KR101721396B1 - 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 - Google Patents

향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 분자 모델링 기법을 기반으로 호열균의 일종인 Thermotoga neapolitana DSM 5068 유래의 L-아라비노스 이성화효소 변이체(L-arabinose isomerase variant) 개발에 관한 것이다. 또한, 상기 효소 또는 이를 발현하는 코리네형 미생물을 이용하여 D-갈락토스로부터 D-타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

향상된 전환 활성을 가지는 L-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 D-타가토스의 생산 방법{L-ARABINOSE ISOMERASE VARIANTS WITH IMPROVED CONVERSION ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCTION OF D-TAGATOSE USING THEM}
본 발명은 단백질 공학기술(protein engineering)을 적용하여, D-갈락토스에 대하여 향상된 전환활성을 갖는 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 L-아라비노스 이성화효소 변이체, 이를 발현하는 미생물 및 이들을 이용하여 D-갈락토스로부터 D-타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
D-타가토스는 저열량, 비충치성 등의 특징을 가지면서도 설탕의 90% 정도의 단맛을 내는 단당으로서, 기존 감미료로부터 유발되는 각종 성인병의 문제로부터 자유로운 건강 감미료로서 사용될 수 있다.
D-타가토스는 이러한 특성으로 인해 설탕 대체 감미료로서 관심을 받고 있으며, 식품시장에서 시장 잠재성이 큰 물질로 알려져 있다. 그러나, 타가토스는 자연계에 흔하게 존재하는 것이 아니라 유제품 또는 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당이므로, 저칼로리의 기능성 감미료로 사용되기 위해서는 대량 생산할 수 있는 기술이 개발되어야 한다.
D-타가토스는 2003년 알라 푸드(Arla Foods)사에 의하여 D-갈락토스(D-galactose)로부터 Ca(OH)2를 촉매로 한 화학적 이성화법으로 생산되어 '가이오-타가토스(Gaio-tagatose)'라는 상품명으로 출시되었다. 그러나, 화학적 이성화법은 이성화 전환 수율 면에서는 우수하나, 회수 및 정제가 어렵고 공정이 복잡하여 공정 전체 수율을 감안할 경우 오히려 효소적 이성화법에 비하여 수율이 감소한다고 알려져 있다.
L-아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase; EC 5.3.1.5)는 L-아라비노스를 L-리불로스(L-ribulose)로 전환하는 이성화 반응을 촉진하는 효소이다. 또한, L-아라비노스 이성화효소는 본래 기질인 L-아라비노스 뿐만 아니라 이와 구조적으로 유사한 기질인 D-갈락토스도 이성화하여 D-타가토스(D-tagatose)로 전환한다는 사실이 알려져 있다.
L-아라비노스 이성화효소를 이용하여 D-갈락토스로부터 D-타가토스를 생산하는 공정에서 생산성 향상에 기여할 수 있는 가장 중요한 요소는 이성화효소의 개량을 통해 반응성이 좋고, 생산공정에 성공적으로 적용될 수 있는 효소를 개발하는 것이다. 생산성 향상은 원가절감에 따른 이윤의 극대화와 사업의 성패에 결정적인 역할을 하기 때문에, 아라비노스 이성화효소의 지속적인 개량의 필요성이 대두되어 왔다.
고온성 미생물인 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068) 속 유래의 아라비노스 이성화효소는 열안정성은 매우 우수하지만, 글루코스 이성화효소(glucose isomerase) 수준의 경제적 생산성 확보를 위해선 더욱 개량화 될 필요가 있다.
일반적으로 효소의 활성을 증진시키거나 새로운 기질에 대한 활성을 부여하기 위하여 변이형 효소를 제조하는 방법으로는, 크게 나누어 무작위적인 변이를 일으키는 방법(random mutagenesis)과 합리적으로 설계하는 방법(rational design)이 있다. 무작위적으로 변이를 일으키는 방법은 대상이 되는 효소에 대한 특별한 정보가 없이도 적용할 수 있어 광범위하게 이용되고 있지만, 매우 많은 개체의 변이효소를 조사할 수 있는 스크리닝 (screening) 시스템이 갖추어져 있어야 한다. 반면, 합리적 설계에 의한 효소의 개량은 한정된 수의 변이 효소만을 생성하기 때문에 특별한 스크리닝 시스템은 필요하지 않지만, 대상효소의 촉매작용 메커니즘(catalytic mechanism)이나 기질의 결합특성 또는 기질 특이성의 결정요인 등에 대하여 상세히 알고 있어야 한다.
이에 본 출원인은 타가토스 생산에 잠재성을 갖는 아라비노스 이성화효소 효소가 산업적 생산성을 가질 수 있도록, 단백질 공학의 분자모델링 기술과 효소 반응 메커니즘 분석을 기반으로 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 L-아라비노스 이성화효소 (L-arabinose isomerase)의 단백질 3차원 구조를 변화시킴으로써 L-아라비노스 이성화효소의 D-갈락토스에 대한 기질 특이성을 높이고자 하였다.
본 발명의 목적은 향상된 전환활성을 가지는 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 아라비노스 이성화효소 변이체 또는 상기 형질전환된 미생물 또는 상기 형질전환된 미생물의 배양물을 이용하여 D-갈락토스로부터 D-타가토스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래 아라비노스 이성화효소의 469번째 루이신(leucine)이 프롤린(proline)으로 치환되고, 275번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine) 이외의 아미노산으로 치환된, D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 활성이 향상된 아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 아라비노스 이성화효소 변이체 또는 상기 형질전환된 미생물 또는 상기 형질전환된 미생물의 배양물을 이용하여 D-갈락토스로부터 D-타가토스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 아라비노스 이성화효소 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자 염기서열로 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 D-타가토스의 생산성을 향상시킴으로써 원가 절감 및 기반시설 투자비를 줄이는 데 유용할 것이다.
도 1은 써모토가 네아폴리타나 유래 L-아라비노스 이성화효소의 활성 부위 및 보조인자인 망간이온이 이루는 구조를 표시한 그림이다.
도 2는 L-아라비노스와 D-갈락토스가 L-아라비노스 이성화효소의 활성 부위에 결합하는 부위 및 상호작용을 하는 작용기들을 표시한 그림이다. D-갈락토스의 6번 탄소와 275번 페닐알라닌의 잔기가 서로 입체장애를 일으키는 것을 보여준다.
도 3은 L-아라비노스 이성화효소의 275번 잔기를 포화 돌연변이(saturated mutagenesis)시키고, 시스테인-카바졸법으로 선택된 변이체들의 상대적 활성을 발색반응을 통하여 비교한 결과이다. 대조군의 비해 높은 활성을 보인 변이체들이 상당수 확인되었다.
도 4는 선별된 변이체인 F275V/L469P, F275M/L469P, F275I/L469P의 구조를 분자모델링 기법으로 예측한 그림이다.
도 5는 분리 정제된 써모토가 네아폴리타나 유래 L-아라비노스 이성화효소 변이체들을 SDS-PAGE를 통해 분석한 그림이다.
도 6은 선별된 변이체들의 최적온도를 확인하기 위해 각 온도별 상대활성을 평가한 그림이다.
도 7은 선별된 변이체들의 열 안정성을 95℃에서 시간에 따라 측정한 그림이다.
도 8은 선별된 변이체들의 망간 의존성을 확인하기 위해 다양한 농도에서 상대활성을 평가한 그림이다.
일 구현에서, 본 발명은 향상된 전환활성을 가지는 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명은 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래 아라비노스 이성화효소의 275번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine) 이외의 아미노산으로 치환되고, 469번째 루이신(leucine)이 프롤린(proline)으로 치환된, D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 활성이 향상된 아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 아라비노스 이성화효소"란 D-갈락토스를 기질로 하여 이성화 반응을 촉매하여 D-타가토스를 생산하는 효소를 의미한다.
본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체는 아라비노스 이성화효소의 275번째 아미노산이 비극성 지방족 곁사슬(nonpolar aliphatic side chain)을 가지는 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다.
본원에서, 상기 "비극성 지방족 곁사슬을 가지는 아미노산"은 알라닌(Alanine), 발린(Valine), 아이소루이신(Isoleucine), 루이신(Leucine), 메치오닌(Methionine) 및 프롤린(Proline)을 의미한다.
바람직하게는, 상기 아라비노스 이성화효소의 275번째 아미노산은 발린, 메치오닌 및 아이소루이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체는 또한 이성화효소의 469번째 루이신이 프롤린으로 더 치환되는 것이 바람직하다.
본원에서, 상기 "치환"은 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하여 돌연변이를 만드는 것을 의미한다. 적당한 돌연변이 유발 방법은 이러한 목적을 위해 당업자가 이용할 수 있는 모든 방법이 될 수 있다. 특히, 포화 돌연변이 유발(saturated mutagenesis method), 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis method) 및 부위 지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis method)이 있다(Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56:967-978; Promoters selected from random DNA-sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:7405-7409; Mutants generated by the insertion of random oligonucleotides into the active-site of the beta-lactamase gene, Biochemistry 1989, 28:5703-5707).
바람직하게는, 본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체에서 275번째 아미노산은 포화 돌연변이 유발법을 이용하여 치환하고, 469번째 루이신은 부위 지정 돌연변이 유발법을 이용하여 치환한다.
일 구현에서, 본 발명은 상기 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래 야생형 아라비노스 이성화효소(서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 6의 염기서열)를 주형(template)으로 하여 무작위 효소 변이법을 통하여 일정량의 개량된 효소 특성을 보이는 변이체 및 그 유전 정보를 얻었다. 이를 종합적으로 분석한 결과, 상기 아라비노스 이성화효소의 C-말단(C-terminal) 부분의 아미노산 서열의 변화가 효소 활성 증가에 영향을 주는 경향을 보이는 것을 확인하였다.
또한, 야생형 아라비노스 이성화효소 및 아라비노스 이성화효소 변이체의 활성부위를 구성하고 있는 C-말단 부위의 아미노산을 분자모델링을 통해 확인하였다. 그 결과, 상기 변이체는 야생형 아라비노스 이성화효소의 469번째 루이신 잔기가 프롤린으로 바뀜으로써, 단백질의 18번째 베타 병풍구조(beta-sheet)가 사라지고 주쇄(backbone)의 각도가 틀어지면서 17번째 알파 나선구조(alpha-helix)의 3차 구조적 위치가 단백질 몸체(body) 쪽으로 움직여서 단백질의 구조가 변화되었음을 확인하였다.
상기와 같은 결과에 기초하여, 야생형 아라비노스 이성화효소의 469번째 루이신을 부위 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 프롤린으로 치환하여 변이체(L469P)(서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 7의 염기서열)를 제조하였다. 이 변이체들을 배양한 후 활성을 측정한 결과, 상기 변이체가 야생형 아라비노스 이성화효소에 비해 기질인 갈락토스에 대하여 높은 활성을 보임을 확인하였다.
본 발명의 일 구현에서, 아라비노스 이성화효소 변이체 (L469P)에서 전환 활성이 향상된 효소를 얻기 위하여 효소의 기질 결합부 및 활성부의 주요 잔기들을 선정하고 반응메커니즘을 추정하여 최종 선별된 275번째 아미노산을 포화 돌연변이법을 이용해 변이를 더 도입하고, 이를 스크리닝하여 전환 활성이 향상된 변이체를 선별하였다.
선별된 변이체는 서열분석을 통하여 275번째 아미노산이 각각 발린(L469P/F275V), 메치오닌(L469P/F275M), 아이소루이신(L469P/F275I)으로 치환되어 있는 것을 확인하였다. 상기 3종의 변이체들을 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환하고 이를 배양하여 이성화 반응을 수행한 결과, 세 변이체 모두 469번째 루이신이 프롤린으로 치환된 변이체 L469P에 비해 향상된 활성을 보임을 확인하였다.
상기 3종의 변이체들의 특성을 파악하기 위해, 상기 조건에서 배양된 코리네박테리움 속 미생물로부터 발현된 아라비노스 이성화효소를 분리하였다. 정제된 단백질은 D-갈락토스에 대한 아라비노스 이성화효소 활성을 보였으며, SDS PAGE 상으로 분자량 또한 일치하는 것을 확인하였다.
상기 정제된 변이체 효소들을 이용하여 최적온도, 열 안정성, 금속이온 이용성 및 효소활성을 측정하였다. 상기 세 변이체 모두 75℃에서 가장 활성이 높게 측정되었으나, 열 안정성은 다소 감소하였고, 금속이온 이용성은 크게 다르지 않았으며, 아라비노스 이성화효소 활성은 상기 변이체 L469P에 비해서 각각 약 5.5배(F275V/L469P), 5배(F275M/L469P), 3.9배(F275I/L469P) 높은 비활성도(specific activity)를 보였다.
일 구현에서, 본 발명은 상기 아라비노스 이성화효소 변이체를 암호화하는 유전자 염기서열을 제공한다.
상기 유전자 염기서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자 염기서열일 수 있다.
본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체는, 본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체의 아라비노스 이성화효소의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열에 대해서, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열을 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8 내지 10으로 기재되는 유전자 염기서열을 가진다.
본원에서, 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 프로브(probe)와 '엄격한 조건'에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 아라비노스 이성화효소 변이체를 코딩하는 변이형일 수 있다.
본원에서, 상기 용어 "엄격한 조건(stringent conditions)"이란, 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 65℃의 혼성화 완충액(3.5 > SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5　mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2mM EDTA)에서 혼성화한다("molecular Cloning", A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York). 여기에서, SSC는 pH 7의 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을 실온에서 2 > SSC로 세척하고 나서, 68℃의 온도에서 0.1 내지 0.5 > SSC/0.1 × SDS로 세척한다.
일 구현에서, 본 발명은 또한 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 이성화효소 변이체를 제공한다. 구체적으로, 상기 변이체는 275번째 아미노산이 발린, 메치오닌, 아이소루이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환되며, 동시에 469번째 아미노산이 프롤린으로 치환된 아라비노스 이성화효소 변이체를 의미한다.
그러나, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 폴리펩티드가 갖는 활성을 나타내는 효소의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 변이체는, 상기 아라비노스 이성화효소 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열의 275번째 및 469번째 아미노산을 제외한 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있다.
여기에서, "수개"란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 20개, 바람직하게는 2에서 10개, 보다 바람직하게는 2에서 5개이다.
또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 아라비노스 이성화효소 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이(variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다.
일 구현에서, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공한다.
본원에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포로 형질전환되어 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입시킬 수 있는 벡터로, 바람직하게는 대장균과 코리네형 세균에서 양방으로 자가복제가 가능한 셔틀벡터 pECCG112 벡터(Kor.Jour.Microbiol. July 1991, p149-154. 노갑수)를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 신규한 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 벡터는 상동 재조합을 일으켜서, 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있는데, 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
일 구현에서, 본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본원에서, 상기 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 발명의 미생물은 상기 이성화효소 변이체를 발현할 수 있는 한, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이고, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다.
본 발명의 바람직한 구현에서, Ｌ-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰을 서열번호 8, 9, 10의 염기서열을 갖는 벡터로 형질전환하였으며, 제작된 균주를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-TNAI-2, pFIS-1-TNAI-3, pFIS-1-TNAI-4로 명명하고, 2013년 02월 14일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 각각 수탁번호 KCCM11378P, KCCM11379P 및 KCCM11380P로 기탁하였다.일 구현에서, 본 발명은 또한 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양물을 제공한다.
상기 배양물은 상기 미생물의 균체를 포함하는 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 코리네박테리움 속 미생물의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다. 또한, 배양물의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 통상적인 방법을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 탄소원으로 원당 또는 포도당의 일부 혹은 전부가 포함된 배양 배지에 상기 미생물을 접종하여 배양할 수 있다. 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
구체적으로, 본 발명에서 사용되는 배지는 원당 혹은 포도당을 주 탄소원으로 사용하고, 원당을 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 포도당을 사용한다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함되며, 바람직하게는 펩톤을 사용한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
구체적으로, 배양의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 37 ℃이며, 배양 기간은 원하는 단백질이 발현 되는 한 계속 할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.
본 발명은 상기 D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 활성을 가지는 아라비노스 이성화효소 변이체, 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물의 배양물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 존재 하에, D-갈락토스를 포함하는 용액을 망간 이온, 마그네슘 이온 및 아연 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속이온을 제공하는 물질과 반응시켜 D-타가토스를 제조하는 단계를 포함하는, D-타가토스의 제조방법을 제공한다.
상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 배양물은 기질 유입이 가능한 상태로 만들기 위해, 원심 분리하여 수거된 균체에 계면활성제, 라이소자임, 자일렌을 처리할 수 있으며, 바람직하게 0.1% POESA를 처리할 수 있다.
본 발명의 D-갈락토스를 포함하는 용액은 정제된 D-갈락토스, 바이오매스 유래 D-갈락토스 및 유당의 가수분해를 통해 얻어진 D-갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 아라비노스 이성화효소는 금속이온을 보조인자로 사용하는 금속효소(metalloenzyme)의 하나로서, 상기 금속이온은 망간 이온, 마그네슘 이온 및 아연 이온으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않고 이성화효소와 결합하여 이성화반응을 할 수 있는 모든 금속이온이 될 수 있다. 구체적으로, 상기 망간 이온을 제공하는 물질로는 염화망간; 마그네슘 이온을 제공하는 물질로는 염화마그네슘; 및 아연 이온을 제공하는 물질로는 염화아연이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
D-타가토스 생산 반응액은 Tris 버퍼, 인산 버퍼와 같은 pH를 유지하기 위한 버퍼 시스템을 포함하며, 바람직하게는 pH6.5 내지 7.5의 Tris 버퍼를 사용한다. 염화망간, 염화마그네슘 또는 염화아연은 0.1 mM내지 10 mM, 바람직하게 1 mM 내지 5 mM을 포함한다. 기질인 D-갈락토스는 1 g/L 내지 300 g/L, 바람직하게는 18 g/L 내지 300 g/L 첨가하며, 반응온도는 60℃ 내지 95℃, 바람직하게는 70℃ 내지 80℃, 가장 바람직하게는 72℃ 내지 78℃에서 이성화반응을 유도하여 D-타가토스를 생산한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 >
실시예 1: 전환활성이 향상된 효소 제작을 위한 써모토가 네아폴리타나 유래의 아라비노스 이성화효소 단백질 모델링 및 주요 아미노산 변이 유추
써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) DSM 5068 유래 야생형 아라비노스 이성화효소는 아직 3차 구조가 아직 밝혀져 있지 않으므로, 이미 3차 구조가 밝혀져 있고, 서열 유사성이 높은 대장균 (Escherichia coli) 아라비노스 이성화효소를 주형으로 하여 단백질 분자 모델링 기법을 통해 3차 구조 예측을 실시하였다. 3차 구조 예측을 위해 비교모형(comparative modeling) 기법을 사용하였으며, 트리포스 사의 분자 모델링 패키지 내의 APM 모듈(Tripos, USA)을 사용하여 구조 모델을 얻었다.
상기 비교모형(comparative modeling) 기법은 단백질 3차 구조의 예측에 가장 많이 사용되는 방법이다. 원하는 단백질 아미노산 서열이 삼차 구조가 알려진 다른 단백질의 서열과 많이 유사한 경우에는, 상기 방법을 이용하여 원하는 단백질의 삼차 구조를 쉽게 예측할 수 있으며, 이 경우 예측 정확도는 아주 높다.
상기 대장균 유래의 아라비노스 이성화효소의 구조는 단백질 데이터 은행(protein data bank; PDB)에 2HXG.pdb로 등록되어 있는 삼량체(trimer)의 형태로 결정된 구조를 사용하였다.
모델링 결과, 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래의 야생형 아라비노스 이성화효소(아미노산 서열; 서열번호 1, 염기서열; 서열번호 6)는 상기 대장균의 아리비노스 이성화효소와 염기서열뿐만 아니라, 2, 3차 구조 또한 매우 유사한 것으로 예측되었다. 대장균의 아라비노스 이성화효소의 경우 몇몇 연구를 통해서 기질 결합부(substrate binding site), 보조인자 (cofactor)인 망간 이온 (Mn2 +) 결합부 및 이를 구성하는 주요 아미노산들에 대한 정보가 공개되어 있으며(Manjasetty & Chance, J. Mol. Biol., 2006. 360:297-309), 이를 바탕으로 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래 아라비노스 이성화효소의 주요 잔기들을 유추하였다.
주요 아미노산 잔기 분석을 위하여, 단백질 서열 분석(sequence alignment), 분자 도킹 모의실험(molecular Docking simulation), 반응 메커니즘 분석을 실시하였다. 단백질 서열 분석은 10종의 L-아라비노스 이성화효소와 써모토가 네아폴리타나 아라비노스 이성화효소의 서열 정보를 바탕으로 클러스탈W 알고리즘(clustalW algorithm)(//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 이용하여 분석하였다.
서열 분석 결과로 미루어보아, 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래 아라비노스 이성화효소는 다른 이성화 효소들과 마찬가지로 금속 결합부 및 활성부의 서열이 매우 잘 보존 되어 있었다. 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래 이성화효소는 E302(302번째 글루탐산), E329(329번째 글루탐산), H346(346번째 히스티딘), H445(445번째 히스티딘) 아미노산 잔기와 망간이온을 포함하는 활성 부위(active site)를 가지고 있으며(도 1), 상기 E302, E329, H346, H445 아미노산 잔기는 망간이온 결합에 영향을 주고 있다. 특히, E302, E329 잔기는 이성화 반응을 촉진하는 가장 중요한 요소로서 예측된다(Manjasetty & Chance, J. Mol. Biol., 2006. 360:297-309).
써모토가 네아폴리타나 유래 아라비노스 이성화효소는 상기 활성부위의 크기, 형태 및 이들을 구성하는 아미노산 잔기들의 특성에 따라 기질 선택성이 결정될 것으로 가정하였다. 본래의 기질인 L-아라비노스를 이용한 분자 도킹 모의실험(surflexDock;Tripos, USA)을 통하여, 기질 인식에 중요한 잔기들을 선정하였다. 또한, 반응 메커니즘 분석(Adrian J.Mulholland, Drug Discov. Today. 2005. 10(20):1393-402)을 통해 가장 적합한 D-갈락토스의 결합 위치를 선정하였다. 이를 바탕으로 아라비노스 이성화효소의 활성부와 D-갈락토스의 결합을 방해할 가능성이 높은 아미노산 잔기를 선별하였다.
275번 위치의 아미노산은 방향족 곁사슬을 가지며, 상대적으로 크기가 크고, 유연성(flexibility)이 떨어지는 페닐알라닌으로 이루어져있는데, 이 부분이 D-갈락토스의 6번째 탄소와 서로 입체장애 (steric hindrance)를 일으킬 것으로 예측되었다(도 2). L-아라비노스는 5탄당으로 D-갈락토스에 비해 탄소 하나가 적은 것을 제외하고는 거의 같은 구조를 보이기 때문에, 275번을 다른 종류의 아미노산으로 치환하는 것만으로도 상기 아라비노스 이성화효소의 D-갈락토스에 대한 반응성을 크게 증가시킬 수 있을 것으로 기대하였다.
페닐알라닌을 대체할 만한 아미노산으로서, 비슷한 극성을 가지면서 크기가 상대적으로 작고, 유연성이 높아 D-갈락토스의 6번 탄소와의 반발작용을 최소화하면서, 아라비노스 이성화효소의 전체 구조에 영향을 적게 줄 것으로 예상되는 발린, 메치오닌, 아이소루이신을 선정하였다.
이들은 방향족을 포함하고 있는 페닐알라닌에 비해 비극성의 지방족 사슬형태로 이루어져 있어 구조적으로 자유로우면서도 페닐알라닌의 자리를 대체할 수 있을 것으로 기대하였다.
점돌연변이 (point mutation)가 발생된 변이체(아미노산; 서열번호 3 내지 5, 핵산; 서열번호 8 내지 10)들을 다시 분자 모델링 기법으로 구조를 예측한 결과 상기의 변이들이 아라비노스 이성화효소 전체 구조에 미치는 영향은 미비한 것으로 예측되었다.
또한, 상기 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 유래 야생형 아라비노스 이성화효소를 주형(template)으로 하여 무작위 효소 변이법을 통하여 일정량의 개량된 효소 특성을 보이는 변이체 및 그 유전 정보를 얻었다. 이를 종합적으로 분석한 결과, 상기 아라비노스 이성화효소의 C-말단(C-terminal) 부분의 아미노산 서열의 변화가 효소 활성 증가에 영향을 주는 경향을 보이는 것을 확인하였다.
아라비노스 이성화 효소의 C-말단 부위의 사슬 구조가 크게 변이되는 현상을 분자 예측법을 통하여 확인한 결과, 상기 야생형 아라비노스 이성화효소의 469번째 아미노산인 루이신을 프롤린으로 치환하는 것만으로도 상기 아라비노스 이성화효소의 D-갈락토스에 대한 반응성을 크게 증가시킬 수 있을 것으로 기대하였다.
실시예 2: 설계된 아라비노스 이성화효소 변이체의 제조
(1) 469번째 아미노산인 루이신을 프롤린으로 치환
써모토가 네아폴리타나 DSM 5069 유래 야생형 아라비노스 이성화효소의 469번째 루이신을 특정 프라이머를 이용한 위치-특이적 변이유발(site-directed mutagenesis) 방법으로 프롤린으로 치환하였다.
돌연변이를 가진 두 개의 상보적인 염기서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 N-말단 프라이머(서열번호 13)와 C-말단 프라이머(서열번호 14)를 프라이머로 사용하였다. 플라스미드 상태의 DNA를 주형으로 사용하여 새로운 변이를 가진 플라스미드를 시험관에서 증폭, 합성한 다음, 원래의 야생형(wild type) DNA는 Dpn I 제한효소로 절단하여 제거하였다. 즉, 주형으로 사용한 야생형 DNA는 대장균에서 분리된 DNA로서 Gm6ATC를 인식하여 절단하는 Dpn I에 의하여 절단되지만, 시험관에서 합성한 변이 DNA는 절단되지 않는다.
이를 대장균 DH5alpha에 형질전환시켜 변이주를 얻은 다음, 변이 유전자의 염기서열을 분석하여 변이가 제대로 일어났음을 확인하였다. 이 변이주를 최종 발현균주인 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)에 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 이를 L469P로 명명하였다. 이후, 이를 대조군으로서 사용하였다.
(2) 259번째 아미노산을 페닐알라닌 이외의 아미노산으로 치환
상기 제작된 변이체 L469P에서 추가적인 변이를 유도하기 위하여, 이성화효소가 클로닝 되어있는 벡터에 변이를 포함하는 프라이머 쌍을 이용하여 포화 돌연변이 유발(saturated mutagenesis) 기법을 수행하였다.
설계된 프라이머 쌍은 275번 아미노산 코돈이 NNS (N: A, T, G 또는 C, S: G 또는 C)로 치환되도록 설계하였으며 이 방법을 통해 얻어진 변이체들은 20종류의 아미노산을 모두 포함할 수 있다 (서열번호 11 및 서열번호 12). 이러한 변이체들은 형질전환(transformation)을 통해 단일 콜로니로 얻어지게 되며, 이들을 선별하여 활성을 분석함으로써 해당 위치의 20가지 아미노산 변이에 따른 활성의 변화를 빠짐없이 확인할 수 있다.
구체적으로, 20 종류의 아미노산을 포함한 라이브러리를 만들기 위해 100㎕/ml 농도의 pECCG117-CJ1-TNAI_L469P 플라스미드 [대한민국공개특허 10-2010-0016948]를 주형으로, 정방향, 역방향의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. PCR 반응은 하기 표 1 및 표 2와 같은 조건에서 수행하였다. PCR 반응을 통해 얻어진 라이브러리는 대장균 (E. coli K12 DH5α) 균주에 형질전환(transformation)하여 콜로니 형태로 만들었다. 사용한 플라스미드는 대장균과 코리네형 세균 모두에서 복제 및 해당 유전자의 발현이 가능하기 때문에 대장균에 있는 상태에서 발현하여 그대로 활성 테스트를 진행하였다.
이와 같이 얻어진 110개의 콜로니로부터 발현된 이성화효소를 시스테인-카바졸 (cysteine-carbazol method; Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951)법으로 활성을 분석한 결과 대조군 (L469P)에 비해 활성이 높은 다수의 클론을 확인할 수 있었다 (도 3).
이 중 가장 활성이 높게 측정된 10개의 콜로니를 선별하여 이들을 시퀀싱하여 각각의 서열을 확인한 결과, 예상한 바와 같이 발린, 메치오닌, 아이소루이신(아미노산; 서열번호 3 내지 5, 핵산; 서열번호 8 내지 10)의 순으로 활성이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 275번 아미노산 이외에는 변이가 발견되지 않은 것으로 미루어 보아, 가정한 바와 같이 275번 위치의 페닐알라닌 잔기가 D-갈락토스의 반응성을 저해하는 역할을 하고 있었던 것을 확인할 수 있었다.
상기 변이가 이성화효소에 어떠한 영향을 줄 것인지에 대해 알아보기 위해 다시 한번 분자 모델링 기법으로 변이체들의 구조를 예측하였다 (도 4). 구조예측 결과에 따르면, 세 종류의 변이체 모두 2차, 3차 구조에 큰 변화 없이 페닐알라닌의 위치를 대신하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 열 안정성 및 다른 생산 지표들에 큰 변화 없이 D-갈락토스에 대한 반응성이 증가했을 것으로 기대할 수 있었다.
상기 변이주들을 최종 발현균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ACTC 13032에 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 각각 "코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-TNAI-2, pFIS-1-TNAI-3, pFIS-1-TNAI-4"로 명명하였으며, 이를 2013년 02월 14일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 각각 수탁번호 KCCM11378P, KCCM11379P 및 KCCM11380P로 기탁하였다.
포화 돌연변이(Saturated mutagenesis) PCR
반응용액 조성 첨가량 ( μl )
PCR 버퍼 (pfu-ultra) 10X 5
dNTP (2.5 mM) 5
pCJ1-TNAI_L469P 1
TNAI275_F 프라이머 1
TNAI275_R 프라이머 1
pfu-ultra 1
DDW 50 μl 까지
PCR 반응조건
단계 온도 시간 사이클
초기 변성 95℃ 5분 1
변성 95℃ 45초
18
어닐링 60℃ 45초
신장 68℃ 18분
최종 신장 72℃ 10분 1
실시예 3: 코리네박테리아 속 미생물에서 아라비노스 이성화효소 변이체들의 발현
선별된 변이체들의 활성 향상 정도 및 실제 D-타가토스 생산에의 적용 가능성을 측정하기 위해, 상기 3종의 변이체들을 코리네박테리움 속 미생물에서 발현하여 생산성 및 생산 관련 지표들에 관한 연구를 진행하였다.
상기 실시예 2에서 선별된 3종의 변이체를 야생형 코리네박테리움 글루타미컴 (ATCC 13032)에 형질전환하여 재조합 균주를 제작하였다. 이들을 50 μg/ml 농도의 카나마이신(Kanamycin)을 포함한 배지 (Glucose 20g/L, poly peptone 10g/L, yeast extract 10g/L, ammonium sulfate 10g/L, KH2PO4 5.2g/L, K2HPO4 10.7g/L, MgSO4 0.5g/L, Urea 1.5g/L, D-Biotin 1.8mg/L, Thiamine 9mg/L, Ca-Panthothenic 9mg/L, Niacinamide 60mg/L)에서 30℃에서 20시간 배양하여 재조합 아라비노스 이성화효소 변이체들의 발현을 유도하였다.
발현된 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 배양액을 8000 g-force 에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼 용액에 재현탁하였다. 현탁된 균체는 0.1% POESA로 상온에서 1시간 처리하여 세포벽을 약화시켰다. 상기 조건에서 다시 원심분리하여 균체를 재회수하고, 4%(w/v)이 되도록 300g/L D-갈락토스, 5mM 염화망간, 50mM Tris-HCl (pH7.5) 혼합용액에 재현탁하였다. 이를 75℃에서 1시간 반응하였으며, D-갈락토스, D-타가토스 정량을 위해 HPLC분석 (WATERS HPLC, EMPOWER system, WATERS SugarPak ID 6.5-L300mm 컬럼, 2414 Refractive Index Detector)을 실시하였다.
한 시간 반응 결과 동일한 조건에서 대조군인 L469P는 35g/L의 D-타가토스를 생산한 것에 비해, 변이체 F275V/L469P는 121g/L·h, F275M/L469P는 117g/L·h, F275I/L469P는 101g/L·h의 생산성을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 4: 코리네 세균에서 발현된 아라비노스 이성화효소 변이체들의 분리정제 및 활성 측정
활성이 확인된 3종의 F275V/L469P, F275M/L469P, TNAI-F275I/L469P 변이체 및 대조군 L469P를 포함하는 재조합 균주를 종배양 (seed culture)하여, 실시예 3과 동일한 조건에서 2L 플라스크에 200mL 배양하였다. 아라비노스 이성화효소의 발현여부를 파악하기 위해 일부의 배양액을 이용하여 실시예 3과 동일한 조건에서 활성을 측정하였다.
0.1mM 염화망간이 포함된 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼 용액에 배양액으로부터 얻어진 균체를 재현탁하여 고압 세포 파쇄기 T-시리즈 4.0kW (T-series 4.0kW: Constant systems, UK)을 이용하여 세포 파쇄하였다. 아라비노스 이성화효소를 제외한 내재 단백질 (endogenous protein)들의 제거를 위해, 75℃에서 20분간 열처리를 하였다. 열처리된 세포 찌꺼기 (cell debris)를 8,000 g-force 에서 10분간 원심분리를 통해서 제거한 후, 60,000 g-force 로 초고속 원심분리 (BECKMAN COULTER Optima L-80 XP Ultracentrifuge)하여 세포 찌꺼기 및 지질성분 (lipid)을 최대한 제거하였다.
이렇게 하여 얻어진 세포 파쇄액(cell extract)은 이온교환수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography: Mono QTM 10/100GL, GE Healthcare)를 이용하여 정제하였다. 결합용액 [binding solution, 50mM NaCl, 0.1mM 염화망간, 20mM Tris-HCl(pH7.5)] 으로 전평형화(pre-equilibration) 시킨 후, 과량의 세포 파쇄액을 결합시키고, 용리용액 [1M NaCl, 0.1mM 염화망간, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]의 비율을 높여가며 분획하였다. 시스테인-카바졸-황산법(cystein-carbazol-sulfuric acid method)을 통해 기질인 D-갈락토스에 대하여 활성이 보이는 분획을 선택한 후, SDS-PAGE를 통하여 분석하였다.
그 결과, 정제된 단백질이 약 56kDa의 분자량을 가짐을 확인할 수 있었으며, 이는 실제로 알려진 써모토가 네아폴리타나 속 유래의 아라비노스 이성화효소의 분자량과 일치함을 알 수 있었다. SDS-PAGE를 통해 가장 정제도가 좋은 분획 하나를 선택하여 탈염컬럼 (PD-10 Desalting column, GE Healthcare)을 이용하여 고농도의 NaCl을 제거하였다. 최종 확보된 정제 효소를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 5). 분리정제된 단백질은 Bradford assay법을 사용하여 정량하였으며, 표준 단백질로 BSA (Bovine Serum Albumin)을 사용하였다.
실시예 5: 아라비노스 이성화효소 변이체들의 특성 파악 연구
상기 실시예에서 제작된 3종의 아라비노스 이성화효소 변이체들이 469번째 위치한 루이신을 프롤린으로 치환한 변이체에 비해 현저하게 향상된 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 실제 D-타가토스 생산에 영향을 미치는 반응조건과 관련된 변수들에 대한 실험을 진행하였다.
<5-1> 최적온도에 대한 연구
써모토가 네아폴라타나 아라비노스 이성화효소는 고도호열균의 효소로써 상대적으로 높은 열 안정성과 최적 온도를 가진다. D-갈락토스로부터 D-타가토스를 생산하기에 적합한 온도조건은 55℃에서 75℃ 사이로, 이보다 낮은 온도에서는 이종균주의 오염에 따른 문제가 발생하며, 높은 온도에서는 생산된 D-타가토스의 안정성에 문제가 생기기 때문이다. 기존에 사용되고 있는 야생형 아라비노스 이성화효소나 대조군 L469P의 경우 최적 반응온도가 85℃로 생산공정 적용이 가능한 온도에서는 상대적으로 낮은 활성을 보이는 문제가 있었다.
상기 실시예 4에서 분리, 정제된 변이형 아라비노스 이성화효소의 최적온도를 조사하기 위해 100mM D-갈락토스 기질에 정제된 효소를 첨가하여 1mM 염화망간(MnCl2)이 포함된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 에서 60℃ 내지 90℃의 범위에서 5℃ 간격으로 활성을 조사하였다.
상기 활성 측정은 시스테인-카바졸법 으로 측정하였다. 온도에 따른 효소활성을 살펴본 결과, 도 6과 같이 3종의 변이형 아라비노스 이성화효소들의 최적반응온도가 75℃로 L469P에 비해 10℃만큼 이동하였다. 이에 따라 공정적용가능 온도범위에서 이성화효소의 활성이 전반적으로 높게 형성되고 있어 생산공정의 운용범위가 보다 넓게 형성되는 점도 확인되었다.
또한, 세 변이주 모두 유사한 패턴의 특성을 보인 점으로 미루어 보아 275번 아미노산인 페닐알라닌 잔기의 특성이 최적반응온도에 영향을 미치는 것으로 짐작할 수 있다. 이는 본래의 기질이 아닌 D-갈락토스의 반응과정에서 275번 페닐알라닌이 D-갈락토스와의 입체장애를 최소화할 수 있도록 충분한 유연성을 확보하기 위한 것으로 추측해 볼 수 있다. 온도가 증가함에 따라 페닐알라닌의 페닐잔기 및 그 주변잔기들의 분자운동이 활발해지고 이에 따라 D-갈락토스의 6번 탄소와 입체장애가 줄어들 가능성이 있다. 동시에 단백질의 3차, 4차 구조에 큰 영향을 주지 않는 범위안에서 최적의 온도가 형성될 것으로 예측할 수 있다. 따라서, 275번의 변이에 의해 입체장애가 근본적으로 줄어든 변이체들에서 최적 온도의 변화가 있을 수 있다. 그러나 이를 과학적으로 입증하기 위해서는 추가적인 분석과 실험이 필요하다.
<5-2> 열 안정성에 대한 연구
변이형 아라비노스 이성화효소의 열 안정성 조사를 위해, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM 염화망간 용액에 20μg/ml의 농도로 정제된 효소를 첨가하여 95℃에서 180분간 항온수조에 배양하였다. 시간별로 샘플링한 효소액으로 효소반응을 수행하여 효소의 잔존활성을 측정하였다.
열 안정성 조사 결과, 도 7과 같이 아라비노스 이성화효소 변이체들은 95℃에서 시간이 경과함에 따라 잔존활성이 감소함을 보이나, 변이체들간의 열 안정성 차이가 크지 않은 것을 확인하였다. 보다 정량적인 데이터를 얻기 위해 활성의 반감기 (half-life)를 측정한 결과 L469P의 경우 상기 조건에서 약 3시간의 반감기를 가지며, 275번 변이체들은 2시간 전후에서 반감기가 형성되는 것으로 확인되었다 (표 3). 상대적으로 275번 변이체들의 상대적 열 안정성이 비교적 낮게 측정되었으나 차이가 크게 나지 않고 활성 증가분과 공정온도를 낮췄을 때를 감안할 경우 충분히 상쇄될 만한 정도라고 판단된다.
95℃에서 측정된 아라비노스 이성화효소의 반감기
변이체 반감기 (분)
L469P 185
F275V/L469P 122
F275M/L469P 126
F275I/L469P 134
<5-3> 금속이온효과에 의한 활성 변화에 관한 연구
많은 효소들이 촉매작용에 금속이온을 필요로 하기 때문에, 본 발명의 아라비노스 이성화효소 변이체의 열 안정성에서 금속이온에 대한 의존성 확인하고자, 정제된 효소를 이용하여 금속이온에 의한 효소활성 변화를 조사하였다.
농도에 따른 효소활성의 변화를 조사하기 위해 100mM D-갈락토스 기질에 정제된 효소를 첨가하여, 1mM에서 5mM 농도의 염화망간(MnCl2)이 포함된 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액에서 75℃, 10분간 실험을 수행하였다(도 8). 그 결과 모든 변이체들은 실험한 범위 내에서 유사한 정도의 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 망간이온이 효소활성에 필수적인 요소농도에 따른 이성화효소 활성에 대한 영향이 크지 않음을 알 수 있었다.
<5-4> 효소활성에 관한 연구
효소반응속도를 조사하기 위하여, 아라비노스 이성화효소 변이체를 반응온도 75℃ 조건에서 비활성도(specific activity)를 구하였다. pH7.5, 75℃에서 1mM 염화망간, 100mM D-갈락토스를 첨가하여 1mg 효소의 반응성을 측정하였다. 해당 조건에서 10분간 반응하여 비활성을 조사한 결과 275번 변이체들이 L469P에 비해서 각각 약 5.5배(F275V), 5배(F275M), 3.9배(F275I) 높은 비활성도를 보였다 (표 4).
변이체들의 비활성도
　 L469P F275V/L469P F275M/L469P F275I/L469P
비활성도(U/mg) 2.4 13.1 12.1 9.3
한국미생물보존센터(국외) KCCM11378P 20130214 한국미생물보존센터(국외) KCCM11379P 20130214 한국미생물보존센터(국외) KCCM11380P 20130214
<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them <130> PP14-0114 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 1 Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser 20 25 30 Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile 35 40 45 Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro 100 105 110 Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly 165 170 175 Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu 180 185 190 Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr 195 200 205 Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Ala Val Pro Glu Asn 210 215 220 Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro 225 230 235 240 Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu 245 250 255 Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr 260 265 270 Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala 275 280 285 Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp 290 295 300 Trp Lys Ala Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Ala Gly 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Thr 325 330 335 Pro Gly Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro 340 345 350 Thr Ile Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Gln Glu Gly 370 375 380 Pro Ala Val Asn Ala Ser Ile Val Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu 385 390 395 400 Val Val Asn Arg Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Lys Met Pro Lys 405 410 415 Leu Pro Thr Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asp Phe Lys Arg 420 425 430 Ala Thr Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe 435 440 445 Ser Thr Ala Val Asp Val Glu Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Ala Leu 450 455 460 Glu Ile Glu Tyr Leu Val Ile Asp Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asn Phe 465 470 475 480 Lys Lys Glu Leu Arg Trp Asn Glu Leu Tyr Trp Gly Leu Leu Lys Arg 485 490 495 <210> 2 <211> 496 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 2 Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser 20 25 30 Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile 35 40 45 Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro 100 105 110 Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly 165 170 175 Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu 180 185 190 Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr 195 200 205 Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Ala Val Pro Glu Asn 210 215 220 Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro 225 230 235 240 Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu 245 250 255 Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr 260 265 270 Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala 275 280 285 Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp 290 295 300 Trp Lys Ala Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Ala Gly 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Thr 325 330 335 Pro Gly Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro 340 345 350 Thr Ile Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Gln Glu Gly 370 375 380 Pro Ala Val Asn Ala Ser Ile Val Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu 385 390 395 400 Val Val Asn Arg Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Lys Met Pro Lys 405 410 415 Leu Pro Thr Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asp Phe Lys Arg 420 425 430 Ala Thr Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe 435 440 445 Ser Thr Ala Val Asp Val Glu Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Ala Leu 450 455 460 Glu Ile Glu Tyr Pro Val Ile Asp Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asn Phe 465 470 475 480 Lys Lys Glu Leu Arg Trp Asn Glu Leu Tyr Trp Gly Leu Leu Lys Arg 485 490 495 <210> 3 <211> 496 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 3 Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser 20 25 30 Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile 35 40 45 Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro 100 105 110 Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly 165 170 175 Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu 180 185 190 Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr 195 200 205 Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Ala Val Pro Glu Asn 210 215 220 Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro 225 230 235 240 Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu 245 250 255 Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr 260 265 270 Thr Thr Val Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala 275 280 285 Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp 290 295 300 Trp Lys Ala Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Ala Gly 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Thr 325 330 335 Pro Gly Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro 340 345 350 Thr Ile Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Gln Glu Gly 370 375 380 Pro Ala Val Asn Ala Ser Ile Val Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu 385 390 395 400 Val Val Asn Arg Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Lys Met Pro Lys 405 410 415 Leu Pro Thr Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asp Phe Lys Arg 420 425 430 Ala Thr Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe 435 440 445 Ser Thr Ala Val Asp Val Glu Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Ala Leu 450 455 460 Glu Ile Glu Tyr Pro Val Ile Asp Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asn Phe 465 470 475 480 Lys Lys Glu Leu Arg Trp Asn Glu Leu Tyr Trp Gly Leu Leu Lys Arg 485 490 495 <210> 4 <211> 496 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 4 Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser 20 25 30 Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile 35 40 45 Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro 100 105 110 Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly 165 170 175 Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu 180 185 190 Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr 195 200 205 Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Ala Val Pro Glu Asn 210 215 220 Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro 225 230 235 240 Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu 245 250 255 Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr 260 265 270 Thr Thr Met Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala 275 280 285 Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp 290 295 300 Trp Lys Ala 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tggagtacct catcgactgg 1380 gcggaggctt tggagataga gtatcttgtc atcgatgaaa atctggatct ggagaacttc 1440 aaaaaggaac tgagatggaa cgaactctac tggggacttt taaaaagatg a 1491 <210> 7 <211> 1491 <212> DNA <213> Thermotoga neapolitana <400> 7 atgatcgatc tcaaacagta tgagttctgg tttcttgtcg gcagccagta tctctacggt 60 ctggagacgt tgaagaaggt agagcagcag gcaagcagga tagttgaggc actgaacaat 120 gatcccattt ttccctcaaa gatcgttctg aaacccgttc tgaaaaattc cgccgagatc 180 agagagatct tcgaaaaggc aaatgcagaa ccaaaatgcg ccggtgtcat cgtgtggatg 240 cacacgttct caccttcgaa gatgtggata agaggcctct ccatcaataa aaaacccctg 300 cttcacctcc acacccagta caacagggag atcccgtggg acacgatcga tatggactac 360 atgaacctga accaatctgc ccacggtgac agggaacacg gattcattca cgcgaggatg 420 agactcccaa gaaaggtcgt ggtgggacat tgggaagaca gagaagtcag ggaaaagatc 480 gcaaaatgga tgagagtggc ctgcgcgata caggatggaa gaactggaca gatcgtgaga 540 ttcggcgata acatgagaga ggttgccagc accgaaggag acaaggtgga ggcacagata 600 aaactcggct ggtccataaa cacctggggt gtcggagagc tcgccgagag agtgaaggcg 660 gttccagaaa acgaagtgga ggaattgttg aaggagtaca aagaaaggta catcatgcca 720 gaagacgaat acagcctcaa agcgatcaga gaacaggcga agatggagat tgcactgaga 780 gagtttctga aagagaagaa tgccatcgcc ttcaccacca ccttcgagga tcttcacgat 840 cttccccagc ttcccggtct tgcagtccag aggctcatgg aggaagggta tggatttgga 900 gcggaaggag actggaaggc agccgggctt gtgagggctt tgaaggtcat gggagctggt 960 cttcccggtg gtacatcctt catggaggac tacacctacc atctcacacc gggaaacgaa 1020 ctcgtgctgg gagcgcacat gctagaggtg tgccccacga tcgctaagga aaagccaaga 1080 atagaggtgc atcctctcag catcggtgga aaagcagatc ctgcacgcct tgttttcgat 1140 ggacaagaag gtcccgctgt caacgcctcc atcgttgaca tgggaaacag gttcaggctg 1200 gtagtgaaca gagtgttgtc cgttcccatt gaaaggaaga tgcccaaact tccaacggca 1260 agagttttgt ggaagccgct tcctgatttc aagagggcga cgactgcgtg gattctcgct 1320 ggaggatccc atcatactgc cttctcaaca gcggtggatg tggagtacct catcgactgg 1380 gcggaggctt tggagataga gtatcctgtc atcgatgaaa atctggatct ggagaacttc 1440 aaaaaggaac tgagatggaa cgaactctac tggggacttt taaaaagatg a 1491 <210> 8 <211> 1491 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ccgttgagga tcttcacgat 840 cttccccagc ttcccggtct tgcagtccag aggctcatgg aggaagggta tggatttgga 900 gcggaaggag actggaaggc agccgggctt gtgagggctt tgaaggtcat gggagctggt 960 cttcccggtg gtacatcctt catggaggac tacacctacc atctcacacc gggaaacgaa 1020 ctcgtgctgg gagcgcacat gctagaggtg tgccccacga tcgctaagga aaagccaaga 1080 atagaggtgc atcctctcag catcggtgga aaagcagatc ctgcacgcct tgttttcgat 1140 ggacaagaag gtcccgctgt caacgcctcc atcgttgaca tgggaaacag gttcaggctg 1200 gtagtgaaca gagtgttgtc cgttcccatt gaaaggaaga tgcccaaact tccaacggca 1260 agagttttgt ggaagccgct tcctgatttc aagagggcga cgactgcgtg gattctcgct 1320 ggaggatccc atcatactgc cttctcaaca gcggtggatg tggagtacct catcgactgg 1380 gcggaggctt tggagataga gtatcctgtc atcgatgaaa atctggatct ggagaacttc 1440 aaaaaggaac tgagatggaa cgaactctac tggggacttt taaaaagatg a 1491 <210> 9 <211> 1491 <212> DNA <213> Thermotoga neapolitana <400> 9 atgatcgatc tcaaacagta tgagttctgg tttcttgtcg gcagccagta tctctacggt 60 ctggagacgt tgaagaaggt agagcagcag gcaagcagga tagttgaggc actgaacaat 120 gatcccattt ttccctcaaa gatcgttctg aaacccgttc tgaaaaattc cgccgagatc 180 agagagatct tcgaaaaggc aaatgcagaa ccaaaatgcg ccggtgtcat cgtgtggatg 240 cacacgttct caccttcgaa gatgtggata agaggcctct ccatcaataa aaaacccctg 300 cttcacctcc acacccagta caacagggag atcccgtggg acacgatcga tatggactac 360 atgaacctga accaatctgc ccacggtgac agggaacacg gattcattca cgcgaggatg 420 agactcccaa gaaaggtcgt ggtgggacat tgggaagaca gagaagtcag ggaaaagatc 480 gcaaaatgga tgagagtggc ctgcgcgata caggatggaa gaactggaca gatcgtgaga 540 ttcggcgata acatgagaga ggttgccagc accgaaggag acaaggtgga ggcacagata 600 aaactcggct ggtccataaa cacctggggt gtcggagagc tcgccgagag agtgaaggcg 660 gttccagaaa acgaagtgga ggaattgttg aaggagtaca aagaaaggta catcatgcca 720 gaagacgaat acagcctcaa agcgatcaga gaacaggcga agatggagat tgcactgaga 780 gagtttctga aagagaagaa tgccatcgcc ttcaccacca ccatggagga tcttcacgat 840 cttccccagc ttcccggtct tgcagtccag aggctcatgg aggaagggta tggatttgga 900 gcggaaggag actggaaggc agccgggctt gtgagggctt tgaaggtcat gggagctggt 960 cttcccggtg gtacatcctt catggaggac tacacctacc atctcacacc gggaaacgaa 1020 ctcgtgctgg gagcgcacat gctagaggtg tgccccacga tcgctaagga aaagccaaga 1080 atagaggtgc atcctctcag catcggtgga aaagcagatc ctgcacgcct tgttttcgat 1140 ggacaagaag gtcccgctgt caacgcctcc atcgttgaca tgggaaacag gttcaggctg 1200 gtagtgaaca gagtgttgtc cgttcccatt gaaaggaaga tgcccaaact tccaacggca 1260 agagttttgt ggaagccgct tcctgatttc aagagggcga cgactgcgtg gattctcgct 1320 ggaggatccc atcatactgc cttctcaaca gcggtggatg tggagtacct catcgactgg 1380 gcggaggctt tggagataga gtatcctgtc atcgatgaaa atctggatct ggagaacttc 1440 aaaaaggaac tgagatggaa cgaactctac tggggacttt taaaaagatg a 1491 <210> 10 <211> 1491 <212> DNA <213> Thermotoga neapolitana <400> 10 atgatcgatc tcaaacagta tgagttctgg tttcttgtcg gcagccagta tctctacggt 60 ctggagacgt tgaagaaggt agagcagcag gcaagcagga tagttgaggc actgaacaat 120 gatcccattt ttccctcaaa gatcgttctg aaacccgttc tgaaaaattc cgccgagatc 180 agagagatct tcgaaaaggc aaatgcagaa ccaaaatgcg ccggtgtcat cgtgtggatg 240 cacacgttct caccttcgaa gatgtggata agaggcctct ccatcaataa aaaacccctg 300 cttcacctcc acacccagta caacagggag atcccgtggg acacgatcga tatggactac 360 atgaacctga accaatctgc ccacggtgac agggaacacg gattcattca cgcgaggatg 420 agactcccaa gaaaggtcgt ggtgggacat tgggaagaca gagaagtcag ggaaaagatc 480 gcaaaatgga tgagagtggc ctgcgcgata caggatggaa gaactggaca gatcgtgaga 540 ttcggcgata acatgagaga ggttgccagc accgaaggag acaaggtgga ggcacagata 600 aaactcggct ggtccataaa cacctggggt gtcggagagc tcgccgagag agtgaaggcg 660 gttccagaaa acgaagtgga ggaattgttg aaggagtaca aagaaaggta catcatgcca 720 gaagacgaat acagcctcaa agcgatcaga gaacaggcga agatggagat tgcactgaga 780 gagtttctga aagagaagaa tgccatcgcc ttcaccacca ccatcgagga tcttcacgat 840 cttccccagc ttcccggtct tgcagtccag aggctcatgg aggaagggta tggatttgga 900 gcggaaggag actggaaggc agccgggctt gtgagggctt tgaaggtcat gggagctggt 960 cttcccggtg gtacatcctt catggaggac tacacctacc atctcacacc gggaaacgaa 1020 ctcgtgctgg gagcgcacat gctagaggtg tgccccacga tcgctaagga aaagccaaga 1080 atagaggtgc atcctctcag catcggtgga aaagcagatc ctgcacgcct tgttttcgat 1140 ggacaagaag gtcccgctgt caacgcctcc atcgttgaca tgggaaacag gttcaggctg 1200 gtagtgaaca gagtgttgtc cgttcccatt gaaaggaaga tgcccaaact tccaacggca 1260 agagttttgt ggaagccgct tcctgatttc aagagggcga cgactgcgtg gattctcgct 1320 ggaggatccc atcatactgc cttctcaaca gcggtggatg tggagtacct catcgactgg 1380 gcggaggctt tggagataga gtatcctgtc atcgatgaaa atctggatct ggagaacttc 1440 aaaaaggaac tgagatggaa cgaactctac tggggacttt taaaaagatg a 1491 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for substitute codon of 275th amino acid with NNS(N: A, T, G or C, S: G or C) <400> 11 ccatcgcctt caccaccacc nnsgaggatc ttcacgatct tcccc 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for substitute codon of 275th amino acid with NNS(N: A, T, G or C, S: G or C) <400> 12 ggggaagatc gtgaagatcc tcsnnggtgg tggtgaaggc gatgg 45 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggatcccata ctcctttctc aacagag 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgctgttgag aaaggagtat gatgggatcc 30

Claims (5)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 275번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine) 이외의 비극성 지방족 곁사슬을 가지는 아미노산으로 치환되고, 469번째 아미노산이 프롤린(proline)으로 치환된, D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 활성이 향상된 아라비노스 이성화효소 변이체.
  2. 제 1항의 아라비노스 이성화 효소 변이체를 이용하여 D-갈락토스를 D-타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 D-타가토스의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 D-타가토스의 제조방법은 아라비노스 이성화 효소 변이체와 D-갈락토스 용액과 반응시키는 단계를 포함하는 D-타가토스의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 D-갈락토스 용액은 망간 이온, 마그네슘 이온 및 아연 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는 D-타가토스의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 금속 이온은 0.1 mM 내지 10 mM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 D-타가토스의 제조방법.
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