KR101388457B1 - 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제, 상기 만노시다제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에 의한 재조합 만노시다제를 대량 생산하여 농업, 식품 산업의 실질적으로 이용함으로써 경제성을 제고시킬 수 있다.

Description

동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제{Novel mannosidase derived from microbial in intestinal of blacksoldier fly}

본 발명은 동애등에(Blacksoldier fly: BSF) 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제, 상기 만노시다제 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

식물의 세포벽은 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스나 펙틴 등의 다당류, 효모는 글루칸, 만난-단백질 복합체와 키틴, 곰팡이는 글루칸, 셀룰로오스, 키틴, 키토산 등으로 이루어지고 있다. 그래서 이들을 분해하는 베타-글루카나아제(베타-glucanase), 만나아제(mannase), 키티나아제(chitinase), 프로테아제(protease) 등의 활성을 갖는 효소를 세포벽 용해효소라고 부른다. 만나아제는 베타-D-만노시드를 비환원 말단에서 가수분해하여 만노오스를 유리하는 엑소형 효소이다. 베타-만노시다제는 종래, 베타-D-만난(mannan)의 비환원 말단으로부터 만노스(mannose) 단위로 가수분해되는 효소로서 알려져 있다. 분자 내에 베타-만노시도 결합을 가지는 저분자, 베타-D-만난(mannan), 글루코만난(glucomannan), 갈락토 만난(galacto mannan), 갈락토 글루코만난(galacto glucomannan))에 작용하고, 비환원 말단 부위로부터 순차적으로 가수분해하여 만노스(mannose)를 생성한다. 이는 동물, 식물, 미생물에서 발견되고 있다. Asp. niger 유래의 효소는 최적 pH 3.5, 분자량은 130,000으로 폴리펩티드 사슬의 80%는 베타-sheat 구조를 갖는다.

또 곤약 만난(konjak mannan) 중의 베타-1,4 결합을 엔도형으로 분해하는 효소로서는 엔도-1, 4-베타-D-만나아제(endo-1,4-베타-D-mannase. EC 3.2.1.78)가 있다. 또한 효모 세포벽 만난 중의 알파-1, 2-만노시도 결합, 알파-1,3-만노시드 결합을 가수분해하는 효소로서는 엑소-1,2-1,3-만노시다아제(EC 3.2.1. 77)가 있다.

동물, 식물, 미생물 등에 기원을 가지는 종래 제안된 베타-만노시다제는, 공업에 대규모로 이용하기에는 그 효소의 생산성이 낮고, 그 제법, 정제법도 복잡하므로 실용화하기에는 여전히 한계가 있었다. 따라서, 제조·정제가 용이하고, 게다가 높은 안정성을 가지는 이런 종류의 효소를 새롭게 개발하는 것은, 전분(starch)과 동시에 천연계에 대량으로 존재하는 재생 이용 가능한 베타-만난(mannan)을 분해하고, 분해 생성물(만노스(mannose), 갈락토오스(galactose), 글루코스(glucose) 등)을 회수·이용하는 점에서 의의를 갖는다.

Biochemistry, 1972, 11, 1493∼1501

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제, 상기 만노시다제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 3의 아미노산서열로 표시되는 만노시다제 단백질, 서열번호 4의 아미노산서열로 표시되는 만노시다제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 만노시다제 유전자, 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 만노시다제 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 메타게놈 유전자은행으로부터 종래의 기술로 배양하기 힘든 동애등에 장 내 미생물 유래의 신규 만노시다제 유전자를 발현할 경우에 수용성 베타-만노시다제 효소의 생산성이 탁월하여 대량생산이 가능하며, 일부는 배양액으로 분비되는 특성이 있으므로 농업, 식품, 바이오 연료 등의 다양한 분야에서 상업적인 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 DDML5 만노시다제의 아미노산 핵산서열과 BlastP 검색에서 유의성을 가진 것으로 보인 만노시다제 계열 효소들과의 계통분석를 나타낸 것이다. 각 branch에 있는 숫자는 Bootstrap 분석치(1,000 resampling)이다(Bar, 0.2 substitutions per amino acid position).
도 2는 단백질 과발현용 신규 베타만노시다제의 재조합 플라스미드(pEML5과 pEMD5)의 제작도를 나타낸다.
도 3(A)는 pEM5과 pEMD5의 대장균에서의 이종 대량발현 및 정제 결과 46 kDa의 목적단백질인 베타 만노시다제가 과다 발현된 것을 나타낸 것이다. 도 3(B)는 시그날펩타이드가 제거된 pEMD5의 세포외 발현(배지내 분비)을 확인한 것이다.
도 4는 pEMD5 발현 베타 글루코시다제의 최적 온도 및 pH 분석을 나타낸 것이다.
도 5(A)는 pEMD5 발현 DDMD5베타 만노시다제의 기질특이성을 나타낸 것이고, 도 5(B)는 금속이온, 유기용매, 여러 케미칼에 대한 pNPG 분해활성을 나타낸 것이다.
도 6은 pEMD5의 단백질 발현 및 Ni-NTA affinity 칼럼에 의한 신규 베타 만노시다제 정제, 효소활성 및 생산성 분석 (LB배지 배양액 250ml 기준)을 나타낸 것이다.

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 유전자는 만노시다제 단백질을 코딩하는 게놈DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 만노시다제 유전자는 총 1278bp의 뉴클레오티드를 포함하며, 총 426개의 아미노산을 코딩하고 있다. 또한 본 발명에 따른 만노시다제 코딩 유전자의 아미노산 서열을 기존의 유전자 데이터베이스 및 BlastP를 검색한 결과, 본 발명의 유전자는 기존의 보고된 만노시다제와 아미노산 수준에서 최대 61%의 상동성을 보여 신규 유전자로 밝혀졌다. 이 유전자를 'DDML5'이라 명명하였다.

또한, 상기 핵산서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1의 핵산서열과 각각 70%이상, 80%이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 만노시다제 단백질을 코딩하는 게놈DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 만노시다제 유전자는 이 효소의 N말단부 26개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide를 코딩하는 부분을 제거한 총 1200bp의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 총 400개의 아미노산을 코딩하고 있다. 이 유전자를 'DDMD5'이라고 명명하였다.

또한 상기 핵산서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열과 각각 70%이상, 80%이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

하기 표 1은 서열번호 1 및 2에 관한 것이다.

[표 1]

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질을 제공한다. 상기 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 만노시다제 단백질의 범위는 서열번호3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%이상, 70%이상, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. “실질적으로 동질의 생리활성”이란 생물체 내에서 가수분해 능이 우수한 만노시다제의 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질을 제공한다. 상기 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 만노시다제 단백질의 범위는 서열번호 4으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 이는 서열번호 3의 만노시다제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자에서 세포외 분비와 관련하는 singnal peptide를 코딩하는 하는 부분을 제거하여 총400개의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%이상, 70%이상, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. “실질적으로 동질의 생리활성”이란 생물체 내에서 가수분해 능이 우수한 만노시다제의 활성을 의미한다.

하기 표 2는 서열번호 3 및 4에 관한 것이다.

[표 2]

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만노시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET21a 벡터를 예로 들 수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pKBN-IFN벡터를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 DDML5유전자를 단백질 발현벡터인 pET21a에 클로닝하여 재조합 벡터 pEM5을 제조하였다. 또한 본 발명은 DDMD5유전자를 단백질 발현 벡터인 pET21a에 클로닝하여 재조합 벡터 pEMD5을 제조하였다.

용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내로 재도입된 것이다.

용어 ”벡터”는 세포 내로 전달하는 DNA단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 “전달체”는 흔히 “벡터”와 호환하여 사용된다. 용어 “발현벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 유전자는 전형적으로 클로닝 또는 단백질발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한， 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면， pSC101， ColE1，pBR322， pUC8/9， pHC79， pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 pUC19 등)， 파지(예를 들면， λgt4.λB， λ-Charon및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면， SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편， 본 발명의 유전자가 식물에 최적화된 코돈으로 전환하여, 식물 세포를 숙주로 하는 경우에는 당 업계에서 통용적으로 사용되는 벡터(예를 들면, pBI vectors, pCAMBIA vectors, pSB vectors)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당 업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면 E. coli JM109， E. coli BL21， E. coli RR1， E. coli LE392， E. coli B， E. coli X 1776， E. coli W3110， 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)， 바실러스 츄런겐시스(Bacillus thuringiensis) 와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모낼라 티피무리움(Samonella typhimurium)， 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이다.

또한， 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 효모， 곤충세포， 사람세포 (예컨대， CHO(Chinese hamster ovary) 세포주， W138， BHK， COS-7， 293， HepG2， 3T3， RIN 및 MDCK 세포주) 식물세포 등이 이용될 수 있으며， 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyce cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaC 방법(Cohen， S.N. et al.， Proc. Natl. Acac. Sci. USA， 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan， D.， J. Mol. Biol.， 166:557580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower， W.J. et al.， Nucleic. Acids Res.， 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시 될 수 있다. 또한， 숙주세포가 진핵세포인 경우에는， 미세주입법(Capecchi， M.R.， Cell， 22:479(1980))， 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham， F.L. et al.， Virology， 52:456(1973))， 전기천공법(Neumann， E. et al.， EMBO J.， 1:841(1982))， 리포좀-매개 형질감염법(Wong， T.K. et al.， Gene， 10:87(1980))， DEAE-텍스트란 처리법 (Gopal， Mol. Cell Biol.， 5:1188-1190(1985))， 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al.， Proc.Natl. Acad. Sci.，87.9568-9572(1990))등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타 글루코시다아제를 생산할 수 있으며， 그 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어， 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효， 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소，질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면， American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 베타-만노시다제는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당 업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 초음파파쇄, 여과, 추출， 분무 건조， 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만， 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환， 친화성， 소수성 및 크기별 배제), 전기영동， 분별염석(예를 들면 암모늄 설페이트 침전)， SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

이하， 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단，하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 동애등에 메타게놈 은행 구축

동애등에의 유충은 국립농업과학원 곤충산업과에서 분양 받았다. 1,000여 마리 이상 유충으로부터 유충을 고정한 뒤 핀셋으로 장을 분리하였다. 분리한 장에서 장내 미생물을 분리하기 위하여 조직을 막자 사발에서 적절하게 파쇄한 뒤 percoll gradient 방식을 통하여 미생물을 분리하였다(Current Protocols in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratories Ed.). 분리한 동애등에 유충 장내 미생물로부터 메타게놈 라이브러리를 제작하기 위하여, 분리 정제한 전체 DNA를 1% Low-melting-point agarose gel에 CHEF DR-III전기영동 장치(Biorad사)에 6V/cm로 14℃, 120° 각도로 11초간 ramping 하여 13시간 전기영동하고 SybrGreen Gold Dye로 염색한 후 UV illuminator 상에서 확인하고 40 kb 이상의 DNA를 포함하는 agarose block 만을 자른 다음 agarase 효소를 넣어 1시간 동안 반응시킨 후 70℃에서 10분간 agarase를 비활성화 시켰다. 여기에 에탄올로 침전, 세척하여 순수한 DNA를 분리하여 준비하였다. Fosmid library 제작은 정제한 장내 미생물 DNA 25 μl (5 μg)에 5 unit의 T4 polymerase (Takara Co.)와 2 unit T4 polynucleotide kinase (Takara Co.) 그리고 6 units의 Klenow fragment (Takara Co.)를 가한 후 반응액량을 50 μl로 조절한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 DNA 말단을 평활화하여 제작하였다. 반응이 끝난 후 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1,v/v/v)을 첨가하여 섞은 다음 10분간 원심분리하고 상등액을 모아서 동량의 chloroform/isoamylalchohol (24:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 후에 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 만을 취하고 2.5배의 100% ethanol을 넣어 1시간 동안 상온에서 방치한 다음 원심분리하여 상등액은 버리고 70% 에탄올로 DNA를 세척하여 DNA를 준비하였다. EpiFOS fosmid vector (pCC1/2, Epicentre, USA)에 end-repaired DNA를 첨가하여 16℃에서 16시간 ligation 반응시켰다.

In vitro packaging을 위해 16℃에서 16시간 반응한 시료들을 70℃에서 10분간 열처리하여 ligase 효소를 불활성화시켰다. Ligation한 반응액 7.5 μl에 MAX lambda packaging extracts kit (Epicentre, USA)의 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켰다. 여기에 다시 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켜 in vitro packaging을 수행하였다. SM 완충용액을 1 ml 첨가하여 위아래로 잘 섞어 준 다음 여기에 25 μl의 chloroform을 넣어 다시 packaging 되지 않은 물질들을 불활성화 시켰다. 원심분리를 조심스럽게 하여 정치한 다음 4℃에 보관하였고 상등액을 대장균에 형질전환하여 library로 사용하였다. 대장균에 클로닝된 유전자 형태로 구축한 메타게놈 유전자은행은 LB-Chloramphenicol-glycerol 배지를 기본배지로 하여 384-well plate에 개별 클론으로 접종하여 메타게놈 유전자은행을 작성하고 -70℃에 장기 보존하였다.

2. 동애등에 메타게놈 라이브러리에서 베타 만노시다제 유전자 선발 및 신규성 분석

동애등에 장내 미생물 메타게놈 라이브러리로부터 셀루라아제 분해 클론을 선발하기 위해 선별 agar 배지(LB+0.5% carboxymethylcellulose)에서 28℃에서 5일간 배양하여 0.1% Congo red액에 10분간 염색시키고 이어서 1M NaCl로 수 차례 세척하여 콜로니 주변에 환이 생긴 즉 셀루라아제를 외부로 분비하는 클론을 선발하고 이로부터 Fosmid를 분리해 삽입단편을 확인하였다. 음성 반응 대조군으로 메타게놈 유전자은행을 구축한 대장균 숙주(host)에 fosmid 벡터만 들어간 것을 사용하여 동일한 조건에서 배양하여 background 시그널을 확인하였다.

상기 1의 제작된 메타게놈을 당 분해효소 유전자를 가진 것으로 추정되는 DDHC3클론을 기질이용 선택배지로 최종 선발하였으며 이들에서 삽입 DNA단편(약 36kb)에 대한 염기서열 분석을 수행하였다. 양성을 보인 클론들에서 pUC-universal primer과 BigDye system을 사용하여 염기서열을 결정하여 분석하였다. Sequencing은 ABI BigDye-terminator (ver. 3.1)로 반응하였고, 사용한 PCR primer는 각 벡터에서 제공되는 5‘- 또는 3’-end universal primer를 사용하였다(EpiCentre, USA). Sequencing PCR 반응은 DNA 4μl, BigDye 0.5μl, primer 3pmol, 5XBuffer 1.75μl, Sterile water 3.45μl를 넣고 94℃, 4min→[96℃, 10sec→50℃, 6 sec→60℃, 4min] X 25 cycle→4℃, Hold 방식으로 수행하였다. Dye peak가 분명하게 분리되는 약 500bp partial sequence를 이용하여 GenBank(National Center for Biotechnology Information)의 BlastX 알고리즘을 사용하여 가장 유사성이 높은 유전자를 검색하였다. 전체 염기서열은 VectorNTI 프로그램을 통하여 contig으로 작성하여 가수분해 효소 역할을 수행하는 ORF를 검출하였다. 검출된 ORF는 GenBank의 BlastX 알고리즘으로 검색하여 기능을 추정하였다.

이들 결과로부터 베타 만노시다제로 추정되는 1281bp의 전사해독프레임 ORF(Open Reading Frame)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이 전사해독 프레임을 DDML5라 명명하였다. 또한 GenBank의 BlastX 알고리즘으로 검색하여 기능을 추정하였다. 유연관계 분석은 Blast P검색을 사용하여 기존 보고된 베타 만노시다제의 아미노산 배열에서 본 발명의 만노시다제와 상동성이 높은 자료를 모으고 이를 MEGA 5.1과 ClustalX program으로 분석하였다. N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree작성을 실시하여 비교하였으며, 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다. 본 발명의 베타 만노시다제는 비교적 독립된 클러스트에 위치함을 보여준다(도 1). 따라서DDML5나 DDMD5만노시다제가 아미노산 수준에서 최대 61%의 상동성을 보여 기존의 보고된 만노시다제와는 다른 아직까지 전혀 알려지지 않은 미생물에서 유래한 신규한 만노시다제임을 보여준다.

3. 베타 만노시다제 유전자의 과다발현을 위한 형질전환체의 제조

본 발명의 베타-만노시다제를 발현하는데 있어서, 상기 2의 DDML5(핵산서열: 서열번호 1) 핵산서열에서 signal peptide가 포함된 원래 유전자 DDML5와 DDMD5의 N말단에서 signal peptide에 해당되는 26개의 아미노산이 결실된 DDMD5를 아래와 같이 프라이머를 디자인하여 중합효소 증폭반응을 통해 증폭하였다. 각각의 ORF만을 증폭하기 위하여 PCR primer를 제작하였고, fosmid/cosmid DNA를 template로 하여 HighPrime Taq polymerase(Takara, Japan)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 산물은 각 ORF의 reading-frame에 따라 Hig-Tag을 가진 대장균 발현 벡터인 pET21a 에 frame 별로 directional in-fusion 하였다(In-Fusion cloning kit, Clone Tech, USA). PCR 증폭산물이 발현벡터에 적절하게 삽입된 것은 junction 부위의 염기서열을 결정하여 확인하였다.

< Primers used >

*pEML5 ('With' the leader sequence, without TAA stop codon at the 3'-end)

Forward (BamHI site included); CGCGGATCCATGAAAAAACTGATTCTATT

Reverse (XhoI site included) ; CCGCTCGAGTAGTTTTTGAGTATAGCTTT

*pEMD5 ('Without' the leader sequence, without TAA stop codon at the 3'-end)

Forward (BamHI site included); CGCGGATCCTCTTTCGTAAAGCAGAAGGA

Reverse (XhoI site included) ; CCGCTCGAGTAGTTTTTGAGTATAGCTTT

추정되는 Protein size : pEML5 48kDa, pEMD5 46kDa

증폭된 단편들을 제한효소 BamH I과 Xho I으로 절단한 후, 이와 동일한 효소로 절단된 pET21a벡터에 삽입, DDML5과 DDMD5의 ORF(Open Reading Frame)를 pET21a(Novagene, USA)에 각각 클로닝하여 E. coli DH5알파의 competent cell에 형질전환하여 엠피실린이 함유된 배지(100ug/ml)에서 선발하고 이로부터 재조합 플라스미드(pEML5 과 pEMD5)를 분리하였다. 이 플라스미드는 단백질과 발현 숙주세포인 E. coli BL21(DE3)에 재형질전환하고 이를 한국농용미생물센타에 기탁하여(2012. 5. 10일) KACC95116P(pEMD5)와 KACC95117P(pEML5)의 기탁번호를 부여 받았다. 이 균주는 베타 만노시다아제의 대량 발현 및 정제를 위한 균주로 사용하였다.

4. 재조합단백질(신규 베타-만노시다제)의 발현 및 정제

pEML5 및 pEMD5를 형질전환 시킨 KACC95116P(pEMD5)와 KACC95117P(pEML5)를 250ml LB(Luria-Bertani, Gibco-BRL사) 액체 배지에 ampicillin(100 μg/mL)과 함께 접종하여, OD600nm값 0.6에서 0.5 mM IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 발현시킨 다음, 6,000 rpm, 10분간 원심분리후 cell pellet을 회수하였다. 여기서 효소가 균체 외로 분비되는가를 보기 위해 균체가 제거된 배양액은 암모늄설페이트 분말을 포화되도록(700g/리터) 서서히 실온에서 첨가하여 혼합해주었다. 포화된 용액은 원심분리하여(6,000rpm, 10분) 그 침전물을 멸균증류수로 5ml 녹인 뒤 투석막(분자량 6,000 cut-off, 스펙트럼사)에 넣고 증류수로 여러 차례 투석하고 그것을 활성 분석 또는 SDS-PAGE의 시료로 사용하였다. 원심분리로 세포침전물을 제거한 cell lysate를 nickel-nitrotriacetic acid (Ni-NTA) agarose resin(Qiagen, Germany)에 binding 시킨 후, 동일한 완충액으로 2회 세척 하고, 100~250mM imidazole 함유 elution buffer로 6His-tagged protein을 용출하였다. 용출한 단백질은 dialysis buffer [20 mM Tris-HCl, pH 7.5]로 충분히 투석하여 사용하였다.

한편 회수된 균체는 Lysis buffer(20%(W/V) sucrose, 30mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 25ml로 현탁시키고 초음파로 파쇄(Pulse on 15초, Pulse off 30초, 3회 실시)하여 다시 원심분리(13,000×rpm, 10 min)하여 회수한 상등액을 조효소액으로 사용하고 이를 정제하기 위해서 Ni-NTA(Qiagen, Germany) 10ml로 충진된 칼럼에 로딩하여 결합시키고 10 volume의 washing buffer(50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 20mM Imidazole)로 씻어주고 단백질을 마지막으로 5 volume의 elutioin buffer(50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 100mM Imidazole)로 용출시켜 순수 분리하였다(Qiagen U.S.A). 이들 분획은 분자량 10kDa 이상을 농축할 수 있는 Centrifugal filter(Amicon Ultracell -10K, Millipore Co.)을 이용하여 정제하였다. 최종 정제된 단백질은 활성 분석 또는 SDS-PAGE의 시료로 사용하였다.

효소활성은 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 p-nitrophenyl-β-D-mannoside를 10 mM이 되도록 각각 제조한 후, 10 μL의 기질용액에 조효소액이나 Ni-NTA칼럼으로 분획한 정제액을 각각 100배 희석한 시료10μL씩 첨가하여 55℃에서 60분간 반응시킨 후 1M Na₂CO₃ 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 중지시켜 유리된 ρ-nitrophenol(pNP, Sigma, USA)의 양을 405 nm에서 흡광도로 측정하였다. 효소활성 단위는 1분 동안에 1 mole의 pNP를 유리시키는데 필요한 효소량을 1 unit로 정의하였다.

발현된 단백질은 SDS-PAGE(Lamni 법)에 의해 확인하였다. 상기의 분석 결과 pEML5 및 pEMD5의 48 및46kDa 크기의 재조합 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도3: lane3, lane6). 또한, 이들 유전자의 발현 균주 배양액으로부터 암모늄설페이트 침전물을 비교하였다(도3의 lane 4, lane 7). 그 결과 26개 아미노산의 signal sequence를 제거한 pEMD5형질전환 대장균이 pEML5형질전환주와 달리 세포외로 베타 만노시다제를 분비함을 확인하였다. 즉, DDHC3 클론 내 베타 만노시다제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자에서 세포외 분비와 관련하는 signal peptide 존재가 확인되었다. 상세하게는 예측한 베타-만노시다제의 N말단 부위 약 26개 아미노산의 signal sequence의 제거가 오히려 세포외 분비에 중요한 역할을 하고 있음을 확인시켜주는 것으로 판단된다. 균체의 경우에도 단지 초음파 처리에서도 DDMD5-만노시다제가 예측된 분자량 위치에 단백질 밴드가 진하게 나타나고 강한 활성을 보임으로서 이들이 과 발현에서 흔히 나타나는 불용성 단백질체(인글루전바디)가 전혀 형성되지 않은 매우 수용성이 높은 만노시다제가 다량으로 발현됨을 확인하였다.

5. 신규 베타- 만노시다제의 최적활성 조건과 열 안정성 분석

pH별 활성 측정에 사용된 버퍼는 pH 4~6, Sodium acetate; pH 6~7.5, Potasium phosphate; pH 7.5~9, Tris?Cl buffer를 사용하였다. 발현단백질을 pNP-베타-D-mannooside를 기질로 사용하여 각 온도와 pH별로 만노시다제 활성을 측정하였다. pEMD5의 산물인 DDMD5 베타-만노시다제는 60℃와 pH 7.0에서 최적 활성을 나타내었으며(도 4), 특이하게도 pH 9.0에서도 70% 이상의 활성을 유지하였다. 이 효소는 70℃이상의 고온과 산성 조건(pH5이하)에서는 활성이 급속히 감소하였다.

또한 발현단백질을 pNP-베타-1,4-D-mannoside를 기질로 사용하여 각 온도(25℃, 35℃, 45℃, 55℃, 65℃)로 1시간 처리 후, DDMD5베타-D-만노시다제는 60℃와 pH 7.0에서 시간 별로 활성을 측정하였다. 이 효소는 35℃까지 열 안정성이 있으나 55℃에서는 급격히 열안정성이 감소됨을 보여주었다. 또한 35℃에서 시간 별로 효소의 안정성 분석을 하였고, 이 분석의 조건은 60℃. pH 7.0에서 60분 반응 후 기질pNPG에 대한 효소활성을 최적조건을 100으로 하고 상대적 활성을 나타내었다. 시간 별로 효소안정성을 분석한 결과 이 효소는 14시간반응에도 효소활성이 80%이상 유지하였으므로 이는 비교적 열에 안정함으로 비교적 산업적 응용에 유리한 것으로 기대된다(도 4).

6. 신규 베타 만노시다제의 기질 특이성 및 다양한 화합물에 대한 활성 영향 분석

상기4에서 설명한 방법대로 이들 발현된 유전자의 산물인 효소의 활성과 기질특이성을 검정한 결과는 도5에서 보는 바와 같다. 핵산서열 분석 상 만노시다제로 추정되는 유전자(pEMD5)의 발현단백질의 활성 검정에서, 재조합단백질은 예상한대로 주 활성이 베타-1,4 D-만노시다제 임이 최종 확인되었으며 이것은 기타 다른 당에서는 전혀 작동하지 않으므로 매우 베타 만노시드 결합에 특이적인 분해능을 가지는 만노시다제임을 보여준다.

또한, 금속이온은 10mM, 기타 케미칼은 3%, 유기용매는 실온에서 1시간 노출 후 55℃. pH 7.0에서 60분 반응 후 기질pNPG에 대한 효소활성을 무처리를 대조구로 하여 상대적 활성을 분석하였다.

다양한 금속이온에 대한 이 효소의 활성도를 분석한 결과, 니켈, 구리에는 심각하게 활성을 저해하였고 마그네슘은 오히려 5%정도 활성을 증가시켰다. 한편 유기용매나 다양한 케미칼에 대한 본 효소의 활성에 대한 영향을 분석한 결과, 3%의 DTT 조건에서 오히려 활성이 약간 증가경향이 있는 반면에, 대부분의 유기용매에서(에탄올 제외) 1시간 노출 시, 또는 트윈계 화합물, 트리톤X-100, SDS, EDTA, 글리세롤에서는 심각한 활성 저해가 보였다. 보다 특기할 사항은 본 효소가 10mM만노오즈에 의해 활성이 저해받지만 기질을 증가시키면 활성이 회복되는 것으로 보아 이 반응의 산물인 만노오즈가 경쟁적 저해제로 작용한다. 이와 같이 본 발명의 신규 만노시다제는 기존 보고된 것과는 매우 다른 생화학적 특성을 보이고 있다(도 5).

본 발명의 베타 만노시다제는 단지 베타 만노시드 결합에만 작용하는 기질특이성을 가지며 정제된 효소의 비활성(specific activity)은 약 100unit/단백질mg으로 다른 생물에서 정제된 것 보다 우수하였다.

7. 신규 DDMD5 -베타 만노시다제의 생산성 분석 및 경제적 가치

KACC95116P(pEMD5)에 의한 DDMD5-만노시다제의 생산량과 총 효소활성을 보기 위해 250ml의 LB 배지에 OD600nm에서 0.6되도록 배양한 뒤 1mM IPTG로 4시간 동안 유전자를 발현유도하고 그것의 세포 잔사를 모은 뒤 Lysis buffer(20%(W/V) sucrose, 30mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 15ml로 현탁시키고 초음파로 파쇄(Pulse on 15초, Pulse off 30초, 3회)하여 원심분리하였다. 그 상층을 단백질 정량하고 이를 Ni-NTA affinity column으로 결합시킨 뒤 20-100mM imidazole 완충액으로 용출하여 각 분획의 단백질 양과 효소활성을 분석하였다(도 6). 한편 단백질의 양을 측정하기 위해서 Bradford 분석법을 이용하였다. BSA(bovine serum albumin, New Englnad BioLab)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다. 1:5 비율로 dilution한 protein assay dye reagent(Bio-Rad) 1ml에 시료 10ul를 상온에서 5분 동안 incubation 시킨 후, 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

초음파처리로 파쇄된 수용성 단백질 총량에 목표된 효소의 정제도는 75%이상이었으며 이를 정제한 분획(정제도 98%)에서는 specific 효소활성도가 100 unit/단백질mg 정도였다. 이는 통상적인 배양조건에도 리터당 정제 효소가 적어도80mg, 총 8,000unit이상 생산되는 것으로 산정된다. 이는 대장균에서 기존의 보고된 어떠한 재조합 만노시다제 보다도 탁월한 생산성을 보인 것이며 특히 숙주인 대장균에서 세포 외로도 수용성 효소를 분비하였기 때문에 생산단가를 획기적으로 절감할 수 있을 것이다. 이 효소는 식품 및 연구용 시약효소 생산의 적용에 기여할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 서열번호 3의 아미노산서열로 표시되는 만노시다제 단백질.
2. 서열번호 4의 아미노산서열로 표시되는 만노시다제 단백질.
3. 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 만노시다제 유전자.
4. 서열번호 2의 핵산서열로 표시되는 만노시다제 유전자.
5. 제3항 또는 제4항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체.
   
   
7. 삭제

Images