KR102084065B1

KR102084065B1 - 써모토가 마리티마 유래의 내열성 재조합 셀룰라아제 b 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102084065B1
Application number: KR1020180086172A
Authority: KR
Inventors: 김정호
Original assignee: 서원대학교산학협력단
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2020-03-03
Also published as: KR20200011288A

Abstract

본 발명은 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 내열성 셀룰라아제의 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 히스티딘 태그 및; 시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 셀룰라아제 B 단백질과 이를 코딩하는 유전자를 개시한다. 본 발명의 재조합 셀룰라아제 B 단백질은 최적활성을 갖는 pH 및 온도가 셀룰로오스 분해에 더욱 유리하도록 개량된 내열성 셀룰라아제 B 단백질로, 대량의 셀룰로오스를 분해하여 이용하는 식품, 섬유, 종이 가공업 등 많은 산업에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

써모토가 마리티마 유래의 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질 및 이의 용도{THERMOSTABLE RECOMBINANT CELLULASE B PROTEIN DERIVED FROM THERMOTOGA MARITIMA AND THE USES THEREOF}

본 발명은 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 내열성 셀룰라아제의 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 히스티딘 태그 및 시그널 펩타이드를 제거한 써모토가 마리티마 유래의 셀룰라아제 B를 포함하는, 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

셀룰로오스(cellulose)는 D-글루코피라노오스(glucopyranose)가 β-1,4 글라이코시딕 결합에 의해 연결되어 있는 다당류로, 식물 세포막의 주성분이며 자연계에 가장 많이 존재하는 유기물이다. 셀룰로오스를 분해하는 효소들을 통칭하여 셀룰라아제(cellulase)라고 하는데, 셀룰라아제는 동물사료, 섬유, 펄프 및 종이의 제조, 농축산폐기물의 분해, 과일 및 채소의 가공, 가정 및 산업용 세제 등 다양한 분야에서 이용되며 상업성 중요성을 가진다. 사람은 셀룰로오스를 분해하는 효소를 가지고 있지 않아서 소화시키지 못하지만 초식동물은 소화기관에 공생하는 미생물들에 의해 셀룰로오스를 소화시킬 수 있으며, 다양한 셀룰라아제가 세균, 곰팡이 등 많은 미생물로부터 분리된 바 있다.

써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)는 최적 생장온도가 80℃이고 90℃까지 생존이 가능하며, 현재까지 확인된 미생물 중 가장 내열성이 높은 것으로 알려져 있다. 써모토가 마리티마는 자일란, 녹말, 셀룰로오스 등 많은 종류의 다당류 물질을 분해할 수 있어, 이로부터 산업적으로 매우 유용한 내열성 효소들을 분리할 수 있다. 써모토가 마리티마의 전체 게놈 염기서열이 이미 밝혀져 있으며 내열성 셀룰라아제 B 효소의 유전자로 추정되는 유전자(GeneBank Z69341.1 1877-2701)도 확인되었다. 효소 활성에 대한 연구 역시 진행되어, 셀룰라아제 B 효소는 최적활성을 가지는 pH가 7 부근이며, 온도가 85 내지 90℃인 것으로 보고되었다.

산업적 이용을 위한 대량생산에 있어 반응속도의 개선은 중요한 의미를 가진다. 이는 소규모 반응에서는 적은 수준의 개선이라도 대규모 공정에서 결과적으로 나타나는 효과가 크기 때문이다. 셀룰로오스의 분해, 즉 O-글라이코시딕 결합을 끊는 반응은 온도와 pH에 따라 그 속도가 달라지게 되는데, 특히 온도가 높아질수록, 그리고 pH가 낮아질수록 반응이 더 쉽게 일어나게 된다. 따라서 이러한 과정을 촉매할 수 있는 효소를 추가하여 반응 속도를 높이되 상기 효소가 더 높은 온도 및 낮은 pH에서 활성을 가진다면 셀룰로오스를 좀더 효율적으로 분해할 수 있을 것이며, 이러한 변화는 셀룰로오스의 분해 산물을 산업적으로 이용하는 데 있어 중요한 의미를 가질 수 있다.

본 발명은 전술한 요구를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 내열성이 가장 높은 것으로 알려져 있는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 셀룰라아제 B를 개량하여, 내열성이 강화되고 최적 pH가 낮아져 셀룰로오스를 좀더 효율적으로 분해할 수 있는 재조합 셀룰라아제 B 단백질을 제공한다.

또한 본 발명의 일 실시예는 상기 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질은 히스티딘 태그 및; 시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 셀룰라아제 B;를 포함한다.

여기서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 단백질은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 단백질은 효소활성을 갖는 최적 pH가 4.5 내지 5.0이고, 최적 온도가 90 내지 100℃이며, 100℃에서 180분 처리 후에도 효소활성을 80% 이상 유지하는 내열성을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 유전자는 상기 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질을 코딩한다.

여기서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 히스티딘 태그 및; 시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마 유래의 셀룰라아제 B를 포함하는 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질은 더 높아진 온도 및 낮아진 pH에서 최적의 셀룰라아제 B 활성을 가질 수 있으며, 이러한 성질은 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하면 상기 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질을 대량생산할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 실시예1에 따라 재조합된 유전자로부터 코딩된 셀룰라아제 B 단백질(재조합 TmCelB)의 아미노산 서열.
도 2는 실시예1에 따른 내열성 재조합 TmCelB를 코딩하는 유전자의 핵산 서열.
도 3은 대장균에서 재조합 TmCelB의 발현을 10% SDS-PAGE로 분석한 결과(레인 M: 분자량 마커, 레인 1: pRSET 플라스미드로 형질전환된 대장균의 총 추출액, 레인 2: pRBTmCelB 플라스미드로 형질전환된 대장균의 총 추출액, 레인 3: pRBTmCelB로 형질전환된 대장균 추출물의 가용 분획물, 레인 4: 정제된 재조합 TmCelB).
도 4는 각 온도(A) 및 pH 범위(B)에서의 재조합 TmCelB 효소 활성 측정 결과.
도 5은 100℃에서 유지된 시간별 재조합 TmCelB의 활성 측정 결과.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위에 의해 정의될 뿐이다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 ‘포함’한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 측면에 따른 내열성 재조합 셀룰라아제 B(재조합 Thermotoga maritima cellulase B, 이하 재조합 TmCelB) 단백질은 히스티딘 태그 및; 시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 셀룰라아제 B;를 포함한다.

여기서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 단백질은 써모토가 마리티마로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 셀룰로오스 분해 활성을 의미한다.

상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 된 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 서열번호 1의 아미노산 서열로 된 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파지(λ)의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

상기 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균 JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X 1776, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

상기 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

상기 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci.,87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

전술한 재조합 TmCelB 단백질을 생산하는 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 생산 방법에서는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

상기 단백질은 효소활성을 갖는 최적 pH가 4.0 내지 6.0이고, 최적 온도가 85 내지 105℃이며, 100℃에서 180분 처리 후에도 효소활성을 70% 이상 유지하는 내열성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 좀더 바람직하게 상기 단백질은 효소활성을 갖는 최적 pH가 4.2 내지 5.5이고, 최적 온도가 87 내지 103℃이며, 100℃에서 180분 처리 후에도 효소활성을 75% 이상 유지하는 내열성을 가질 수 있으며, 상기 단백질은 효소활성을 갖는 최적 pH가 4.5 내지 5.0이고, 최적 온도가 90 내지 100℃이며, 100℃에서 180분 처리 후에도 효소활성을 80% 이상 유지하는 내열성을 가질 수 있다.

여기서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열의 상동체를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 유전자는 전술한 재조합 TmCelB 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예1. 재조합 TmCelB의 발현 벡터의 제조

내열성 셀룰라아제 효소의 유전자로 추정되는 유전자(GeneBank Z69341.1 1877-2701)는 Thermotoga neapolitana에서 셀룰라아제B와 높은 서열 유사성(94.5%)을 가지는 것에 기초하여 써모토가 마리티마 게놈에서 선발하였다.(Applied and Environmental Microbiology (1998) Vol. 64, p.4774-4781). 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)에서 내열성의 셀룰라아제 B(TmCelB)를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해, GenBank 등록 서열 분석에 따라 설계된 TmCelB 특이 프라이머를 사용하였다. 유전자 클로닝 및 벡터 제작을 위해서는 ATCC로부터 구입한 써모토가 마리티마 DNA 및 대장균 Top 10을 사용하였다. 제한효소와 DNA 변형 효소는 프로메가에서 구입하여 이용하였고, 그 외 다른 시약과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)는 시그마사에서 구입하였다.

내열성 셀룰라아제 효소의 유전자로 추정되는 유전자의 ORF(open reading frame)는 분자량이 35kDa인 274개의 아미노산 잔기를 코딩하며, 825bp의 크기이다. 이 중 N-말단의 17개 아미노산은 시그널 펩타이드로 추정되고, 이를 제외한 257개의 아미노산 잔기로 구성된 단백질이 세포 내에서 셀룰라아제 B 효소로 작용할 것으로 예상되어, 시그널 펩타이드를 제외한 셀룰라아제 B 유전자(774bp)를 PCR로 증폭시키고자 하였다.

PCR을 통해 증폭된 시그널 펩타이드를 제외한 셀룰라아제 B 유전자는 pRSET-B 대장균 발현 벡터에 삽입하여 6XHis 태그가 5’에 in-frame으로 연결되도록 한 후(재조합 벡터는 이하 pRBTmCelB로 칭함) 대장균 BL21에서 발현시켰다. 이때, TmCelB-특이 프라이머는 5'-AAA TTT GAA TTC TCC GAG GTG GTT CTC ACG-3'(서열번호 3)과 5'-AAA TTT GAA TTC TTA TTT TAC AAC TTC GAC AGA-3'(서열번호 4)를 이용하였고, 얻어진 PCR 산물을 제한효소 EcoRI으로 절단하고, pRSET-B 벡터에 클로닝하였다. PCR 반응물은 2.5U Taq DNA 폴리머라제, 1mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTPS, 100ng 주형 DNA, 각각 프라이머 100pmole을 포함해 50㎕로 제조하여, 94℃에서 3분, 94℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 2분을 30회, 마지막 연장반응을 72℃에서 5분동안 수행하였다.

실시예 2. 재조합 TmCelB의 발현 및 정제

pRBTmCelB 벡터를 37℃에서 대장균 BL21에 형질전환하였고, 4시간 동안 0.7mM IPTG를 첨가하여 반응시킨 후, 얻어진 세포 펠렛은 4㎖ 용해버퍼(50mM NaH₂PO₄(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM 이미다졸)를 첨가하고 얼음물에서 4분 동안 초음파분해(sonication)하였다. 재조합 TmCelB를 포함하는 조추출물은 Ni²⁺-NTA-아가로스 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였고, 250mM 이미다졸 용액의 농도 구배로 용출하였다.

실시예 1. TmCelB 단백질 분석

효소 활성과 재조합 TmCelB의 생화학적 특성을 분석하기 위해 대장균 BL21에서 과발현시킨 후 불연속 SDS-PAGE를 통해 분석했다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 재조합 TmCelB는 대장균 BL21에서 과발현되었고, 6개의 히스티딘 태그를 함유한 재조합 TmCelB의 분자량은 약 30kDa로 확인되었다. 이 값은 유추된 아미노산으로부터 계산된 값과 같음을 알 수 있었다. 재조합 TmCelB 활성은 300㎕ 최종 부피로 50mM McIlvaine 버퍼(pH 5.0)로 정제 후 분석하였는데, 90℃에서 30분 동안 배양 후에 반응하는 동안 방출된 환원당의 양은 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 방법에 의해 측정하였다. 재조합 TmCelB의 셀룰라아제 활성은 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CM-cellulose)와 정제된 재조합 TmCelB 2㎕를 섞은 반응액에서 분석한 결과, 재조합 TmCelB는 셀룰로오스 분해 활성이 있는 것으로 분석되었다.

실시예 2. 재조합 TmCelB의 생화학적 특성 분석

재조합 TmCelB의 활성의 최적 pH는 4.0에서 6.0의 pH값을 가지는 100mM McIlvaine 버퍼, 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.8~8.0)로 연속적으로 구하였다. 최적의 재조합 TmCelB 활성 온도는 80~100℃의 항온수조에서 연속적으로 구하였다. 재조합 TmCelB이 효소 활성을 가지는 온도 범위는 80~100℃, pH 범위는 pH 4.0~6.0으로 측정되었다(도 4). 특히, 재조합 TmCelB는 도 4A와 같이 약 95℃ 부근에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었고, 95℃에서 최대 활성을 80% 이상 유지하는 것을 확인하였다. 또한, 재조합 TmCelB는 약 pH 4.5~5.0에서 최대 활성을 나타내었고, pH 4.0~6.0 범위에서 최대 활성을 60% 이상 유지하였다(도 4B). 기존에 알려진 야생형 TmCelB가 최대 활성을 나타내는 조건은 pH 7 및 85-90℃로, 본 발명의 재조합 TmCelB는 최적 pH는 낮은 범위로, 최적 온도는 높은 범위를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 재조합 TmCelB의 내열성 분석

내열성 결정을 위해 재조합 TmCelB를 80, 85, 90, 95 및 100℃에서 배양하였다. 효소는 180분 동안 매 30분마다 추출하여 잔류활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 TmCelB는 100℃에서 180분 후에도 효소활성을 80% 이상 유지하였다(도5).

<110> SEOWON UNIVERSITY INSTITUTE OF INDUSTRY-ACADEMY COLLABORATION <120> THERMOSTABLE RECOMBINANT CELLULASE B PROTEIN DERIVED FROM THERMOTOGA MARITIMA AND THE USES THEREOF <130> P20180189KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermostable recombinant cellulase B derived from Thermotoga maritima <400> 1 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Ser Ser Arg Ser Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Ser Glu Val Val 35 40 45 Leu Thr Ser Val Gly Ala Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly Phe Pro Val 50 55 60 Thr Met Glu Leu Asn Phe Trp Asn Val Lys Ser Tyr Glu Gly Glu Thr 65 70 75 80 Trp Leu Lys Phe Asp Gly Glu Lys Val Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Tyr 85 90 95 Asn Ile Val Leu Gln Asn Pro Asp Ser Trp Val His Gly Tyr Pro Glu 100 105 110 Ile Tyr Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Gly His Asn Ser Gly Val Glu 115 120 125 Phe Leu Pro Val Lys Val Lys Asp Leu Pro Asp Phe Tyr Val Thr Leu 130 135 140 Asp Tyr Ser Ile Trp Tyr Glu Asn Asn Leu Pro Ile Asn Leu Ala Met 145 150 155 160 Glu Thr Trp Ile Thr Arg Ser Pro Asp Gln Thr Ser Val Ser Ser Gly 165 170 175 Asp Ala Glu Ile Met Val Trp Phe Tyr Asn Asn Val Leu Met Pro Gly 180 185 190 Gly Gln Lys Val Asp Glu Phe Thr Thr Thr Val Glu Ile Asn Gly Val 195 200 205 Lys Gln Glu Thr Lys Trp Asp Val Tyr Phe Ala Pro Trp Gly Trp Asp 210 215 220 Tyr Leu Ala Phe Arg Leu Thr Thr Pro Met Lys Glu Gly Lys Val Lys 225 230 235 240 Ile Asn Val Lys Asp Phe Val Gln Lys Ala Ala Glu Val Val Lys Lys 245 250 255 His Ser Thr Arg Ile Asp Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Phe Cys Val Trp 260 265 270 Glu Ile Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Asn Thr Thr Ala Ala Lys Phe 275 280 285 Gly Trp Thr Phe Arg Asp Phe Ser Val Glu Val Val Lys 290 295 300 <210> 2 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF of Thermostable recombinant cellulase B derived from Thermotoga maritima <400> 2 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60 atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccga gctcgagatc tgcagctggt 120 accatggaat tctccgaggt ggttctcacg agcgttggtg caacggacat ttccttcaac 180 ggatttccag tcaccatgga actcaacttc tggaacgtga aatcctatga aggagaaacg 240 tggctcaaat ttgatggaga aaaggttgag ttctatgcgg atttgtacaa catcgttctt 300 cagaatccag acagctgggt gcatggatat ccagagatct actacggtta caagccctgg 360 gcggggcaca acagcggtgt tgaatttctt cctgtgaagg tgaaagatct tccggatttc 420 tacgtgactc ttgattactc gatctggtac gaaaacaacc tgcctatcaa ccttgccatg 480 gagacgtgga tcacgagaag tcccgaccag acctctgttt cttcgggtga cgcggagatc 540 atggtttggt tctacaacaa cgttctgatg cccggcggtc agaaagtgga cgagttcact 600 acaacagtcg agataaacgg cgtgaagcag gaaacaaagt gggatgttta ctttgcaccg 660 tggggatggg attaccttgc tttcagactg acaacaccga tgaaagaagg aaaggtgaaa 720 atcaacgtga aggacttcgt tcagaaagcc gcggaagttg tcaagaagca ctcaacgaga 780 atagacaatt tcgaagagct gtatttctgc gtctgggaga tcggaacgga gtttggagat 840 ccgaacacaa cagcggcgaa attcggctgg actttcaggg acttctctgt cgaagttgta 900 aaataa 906 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer used for PCR of cellulase B enzyme domain from Thermotoga maritima <400> 3 aaatttgaat tctccgaggt ggttctcacg 30 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer used for PCR of cellulase B enzyme domain from Thermotoga maritima <400> 4 aaatttgaat tcttatttta caacttcgac aga 33

Claims

히스티딘 태그 및;
시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 셀룰라아제 B;
를 포함하는 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질로서,
상기 히스티딘 태그는 상기 시그널 펩타이드가 제거된 써모토가 마리티마 유래의 셀룰라아제 B의 N말단 방향에 위치하고
상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산되고, 효소활성을 갖는 최적 pH가 4.5 내지 5.0이며, 최적 온도가 90 내지 100℃이고, 100℃에서 180분 처리 후에도 효소활성을 80% 이상 유지하는 내열성을 갖는 것을 특징으로 하는, 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질.
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제1항에 따른 내열성 재조합 셀룰라아제 B 단백질을 코딩하는 유전자로서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 내열성 재조합 셀룰라아제 B를 코딩하는 유전자.
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