BR112012005263A2 - promotor modificado - Google Patents

Abstract

PROMOTOR MODIFICADO A presente invenção fornece um promotor modificado, um vetor de expressão e um trans-formante cada um contendo o promotor e um método para a obtenção de um produto gênico de interesse utilizando o transformante. A invenção fornece um promotor modifica-do, que inclui uma sequência de nucleotídeos de um promotor derivado de bactéria que pertence ao gênero Bacillus em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecio-nada da seguinte foi modificada: uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos repre-sentada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituída, deletada, adicionada ou inserida; e uma sequência de nucle-otídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequên-cia de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1.

Description

"PROMOTOR MODIFICADO" Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um promotor modificado, a um vetor de expressão e a um transformante cada um contendo o promotor e a um método para a obtenção de um 5 produto gênico de interesse utilizando o transformante.

Fundamento da Invenção Através do uso de microorganismos, uma variedade de substâncias úteis foi produ- zida em uma escala industrial, incluindo alimentos tais como bebidas alcoólicas, miso e shoyu (fonte de soja) e outras substâncias tais como aminoácidos, ácidos orgânicos, subs- 1O tâncias relacionadas a ácidos nucléicos, antibióticos, açúcares, lipídeos e proteínas.

Tais substâncias são úteis em uma faixa ampla de campos tais como alimentos, produtos farma- cêuticos e artigos de uso diário tais como detergentes e cosméticos, bem como matérias primas para produtos químicos.

Em tal produção industrial de substâncias úteis através da mediação de microorga- nismos, o aprimoramento na produtividade é uma questão importante.

Uma abordagem que foi empregada para aprimorar a produtividade é produção, através de uma técnica genética tal como mutação, de uma bactéria que produz uma substância de interesse.

Nos últimos anos, acompanhados do desenvolvimento de genética e biotecnologia de microorganismos, métodos mais eficientes baseados em uma técnica recombinante ou similar se concentra- ram na produção de substâncias úteis.

Um número de estudos foi realizado em promotores que são requeridos para a transcrição de genes.

Em relação a Bacil/us subtilis, um domínio promotor de um gene de celulase alcalina derivado de Bacillus sp. cepa KSM-65 (FERM BP-2886) (ver, por exemplo, Documento de Não Patente 1), um domínio promotor presente na região a montante de um gene de celulase alcalina derivado de Bacil/us sp. cepa KSM-S237 (FERM BP-7875) (ver, por exemplo, Documento de Patente 1 e Documento de Não Patente 2) e outros domínios promotores são empregados como domínios promotores que transcrevem ativamente um gene que codifica uma proteína ou um polipeptídeo heterólogo.

Entretanto, com a finalidade de reduzir o custo de produção na produção industrial, há uma demanda por um promotor ou um microorganismo que realiza maior produtividade.

Geralmente, um domínio promotor possui vários sítios que estão relacionados com a regulação da transcrição.

Estes sítios desempenham uma função na promoção ou na su- pressão da expressão de um gene através da mediação de sinais externos.

Por exemplo, quando um meio de cultura para microorganismos contém grandes quantidades de catabóli- tos tal como glicose, os microorganismos utilizam principalmente os catabólitos como fontes de carbono e a expressão de uma enzima para a degradação de açúcar de molécula maior é suprimida.

Este fenômeno é chamado de "repressão catabólica", que foi observada em E.

coli, Bacillus etc.

É sabido que a repressão catabólica em Bacillus subtilis ocorre no nível da transcrição.

O domínio que está envolvido na repressão catabólica em Bacillus é chamado de "elemento que responde a catabólitos (cre)". O Documento de Não Patente 3 divulga que a repressão catabólica pode ser au- 5 mentada ou reduzida através de uma mutação pontual em um domínio operador de repres- são catabólica no gene da a-amilase derivado de Bacillus subtilis.

Enquanto isso, em um promotor na endonuclease derivada de Bacillus subti/is, há uma sequência de nucleotídeos similar àquela do domínio de repressão catabólica da a-amilase, que é chamada de uma "sequência similar a operador de repressão catabólica" (Documento de Não Patente 2) . 1O Entretanto, a função real da sequência não foi esclarecida. [Documento de Patente 1] JP-A-2000-210081 [Documento de Não Patente 1] Sumitomo e outros, Biasei.

Biotech.

Biachem., 59: 2172-2175, 1995 [Documento de Não Patente 2] Hakamada e outros, Biasei.

Biotech.

Biachem. 64: 2281-2289, 2000 [Documento de Não Patente 3] Weickert & Chambliss, Prdc, Natl.

Acad.

Sei.

USA, 87: 6238-6242, 1990 Divulgação da Invenção A presente invenção se direciona a um promotor modificado, que inclui uma se- quência de nucleotídeos de um promotor derivado de bactéria que pertence ao gênero Baci- 1/us em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da seguinte foi modifi- cada: uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituída, deleta- da, adicionada ou inserida; e uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1. A presente invenção também está direcionada a um método para a produção de um promotor modificado, o método incluindo a modificação, em um promotor derivado de bacté- ria que pertence ao gênero Bacil/us, de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecio- nada da seguinte: uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituí- da, deletada, adicionada ou inserida; e uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos represen- tada pela SEQ ID NO: 1. A presente invenção também está direcionada ao promotor modificado mencionado anteriormente ou a um promotor modificado produzido através do método mencionado ante- riormente, em que uma ou uma pluralidade de bases contidas é adicionalmente substituída, deletada, adicionada ou inserida.

A presente invenção também está direcionada a um vetor de expressão que inclui o 5 promotor modificado mencionado anteriormente ou o promotor modificado produzido através do método mencionado anteriormente.

A presente invenção também está direcionada a um transformante que inclui o promotor modificado mencionado anteriormente ou o promotor modificado produzido através do método mencionado anteriormente. 1O A presente invenção também está direcionada a um método para a obtenção de um produto gênico de interesse, o método inclui o emprego do transformante.

Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus é um promotor proveniente de Bacillus subtilis ou uma cepa mutante de Bacillus subtilis.

Em outra modalidade, o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus é: um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM-65 de Bacillus sp. (FERM BP-2886); um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM-S237 de Bacillus sp. (FERM BP-7875); ou um promotor que contém uma se- quência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em rela- ção à sequência de nucleotídeos de qualquer um dos ditos promotores e que possui uma sequência similar a cre.

Em outra modalidade, a modificação das sequências de nucleotídeos é deleção, substituição ou adição de uma base nas sequências de nucleotídeos.

Em outra modalidade, o promotor modificado está ligado de forma operacional a montante de um gene que codifica um produto gênico de interesse.

Breve Descrição dos Desenhos [Fig. 1] Um procedimento para a produção de um promotor mutado que possui uma deleção através do método de SOE-PCR. [Fig. 2] Um procedimento para a preparação de um plasmídeo pDL2-S237. [Fig. 3] Atividade de [3-galactosidase do transformante da presente invenção e aquela do tipo selvagem.

A: Atividade em meio contendo glicose.

B: Atividade em meio con- tendo maltose.

C: Atividade em meio contendo sorbitol.

D: Atividade no meio contendo solu- ção sacarificada modelo.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se ao fornecimento de um promotor modificado que aumenta a transcrição gênica, um vetor de expressão e um transformante cada um conten- do o promotor e um método para a obtenção de um produto gênico de interesse através do uso do transformante. 5 Os presentes inventores descobriram que um grande número de sequências que são similares às sequências de repressão catabólica no domínio promotor_de um gene de celulase em um microorganismo que pertence ao gênero Baci/lus.

Os presentes inventores também descobriram que quando as sequências encontradas dessa maneira sofriam muta- ção, a expressão do gene regulado pelo promotor era consideravelmente maior e a produti- 1O vidade do produto gênico codificado pelo gene era aumentada.

O promotor modificado da presente invenção aumenta de forma notável a quanti- dade de transcrição do gene que está ligado a jusante do promotor.

Assim, de acordo com a presente invenção, um produto gênico alvo é fornecido mais eficientemente.

Na presente invenção, a identidade de sequência entre sequências de aminoácidos e aquela entre sequências de nucleotídeos são ambas determinadas através do método de Lipman-Pearson (Science, 227, 1435 (1985)). Especificamente, a identidade de sequência é calculada através da análise pelo uso de um programa de análise de homologia (busca de homologia) do software de processamento de informação genética Genetyx-Win (Software Development Co., Ltd.), com o parâmetro ktup (tamanho de unidade a comparar) sendo ajustado em 2. A não ser que seja especificado de outra maneira, os Nos. de sequências de nucle- otídeos e de bases do DNA de Baci/lus subtilis utilizados no presente relatório descritivo se baseiam no sítio de recuperação do fator de transcrição de Bacil/us subtilis (http://dbtbs.hgc.jp/). O promotor modificado da presente invenção é produzido através da modificação de uma sequência de nucleotídeos similar àquela do elemento que responde a catabólitos (posteriormente referida aqui como "sequência similar a cre") presente em um polinucleotí- deo que codifica um promotor derivado de um gene em um microorganismo que pertence ao gênero Baci/lus que possui a sequência similar a cre.

Os exemplos da sequência similar a cre incluem uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 e uma se- quência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituí- da, deletada, adicionada ou inserida.

Os exemplos da sequência similar a cre incluem ainda uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais, preferencialmente 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais em relação à sequên- cia de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1. Como utilizado aqui, o termo "uma pluralidade de" refere-se a 1 até 6, preferencialmente 1 até 3.

O método de substituição, deleção, adição ou inserção de uma base é divulgado, por exemplo, em Dieffenbach e outros (Cold 8pring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995). Através do emprego desta técnica, uma ou uma pluralidade de bases pode ser substituída, deletada, adicionada ou inserida.

O fato da sequência de interesse ser ou 5 não uma sequência similar a cre pode ser confirmado, por exemplo, através da observação de maior expressão de um gene alvo na presença de um catabólito tal como glicose quando a mutação é introduzida na sequência de uma maneira similar àquela dos Exemplos descri- tos aqui abaixo.

Os exemplos da sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos representada pela 8EQ ID NO: 1 incluem uma sequência de nucleotídeos representada pela 8EQ ID NO: 2. A se- quência de nucleotídeos representada pela 8EQ ID NO: 2 é equivalente à sequência de nu- cleotídeos representada pela 8EQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que três bases contidas ali foram substituídas.

Portanto, a sequência de nucleotídeos representada pela 8EQ ID NO: 2 possui uma homologia de 76,9% em relação à sequência de nucleotídeos representada pela 8EQIDN0:1. Nenhuma limitação particular é imposta sobre o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus partindo do qual o promotor modificado da presente inven- ção é produzido, isto é, o promotor parental que corresponde ao promotor modificado da presente invenção, contanto que o promotor parental seja um promotor que é derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus e que possui uma sequência similar a cre.

O promotor parental é preferencialmente derivado de Bacil/us subtilis ou de uma cepa mutante de Bacillus subtilis.

Os exemplos de promotor parental preferido incluem um promotor de um gene de celulase alcalina derivado da cepa K8M-65 de Bacillus sp. (FERM BP-2886) (bases No. 1 até 609 na 8EQ ID NO: 3) e um promotor de um gene de celulase alcalina derivado da cepa K8M-8237 de Bacil/us sp. (FERM BP-7875) (bases No. 1 até 572 na 8EQ ID NO: 4). As sequências de nucleotídeos representadas pela 8EQ ID NOs: 1 e 2 correspondem às sequências de nucleotídeos de bases No. 399 até 412 e 264 até 276, respectivamente, no promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa K8M-65 que é representado pelas bases No. 1 até 609 na 8EQ ID NO: 3 e correspondem às sequências de nucleotídeos de bases No. 359 até 372 e 223 até 235, respectivamente, no promotor de um gene de celu- lase alcalina proveniente da cepa K8M-8237 que é representado pelas bases No. 1 até 572 na 8EQ ID NO: 4. Outros exemplos do promotor parental na presente invenção incluem um promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus e que possui uma sequência si- milar a cre, que possui: uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleo- tídeos do promotor do gene da celulase alcalina representado pela 8EQ ID NO: 3 ou 4, ex- ceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituída, deletada,

adicionada ou inserida; ou uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais, preferencialmente 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, ainda mais preferencialmente 98% ou mais, em relação à sequência de nucleotídeos do promotor do gene da celulase alcalina 5 representada pela SEQ ID NO: 3 ou 4. O fato de o promotor ter ou não uma sequência simi- lar a cre pode ser confirmado através da determinação da presença de uma sequência simi- lar a cre na sequência de nucleotídeos do promotor através do sequenciamento ou através da comparação da sequência do promotor com aquela do promotor do gene da celulase alcalina representada pela SEQ ID NO: 3 ou 4 para identificar a região que corresponde à 1O sequência similar a cre.

O método de substituição, deleção, adição ou inserção de uma base é divulgado, por exemplo, em Dieffenbach e outros (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995). Através do emprego desta técnica, uma ou uma pluralidade de bases pode ser substituída, deletada, adicionada ou inserida.

A sequência promotora pode ser identificada, por exemplo, através da observação de expressão de f3-galactosidase quando um gene LacZ foi introduzido de uma maneira similar àquela dos Exemplos descri- tos aqui abaixo.

No caso em que o promotor parental inclui duas ou mais sequências similares a cre, pelo menos uma sequência de nucleotídeos das sequências similares a cre presentes no promotor parental pode ser modificada.

Em outras palavras, uma, duas ou mais ou todas as sequências similares a cre presentes no promotor parental podem ser modificadas.

Por exemplo, quando um promotor parental tiver duas sequências similares a cre representadas pelas SEQ ID NOs: 1 e 2, apenas a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 ou a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 pode ser modificada ou ambas sequências de nucleotídeos representadas pela SEQ ID NO: 1 e pela SEQ ID NO: 2 podem ser modificadas.

Preferencialmente, as duas sequências de nucleotídeos represen- tadas pela SEQ ID NO: 1 e pela SEQ ID NO: 2 são modificadas.

Em uma modalidade, o promotor modificado da presente invenção é produzido através da modificação de pelo menos uma sequência similar a cre presente em um promo- tor proveniente de Bacillus subtilis ou uma cepa mutante de Bacil!us subtilis.

Em outra modalidade, o promotor modificado da presente invenção é produzido através da modificação de pelo menos uma da sequência similar a cre representada pelas bases No. 264 até 276 e da sequência similar a cre representada pelas bases No. 399 até 412, no promotor de um gene de celulase alcalina derivado da cepa KSM-65 (FERM BP- 2886) (bases No. 1 até 609 na SEQ ID NO: 3). Preferencialmente, tanto a sequência similar a cre representada pelas bases No. 264 até 276 quanto a sequência similar a cre represen- tada pelas bases No. 399 até 412 são modificadas.

Em outra modalidade, o promotor modificado da presente invenção é produzido através da modificação de pelo menos uma da sequência similar a cre representada pelas bases No. 223 até 235 e da sequência similar a cre representada pelas bases No. 359 até 372, no promotor de um gene de celulase alcalina derivado da cepa KSM-S237 de Bacil/us sp. (FERM BP-7875) (bases No. 1 até 572 na SEQ ID NO: 4). Preferencialmente, tanto a sequência similar a cre representada pelas bases No. 223 até 235 quanto a sequência simi- lar a cre representada pelas bases No. 359 até 372 são modificadas.

Os exemplos de uma modificação da sequência de nucleotídeos da sequência simi- lar a cre incluem a deleção de uma parte de ou de todas as bases na sequência de nucleo- tídeos, a substituição de uma parte de ou de todas as bases na sequência de nucleotídeos e 1O a adição de uma base em qualquer posição na sequência de nucleotídeos.

Como utilizado aqui o termo "uma parte das bases" refere-se a uma ou mais bases, preferencialmente três ou mais bases, mais preferencialmente 6 ou mais bases, ainda mais preferencialmente 1O ou mais bases.

A deleção, a substituição ou a adição de uma base pode ser realizada atra- vés de um método geralmente empregado na arte, tal como mutagênese direcionada ao sítio.

A mutagênese direcionada ao sítio pode ser realizada através do método de Kunkel (Proc.

Natl.

Acad.

Sei.

USA, 82, 488, 1985), PCR ou similar.

Alternativamente, o promotor modificado da presente invenção pode ser produzido através do método de SOE (processamento por extensão de sobreposição)-PCR (Gene, 77, 51, 1989), em que uma base é deletada, substituída ou adicionada na sequência de nucleo- tídeos da sequência similar a cre presente no promotor.

De acordo com o método de SOE-PCR, um fragmento de DNA a montante que possui um sítio de modificação de sequência de nucleotídeos na extremidade a jusante e um fragmento de DNA a jusante que possui um sítio de modificação de sequência de nucle- otídeos na extremidade a montante são preparados através da primeira PCR.

No caso em que um fragmento cuja sequência similar a cre foi deletada for preparado, é planejado um iniciador de forma que a porção a jusante do fragmento de DNA a montante e a porção a montante do fragmento de DNA a jusante sejam mutuamente aneladas e é fornecida uma sequência de nucleotídeos com a sequência similar acre deletada (Fig. 1). Subsequentemente, a segunda PCR é realizada através do uso dos dois fragmen- tos de DNA preparados através da primeira PCR como moldes e o iniciador a montante do fragmento de DNA a montante e o iniciador a jusante do fragmento de DNA.

Como um resul- tado, o anelamento ocorre entre a extremidade a jusante de do fragmento de DNA a mon- tante e a extremidade a montante do fragmento de DNA a jusante, através do que os dois fragmentos de DNA são ligados um ao outro.

Assim, é produzido um fragmento de DNA que contém uma sequência promotora em que a sequência similar a cre foi deletada (Fig. 1). Neste caso, quando os iniciadores empregados na PCR forem planejados para ter uma se- quência de restrição, um fragmento de DNA promotor que inclui sequências de restrição nas

........

extremidades é produzido e incorporado em um vetor através do método de enzimas de restrição.

Similarmente, quando um iniciador é planejado de forma que a porção a jusante do fragmento de DNA a montante e a porção a montante do fragmento de DNA a jusante sejam 5 mutuamente aneladas e que uma sequência de nucleotídeos que inclui uma sequência simi- lar a cre em que pelo menos uma base é substituída ou adicionada seja preparada, pode ser preparado um fragmento de DNA que contém uma sequência promotora em que pelo me- nos uma base da sequência similar acre tenha sido substituída ou adicionada.

No promotor modificado da presente invenção, uma ou uma pluralidade de bases 1O pode ser adicionalmente substituída, deletada, adicionada ou inserida, contanto que a fun- ção do promotor e o efeito de aprimorar a expressão do gene de interesse sejam mantidos.

O método de substituição, deleção, adição ou inserção de uma base é divulgado, por exem- plo, em Dieffenbach e outros (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995). Através do emprego desta técnica, uma ou uma pluralidade de bases pode ser subs- tituída, deletada, adicionada ou inserida.

O fato de o promotor modificado que foi ou não adicionalmente modificado possui função promotora a exibir um efeito de aprimoramento da expressão de um gene de interesse pode ser confirmado, por exemplo, através da observa- ção de um efeito de aprimoramento da ~xpressão de um gene alvo na presença de um ca- tabólito tal como glicose de uma maneira similar àquela dos Exemplos descritos aqui abaixo.

Através da incorporação do promotor modificado preparado dessa maneira da pre- sente invenção em um vetor apropriado, o vetor de expressão da presente invenção pode ser produzido.

Nenhuma limitação particular é imposta sobre o vetor no qual o promotor mo- dificado é incorporado e vetores tais como pDL2 e pMUTIN são preferidos.

A incorporação de um promotor modificado em um vetor pode ser realizada de acordo com quaisquer méto- dos geralmente empregados na arte.

Por exemplo, um vetor é clivado através de enzimas de restrição e combinado com um promotor que possui as sequências de restrição produzi- das anteriormente nas extremidades, através do que o promotor é incorporado no vetor (mé- todo de enzimas de restrição). No vetor de expressão da presente invenção, o promotor modificado da presente invenção está ligado de forma operacional a montante do gene que codifica um produto gê- nico de interesse.

Os exemplos do produto gênico de interesse incluem proteína, polipeptí- deo e RNA não codificador.

Nenhuma limitação particular é imposta sobre as espécies da proteína e do polipeptídeo e a proteína ou o polipeptídeo inclui enzimas para usos industriais tais como detergentes, alimentos, fibra, alimento para animais de criação, produtos quími- cos, cuidado médico e diagnóstico, bem como peptídeos fisiologicamente ativos.

Os exem- plos da enzima para usos industriais incluem oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase e ligase/sintetase.

Os genes de hidrolases tais como celulase, a-amilase e pro-

tease são preferidos.

Os exemplos específicos da hidrolase incluem celulase que pertence à família 5 como é definido pela classificação de hidrolases de polissacarídeos (Biachem.

J., 280, 309, 1991). Dentre estas, celulases derivadas de microorganismos; por exemplo, um microorganismo que pertence ao gênero Bacil/us, são preferidas.

Mais exemplos específicos incluem uma celulase alcalina derivada da cepa KSM-65 de Bacillus sp. (FERM BP-2886) que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3, uma celu- lase alcalina derivada da cepa KSM-S237 de Baci//us sp. (FERM BP-7875) que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e celulases que consistem de uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de sequência de 70% ou 1O mais, preferencialmente 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, ainda mais preferencialmente 98% ou mais, em relação à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 ou 4. Os exemplos específicos da a-amilase incluem a-amilases derivadas de microor- ganismos.

Uma a-amilase de liquefação derivada de um microorganismo que pertence ao gênero Bacillus é preferida.

Mais exemplos específicos incluem uma amilase alcalina deri- vada da cepa KSM-K38 de Bacillus sp. (FERM BP-6946) que consiste de uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 5 e amilases que consistem de uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais, preferencialmen- te 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, ainda mais preferencialmente 98% ou mais, em relação à sequência de aminoáci- dos representada pela SEQ ID NO: 5. Os exemplos específicos da protease incluem serina protease e metaloprotease derivadas de um microorganismo tal como um microorganismo que pertence ao gênero Bacillus.

Preferencialmente, o gene de proteína ou o gene de polipeptídeo mencionado ante- riormente está ligado de forma operacional à região do promotor modificado da presente invenção e a uma região peptídica sinal de secreção.

Por exemplo, um gene estrutural da proteína ou polipeptídeo alvo pode estar ligado de forma operacional a uma região peptídica sinal de secreção de um gene de celulase derivado da cepa KSM-65 (FERM BP-2886) ou da cepa KSM-S237 (FERM BP-7875). Mais especificamente, um gene estrutural da proteína ou peptídeo alvo pode estar ligado de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos representada pelas bases No. 61 O até 696 da SEQ ID NO: 3; uma sequência de nucleotí- deos representada pelas bases No. 573 até 659 da SEQ ID NO: 4; um fragmento de DNA que consiste de uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais, preferencialmente 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, ainda mais preferencialmente 98% ou mais, em relação a qualquer uma das sequências de nucleotídeos anteriores; ou um fragmento de DNA equivalente a qualquer uma das sequências de nucleotídeos, exceto pelo fato de que uma parte de uma base ou bases é deletada.

O RNA não codificador é um RNA que não é traduzido em proteína após a transcri- ção do DNA correspondente.

Os exemplos do RNA não codificador incluem uma região não traduzida que inclui uma sequência reguladora, tRNA, rRNA, ncRNA do tipo mRNA (RNA não codificador similar a mRNA), snRNA (RNA nuclear pequeno), snoRNA (RNA nucleolar pequeno), miRNA (microRNA), stRNA (RNA temporal pequeno) e siRNA (RNA interferente curto). Estes RNAs não codificadores estão envolvidos em vários mecanismos de atividade biológica que incluem regulação de expressão, desenvolvimento, diferenciação celular e outros e podem ser utilizados na pesquisa, no cuidado médico, em diagnóstico, no desen- 1O volvimento de fármacos, na agricultura (por exemplo, cultivo ou produção de pesticidas), indústria de pesca, indústria para animais de criação e produção química.

O promotor modificado da presente invenção e um gene que codifica um produto gênico de interesse ou uma região peptídica sinal de secreção podem ser ligados antes da incorporação dos mesmos em um vetor.

Alternativamente, o promotor modificado da presen- te invenção pode ser incorporado em um vetor que já contém um gene que codifica um pro- duto gênico de interesse ou o vetor que contém adicionalmente uma região peptídica sinal de secreção.

Como utilizado aqui, o termo "ligação operacional" entre o promotor e um gene ou entre o promotor, um gene e um sinal de secreção refere-se a tal ligação que o promotor pode induzir a transcrição do gene ou a tal ligação que a proteína codificada pelo gene é secretada pelo sinal de secreção.

O procedimento de "ligação operacional" entre o promotor e um gene ou entre o promotor, um gene e um sinal de secreção, é conhecido pelos peritos na arte.

Através da incorporação do vetor de expressão produzido da presente invenção em um microorganismo hospedeiro através de um método de transformação comum, é forneci- do o transformante da presente invenção.

Alternativamente, o transformante da presente invenção também pode ser produzido através da constituição de um fragmento de DNA em que uma região apropriada homóloga ao genoma do microorganismo hospedeiro é combi- nada com um fragmento preparado através da ligação do promotor modificado da presente invenção a um gene que codifica um produto gênico de interesse e opcionalmente a uma região peptídica sinal de secreção; e da incorporação diretamente do fragmento de DNA no genoma do microorganismo hospedeiro através de recombinação homóloga.

O transformante da presente invenção também pode ser fornecido através da in- corporação do vetor de expressão da presente invenção em um microorganismo hospedeiro com uma técnica de recombinação comum.

Um produto gênico de interesse pode ser obtido pelo uso do transformante da pre- sente invenção através do procedimento a seguir: inoculação da cepa transformante em um meio que contém uma fonte de carbono assimilável, uma fonte de nitrogênio e outros ingre- dientes essenciais; cultivo dos transformantes através de um método de cultivo comum; e subsequentemente coleta ou purificação de um produto gênico de interesse.

Como descrito nos Exemplos aqui abaixo, o transformante da presente invenção exibe maior produtividade de um produto gênico de interesse, quando comparado com um microorganismo em que a sequência similar a cre não foi modificada.

Exemplos A presente invenção será descrita a seguir em maiores detalhes através dos exem- pios.

Exemplo 1: Preparação de promotor modificado derivado de gene da celulase alca- lina Um fragmento de DNA promotor derivado da celulase de KSM-S237 (Hakamada e outros, Biasei.

Biotechnol.

Biachem. 64, 2281-2289, 2000) foi preparado através de PCR.

Um fragmento de região promotora em um DNA de gene de celulase alcalina derivado de Bacillus sp.

KSM-S237 (bases No. 1 até 572 da SEQ ID NO: 4), que foi incorporado em um vetor bidirecional pHY300PLK para E. coli-Baclllus subtílís, foi utilizado como um molde.

BcoRl_PS237 FW (SEQ ID NO: 6) e Ba277Hl_PS237 RV (SEQ ID NO: 7) mostrados na Tabela 1 foram utilizados como iniciadores.

Um fragmento de DNA promotor que possui um sítio de reconhecimento de EcoRI na porção a montante e um sítio de reconhecimento de BamHI na porção a jusante foi preparado através de PCR utilizando o molde e os iniciadores descritos anteriormente.

Então, para a preparação de um fragmento de DNA promotor mu- tante em que uma sequência alvo no fragmento de DNA promotor foi deletada, foram reali- zadas PCRs utilizando o fragmento preparado através da PCR anterior como um molde e um conjunto de iniciadores de b.cre1 FW (SEQ ID NO: 8) e BamHl_PS237 RV ou um con- junto de iniciadores de EcoRl_PS237 FW e b.cre1 RV (SEQ ID NO: 9), cada um mostrado na Tabela 1, preparando assim fragmentos que possuem, na porção a montante e na por- ção a jusante respectivamente, uma região em que uma sequência alvo foi deletada.

Os dois fragmentos obtidos dessa maneira foram combinados para serem utilizados como um molde misto.

A PCR foi realizada com o molde misto e um iniciador EcoRI PS237 FW e um iniciador BamHl_PS237 RV para preparar um fragmento de DNA de sequência promotora em que os resíduos de bases 223 até 235 na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 4 foram deletados (b.cre1) (Fig. 1). De uma maneira similar, um fragmento de DNA de sequência de domínio promotor em que os resíduos de bases 359 até 372 na se- quência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 4 foram deletados (b.cre2) foi pre- parado, através do uso de b.cre2 FW (SEQ ID NO: 1O) ao invés de b.cre1 FW e b.cre2 RV (SEQ ID NO: 11) ao invés de b.cre1 RV.

Foram realizadas PCRs adicionais utilizando b.cre1 como um molde e um conjunto de iniciadores de b.cre2 FW e BamHl_PS237 RV ou um con-

junto de iniciadores de EcoRl_PS237 FW e b.cre2 RV.

Utilizando os dois fragmentos obtidos dessa maneira como um molde misto, a PCR foi realizada com os iniciadores EcoRl_PS237 FW e BamHl_PS237 RV, preparando assim um fragmento de DNA de sequência promotora em que os resíduos de bases 223 até 235 e 359 até 372 na sequência de nucleotídeos re- 5 presentada pela SEQ ID NO: 4 foram deletados (b.cre2). Para a amplificação de um fragmento de DNA, a PCR foi realizada através de um GeneAmp PCR System (produto da Applied Biosystems) e através do uso de Pyrobest DNA Polymerase (Produto da Takara Bio) e reagentes que os acompanham.

A solução de PCR (50 µL) foi preparada de forma a combinar um fragmento de DNA molde diluído apropriada- mente (1 µL), cada um de um iniciador senso e um iniciador antissenso (1 O pmoles cada) e Pyrobest DNA Polymerase (2,5 U). A PCR incluía 30 ciclos do tratamento térmico de 3 eta- pas (98ºC durante 1O s, 55ºC durante 30 s e 72ºC durante 1 até 5 min (aproximadamente 1 min/kb, com ajuste de acordo com o produto alvo) e reação a 72ºC durante 5 min.

Tabela 1

Iniciador Sequência de nucleotídeos 5' --)3' SEQ ID NO: Ecc:ru: PS237 FW AAAGAATTCGCTTATATTTAGAGGAAATTTC 6 Bam-iI PS237 RV TTTGGATCCATTACCTCCTAAATAlllllAAAG 7 !J.cre1 FW GAAAATACTGTTTACTATAAAACCTTATATTC 8 L1cre1 RV GAATATAAGG 111 IATAGTAAACAGTATITIC 9 L1cre2 FW CI 11111 lACGATATACCTTGTGCTATATG 10 !J.cre2 RV CATATAGCACAAGGTATATCGTAAAAAAAG 11

Exemplo 2: Preparação de vetores de expressão Cada um dos fragmentos de DNA de sequência promotora preparados no Exemplo 1 foi clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e BamRI e ligados ao plasmídeo pDL2 (Fuku- chi e outros, Microbiology, 146, 1573-1583, 2000) extraído por clivagem por EcoRI e BamHI.

As células de E. coli foram transformadas pelo uso do plasmídeo obtido dessa maneira atra- vés de um método de rotina e o plasmídeo foi recuperado das células transformantes obti- das (ver a Fig. 2). O sequenciamento da sequência promotora inserida no plasmídeo obtido foi realizado através de um sequenciador 3100DNA (Applied Biosystems). Um plasmídeo que contém cada fragmento de DNA de sequência promotora preparado no Exemplo 1 foi recuperado como um vetor de expressão.

Exemplo 3: Produção de transformantes O vetor de expressão preparado no Exemplo 2 foi clivado por uma enzima de restri- ção Scal para formar fragmentos e incorporado em células da cepa 168 de Bacillus subti/is através do método para transformação com competentes.

As células obtidas dessa maneira foram cultivadas em um meio LB com ágar contendo ampicilina (1 µg/ml). Partindo das co-

lônias cultivadas, foi recuperado um transformante em que a região promotora e um gene LacZ foram incorporados em um gene amyE.

Exemplo 4: Determinação de atividade de [3-galactosidase Cada transformante obtido no Exemplo 3 foi cultivado em meio contendo uma vari- 5 edade de fontes de carbono.

A eficiência de transcrição de cada promotor foi avaliada atra- vés da atividade de [3-galactosidase como um índice.

Como uma fonte de carbono, foi utili- zada uma solução de glicose, maltose, sorbitol ou sacarificada modelo (solução de carboi- dratos imitando uma fonte de carbono derivada de biomassa: 4% de glicose, 0,5% de xilose e 0,5% de celobiose). Cada transformante foi cultivado em um meio LB (1 ml) a 30ºC du- 1O rante 12 horas e a solução de cultura obtida dessa maneira foi inoculada em um meio LB (1 ml) contendo uma fonte de carbono em uma concentração final de 0,5% em uma quantida- de tal que a concentração final seja ajustada em 1%. As células foram cultivadas a 37°C durante 8 horas e a D0(600) foi medida.

Uma solução de cultura que possui uma D0(600) de 1,0 foi centrifugada para recuperar as células.

As células foram ressuspensas em Tris- HCI a 25 mM (pH: 7,4) (0,5 ml) para remover completamente o meio de cultura e as células foram coletadas novamente através de centrifugação.

As células coletadas dessa maneira foram suspensas em tampão Z (60 mM de Na 2 HP0 4 , 40 mM de NaH 2 P0 4 , 1O mM de KCI, 1 mM de MgS0 4/7H 2 0 e 2 mM de DTT) (0,64 ml) e uma solução a 2,5 mg/ml (O, 16 ml) de lisozima em tampão Z foi adicionada à suspensão.

A mistura foi incubada a 37°C durante 5 minutos para remover as paredes celulares e dessa maneira foram preparados células na forma de protoplastos.

Nas células na forma de protoplastos foi adicionado Triton-X 100 a 10% (8 µL) e a mistura obtida dessa maneira foi empregada como uma solução de células lisadas.

Uma solução de células lisadas de controle foi preparada através do procedimento similar partindo de uma cepa do tipo selvagem em que foi incorporado lacZ.

A atividade de [3-galactosidase de cada uma das soluções de células lisadas obti- das foi determinada através do método de ONPG.

Especificamente, a solução de células lisadas foi incubada de forma preliminar a 30ºC durante três minutos e foi adicionada à mesma uma solução a 4 mg/ml (0,2 ml) de ONPG em tampão Z.

Desde o início da adição da solução de ONPG (O s), quando a solução tinha ficado amarelada por causa da atividade de [3-galactosidase, a reação foi interrompida através da adição de Na 2 C0 3 a 1 M (0,4 ml) na solução.

As frações insolúveis foram removidas através de centrifugação e a D0(420) de cada mistura de reação foi medida e a atividade de [3-galactosidase foi calculada através da equação a seguir: Atividade de [3-galactosidase (Unidade) = 1000 x DO (420) /tempo de reação (min). Os resultados são mostrados na Tabela 2 e nas Figs. 3A até 3D.

No caso de cultivo em um meio contendo glicose, um transformante contendo um promotor L).cre1 exibia uma atividade de 13-galactosidase aproximadamente 1,9 vez aquela da célula do tipo selvagem e um transformante contendo um ilcre2 exibia uma atividade de 13-galactosidase aproximada- mente 6,2 vezes aquela da célula do tipo selvagem.

Um transformante contendo um promo- tor L\cre1 .2 (em que tanto ilcre1 quanto L\cre2 foram deletados) exibia uma atividade de 13- galactosidase aproximadamente 7,8 aquela da célula do tipo selvagem, que é a eficiência de transcrição mais alta.

No mesmo experimento realizado através do uso de maltose ou sorbitol como uma fonte de carbono, a eficiência de transcrição de cada promotor no transformante correspon- dente era notavelmente maior, quando comparada àquela da célula do tipo selvagem.

No 1O experimento utilizando o meio de cultura que contém uma fonte de carbono imitando uma solução de carboidratos de uma biomassa tal como uma planta (solução sacarificada mode- lo), também foi observada uma eficiência de transcrição notavelmente maior.

Tabela 2

Fonte de Atividade de 13- Cepa Vetor de transdução carbono galcictosic!as_e (.Unid.

Wild type PS237-lacZ 135.2 Licre1 PLicre1-lacZ 256.8 .. Glicose Licre2 PLicre2-lacZ 840.5 Licrel.2 PLicrel.2-lacZ 1050.0 Wild type PS237-lacZ 354.0 L'.icrel P.ó.cre1-lacZ 462.9 Maltose Licre2 ~Licre2-lacZ 850.0 --- - - - - - - - - t.\crel.2 P.ó.cre1.2-lacZ 723.8 Wild type .. PS237-lacZ 140.0 Sorbitol ticre1 1 P.ó.crel-lacZ 308.7 Licre2 1 P!\cre2-lacZ 624.3 1 Licrel.2 1 Ptlcrel.2-lacZ 846.8 Wild type i PS237-lacZ 290.7 Solução Licre1 1 PLicre1-lacZ 706.4 sacarificada modelo õcre2 ~-------r

--j ! PLicre2-lacZ 1359.0 -1 -- Licrel.2 ! PLicrel.2-lacZ 1604.8 !

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Promotor modificado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma se- quência de nucleotídeos de um promotor derivado de bactéria que pertence ao gênero Baci- 1/us em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da seguinte foi modifi- 5 cada: uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituída, deleta- da, adicionada ou inserida; e uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência representada pela SEQ ID NO: 1. 1O

2. Promotor modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2.

3. Promotor modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacil/us é um promotor proveniente de Bacillus subtilis ou uma cepa mutante de Ba- cillus subtilis.

4. Promotor modificado, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus é um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM-65 de Bacillus sp. (FERM BP-2886); um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM- S237 de Bacillus sp. (FERM BP-7875); ou um promotor que contém uma sequência de nu- cleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequên- cia de nucleotídeos de qualquer um dos ditos promotores e que possui uma sequência simi- lar acre.

5. Promotor modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das sequências de nucleotídeos é a de- leção, a substituição ou a adição de uma base nas sequências de nucleotídeos.

6. Método para a produção de um promotor modificado, CARACTERIZADO pelo fa- to de que o método compreende a modificação, em um promotor derivado de bactéria que pertence ao gênero Bacil/us, de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da seguinte: uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, exceto pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas ali é substituída, deleta- da, adicionada ou inserida; e uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à primeira sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2. 5

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacil/us é um promotor proveniente de Bacillus subtilis ou uma cepa mutante de Ba- cillus subtilis.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor derivado de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus é: um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM-65 de Baci/lus sp. (FERM BP-2886); um promotor de um gene de celulase alcalina proveniente da cepa KSM-S237 de Bacillus sp. (FERM BP-7875); ou um promotor que contém uma sequência de nucleotídeos que possui uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de nucleotídeos de qualquer um dos ditos promotores e que possui uma sequência similar a cre.

1O. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das sequências de nucleotídeos é a de- leção, a substituição ou a adição de uma base nas sequências de nucleotídeos.

11. Promotor modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um promotor modificado produzido através do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a1 O, CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou uma pluralidade de bases contidas é adicionalmente substituída, deletada, adicionada ou inserida.

12. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um pro- motor modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 11 ou um promotor modificado produzido através do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 10.

13. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor modificado está ligado de forma operacional a montante de um gene que codifica um produto gênico de interesse.

14. Transformante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um promotor modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 11 ou um promo- tor modificado produzido através do método conforme definido em qualquer uma das reivin- dicações 6 a1 O, em que o promotor modificado está ligado de forma operacional a montante de um gene que codifica um produto gênico de interesse.

15. Método para a obtenção de um produto gênico de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende o emprego de um transformante conforme definido na reivindicação 14.

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CU Z m CJ á - |))"\|'li?, ) ) ' |jj'l !

Fíg. 2 amyE- Scal 515 d fragmento de 0,57 kb derivado da célu- Lacz la de Bacil/us sp.

EcoRI KSM-S237 Bamlll . .S ,D,2 9891 bp

CAT BamH 60 6 amyE- verso EcoRI 6066 Bam Hl ~ I Bam Hl EcoRI ~ I" EgoRl l T4 DNA Iigase amyE - frente r Scal 515 LacX i0' LacZ: Íj-Galactosidase gene pDL2-PS237 - 10456 bp / Cat:gene de resistência ao cloranfenicd - BamHI 6641 CAT amyE- verso ps237r ECORI 6066