JP2011103875A - 改変プロモーター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、特定の塩基配列;当該塩基配列に対して1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列;ならびに前記特定の塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの1以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。
【選択図】なし
Description
(1)バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号1で示される塩基配列;当該塩基配列に対して1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列;ならびに配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの1以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。
(2)上記配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号2で示される塩基配列である、(1)記載の改変プロモーター。
(3)バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、(1)又は(2)記載の改変プロモーター。
(4)バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス エスピーKSM−64株(FERM BP−2886)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス エスピーKSM−S237株(FERM BP−7875)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つcre様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、(3)記載の改変プロモーター。
(5)塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、(1)〜(4)のいずれか1に記載の改変プロモーター。
(6)バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号1で示される塩基配列;当該塩基配列に対して1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列;ならびに配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの1以上を改変する工程を含む、改変プロモーターの製造方法。
(7)上記配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号2で示される塩基配列である、(6)記載の製造方法。
(8)バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、(6)又は(7)記載の製造方法。
(9)バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス エスピーKSM−64株(FERM BP−2886)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス エスピーKSM−S237株(FERM BP−7875)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つcre様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、(8)記載の製造方法。
(10)塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、(6)〜(9)のいずれか1に記載の製造方法。
(11)(1)〜(5)のいずれか1に記載の改変プロモーター又は(6)〜(10)のいずれか1に記載の方法で製造された改変プロモーターにおいて、さらに1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された改変プロモーター。
(12)(1)〜(5)及び(11)のいずれか1に記載の改変プロモーター、又は(6)〜(10)のいずれか1に記載の方法で製造された改変プロモーターを含有する発現ベクター。
(13)改変プロモーターが目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている、(12)記載の発現ベクター。
(14)目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている請求項(1)〜(5)及び(11)のいずれか1に記載の改変プロモーター又は(6)〜(10)のいずれか1に記載の方法で製造された改変プロモーターを含む、形質転換体。
(15)(14)記載の形質転換体を用いることを特徴とする、目的遺伝子産物の製造方法。
KSM−S237セルラーゼ[Hakamada ら,Biosci.Biotechnol.Biochem.64,2281−2289,2000]由来のプロモーター領域DNAの取得のため、大腸菌−枯草菌のシャトルベクターpHY300PLK中に組換えられたBacillus sp.KSM−S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子DNAのプロモーター領域(配列番号4の塩基番号1〜572)を鋳型とし、表1に示したプライマーEcoRI_PS237 FW(配列番号6)、及びBamHI_PS237 RV(配列番号7)を用いたPCRにより、上流にEcoRI、下流にBamHI制限酵素認識部位を付加したプロモーター領域DNA断片を調製した。次に、プロモーター領域中の標的配列が欠失した変異体プロモーターDNA断片の取得のため、上記PCRで調製した断片を鋳型とし、表1に示したプライマーセットΔcre1 FW(配列番号8)及びBamHI_PS237 RV、ならびにEcoRI_PS237 FW及びΔcre1 RV(配列番号9)を用いたPCRにより、標的配列が欠失した領域を上流、及び下流に持つ断片をそれぞれ調製した。得られた2断片を混合して鋳型とし、EcoRI_PS237 FW及びBamHI_PS237 RVを用いたPCRを行うことで、配列番号4で示される塩基配列の223〜235残基が欠失したプロモーター領域配列DNA断片(Δcre1)を取得した(図1)。同様に、Δcre1 FWの代わりにΔcre2 FW(配列番号10)、Δcre1 RVの代わりにΔcre2 RV(配列番号11)を用いることで、配列番号4で示される塩基配列の359〜372残基が欠失したプロモーター領域配列DNA断片(Δcre2)を取得した。さらに、Δcre1を鋳型としてプライマーΔcre2 FW及びBamHI_PS237 RV、ならびにEcoRI_PS237 FW及びΔcre2 RVを用いたPCRをそれぞれ行い、得られた2断片を鋳型としてプライマーEcoRI_PS237 FW及びBamHI_PS237 RVを用いたPCRを行うことで、配列番号4で示される塩基配列の223〜235残基及び359〜372残基が欠失したプロモーター領域配列DNA断片(Δcre1.2)を取得した。
実施例1で得られた各プロモーター領域配列DNA断片を、制限酵素EcoRI、BamHIで切断後、EcoRI、BamHIで切断したpDL2プラスミド[Fukuchiら,Microbiology,146,1573−1583,2000]とライゲーションした。得られたプラスミドを用いて定法に従って大腸菌の形質転換処理を行い、出現した形質転換体からプラスミドを抽出した(図2参照)。取得したプラスミド中に挿入されたプロモーターの塩基配列の確認は、3100DNAシークエンサー(Applied Biosystems)を用いて行なった。実施例1で得られたプロモーター領域配列DNA断片を含むプラスミドを、発現ベクターとして所得した。
実施例2で得られた発現ベクターを、制限酵素ScaIで切断し断片化した後、コンピテント法により枯草菌168株に組み込んで形質転換処理を行い、処理した菌をアンピシリン(1μg/mL)を含むLB寒天培地上で培養した。生育したコロニーをamyE 遺伝子中にプロモーター領域とLacZ遺伝子が組み込まれた形質転換体として分離した。
実施例3で得られた形質転換体を各種糖源含有培地で培養した際の各プロモーターの転写強度を、β−ガラクトシダーゼ活性を指標として評価した。糖源としては、グルコース、マルトース、ソルビトール、及びモデル糖化液(バイオマス由来の炭素源を模した液:4%グルコース、0.5%キシロース、0.5%セロビオースを含む糖液)を用いた。菌体の培養は、終濃度0.5%の糖源を含むLB培地1mlに、LB培地1ml、30℃で12時間培養した培養液を終濃度1%となるように植菌した。37℃で8時間培養した後OD600を測定し、OD600=1.0の培養液を遠心分離して集菌した。その後、菌体を0.5mLの25mM Tris−HCl(pH7.4)に再懸濁することで培養液を完全に除去し、遠心分離で再集菌した。集菌した菌体は、0.64mLのZ buffer(60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4/7H2O、2mM DTT)に懸濁し、さらにZ bufferに溶かした2.5mg/mLのリゾチーム溶液を0.16mL加え、37℃、5分間インキュベートすることで細胞壁を除去し、プロトプラスト細胞を作製した。ここに10% Triton−X100を8μL加えて混和することで、菌体溶菌液とした。対照として、lacZを組み込んだ野生株から同様の手順で菌体溶菌液を得た。
得られた溶菌液のβ−ガラクトシダーゼ活性はONPG測定法を用いて測定した。方法は以下のとおりである。溶菌液を30℃で3分プレインキュベーションし、ONPGのZ buffer溶液(4mg/mL)を0.2mL加えた。ONPG溶液を加えた時間を0秒とし、β−ガラクトシダーゼ活性によって溶液が黄変したところで1M Na2CO3を0.4mL加えて反応を停止させた。遠心分離により不溶性画分を取り除いた後、各反応液のOD420を測定し、以下の式を用いた計算によってβ−ガラクトシダーゼ活性を算出した。
β−ガラクトシダーゼ活性(Unit)=1000×OD420/反応時間(分)
結果を表2及び図3A〜Dに示す。グルコースを含む培地で培養した場合、Δcre1プロモーターを含む形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性は野生型の約1.9倍に向上していた。Δcre2プロモーターを含む形質転換体は、野生型の約6.2倍のβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。また、Δcre1とΔcre2の欠失を組み合わせたΔcre1.2プロモーターを含む形質転換体は、野生型の約7.8倍の活性を示し、最も高い転写強度を有していた。
糖源をマルトース、ソルビトールに置き換えて同様の実験を行った場合でも、形質転換体におけるプロモーターの転写強度は野生型と比較して顕著に向上していた。さらに植物体等のバイオマスの糖化液をモデル化した糖源(モデル糖化液)においても顕著な転写強度の向上が認められた。
Claims (15)
- バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号1で示される塩基配列;当該塩基配列に対して1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列;ならびに配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの1以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。
- 前記配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号2で示される塩基配列である、請求項1に記載の改変プロモーター。
- バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、請求項1又は2記載の改変プロモーター。
- バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス エスピーKSM−64株(FERM BP−2886)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス エスピーKSM−S237株(FERM BP−7875)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つcre様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、請求項3記載の改変プロモーター。
- 塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、請求項1〜4のいずれか1項記載の改変プロモーター。
- バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号1で示される塩基配列;当該塩基配列に対して1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列;ならびに配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの1以上を改変する工程を含む、改変プロモーターの製造方法。
- 前記配列番号1で示される塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号2で示される塩基配列である、請求項6記載の製造方法。
- バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、請求項6又は7記載の製造方法。
- バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス エスピーKSM−64株(FERM BP−2886)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス エスピーKSM−S237株(FERM BP−7875)のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して70%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つcre様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、請求項8記載の製造方法。
- 塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、請求項6〜9のいずれか1項記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変プロモーター又は請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法で製造された改変プロモーターにおいて、さらに1個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された改変プロモーター。
- 請求項1〜5及び11のいずれか1項記載の改変プロモーター、又は請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法で製造された改変プロモーターを含有する発現ベクター。
- 改変プロモーターが目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている、請求項12記載の発現ベクター。
- 目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている請求項1〜5及び11のいずれか1項記載の改変プロモーター又は請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法で製造された改変プロモーターを含む、形質転換体。
- 請求項14記載の形質転換体を用いることを特徴とする、目的遺伝子産物の製造方法。
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