CN106062188A - 具有提高的转化活性的l‑阿拉伯糖异构酶变异体及利用该变异体生产d‑塔格糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于蛋白质分子建模法的来源于嗜热菌的一种新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的L‑阿拉伯糖异构酶变异体(L‑arabinose isomerase variant)的开发。并且，涉及一种利用所述酶或表达所述酶的棒状微生物由D‑半乳糖生产D‑塔格糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitanaDSM 5068)的L-阿拉伯糖异构酶变异体、表达该变异体的微生物、以及利用这些由D-半乳糖生产D-塔格糖的方法，所述L-阿拉伯糖异构酶变异体是利用蛋白质工程技术(proteinengineering)来生产的，从而对D-半乳糖具有提高的转化活性。
背景技术
D-塔格糖是既具有低热量、无龋齿性等特征，又具有相当于白糖的约90％的甜度的单糖，其可以用作健康甜味剂而不会引起由现有的甜味剂诱发的各种成人疾病问题。
由于这些特性，D-塔格糖作为替代白糖的甜味剂而受到关注，并且被认为是在食品市场中拥有巨大市场潜力的物质。但是，塔格糖并不大量存在于自然界中，而是仅以微量存在于乳制品或一些植物中的稀有糖，因此为了用作低热量的功能性甜味剂，需开发能够大量生产的技术。
D-塔格糖是爱氏晨曦(Arla Foods)公司于2003年利用以Ca(OH)2作为催化剂的化学异构法由D-半乳糖(D-galactose)生产的，并以Gaio-塔格糖(Gaio-tagatose)的产品名市售。但是，已知化学异构法虽然在异构化转化产量方面优异，但是难于回收及精制，工序复杂，因此考虑到工序整体产量的情况下，收率反而比利用酶的异构法低。
L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase；EC 5.3.1.5)是促进由L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的异构化反应的酶。并且，已知为，L-阿拉伯糖异构酶不仅使原始底物L-阿拉伯糖进行异构化，而且使与L-阿拉伯糖结构相似的底物D-半乳糖进行异构化而转化为D-塔格糖(D-tagatose)。
在利用L-阿拉伯糖异构酶由D-半乳糖生产D-塔格糖的工序中，能够对提高生产性作出贡献的最重要的因素是通过异构酶的改良而开发出反应性好且能成功适用于生产工序中的酶。生产性的提高对基于降低成本的利润最大化和产业的成败起到决定性作用，因此对阿拉伯糖异构酶进行持续性改良的必要性呈上升趋势。
来源于作为高温性微生物的新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoganeapolitana DSM 5068)属的阿拉伯糖异构酶的热稳定性非常优异，但为了确保葡萄糖异构酶(glucose isomerase)水平的经济生产性，需要进行进一步的改良。
一般而言，为了提高酶的活性或对新的底物赋予活性而制备变异型酶的方法大体上可分为随机变异法(random mutagenesis)和合理设计法(rational design)。随机变异法因可在不用了解关于作为对象的酶的特别信息的情况下也可适用而被广泛利用，但需要具备能够调查大量个体变异型酶的筛选(screening)系统。另一方面，基于合理设计的酶的改良由于只生成有限数量的变异型酶，因此不需要专门的筛选系统，但需要对对象酶的催化作用机理(catalytic mechanism)、底物的结合特性或底物特异性的决定因素等进行详细地研究。
发明内容
要解决的技术问题
为此，本申请人为了使对生产塔格糖具有潜力的阿拉伯糖异构酶能够具有产业生产性，以蛋白质工程的分子模拟技术和酶反应机理的分析为基础，对来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase)的蛋白质三维结构进行变化，从而提高L-阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的底物特异性。
本发明的目的在于，提供一种具有提高的转化活性的、来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的阿拉伯糖异构酶变异体及编码该变异体的基因碱基序列。
本发明的另一个目的在于，提供一种包含所述基因碱基序列的重组载体及用所述重组载体转化的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一目的在于，提供一种由D-半乳糖制备D-塔格糖的方法，所述方法利用所述阿拉伯糖异构酶变异体或所述转化的微生物或所述转化的微生物的培养物进行。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种使D-半乳糖转化为D-塔格糖的活性得到提高的阿拉伯糖异构酶变异体及编码该变异体的基因碱基序列，其中阿拉伯糖异构酶变异体是来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的阿拉伯糖异构酶的第469位亮氨酸(leucine)被脯氨酸(proline)取代、第275位氨基酸被除苯丙氨酸(phenylalanine)以外的氨基酸取代。
本发明还提供一种包含所述基因碱基序列的重组载体及用所述重组载体转化的棒状杆菌属微生物。
本发明还提供一种由D-半乳糖制备D-塔格糖的方法，其利用所述阿拉伯糖异构酶变异体或所述转化的微生物或所述转化的微生物的培养物。
发明效果
利用由本发明的新型阿拉伯糖异构酶变异体或编码该变异体的基因碱基序列转化的棒状杆菌属菌株，提高了D-塔格糖的生产性，从而有效地降低了成本及减少了基础设施的投资费用。
附图说明
图1示出来源于新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶的活性位点及作为辅助因子的锰离子所构成的结构的图。
图2示出L-阿拉伯糖和D-半乳糖结合到L-阿拉伯糖异构酶的活性位点，以及起到相互作用的功能基团的图。显示出D-半乳糖的第6位碳和第275位苯丙氨酸的残基相互引起空间位阻。
图3示出通过对L-阿拉伯糖异构酶的第275位残基进行饱和诱变(saturatedmutagenesis)并利用半胱氨酸-咔唑法通过显色反应对选择的变异体的相对活性进行比较所获得的结果。与对照组相比，可以确认相当数量的变异体显示了更高的活性。
图4是利用分子模拟技术预测的筛选出的变异体F275V/L469P、F275M/L469P、F275I/L469P的结构图。
图5示出通过SDS-PAGE对分离精制的新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶变异体进行分析的图。
图6是为了确认筛选出的变异体的最适温度而对其在各温度下的相对活性进行评价的图。
图7是在95℃下根据时间对筛选出的变异体的热稳定性进行测定的图。
图8是为了确认筛选出的变异体的锰依赖性而对其在在多种浓度对相对活性进行评价的图。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明提供一种具有提高的转化活性的、来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的阿拉伯糖异构酶变异体及编码该变异体的基因碱基序列。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供一种使D-半乳糖转化为D-塔格糖的活性得到提高的阿拉伯糖异构酶变异体及编码该变异体的基因碱基序列，其中阿拉伯糖异构酶变异体是来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的阿拉伯糖异构酶的第275位氨基酸被除苯丙氨酸(phenylalanine)以外的氨基酸取代、第469位亮氨酸(leucine)被脯氨酸(proline)取代。
本发明中，所述“将D-半乳糖转化为D-塔格糖的阿拉伯糖异构酶”表示以D-半乳糖为底物催化异构化反应而生产D-塔格糖的酶。
优选地，本发明的阿拉伯糖异构酶变异体是阿拉伯糖异构酶的第275位氨基酸被具有非极性脂肪族侧链(nonpolar aliphatic side chain)的氨基酸取代。
本文中，所述“具有非极性脂肪族侧链的氨基酸”表示丙氨酸(Alanine)、缬氨酸(Valine)、异亮氨酸(Isoleucine)、亮氨酸(Leucine)、蛋氨酸(Methionine)及脯氨酸(Proline)。
优选地，所述阿拉伯糖异构酶的第275位氨基酸被选自缬氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸中的任一种氨基酸取代。
优选地，本发明的阿拉伯糖异构酶变异体进一步地是异构酶的第469位亮氨酸被脯氨酸取代。
本文中，所述“取代”表示特定位置的氨基酸被其他氨基酸替代而引起突变。适当的诱变方法可以是本领域技术人员为了所述目的而可以利用的所有方法。尤其是饱和诱变法(saturated mutagenesis method)、随机诱变法(random mutagenesis method)及定点诱变法(site-directed mutagenesis method)(Evolutionary molecular engineeringbased on RNA replication,Pure Appl.Chem.1984,56:967-978；Promoters selectedfrom random DNA-sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:7405-7409；Mutantsgenerated by the insertion of random oligonucleotides into the active-site ofthe beta-lactamase gene,Biochemistry 1989,28:5703-5707)。
优选地，本发明的阿拉伯糖异构酶变异体中，利用饱和诱变法来取代第275位氨基酸，利用定点诱变法来取代第469位亮氨酸。
在本发明的一个实施方案中，以所述来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 5068的野生型阿拉伯糖异构酶(SEQ ID NO:1的氨基酸序列及SEQ ID NO:6的碱基序列)为模板(template)，通过随机酶变异法 得到了一定数量的显示改良的酶特性的变异体及其基因信息。对变异体进行综合分析的结果，可以确认所述阿拉伯糖异构酶的C-末端(C-terminal)区域的氨基酸序列的变化影响酶活性的提高。
并且，通过分子模拟确认了构成野生型阿拉伯糖异构酶及阿拉伯糖异构酶变异体的活性位点的C-末端区域的氨基酸。结果可以确认所述变异体由于野生型阿拉伯糖异构酶的第469位亮氨酸残基被脯氨酸取代而引起蛋白质的第18位β-片层结构(beta-sheet)消失和主链(backbone)的角度倾斜，同时使第17位α-螺旋(alpha-helix)的三维结构的位置向蛋白质本体(body)方向移动，这表明蛋白质的结构改变。
基于上述结果，利用定点诱变(site-directed mutagenesis)法,将野生型阿拉伯糖异构酶的第469位亮氨酸取代为脯氨酸而制备了变异体(L469P)(SEQ ID NO:2的氨基酸序列及SEQ ID NO:7的碱基序列)。将这些变异体培养后对活性进行测定，结果可以确认，与野生型阿拉伯糖异构酶相比，所述变异体对作为底物的半乳糖具有更高的活性。
本发明的一个实施方案中，为了从阿拉伯糖异构酶变异体(L469P)得到转化活性提高的酶，选择酶的底物结合部及活性部的主要残基并推测反应机理，从而最终筛选第275位氨基酸，并利用饱和诱变法进一步向第275位氨基酸引入变异，并进行筛选，从而筛选转化活性得到提高的变异体。
对筛选出的变异体进行测序，结果可以确认选定的变异体的第275位氨基酸分别被缬氨酸(L469P/F275V)、蛋氨酸(L469P/F275M)、异亮氨酸(L469P/F275I)取代。将所述3种变异体转化到棒状杆菌属微生物并对其进行培养后进行异构化反应。结果可以确认，与第469位亮氨酸被脯氨酸取代的变异体L469P相比，3种变异体均显示提高的活性。
为了了解所述3种变异体的特性，从在所述条件下培养的棒状杆菌属微生物分离了所表达的阿拉伯糖异构酶。发现精制的蛋白质显示了对D-半乳糖的阿拉伯糖异构酶活性，并用SDS PAGE确认了其分子量与阿拉伯糖异构酶的一致。
利用所述精制变异体酶，对最适温度、热稳定性、金属离子利用性及酶活性进行了测定。结果所述三种变异体均在75℃下测到了最高的活性，但热稳定性略微降低，金属离子利用性则无很大差异，阿拉伯糖异构酶活性显示比所述变异体L469P分别高约5.5倍(F275V/L469P)、约5倍(F275M/L469P)、约3.9倍(F275I/L469P)的比活度(specificactivity)。
在一个实施方案中，本发明提供一种编码所述阿拉伯糖异构酶变异体的基因碱基序列。
所述序列可以为选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10中的任一条基因碱基序列。
就本发明的阿拉伯糖异构酶变异体而言，只要能够维持或提高本发明的阿拉伯糖异构酶变异体的阿拉伯糖异构酶的活性，就可以具有编码与SEQ ID NO:3至5的氨基酸序列具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、尤其优选为97％以上同源性的蛋白质的基因碱基序列，最为优选可以具有SEQ ID NO:8至10所示的基因碱基序列。
本文中，所述术语“同源性”表示两条氨基酸序列之间的同一性，其可以通过用本领域技术人员所熟知的方法例如BLAST 2.0来测定，其中BLAST 2.0用于计算分数(score)、同一性(identity)、相似性(similarity)等参数(parameter)。
并且，本发明的多核苷酸可以是编码阿拉伯糖异构酶变异体的变异型，其可在‘严格条件’下与SEQ ID NO:8至10所示的多核苷酸或来源于所述多核苷酸的探针(probe)进行杂交并发挥正常功能。
本文中，所述术语“严格条件(stringent conditions)”表示可以实现多核苷酸之间的特异性杂交的条件。例如，在65℃的杂交缓冲液(3.5>SSC，0.02％聚蔗糖(Ficoll)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中进行杂交。("molecular Cloning(分子克隆)",A Laboratory Manual,J.Sambrook etal.,Editors,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989)或Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现代实验室指南)(F.M.Ausubel et al.,Editors,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。这里，SSC是pH 7的0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠。杂交后，将转移有DNA的膜在室温下用2>SSC进行清洗，然后在68℃的温度下用0.1-0.5>SSC/0.1×SDS进行清洗。
在一个实施方案中，本发明还提供一种异构酶变异体，其具有选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中的任一条氨基酸序列。具体而言，所述变异体表示第275位氨基酸被选自缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸中的任一条氨基酸取代同时第469位氨基酸被脯氨酸取代的阿拉伯糖异构酶变异体。
但是，根据微生物的种类或菌株，显示所述多肽活性的酶的氨基酸序列会存在差异，因此异构酶变异体不限定此。即，就本发明的变异体而言，只要可以维持或提高所述阿拉伯糖异构酶的活性，则可以是编码具有以下氨基酸序列的多肽的突变体或人工变型体，所述氨基酸序列包括在SEQ ID NO:3至5的氨基酸序列中除了第275位及第469位氨基酸以外的一个以上位置上进行1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等。
在这里，“多个”会根据蛋白质的氨基酸残基在立体结构上的位置或种类而不同，但具体为2至20个，优选为2至10个，更加优选为2至5个氨基酸。
并且，这些氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括因根据含有所述阿拉伯糖异构酶活性的微生物的个体或种类的差异的情况等的自然产生的突变或人工变异(variant)而发生的。
在一个实施方案中，本发明还提供一种以可操作的方式连接有多核苷酸的重组载体。
本文中，所述术语“载体”表示一种DNA制备物，其含有编码可操作地连接到合适的调控序列的所述目标蛋白质的多核苷酸的碱基序列，以在合适的宿主内表达目标蛋白质。所述调控序列包括：能够启动转录的启动子；用于调控所述转录的任一操纵基因序列；编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列；调控转录及翻译的终止的序列。一旦载体转化至合适的宿主内后，载体即可以与宿主基因组独立地实施复制或发挥功能，或可以整合到基因组本身。
本发明中使用的载体，只要在宿主中进行复制，则不受特别限定，可以利用本领域已知的任意的载体。通常使用的载体可以例举如天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒及噬菌体。
本发明中使用的载体是转化到宿主细胞从而能够将编码目标蛋白质的多核苷酸插入到宿主细胞内的染色体内的载体，优选地，可以举例如，能够在大肠杆菌和棒状杆菌中沿两方向进行自主复制的穿梭载体pECCG112载体(Kor.Jour.Microbiol.July 1991，p149-154.Kap-soo，Noh)，但不限定于此。
并且，通过细菌内染色体插入用载体，能够将编码染色体内内源性目标蛋白质的多核苷酸替换为新型多核苷酸。将所述多核苷酸插入到染色体内的方法可以使用本领域已知的任意方法，例如可以通过同源重组来实现。
本发明的载体可以通过同源重组来插入到染色体内，因此可以进一步包含用于确认是否成功插入到所述染色体的筛选标记(selection marker)，筛选标记的使用是为了筛选出用载体转化的细胞即为了确认目标多核苷酸的插入与否，因此可以使用能够赋予诸如耐药性、营养缺陷型、细胞毒素剂的耐受性或表达表面蛋白质的可选性表现型的标记。在用筛选剂(selective agent)处理过的环境下，只有表达筛选标记的细胞生存或显示不同的表现型，因此可以筛选出被转化的细胞。
在一个实施方案中，本发明还提供一种用所述重组载体转化的棒状杆菌属微生物。
本文中，所述术语“转化”表示将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞内，以使得所述多核苷酸所编码的蛋白质能够在宿主细胞内表达。就被转化的多核苷酸而言，只要能够在宿主细胞内表达，不管其位置是插入到宿主细胞的染色体内或染色体外，其都包含全部基因。并且，所述多核苷酸包含编码靶蛋白的DNA及RNA。就所述多核苷酸而言，只要能够引入到宿主细胞内并表达就可，与基因引入的形式没有关系。例如，所述多核苷酸可以以表达盒(expression cas sette)的形式引入到宿主细胞中，所述表达盒是包含自主表达所需的所有因素的多核苷酸构建体。所述表达盒通常包含可操作地连接到所述基因的启动子(promoter)；转录终止信号；核糖体结合位点；以及翻译终止信号。所述表达盒可以是能够实现自主复制的表达载体形式。并且，所述多核苷酸可以是以本身的形状引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中可操作地连接到表达所需要的序列。
本发明的微生物，只要是能够表达所述异构酶变异体，则可以包含任意原核微生物及真核微生物。例如，其可以包含属于埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、普罗维登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属及短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株。优选地，本发明的微生物为属于棒状杆菌属的微生物，更加优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
本发明的优选实施方案中，用具有SEQ ID NO:8、9、10的碱基序列的载体转化具有L-氨基酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，并将制备的菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI-2、pFIS-1-TNAI-3、pFIS-1-TNAI-4，并于2013年2月14日分别以保藏编号分别为KCCM11378P、KCCM11379P及KCCM11380P保藏于位于韩国首尔西大门区弘济1洞361-221号的国际保藏机构韩国菌种协会附属韩国微生物保藏中心。在一个实施方案中，本发明还提供所述棒状杆菌属微生物的培养物。
所述培养物可以是包含所述微生物的菌体的培养原液，并且可以是去除培养上清液或浓缩培养物而获得的菌体。所述培养液的组成不仅可以包含通常的棒状杆菌属微生物的培养所需的成分，还可以进一步包含对棒状杆菌属微生物的成长具有促进作用的成分，对于所述的组成，本领域普通技术人员可以很容易地进行选择。并且，培养物的状态可以是液相状态或干燥状态，干燥的方法可以使用风干燥、自然干燥、喷雾干燥及冷冻干燥，但不限定于此。
本发明的棒状杆菌属微生物的培养，可以通过常规的方法来进行。具体而言，可以在完全或部分含有原糖或葡萄糖作为碳源的培养基中接种所述微生物并培养。所述培养过程可以在本领域已知的适当的培养基和培养条件下进行。就这种培养过程而言，本领域技术人员可以根据所选择的菌株容易地调整并使用。所述培养方法的例子包括分批式培养、连续式培养及流加式培养，但不限定于此。培养中使用的培养基应当适当地满足特定菌株的要求条件。
具体而言，本发明中使用的培养基使用原糖或葡萄糖作为主要碳源，并且包含大量原糖的糖浆也可以用作碳源。另外，适量的碳源可以通过各种形式被利用，优选使用精制葡萄糖。可以用作氮源的例子包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸渍液及大豆豆粕的有机氮源，及诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵等无机氮源，优选使用蛋白胨。这些氮源可以单独使用或组合使用。所述培养基包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及对应的含钠盐作为磷源。并且，所述培养基可以包含诸如硫酸镁或硫酸铁的金属盐。另外，所述培养基还可以包含氨基酸、维生素及适当的前躯体等。这些培养基或前躯体可以以分批式或连续式添加到培养物中。
具体而言，培养的温度通常为27℃至37℃，优选为30℃至37℃，培养时间可以持续到所需要的蛋白质表达，优选为10至100小时。
本发明提供一种D-塔格糖的制备方法，其包括以下包括：选自具有将所述D-半乳糖转化为D-塔格糖的活性的阿拉伯糖异构酶变异体、所述转化的棒状杆菌属微生物或所述转化的棒状杆菌属微生物的培养物中的任一种存在的条件下，使包含D-半乳糖的溶液与提供金属离子的物质进行反应，所述金属离子是选自锰离子、镁离子及锌离子中的任一种以上。
为了将所述棒状杆菌属微生物或培养物制备成能够引入底物的状态，将离心分离而回收的菌体用表面活性剂、溶菌酶、二甲苯进行处理，优选用0.1％POESA处理。
本发明的包含D-半乳糖的溶液可以选自精制D-半乳糖、来源于生物质的D-半乳糖及通过乳糖的水解得到的D-半乳糖，但不限定于此。
所述阿拉伯糖异构酶是使用金属离子作为辅助因子的金属酶(metalloenzyme)的一种，所述金属离子可以选自锰离子、镁离子及锌离子，但不限定于此，可以是与异构酶结合并能够进行异构化反应的所有金属离子。具体而言，提供所述锰离子的物质有氯化锰；提供镁离子的物质有氯化镁；以及提供锌离子的物质有氯化锌，但不限定于此。
D-塔格糖生产反应液包含诸如三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸缓冲液的用于维持pH的缓冲液系统，优选使用pH 6.5至7.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。所包含的氯化锰、氯化镁或氯化锌为0.1mM至10mM，优选为1mM至5mM。添加作为底物的D-半乳糖1g/L至300g/L，优选添加18g/L至300g/L，在60℃至95℃，优选在70℃至80℃，最为优选在72℃至78℃的反应温度下，诱导异构化反应从而生产D-塔格糖。
下面，将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例是为了更加具体地说明本发明而提出的，本领域普通技术人员应该很清楚根据本发明的宗旨，本发明的范围并不限定于这些实施例。
<实施例>
实施例1：用于制备转化活性得到提高的酶的来源于新阿波罗栖热袍菌的阿拉伯糖异构酶的蛋白质的建模及主要氨基酸变异的推测
来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068的野生型阿拉伯糖异构酶的三维结构还没公开，因此以三维结构已被公开且序列相似性高的大肠杆菌(Escherichia coli)阿拉伯糖异构酶为模板，通过蛋白质分子建模法，对三维结构进行了预测。为了预测三维结构，使用了比较建模(comparative modeling)法，并使用Tripos公司的分子建模软件包(molecular modeling package)中的APM模块(Tripos,USA)得到了结构模型。
所述比较建模(comparative modeling)法是预测蛋白质三维结构时最多使用的方法。在所需的蛋白质氨基酸序列与三维结构已被公开的其他蛋白质的序列很相似的情况下，可以利用所述方法容易地预测所需蛋白质的三维结构，在这种情况下预测准确度非常高。
所述来源于大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶的结构是使用了在蛋白质数据库(protein data bank；PDB)中以2HXG.pdb登记的、以三聚物(trimer)的形状所决定的结构。
从建模的结果，预测出来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖异构酶(氨基酸序列：SEQ ID NO:1，碱基序列：SEQ ID NO:6)与所述大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶不仅具有非常相似的碱基序列，还具有非常相似的二、三维结构。对于在大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶，通过一些研究，关于底物结合位点(substrate binding site)、作为辅助因子(cofactor)的锰离子(Mn2+)结合位点及组成其的主要氨基酸的信息已被公开(Manjasetty&Chance,J.Mol.Biol.,2006.360:297-309)，在此基础上推测了来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的阿拉伯糖异构酶的主要残基。
为了分析主要氨基酸残基，进行了蛋白质序列分析(sequence alignment)、分子对接模拟实验(molecular Docking simulation)、反应机理分析。蛋白质序列分析是以10种L-阿拉伯糖异构酶和新阿波罗栖热袍菌阿拉伯糖异构酶的序列信息为基础，利用clustalW算法(clustalW algorithm)(//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行分析。
从序列分析的结果可以得知，来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的阿拉伯糖异构酶与其他异构酶一样，金属结合位点及活性位点的序列被很好地保存得。来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的阿拉伯糖异构酶具有包含E302(第302位谷氨酸)、E329(第329位谷氨酸)、H346(第346位组氨酸)、H445(第445位组氨酸)氨基酸残基和锰离子的活性位点(active site)(图1)，所述E302、E329、H346、H445氨基酸残基会影响锰离子结合。尤其是，E302、E329残基被预测为促进异构化反应的最重要的因素(Manjasetty&Chance,J.Mol.Biol.,2006.360:297-309)。
假设来源于新阿波罗栖热袍菌的阿拉伯糖异构酶根据所述活性位点的尺寸、形状及组成它们的氨基酸残基的特性决定底物选择性。通过利用原始底物L-阿拉伯糖的分子对接模拟实验(surflexDock；Tripos,USA)，选定了对底物识别重要的残基。并且，通过反应机理分析(Adrian J.Mulholland,Drug Discov.Today.2005.10(20):1393-402)，选定了D-半乳糖的最合适的结合位置。在此基础上筛选出阻碍阿拉伯糖异构酶的活性位点和D-半乳糖的结合的高可能性的氨基酸残基。
第275位氨基酸由具有芳香族侧链、尺寸相对大、柔韧性(flexibility)低的苯丙氨酸组成，可以预测到此位点与D-半乳糖的第6位碳互相引起空间位阻(sterichindrance)(图2)。L-阿拉伯糖是五碳糖，其与D-半乳糖相比时，除了少一个碳以外，结构基本相同，因此期望只将第275位取代为其他种类的氨基酸，也能大幅度提高所述阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的反应性。
对于能够替代苯丙氨酸的氨基酸，选定了缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸，它们与苯丙氨酸具有相似的极性，尺寸相对较小，柔韧性高，从而使与D-半乳糖的第6位碳的排斥作用最小化，同时对阿拉伯糖异构酶的整体结构所引起的影响较小。
它们与包含芳香族的苯丙氨酸相比，因由非极性的脂肪族链形式组成而在结构上自由，同时期望可以取代苯丙氨酸的位置。
再次用分子建模法对发生点突变(point mutation)的变异体(氨基酸：SEQ IDNO:3至5，核酸：SEQ ID NO:8至10)的结构进行预测，结果是，上述变异对阿拉伯糖异构酶整体结构引起的影响并不明显。
并且，以所述来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖异构酶为模板(template)，通过随机的酶变异法得到了一定数量的、具有改良的酶特性的变异体及其基因信息。对这些进行综合分析，结果可以确认所述阿拉伯糖异构酶的C-末端(C-terminal)部分的氨基酸序列的变化会影响酶活性的提高。
通过分子预测法，确认阿拉伯糖异构酶的C-末端区域的链结构发生大幅度变异的现象，结果是，只将作为所述野生型阿拉伯糖异构酶的第469位氨基酸的亮氨酸取代为脯氨酸，也能期望大幅度提高所述阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的反应性。
实施例2：制备所设计的阿拉伯糖异构酶变异体
(1)作为第469位氨基酸的亮氨酸被脯氨酸取代
通过利用特定引物的定点诱变(site-directed mutagenesis)法，使来源于新阿波罗栖热袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖异构酶的第469位亮氨酸被脯氨酸取代。
使用具有突变的两个互补的碱基序列的寡核苷酸(oligonucleotide)即N-末端引物(SEQ ID NO:13)和C-末端引物(SEQ ID NO:14)作为引物。使用质粒状态的DNA作为模板，在试管中对发生新变异的质粒进行扩增、合成，然后用Dpn I限制酶切割并去除原来的野生型(wild type)DNA。即，作为模板使用的野生型DNA是从大肠杆菌分离的DNA，其会被用于识别并切割Gm6ATC的Dpn I切割，但是在试管中合成的变异DNA不会被切割。
将DNA转化到大肠杆菌DH5alpha而得到变异株，然后对变异基因的碱基序列进行分析并确认发生了正确的变异。将该变异株转化到作为最终表达菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)以制备重组菌株，然后将其命名为L469P。此后，将其用作对照组。
(2)第259位氨基酸被除了苯丙氨酸以外的氨基酸取代
为了在所述制备的变异体L469P中诱导进一步的变异，在克隆有异构酶的载体上，利用包含变异的一对引物，实施饱和突变(saturated mutagenesis)法。
所设计的一对引物被设计成第275位氨基酸密码子被NNS(N:A、T/G或C,S:G或C)取代，通过这种方法得到的变异体可以包含所有20种氨基酸(SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12)。这些变异体可以通过转化(transformation)制备成单一菌落，对它们进行筛选并分析活性，可以确认根据相应位置的20种氨基酸变异的活性的变化。
具体而言，为了构建包含20种氨基酸的库，以100ul/ml浓度的pECCG117-CJ1-TNAI_L469P质粒[韩国公开专利10-2010-0016948]作为模板，添加正向引物、反向引物并进行聚合酶链反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)。PCR反应在如下述表1及表2的条件下进行。将通过PCR反应得到的库转化(transformation)到大肠杆菌(E.coli K12DH5α)菌株并制备成菌落形态。所使用的质粒由于均能够在大肠杆菌和棒状细菌中进行复制及表达相应基因，因此在大肠杆菌中的状态下表达并直接进行了活性试验。
对由如所述得到的110个菌落表达的异构酶，用半胱氨酸-咔唑(cysteine-carbazol method；Dische,Z.,and E.Borenfreund.,A New Spectrophotometric Methodfor the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses,J.Biol.Chem.,192:583-587,1951)法分析活性，结果可以确认与对照组(L469P)相比其多数克隆具有更高的活性(图3)。
其中筛选出所测定的活性最高的10个菌落并对它们进行测序而分别确认序列的结果，如预期一样可以确认活性以缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸(氨基酸：SEQ ID NO:3至5，核酸：SEQ ID NO:8至10)的顺序提高。并且，从除了第275位氨基酸以外没有发现变异的情况来看，可以确认如假设一样第275位位置的苯丙氨酸残基起到阻碍D-半乳糖的反应性的作用。
为了解所述变异对异构酶会产生何种影响，再次用分子建模法对变异体的结构进行了预测(图4)。根据结构预测的结果，可以确认三种变异体均对二维、三维结构没有引起大幅度变化，并且代替了苯丙氨酸的位置。因此，可以期望对热稳定性及其他生产指标没有引起大幅度变化，同时提高了对D-塔格糖的反应性。
将所述变异株转化到作为最终表达菌株的谷氨酸棒状杆菌ACTC13032以制备重组菌株，然后分别命名为“谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI-2、pFIS-1-TNAI-3、pFIS-1-TNAI-4”，并于2013年2月14日分别以保藏编号KCCM11378P、KCCM11379P及KCCM11380P保藏于位于韩国首尔西大门区弘济1洞361-221号的国际保藏机构韩国菌种协会附属韩国微生物保藏中心。
表1
饱和诱变(Saturated mutagenesis)PCR
| 反应溶液的组成 | 添加量(μl) |
| PCR缓冲液(pfu-ultra)10X | 5 |
| dNTP(2.5mM) | 5 |
| pCJ1-TNAI_L469P | 1 |
| TNAI275_F引物 | 1 |
| TNAI275_R引物 | 1 |
| pfu-ultra | 1 |
| DDW | 至50μl |
表2
PCR反应条件
实施例3：阿拉伯糖异构酶在棒状杆菌属微生物中的表达
为了对筛选出的变异体的活性提高程度及在实际D-塔格糖生产中的适用可能性进行测定，将所述3种变异体在棒状杆菌属微生物中表达并进行了关于生产性及生产相关指标的研究。
将在所述实施例2中筛选出的3种变异体转化到野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)而制备了重组菌株。将这些菌株在包含50μg/ml浓度的卡那霉素(Kanamycin)的培养基(葡萄糖20g/L,多价蛋白胨(poly peptone)10g/L,酵母提取物10g/L,硫酸铵10g/L,KH2PO4 5.2g/L,K2HPO4 10.7g/L,MgSO4 0.5g/L,尿素1.5g/L,D-生物素1.8mg/L,硫胺素9mg/L,泛酸钙9mg/L,烟酰胺60mg/L)中，在30℃下培养20小时，诱导了重组阿拉伯糖异构酶变异体的表达。
为了对表达的阿拉伯糖异构酶的活性进行测定，将培养液在8000重力(g-force)下离心分离10分钟并回收菌体，然后再悬浮在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH7.5)缓冲溶液中。在常温下，用0.1％POESA对悬浮的菌体进行处理1小时，从而使细胞壁弱化。在所述条件下，再次离心分离并再次回收菌体，并再悬浮在300g/L D-半乳糖、5mM氯化锰、50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)混合溶液中，以达到4％(w/v)的浓度。将其在75℃下进行反应1小时，并为了定量D-半乳糖、D-塔格糖，进行了HPLC分析(高效液相色谱仪(WATERS HPLC),授权系统(EMPOWER system),WATERS SugarPak ID 6.5-L300mm色谱柱,2414折光率检测器(Refractive Index Detector))。
进行1小时反应，结果可以确认在相同条件下，与对照组L469P可以生产35g/L的D-塔格糖相比，变异体F275V/L469P显示121g/L·h的生产性，F275M/L469P显示117g/L·h的生产性，F275I/L469P显示101g/L·h的生产性。
实施例4：在棒状细菌中表达的阿拉伯糖异构酶变异体的分离精制及活性测定
对包含活性得到确认的3种变异体F275V/L469P、F275M/L469P、TNAI-F275I/L469P及对照组L469P的重组菌株进行种菌培养(seed culture)，然后在与实施例3相同的条件下，在2L的烧瓶中培养200mL重组菌株。为了确认阿拉伯糖异构酶表达与否，利用一部分培养液，在与实施例3相同的条件下对活性进行了测定。
将从培养液得到的菌体再悬浮在包含0.1mM氯化锰的20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)缓冲溶液中，并利用高压细胞破碎仪T-系列4.0kW(T-series4.0kW:衡量系统(Constant systems),英国)对细胞进行破碎。为了去除除了阿拉伯糖异构酶以外的内源性蛋白质(endogenous protein)，在75℃下进行热处理20分钟。在8,000重力(g-force)下通过进行10分钟的离心分离去除经过热处理的细胞残渣(cell debris)，然后在60,000重力(g-force)下进行超高速离心分离(BECKMAN COULTER Optima L-80XPUltracentrifuge)，尽可能去除了细胞残渣及脂质成分(lipid)。
利用离子交换树脂层析(阴离子交换树脂层析(anion exchangechromatography):Mono QTM 10/100GL,通用电气医疗集团(GE Healthcare))，对如上述得到的细胞破碎液(细胞抽提物(cell extract))进行精制。用结合液[binding solution,50mM NaCl,0.1mM氯化锰,20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH7.5)]进行预平衡(pre-equilibration)，然后结合过量的细胞破碎液，提高洗脱液[1M NaCl,0.1mM氯化锰,20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)]的比率的同时进行了分级。通过半胱氨酸-咔唑-硫酸法(cystein-carbazol-sulfuric acid method)来选择对D-半乳糖具有活性的级分，然后通过SDS-PAGE来进行分析。
其结果，可以确认精制的蛋白质具有约56kDa的分子量，由此可以知道其与目前已知的来源于新阿波罗栖热袍菌属的阿拉伯糖异构酶的分子量一致。通过SDS-PAGE选择精制度最好的一个级分，并利用脱盐柱(PD-10Desalting column,通用电气医疗集团(GEHealthcare))去除了高浓度的NaCl。通过SDS-PAGE分析最终确保的精制酶(图5)。利用Bradford检测法对经过分离精制的蛋白质进行定量，使用的标准蛋白质为BSA(牛血清白蛋白Bovine Serum Albumin)。
实施例5：对阿拉伯糖异构酶变异体的特性的研究
确认了在上述实施例中制备的3种阿拉伯糖异构酶变异体与将位于第469位的亮氨酸取代为脯氨酸的变异体相比具有明显提高的活性。在此结果的基础上，对与影响D-塔格糖实际生产的反应条件相关的变量进行了实验。
<5-1>对最适温度的研究
新阿波罗栖热袍菌阿拉伯糖异构酶是高度嗜热菌的酶，具有相对高的热稳定性和最适温度。由D-半乳糖生产D-塔格糖的最合适的温度条件为55℃至75℃之间，这是因为在比这个温度低的温度下会发生异种菌株的污染所带来的问题，并且在高的温度下会产生所生产的D-塔格糖的稳定性方面的问题。就目前使用的野生型阿拉伯糖异构酶或对照组L469P而言，最适反应温度为85℃，在可适用于生产工序的温度下，存在活性相对低的问题。
为了确认在所述实施例4中经过分离、精制的变异型阿拉伯糖异构酶的最适温度，在100mM D-半乳糖底物中添加经过精制的酶，并在包含1mM氯化锰(MnCl2)的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液(pH 7.5)中，在60℃至90℃的范围内以5℃的间隔对活性进行了调查。
所述活性测定是用半胱氨酸-咔唑法来进行了测定。如图6所示，观察根据温度的酶活性的结果，3种变异型阿拉伯糖异构酶的最适反应温度为75℃，其与L469P相比，移动了10℃。由此可以确认在能够适用于工序的温度范围内，异构酶的活性在整体上得到了提高，生产工序的运用范围也变得更广。
并且，从三种变异株均显示相似模式的特性来看，可以推测作为第275位氨基酸的苯丙氨酸残基的特性会影响最适反应温度。由此可以推测，这是为了确保充分的柔韧性，以在不是原始底物的D-半乳糖的反应过程中能够最小化第275位苯丙氨酸与D-半乳糖的空间位阻。随着温度的上升，苯丙氨酸的苯基残基及其周边残基的分子活动也会变得活泼，由此存在与D-半乳糖的第6位碳的空间位阻减少的可能性。同时可以预测，在对蛋白质的三维、四维结构不造成大幅度影响的范围内会形成最合适的温度。因此，基于第275位的变异而空间位阻在本质上减少的变异体中，可以出现最适温度的变化。但是为了科学地证明所述内容，需要进行额外的分析和实验。
<5-2>对热稳定性的研究
为了检测变异型阿拉伯糖异构酶的热稳定性，在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)、1mM氯化锰溶液中添加精制成20μg/ml的浓度的酶，并在95℃下，在恒温水槽中培养180分钟。用不同时间点取样的酶溶液进行酶反应，对酶的残存活性进行了测定。
对热稳定性进行调查的结果，如图7所示，可以确认异构酶变异体的残存活性在95℃下随着时间的推移会减弱，但是变异体之间的热稳定性差异并不大。为了得到更加定量的数据，对活性的半衰期(half-life)进行测定，结果可以确认L469P在所述条件下具有约3小时的半衰期，第275位变异体具有约2小时前后的半衰期(表3)。相对而言，所测定到的第275位变异体的相对热稳定性比较低，但是差异并不大，考虑到活性提高的部分和降低工序温度时的情况，可以判断为能够充分抵消的程度。
表3
在95℃下测定的阿拉伯糖异构酶的半衰期
| 变异体 | 半衰期(分) |
| L469P | 185 |
| F275V/L469P | 122 |
| F275M/L469P | 126 |
| F275I/L469P | 134 |
<5-3>关于基于金属离子效果的活性变化的研究
很多酶的催化作用需要金属离子，因此为了确认本发明的阿拉伯糖异构酶变异体的热稳定性对金属离子的依赖性，利用精制的酶，对基于金属离子的酶活性变化进行了调查。
为了调查基于浓度的酶活性变化，在100mM D-半乳糖底物中添加精制的酶，并在包含1mM至5mM浓度的氯化锰(MnCl2)的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)溶液中，在75℃下进行了10分钟的实验(图8)。其结果可以确认所有变异体在实验范围内具有相似程度的活性，并可以得知锰离子对基于酶活性所需的因素浓度的异构酶活性的影响并不大。
<5-4>关于酶活性的研究
为了测定酶反应速度，在75℃的反应温度条件下，对阿拉伯糖异构酶变异体的比活度(specific activity)进行了测定。在pH 7.5、75℃下添加1mM氯化锰、100mM D-半乳糖，然后对1mg酶的反应性进行了测定。在对应的条件下进行反应10分钟后调查比活度,结果第275位变异体的比活度与L469P相比分别高出约5.5倍(F275V)、约5倍(F275M)、约3.9倍(F275I)(表4)。
表4
变异体的比活度
[保藏编号]
保藏机构名：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM11378P
保藏日期：20130214
保藏机构名：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM11379P
保藏日期：20130214
保藏机构名：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM11380P
保藏日期：20130214
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2项)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2项)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2项)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)。
Claims (10)
1.一种阿拉伯糖异构酶变异体，其使D-半乳糖转化为D-塔格糖的活性得到提高，其中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第275位氨基酸被除了苯丙氨酸(phenylalanine)以外的氨基酸取代，第469位氨基酸被脯氨酸(proline)取代。
2.根据权利要求1所述的阿拉伯糖异构酶变异体，其特征在于，所述第275位氨基酸被选自缬氨酸(valine)、蛋氨酸(methionine)及异亮氨酸(isoleucine)中的任一种氨基酸取代。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的阿拉伯糖异构酶变异体。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10的碱基序列。
5.一种棒状杆菌属微生物，其通过包含权利要求3所述的多核苷酸的重组载体转化。
6.根据权利要求5所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
7.根据权利要求5所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI-2(KCCM11378P)、pFIS-1-TNAI-3(KCCM11379P)或pFIS-1-TNAI-4(KCCM11380P)。
8.一种D-塔格糖的制备方法，其包括培养权利要求5～7中任一项所述的棒状杆菌属微生物的步骤。
9.根据权利要求8所述的D-塔格糖的制备方法，其特征在于，在棒状杆菌属微生物存在的条件下，使包含D-半乳糖的溶液与提供金属离子的物质进行反应，其中金属离子选自氯化锰、氯化镁及氯化锌。
10.根据权利要求8所述的D-塔格糖的制备方法，其特征在于，所述氯化锰以0.1mM～10mM的浓度添加。
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