Lys Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala Thr Asn Ile Val Lys Asp

115 120 125

Tyr Arg Tyr Thr Tyr Asp Lys Tyr Phe Leu His Met Pro Ile Thr Ile

130 135 140

Asn Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile Asn Asp Arg Ile Leu Gln

145 150 155 160

Tyr Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly

165 170 175

Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile Asp Thr Cys Gly Asn Ile

180 185 190

Val Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile

195 200 205

Lys Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln Ile Ala Arg Lys Glu Trp

210 215 220

Lys Glu Ile Gly Lys

225

Claims

1.一种RNA指导的内切核酸酶的温度敏感性变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中该变体包含对于RNA指导的内切核酸酶的稳定性或对于RNA指导的内切核酸酶、一个或多个指导RNA(gRNA)和/或一个或多个DNA靶序列之间形成的复合物的稳定性是重要的至少一个氨基酸的改变，优选地取代、缺失或插入。

2.根据权利要求1所述的变体，所述变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置877的氨基酸的改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的34、51、54、57、58、60、61、65、70、82、90、112、130、131、132、134、150、154、159、164、165、166、174、185、188、194、197、220、244、245、287、288、294、297、344、375、448、451、455、471、507、518、520、521、522、525、531、535、554、571、574、586、588、590、594、649、681、682、707、708、709、713、715、723、732、734、738、740、747、756、833、834、836、853、860、865、876、878、897、898、901、927、929、930、932、1004、1017、1011、1027、1029、1031、1042、1043、1101、1118、1127、1128、1163、1167、1196、1197、1200、1209、1210、1212和1213。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变处于与选自由以下组成的组的位置对应的位置处：SEQ ID NO:2的70、57、58、132、220、520、522、531、669、708、732、734、738、897、898、901、1029、1031、1043、1094和1213。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该至少一个改变选自由以下组成的组：F34S、F34N、F34A、F34L、R51K、R51Q、R51S、R51A、R51G、R51L、L54S、L54A、L54G、L54Y、I57S、I57A、I57G、I57L、M58S、M58A、M58G、M58L、D60S、D60A、D60G、D60L、Y61S、Y61A、Y61G、Y61L、F65Y、F65L、F65S、F65A、F65G、L70S、L70N、L70A、L70G、F82S、F82A、F82G、F82L、F82Y、K90Q、K90N、K90S、K90A、K112N、K112S、K112A、K112L、D130S、D130A、D130G、D130L、I131S、I131A、I131G、I131F、L132S、L132N、L132P、L132G、E134S、E134A、E134G、E134L、K150S、K150A、K150G、K150L、I154S、I154A、I154G、I154F、R159K、R159H、R159Q、R159N、F164S、F164A、F164G、F164Y、F164L、K165R、K165H、K165Q、K165N、D166N、D166S、D166A、D166L、C174S、C174A、C174G、C185S、C185A、C185G、I188N、I188S、I188A、I188G、E194N、E194S、E194L、E194G、F197S、F197A、F197G、F197L、G220D、G220N、G220S、G220A、G220G、I244A、I244Y、I244H、I244G、T245A、T245Y、T245Q、T245G、L287A、L287N、L287S、L287G、C288S、C288A、C288G、Y294F、Y294Q、Y294K、Y294H、Y294N、P297L、P297S、P297A、P297G、P297Q、V344S、V344N、V344L、V344G、P375L、P375S、P375A、P375G、P375Q、E448A、E448A、E448G、E448L、A451D、A451N、A451S、A451K、A451G、K455N、K455S、K455A、K455L、F471S、F471N、F471A、F471G、Y507F、Y507L、Y507S、Y507A、Y507G、I518S、I518N、I518A、I518Y、L520S、L520N、L520A、L520Y、N521S、N521N、N521L、N521G、F522Y、F522S、F522A、F522G、F522L、P525L、P525S、P525A、P525G、P525Q、W531F、W531S、W531A、W531G、W531L、K535R、K535H、K535Q、K535N、I554S、I554A、I554G、I554L、P574L、P574S、P574A、P574G、P574Q、P586L、P586S、P586A、P586G、P586Q、P588L、P588S、P588A、P588G、P588Q、K590R、K590H、K590Q、K590N、K594R、K594H、K594Q、K594N、K649R、K649H、K649Q、K649N、D681H、D681S、D681A、D681G、D681L、W682S、W682A、W682G、W682L、N707S、N707A、N707G、N707L、D708S、D708A、D708G、D708L、F709Y、F709Q、F709K、F709H、F709N、L713S、L713A、L713G、L713N、L715S、L715A、L715G、L715N、Y723F、Y723Q、Y723K、Y723H、Y723N、N732S、N732A、N732H、N732L、K734N、K734S、K734L、K734G、L738S、L738A、L738G、L740S、L740A、L740G、L740N、F747S、F747A、F747G、F747L、P756L、P756S、P756A、P756G、P756Q、R833K、R833Q、Y834F、Y834Q、Y834K、Y834H、Y834N、Y836F、Y836Q、Y836K、Y836H、Y836N、K853R、K853Q、K853A、K853P、R860K、R860A、R860Q、I865A、I865F、I865S、I865N、I876S、I876A、I876Y、I876N、A877S、A877H、A877G、A877N、A877L、R878K、R878N、R878S、R878A、R878L、R878H、R878Q、E897S、E897A、E897G、E897L、Q898S、Q898A、Q898G、Q898L、F901S、F901A、F901G、F901L、W927F、W927Q、W927K、W927H、W927N、E929N、E929S、E929A、E929L、E929G、I930S、I930A、I930G、I930L、K932Q、K932N、K932S、K932A、N1004S、N1004A、N1004G、N1004L、Y1011S、Y1011A、Y1011G、Y1011L、P1017L、P1017S、P1017A、P1017G、P1017Q、C1027S、C1027A、C1027G、C1029S、C1029A、C1029G、F1031Y、F1031S、F1031A、F1031G、F1031L、D1042S、D1042A、D1042G、D1042L、P1043L、P1043S、P1043A、P1043G、P1043Q、W1101F、W1101L、W1101S、W1101H、W1101G、R1118K、R1118H、R1118N、D1127N、D1127S、D1127A、T1128S、T1128V、T1128A、F1163Y、F1163Q、F1163K、F1163H、F1163N、R1167K、R1167H、R1167N、P1196L、P1196S、P1196A、P1196G、P1196Q、K1197Q、K1197N、K1197S、K1197A、D1200E、D1200N、D1200S、D1200A、D1200L、P1209L、P1209A、P1209A、P1209G、P1209Q、K1210N、K1210S、K1210A、K1210L、A1212N、A1212S、A1212G、A1212H、A1212L、D1213E、D1213N、D1213S、D1213L和D1213G。

6.根据权利要求5所述的变体，其中该至少一个改变选自由以下组成的组：I57S、M58S、L70S、L132P、G220D、L520A、F522Y、W531A、L669P、D708Y、N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A、F901A、C1029A、F1031S、P1043L和D1213N。

7.根据权利要求5-6中任一项所述的变体，其中该至少一个改变选自由以下组成的组：W531A和P1043L；L699P；N732S、K734N、L738A和D1213N；L70S和D708Y；L132P；C1029A和F1031S；N732S、K734N和L738A；L520A、F522Y、E897S、Q898A和F901A；I57S、M58S、N732S、K734N和L738A；N732S、K734N、L738A、E897S、Q898A和F901A；以及G220D、N732S、K734N和L738A。

8.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据权利要求1-7中任一项所述的变体。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。

10.一种核酸构建体，该核酸构建体包含根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸。

11.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求10所述的核酸构建体。

12.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求1-7中任一项所述的变体、根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10中所述的核酸构建体、和/或根据权利要求11所述的表达载体。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，所述宿主细胞是真核或原核宿主细胞。

14.根据权利要求12-13中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的微生物宿主细胞：细菌、真菌、酵母和古细菌宿主细胞。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的细菌宿主细胞：芽孢杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属细胞；优选地，该宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、淀粉乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、禾口鸡乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、雷曼氏乳酸杆菌、唾液乳杆菌、韩中大乳球菌、福尔摩沙乳球菌、富士山乳球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌、台湾乳球菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞；更优选地，该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

16.根据权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的真菌宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞。

17.根据权利要求12-14中的任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的酵母宿主细胞：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属和耶氏酵母属细胞；优选地，该宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、和解脂耶氏酵母细胞。

18.根据权利要求12-17中任一项所述的宿主细胞，其中该变体是核酸酶无效变体；优选地，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:2的位置877的位置处的氨基酸改变；更优选地，所述变体包含丙氨酸对天冬氨酸的取代，D877A。

19.一种诱导一个或多个DNA靶序列表达的方法，该方法包括以下步骤：

20.根据权利要求19所述的方法，所述方法包括以下另外的步骤：

21.根据权利要求19-20中的任一项所述的方法，其中该许可温度是等于或低于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，其中该限制性温度是等于或高于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，并且其中该限制性温度高于该许可温度。

22.一种抑制一个或多个DNA靶序列的方法，该方法包括以下步骤：

23.根据权利要求22所述的方法，所述方法包括以下另外的步骤：

24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中该许可温度是等于或低于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，其中该限制性温度是等于或高于选自由以下组成的组的温度：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃，并且其中该限制性温度高于该许可温度。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中该一个或多个DNA靶序列包含至少20个核苷酸并进一步包含或侧接针对根据权利要求1-7中任一项所述的变体的功能性PAM序列；优选地，该一个或多个DNA靶序列包含在编码多肽的可读框中或包含在启动子区域中。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中该一个或多个DNA靶序列编码一个或多个选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该一个或多个酶是α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。

27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是真核或原核细胞；优选地，该宿主细胞是微生物宿主细胞；甚至更优选地，该宿主细胞是真菌、细菌或古细菌细胞。

28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞，其选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞；更优选地，该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

29.根据权利要求19-28中任一项所述的方法，其中该一个或多个gRNA包含第一RNA，该第一RNA包含与该一个或多个DNA靶序列至少85％互补并且能够与该一个或多个DNA靶序列杂交的20个或更多个核苷酸；优选地，该20个或更多个核苷酸与该一个或多个DNA靶序列至少90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％互补并且能够与该一个或多个DNA靶序列杂交。

30.根据权利要求1-7中任一项所述的变体、根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的核酸构建体、根据权利要求11所述的表达载体、根据权利要求12-18中的任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求19-29中任一项所述的方法在药物或化妆品中的用途。

31.根据权利要求1-7中任一项所述的变体、根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的核酸构建体、根据权利要求11所述的表达载体、根据权利要求12-18中的任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求19-29中的任一项所述的方法在医学或生物技术研究或生产中的用途。

32.根据权利要求1-7中任一项所述的变体、根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的核酸构建体、根据权利要求11所述的表达载体、根据权利要求12-18中任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求19-29中任一项所述的方法在基因组编辑、基因表达的调节或CRISPR抑制中的用途。

33.根据权利要求1-7中任一项所述的变体、根据权利要求8-9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的核酸构建体、根据权利要求11所述的表达载体、根据权利要求12-18的任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求19-29中任一项所述的方法在酶研究、开发和/或生产中的用途。