KR101278608B1 - 동애등에 유래의 셀룰라아제 유전자 ｃｓ10 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동애등에 유충 장내에 존재하는 난배양 미생물로부터 분리한 셀룰라아제(cellulase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 셀룰라아제 생산 유전자 CS10은 발현을 이용하여 셀룰로오스를 효과적으로 분해할 수 있고, 저분자 올리고당 물질로 변환시킬 수 있다.

Description

동애등에 유래의 셀룰라아제 유전자 ＣＳ10 및 이의 용도 {Cellulase gene CS10 from Hermetia illucens and uses thereof}

본 발명은 동애등에 유충 장내에 존재하는 난배양 미생물로부터 분리한 셀룰라아제(cellulase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

셀룰로오스는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 고분자 유기물로 석유나 석탄처럼 고갈에 대한 염려가 없는 거의 무한한 자원이다. 전 세계에서 생산되는 농산 및 임산 셀룰로오스 폐자원은 매년 30억 톤 이상이며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다. 이는 주로 셀룰로스와 헤미셀룰로스로 이루어져 있어 이들의 당화를 통한 단당류의 생산은 바이오에너지 자원의 중요한 원료가 된다. 셀룰라아제는 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등에서 많이 이용되고 있으며 이외에도 식품 산업에 있어, 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용되고 있다. 셀룰로오스는 산업적으로는 바이오에탄올 생산의 주요 자원이나, 최근에는 셀룰로오스가 농업 폐기물과 음식물 쓰레기의 형태로 환경에 대량 방출되어 주요 오염원이 되기도 한다. 현재 셀룰로오스의 변환은 주로 화학적인 방식에 의존하고 있는데, 이는 산업적인 측면에서 충분한 경제성이 있는 다양한 미생물 유래 당화효소가 개발되지 못하고 있기 때문이다.

셀룰라아제 생산 균주로는 트리코더마 리제이 ZU-02 (Trichoderma reesei ATCC 56764)가 대표적인 균주로 집중 연구되어 왔으나, 효소의 농도 및 활성 측면에서 경제성이 충분하지 못하다는 문제점이 있다. 그 결과, 당화효소를 사용해서 셀룰로오스 계열 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정은 원료 물질의 재생, 생산 연료의 환경 친화성 등 많은 장점을 갖고 있지만 휘발유에 비해 생산 단가가 현저히 높아 실용화에 장애가 되고 있다. 종래에 이들 효소의 생산은 주로 곰팡이(fungi)를 이용하고 있으며, 특히 산업적인 효소 생산은 아스퍼질러스(Aspergillus sp.)와 트리코더마(Trichoderma sp.)를 이용하였다. 그럼에도 불구하고 셀룰로오스를 이용한 바이오에탄올 생산 공정에 있어 비용의 가장 큰 부분은 당화효소의 생산비로서 전체 비용의 절반 이상(약 60 %)이 사용된다. 그러므로 특수한 셀룰라아제를 생산하는 고활성 균주의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 종래 기술로는 셀룰라아제 생산이 가능한 균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)이 공지되어 있다(국내 공개번호 2011-0042397호).

식물체의 세포벽은 불용성 셀룰로오스(β-1,4-글루칸 결합 고분자), 헤미셀룰로오스 (hemicellulose, 비셀룰로오스계 다당류), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)의 중합체이다. 이 가운데 셀룰로오스가 가장 많이 존재하고 그 다음으로 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로오스로 이들 두 성분이 전체 바이오매스의 50% 이상을 구성한다. 셀룰로오스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 중합체로서 이를 단당류로 완전히 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루칸아제 (endo-β-1,4-glucanase) [EC 효소번호: 3. 2. 1. 4], 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 91], 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase) (EC 3. 2. 1. 21) 등 세 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루카나아제는 다당체 안쪽의 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고 엑소-글루카나아제가 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로바이오스 (cellobiose)로 절단해 나간다. 이후 베타-글루코시다아제에 의해서 포도당으로 최종 분해된다. 현장에서는 위의 3가지 군(群)을 통칭하여 셀룰라아제로 관용적으로 사용하고 있다.

산업적으로는 이중 첫 단계인 셀룰로오스의 저분자화에 가장 많은 경비가 소요되고 있으므로, 이 단계의 당화효소 개발을 통한 셀룰로오스의 변환이 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있다.

국내 공개 특허 10-2010-0122795호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 동애등에 유충 장내에 존재하는 난배양 미생물로부터 분리한 셀룰라아제(cellulase) 유전자를 제공하고자 한다.

또한, 상기 유전자를 보유하는 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 보유하는 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 셀룰라아제 생산 유전자 CS10은 발현을 이용하여 셀룰로오스를 효과적으로 분해할 수 있고, 저분자 올리고당 물질로 변환시킬 수 있다. 특히 특별한 스트레스 환경이나 프로모터가 없어도 대장균에서 자연 발현될 수 있으므로 대장균 이외의 그람-음성 균에서 이종발현이 용이한 특성을 가지고 있다.

도 1은 동애등에 유충의 장내 미생물 메타게놈의 분리 과정에 관한 것이다.
도 2는 동애등에 유충의 장내 미생물 유래 13-B13 분리 과정에 관한 것이다(CMC배지에서 키운 후 Congo red로 염색한 뒤, 노란색 환을 보이는 균을 선별함. (좌) 염색 전, (우) 염색 후).
도 3은 신종 셀룰라아제 CS10의 전체 핵산서열에 관한 것이다.
도 4는 신규 셀룰라아제 CS10의 단백질 도메인 검색에 관한 것이다.
도 5는 신종 셀룰라아제 CS10의 Phylogenetic 계통분석도에 관한 것이다.
도 6은 신종 셀룰라아제 CS10의 대장균 발현 정제에 관한 것이다(M, Size marker; B, Induction 전; A, Induction 후; S, Soluble fraction; P, CS10 Purified protein).
도 7은 신종 셀룰라아제 CS10의 최적 활성온도 측정 그래프에 관한 것이다.
도 8은 신종 셀룰라아제 CS10의 최적 활성 pH 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 9는 신종 셀룰라아제 CS10의 pH 안정성을 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 10 은 신종 셀룰라아제 CS10의 온도변화에 따른 안정성을 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 11 은 신종 셀룰라아제 CS10의 기질 특이적 활성을 확인한 값에 대한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 폴리펩티드 및 유전자는 동애등에(Hermetia illucens)에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 동애등에 장내에 존재하는 난배양 미생물로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 동애등에 유래의 유전자 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 핵산서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 핵산서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 핵산서열로 이루어진 유전자 또는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 유전자는 서열번호 2의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 보유하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자는 동애등에 유충 장내 미생물로 유래된 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산으로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 CS10(수탁번호 KACC95110P)이 삽입된 형질전환 벡터는 pET21a 벡터이나, 발명의 형질전환 벡터는 이에 한정되지 않으며, 바람직한 예는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따른 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 형질전환체는 당업계에 공지된 어떠한 형질전화체도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 형질전환체로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 형질전환체 내로 운반하는 방법은, 형질전환체가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 형질전환체 내로 주입할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1: 동애등에 유충 장내 미생물 메타게놈 유전자은행 구축>

도 1에서와 같이 동애등에 유충을 핀으로 고정하여 전체 장을 핀셋으로 적출하여 멸균된 해부칼로 몸통에서 분리하였다. 분리한 장 조직은 이를 용기에 모은 뒤, bacterial DNA isolation kit (MoBio Laboratories, USA)을 사용하여 장내 미생물 전체 메타게놈을 분리하였다. 분리된 유충 메타게놈은 crude DNA에 섞어있는 장내 불순물을 제거하기 위하여 전기영동용 loading buffer(60% glycerol, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol)을 넣어 혼합하고 0.8% low melting agarose gel(0.5×TBE: 45 mM Tris base, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA)에 DNA시료를 넣은후 PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)의 CHEF III system(BioRad, USA)을 이용하여 6 V/cm로 14시간 동안 전기영동 하였다. 35kb이상의 DNA를 포함하는 agarose block만을 자른 다음 agarase효소를 넣어 1시간 동안 반응시킨 후 70℃에서 10분간 agarase를 비활성화 시켰으며, 이 반응액에 2.5배의 에탄올을 첨가하여 원심분리한 후 침전된 DNA pellet을 적당한 농도로 TE buffer에 용해하여 metagenomic library를 만드는데 사용하였다.

Fosmid library 제작은 정제한 DNA 25μl (5 μg)에 5 unit의 T4 polymerase와 2 unit T4 polynucleotide kinase 그리고 6 unit의 Klenow fragment (Takara Co., Japan)를 가한 후 반응액량을 50 μl로 조절한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 DNA의 말단을 평활화하여 제작하였다. 반응이 끝난 후 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1,v/v/v)을 첨가하여 섞은 다음 10분간 원심분리하고 상등액을 모아서 동량의 chloroform/isoamylalchohol (24:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 후에 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하고 2.5배의 100% ethanol을 넣어 1시간 동안 상온에서 방치한 다음 원심분리하여 상등액은 버리고 70% ethanol로 DNA를 세척하여 DNA를 준비하였다. EpiFOS5 fosmid vector (Epicentre, USA)에 end-repaired DNA를 첨가하여 16℃에서 16시간 ligation 반응시켰다. In vitro packaging을 위해 16℃에서 16시간 반응한 시료들을 70℃에서 10분간 열처리하여 ligase 효소를 불활성화시켰다. Ligation한 반응액 7.5μl에 MAX lambda packaging extracts kit (Epicentre, USA)의 extract 25μl를 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 90분간 반응시켰다. 여기에 다시 phage extracts 25μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켜 in vitro packaging을 수행하였다. SM 완충용액을 1 ml 첨가하여 위아래로 잘 섞어 준 다음 여기에 25μl의 chloroform을 넣어 다시 packaging 되지 않은 물질들을 불활성화 시켰다. 원심분리를 조심스럽게 하여 정치한 다음 4℃에 보관하였고 상등액을 대장균 Epi100균에 감염시켜 총 92,000여 개별 형질전환된 균주로 구성된 메타게놈 유전자은행을 완성하였다(도 1).

< 실시예 2: 셀룰로오스 분해 셀룰라아제 유전자 스크리닝>

셀룰로오스를 분해하는 메타게놈 클론을 검정을 위하여 0.1% NaCl, 0.1% Bacto-tryptone, 0.05% Bacto-yeast extract가 함유된 기초배지에 1% Carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma Co. USA)과 항생제 chloramphenicol (20μg/ml)을 첨가한 평판 배지에 replica pin을 이용하여 각 개별 메타게놈 균주를 접종 후 28℃에서 5일간 배양하였다. 배양이 종료된 평판배지를 Congo Red 염색시약을 이용하여 상온에서 5분간 충분히 염색한 뒤, 멸균수로 세척하여 균체 주위에 노란색의 환이 형성되는 것의 유무로 셀룰로오스 분해 효소 생산능력을 검정하였다. 이후 메타게놈 클론의 오염이나 대장균 숙주에 의한 위양성(false-positive)을 확인하기 위하여, 일차 스크리닝을 통하여 선발된 메타게놈에서 분리한 fosmid를 대장균 숙주 DH5α 균주에 다시 형질전환(transformation) 시켜 동일한 스크리닝을 통하여 반복적으로 노란색의 환이 형성되는 것을 확인하였으며, 분리한 fosmid를 HydroShear(DigiLab, USA)를 사용하여 평균 4kb 단편으로 절단하고 전체 절편을 실시 예 1에서 표기한 바와 같이 DNA 말단을 평활화하여 pUC118/EcoRV/CIP 처리한 벡터에 클로닝하여 대장균 DH5α에 electroporation하여 shot-gun subclone library를 제작하였다. 이를 사용하여 앞의 CMC 배지에 반복적으로 도말하며 강한 분해 능력을 보이는 클론을 최종적으로 양성 균으로 선발하고 “13-B13”로 명명하였다(도 2).

< 실시예 3: 신규 셀룰라아제 유전자 염기서열>

실시예 2에서 선발된 셀룰로오스(CMC) 분해 능력이 우수한 13-B13 균에서 분리한 플라스미드는 ABI3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 전체 염기서열 3,826bp을 대상으로 ORF 분석을 한 결과, 176~1,168bp 부위와 1,173~2,945bp의 두 개 ORF 부분이 각 331과 591 아미노산을 합성하는 단백질 유전자로 추정하였다. 각 ORF를 컴퓨터 상에서 가상의 단백질로 변환한 뒤 이들 ORF 아미노산 서열을 GenBank에 BlasP 검색을 수행한 결과 (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), 331개 아미노산 서열만이 사람 장내 혐기성 미생물 Dysgonomonas mossii에서 유래한 미지의 유전자(hypothetical protein)와 유의성을 가진 것으로 나타났다 (Identity 72%, Homology 81%, E=1e-131). 이로부터 합성되는 단백질의 분자량은 38kDa이고, pI값이 5.6인 성질을 가진 것으로 추정하고 유전자와 해당 단백질을 “CS10(수탁번호 KACC95110P)”으로 명명하였다 (도 3).

< 실시예 4: 신규 셀룰라아제 유전자 구성과 도메인 특성>

상기 실시예 3에서 추정되는 ORF 아미노산 서열을 GenBank에 BlastP 검색을 수행한 결과 (www.ncbi.nlm.nih/Blast), CS10과 가장 유사성이 높은 단백질은 그램 음성의 coccobacillus 계열인 혐기성 Dysgonomonas mossii 세균의 ‘hypothetical protein’과 아미노산 identity 72%, homology 81%, E=1e-131의 유사성을 가진 것으로 검색되었다. 그 다음으로 CS10과 유사한 유전자는 Bacteroides cellulosilyticus 유래 셀룰라아제로 57% identity, 73% homology, E=2e-109를 보여 주었다. 기존에 알려져 있는 단백질 아미노산들과 서열 유사성이 매우 낮고, 또한 Dysgonomonas mossii의 reference 단백질 아미노산 염기서열도 기능분석이 이루어지지 않은 것으로 보아 CS10 단백질은 새로운 유전자에서 발현되는 신규 단백질일 가능성이 매우 높다고 할 수 있다. 반면 더 낮은 identity를 가진 경우에는 모두 미생물 유래 셀룰라아제와의 homology 유의성이 높은 (E≤1e-10)것으로 나타났다. 또한 CS10 단백질의 경우 폭넓은 부위에서 하나의 셀룰라아제 도메인이 매우 높은 확실성(E=1.08e-15)을 가지고 검출되었다(도 4).

셀룰라아제 CS10 단백질의 이종발현을 위하여 ORF 증폭용 PCR primer를 합성하였다. BamHI 제한효소 작용 서열을 가진 Forward primer 5'-CGGGATCCA- TGAAAAAGATTTCTATATACC-3' (BamHI 위치 밑줄)와 HindIII 제한효소 작용 염기 서열을 가진 Reverse primer 5'-CCAAGCTTTTTGTTTTCTTTCTGCAATG -3' (HindIII 위치 밑줄)를 사용하여 PCR 증폭한 뒤 BamHI/HindIII double-digestion한 산물을 PCR purification kit (Qiagen, USA)로 정제하였다. 이 산물을 대장균 발현 벡터 pET21a (Novagen, USA)를 BamHI/HindIII double-digestion한 뒤 클로닝 하였다. 클로닝된 재조합 플라스미드는 추가적인 염기서열 결정으로 reading frame을 확인하고, 이를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하였고, 형질전환된 BL21(DE3)을 IPTG로 induction 시켜 CS10 ORF를 단백질로 발현시켰다. CS10 ORF가 발현된 재조합 대장균은 도 2에서 보인 바와 같이 CMC 배지에 접종 시 앞에서 검출한 것과 동일한 셀룰로오스분해 능력을 보여주었다.

< 실시예 5: 신규 셀룰라아제 CS10 유전자의 계통분석>

상기 실시예 4에서 확인된 ORF 단백질 아미노산을 사용하여 셀룰라아제와의 종간 유사성을 계통분석으로 조사하였다. Mega5 program (www.megasoftware.net)을 사용하여, BlastP 검색으로 가장 Homology가 높은 19개 셀룰라아제 단백질 아미노산 서열을 선택하여 CS10 ORF와 multiple-amino acid-alignment를 수행하고 그 결과를 바탕으로 계통분석을 수행하였다. Clustal-W 알고리즘으로 multiple-alignment 한 뒤, Neighbor-Joining 알고리즘을 사용하였고 Bootstrap parameter는 500 replication, Random seed 44087을 사용하였다 (Bootstrap value ≥75). 분석에 사용된 각 셀룰라아제는 유래한 균과 GenBank ID를 보였다. 그 결과, CS10 ORF는 셀룰라아제 도메인을 가진 알려진 균들과 달리 계통상 새로운 것으로 보이나, 주로 장내 혐기성 세균인 Bacteroides sp.와 클러스터를 형성하는 것을 알 수 있었다. 따라서 CS10 ORF가 coding 하는 단백질은 셀룰로오스 분해 능력을 가진 유충 장내 미생물 가운데 미지의 그람-음성균에서 유래한 새로운 셀룰라아제를 만드는 유전자로 판단하였다(도 5).

< 실시예 6: 신규 셀룰라아제 CS10 단백질의 활성분석>

실시예 4에서 발명한 신규 CS10 유전자의 대장균 발현 균주를 이용하여 단백질 발현을 실시하였다. 이 단백질을 분리정제 하기 위하여 CS10으로 형질 전환된 대장균의 50mL 배양액을 원심분리를 통해 세포만을 수득하였고, 이를 10ml lysis buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 10mM Imidazole)에 재현탁한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄 하였다. 파쇄한 세포를 15,000rpm에서 15분간 원심 분리한 뒤 상층액을 수득하여, 셀룰라아제 분리에 필요한 조효소액으로 이용하였다. 상기의 방법으로 확보한 조효소액에서 CS10 단백질은 아미노산 C-terminal에 임의로 붙여준 6XHis-Tag을 사용하여 Ni-NTA resin (Qiagen U.S.A) 과 섞어 주어 column에 packing 하였다. 조효소의 resin에 결합 후, 10 volume의 washing buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 20mM Imidazole)로 씻어 준 다음 CS10 단백질을 5 volume의 elutioin buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH8.0), 300mM NaCl, 250mM Imidazole)로 통상의 알려진 방법으로 순수 분리하였다 (Qiagen U.S.A). 단백질의 농축과 imidazole dialysis는 분자량 10kDa 이상을 농축할 수 있는 YM10 membrane(Amicon Ultra, Millipore Co.)을 이용한 한회여과를 통하여 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질의 상태를 점검하였다. 그 결과, 발현된 단백질의 크기가 C-terminal 6XHis-Tag을 포함한 예상한 38kDa 인 것을 확인할 수 있었다(도 6).

정제된 셀룰라아제에 대한 특성을 확인하고자 순수도가 높게 나타난 분획을 이용하여 실험을 수행하였다. 최적 활성을 나타내는 온도를 측정하기 위해 Na-acetate 완충액(50mM, pH6.0, 100μl)하에서 1시간 동안 CMC(1%, w/v)의 분해능력을 측정하였다. 그 결과 CS10은 매우 광범위한 온도 범위에서 안정된 활성이 유지되는 것을 알 수 있었다. 최고의 활성은 50℃에서 나타내었으며, 30℃에서는 약 80%의 활성을 보였고 70℃의 고온에서도 약 40%의 잔유 활성이 나타났다. 이는 낮은 온도 환경에서도 CS10의 활성을 산업적으로 이용할 수 있다는 점을 보여준다(도 7).

최적 활성 pH를 확인하기 위해 각각 Na-acetate(pH3.5~6.0), Na-phosphate(pH6.0~7.5), Tris 완충액(pH7.5~9.0)을 이용하여 pH3.5와 pH9.0 사이의 CMC 분해 활성을 1시간 동안 측정하였다. 그 결과, CS10 단백질은 pH6.0의 약한 산성에서 최적의 활성을 나타내었다 (도 8).

CS10 단백질의 pH 안정성을 측정하기 위해 상기 각각 서로 다른 pH 하에서 단백질을 4℃에서 15시간 동안 방치한 뒤, CMC 분해 능력을 확인하였다. 그 결과 CS10 단백질은 pH 5.5~8 부위에서 안정된 특성을 보여주었다 (도 9).

반면 CS10 단백질은 저온에서 안정된 특성을 보였는데, 최적온도 50°C 보다 높은 경우 효소활성이 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 예를 들어, 50°C 에서는 1시간 동안 방치하여도 활성 감소가 없었으나, 53°C 에서는 1시간의 처리로 약 50% 정도의 활성 감소가 발생하였고 55 °C에서는 30분간의 처리로 활성이 소실되었다 (도 10).

CS10의 기질에 따른 활성을 확인해보면 CS10은 단위 양 barley glucan과 CMC에 대하여 매우 높은 분해능력을 가진 β-1,4-glucanase의 특징을 가지고 있으나, microcrystalline cellulose인 Avicel을 분해하지 못하므로 endo-glucanase로 분류할 수 있다. 따라서 CS10은 endo-1,4-glucanase 기능을 가진 셀룰라아제라고 할 수 있다 (도 11).

농업생명공학연구원 KACC95110 20111010

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
2. 제 1항의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자.
3. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 동애등에 유래인 유전자.
4. 제 3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 유전자.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 유전자를 보유하는 벡터.
6. 제 5항의 백터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제 6항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.

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