CN110997899B - 嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了一种生产赖氨酸并经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶并过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽的嗜温微生物宿主细胞。并且提供了使用所述遗传修饰的微生物生产赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

Description

嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途

背景技术

被称为酸脱羧酶类型的蛋白质是一组催化碱性氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸)的脱羧酶反应以产生多胺作为许多微生物中酸应激反应的一部分的酶。大肠杆菌(Escherichia coli)具有一些磷酸吡哆醛-依赖性(PLP)-依赖性)酸脱羧酶：CadA、LdcC、AdiA、SpeA、SpeC、SpeF、GadA和GadB。所有这些酶在窄pH范围内起作用，并且酶活性在该pH范围之外显著降低(Kanjee et al.,Biochemistry 50,9388-9398,2011)。先前已经观察到这些PLP依赖性脱羧酶二聚化以形成完整的活性位点。在某些情况下，例如CadA，二聚体形成十聚体，该十聚体聚集成最佳功能所需的较高分子量蛋白质复合物。抑制较高分子量的蛋白质复合物形成(例如，在最佳pH之外的条件下)导致功能的显著降低(Kanjee et al.,The EMBO Journal 30,931-944,2011)。

催化赖氨酸转化为尸胺的PLP依赖性脱羧酶被称为赖氨酸脱羧酶(例如，CadA、LdcC及其同源物)。赖氨酸脱羧酶是特别令人感兴趣的，因为尸胺可以是用于生产各种产物，例如1,5-五亚甲基二异氰酸酯或聚酰胺56的平台化学品。然而，尸胺的产生对宿主细胞有害，因为当尸胺的存在高于一定浓度时，其已被证明对细胞有毒性(Qian et al.,Biotechnol.Bioeng.108,93-103,2011)。因此，在赖氨酸存在下，赖氨酸脱羧酶活性的控制是尸胺以高于宿主细胞可以耐受的浓度过量产生的重要因素。

控制对细胞有毒的酶活性的现有技术方法通常涉及使用诱导型启动子来控制编码酶的基因的表达。理想的诱导型启动子系统在不存在诱导物的情况下不表现出基因表达(因此没有酶产生和活性)，并且仅在添加诱导物后才开启基因表达。这种诱导型控制提供了一种将细胞生长期与产生活性对细胞有害的酶分离的过程。细胞完成其生长期后产生有害酶降低了对细胞的毒性作用，因为大多数毒性作用主要抑制细胞生长并且对细胞功能的影响较小。在一些情况下，诱导型启动子具有渗漏(leaky)表达，这意味着即使在不存在诱导物的情况下也存在少量表达。如果细胞对酶的毒性作用极其敏感，则渗漏表达是一个问题。例如，已知某些启动子系统，例如PBAD，具有极低的渗漏表达，并且通常用于产生毒性基因(Qiu et al.,Appl.Environ.Microbiol.74,7422-7426,2008)。另一种常用的具有低渗漏表达的诱导系统是温度调节的启动子系统，例如pL或pR，其通过温度的相对升高或降低引起基因表达(Valdez-Cruz et al.,Microbial Cell Factories 9:18,2010；Qoronflehet al.,J.Bacteriol.174,7902-7909,1992)。只要系统的温度受到严格控制，温度控制的诱导系统也可以具有低渗漏表达。

虽然先前的研究集中于控制基因表达以控制毒性酶的活性，但是几乎没有关于直接控制毒性酶的活性的工作，因此即使在其底物存在下其存在也不会影响细胞生长。

发明内容

本发明部分地基于提供直接控制毒性酶活性的方法，因此即使当酶在其转化为有毒产物的底物存在下产生时也会降低毒性。本文所述的在其底物存在下直接控制酶的活性的组合物和方法也可以避免与启动子的渗漏表达相关的问题。此外，本公开的控制系统允许在生长期间正常进行蛋白质生产。

来自大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC是嗜温酶。因此，当温度超出大肠杆菌生长的最佳温度范围(25℃至55℃)时，酶的稳定性和活性显著降低(Lemmonier et al.,Microbiology 144,751-760,1998)。本公开提供产生赖氨酸并经遗传修饰以表达赖氨酸脱羧酶蛋白质的嗜温微生物(例如，大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))，该赖氨酸脱羧酶蛋白质在温度高于55℃时具有最大活性，或在温度低于20℃时具有最大活性，从而提供赖氨酸脱羧酶活性，该活性在与嗜温微生物的生长温度不同的温度最大，从而降低酶活性对生长的毒性副作用。

在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达来自嗜冷生物(psychrophile)的赖氨酸脱羧酶的酶的赖氨酸生产嗜温微生物(例如，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌)，该嗜冷生物是一种在20℃以下发挥最佳功能的微生物。嗜冷生物的实例包括Carnobacterium pleistocenium、Trichococcus patagoniensis，以及假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌属(Coliforms)、弧菌属(Vibrio)和李斯特菌属(Listeria)的某些物种。

在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达来自嗜热生物(thermophile)的赖氨酸脱羧酶的酶的赖氨酸生产嗜温微生物(例如，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌)，该嗜热生物是一种在55℃以上发挥最佳功能的微生物。嗜热生物的实例包括Aeropyrum pernix、Caldococcus litoralis；土芽孢杆菌属(Geobacillus)、Gracilibacillus属、Tepidanaerobacter属、Thermosynechoccus属和Thermomicrobium属的某些物种；以及产水菌目(Aquificales)、热袍菌目(Thermotogales)、硫化叶菌目(Sulfolobales)、热变形菌目(Thermoproteales)、脱硫球菌目(Desulfurococcales)、Pyrodictiales目、热球菌目(Thermococcales)、古球菌目(Archaeoglobales)、Methanococales目、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)的某些物种。

在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达嗜温酶(例如来自大肠杆菌的CadA或LdcC)，或相应的嗜温赖氨酸脱羧酶(例如来自克雷伯菌属(Klebsiella)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)的CadA)的嗜热赖氨酸生产微生物。来自其他嗜温物种的其他CadA多肽包括沙雷菌属物种(Serratia sp.),WP033635725.1；和Raoultella ornithinolytica，YP 007874766.1。在一些实施方案中，可以对嗜热宿主细胞进行遗传修饰以表达嗜冷赖氨酸脱羧酶的酶。一旦赖氨酸产生在经修饰以表达嗜温赖氨酸脱羧酶的嗜热宿主中完成，可将温度调节至20℃至55℃之间以启动赖氨酸脱羧酶活性。在其中嗜热宿主被修饰以表达嗜冷赖氨酸脱羧酶的实施方案中，一旦赖氨酸产生完成，可将温度调节至低于约20℃以增加赖氨酸脱羧酶活性。

类似地，在其中嗜冷生物是赖氨酸生产宿主的本公开的实施方案中，然后可以使用嗜温酶例如大肠杆菌CadA或LdcC或来自另一种嗜温宿主细胞的相应酶作为针对赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质开关(switch)。在嗜冷生物最佳生长所需的低温下(<20℃)，嗜温酶在产生赖氨酸时具有低活性。一旦赖氨酸生产完成，温度便可以改变到20℃至55℃之间的温度，以启动赖氨酸脱羧酶活性。类似地，也可以使用嗜冷宿主中的嗜热酶，其中生长在低于20℃发生，并且催化在高于55℃的温度进行。

在另一方面，本发明提供经遗传修饰以表达来自嗜热生物的赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶来自Tepidanaerobacter syntrophicus、Geobacillus kaustophilus、Thermosynechoccus elongatus、或Thermomicrobiumroseum。在典型的实施方案中，宿主细胞也经遗传修饰以过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，嗜温宿主细胞是细菌。例如，在一些实施方案中，宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)、或棒杆菌属(Corynebacteria)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

在再一方面，可以使用根据本发明修饰的宿主细胞的培养物来生产尸胺。因此，在一些方面，该方法包括培养嗜温宿主细胞，其可产生赖氨酸并经遗传修饰以在约20℃至约50℃(例如，约25℃至约42℃)之间的温度表达嗜热赖氨酸脱羧酶，持续足以产生赖氨酸的一段时间；然后孵育宿主细胞，并且温度高于约50℃(例如高于约55℃但低于约110℃)。在一些实施方案中，温度为约55℃至约90℃。

在典型的实施方案中，在细胞在较低温度(例如，约20℃至约50℃；或约25℃至约42℃)完成对数生长并进入稳定期之后发生从赖氨酸生产阶段到尸胺生产阶段的转变(即，表征尸胺生产阶段相对于赖氨酸生产阶段的温度升高)。在一些实施方案中，在温度从较低温度向较高温度的转变下，通过发酵中剩余的葡萄糖的量测定嗜热赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，为了使生产率最大化，在葡萄糖转化为赖氨酸之后发生向更高温度的转变。

在一个方面，本发明因此提供产生赖氨酸并经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶并过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽的嗜温微生物宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含编码一种或多种赖氨酸生物合成多肽的合成操纵子多核苷酸。在一些实施方案中，修饰宿主细胞以过表达至少六种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含两种或更多种合成操纵子，所述合成操纵子包含编码至少六种赖氨酸生物合成多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，与未经遗传修饰以表达外源多核苷酸的对应宿主细胞相比，宿主细胞经遗传修饰以表达外源链霉菌属(Streptomyces)lysC、大肠杆菌dapAB、lysA、asd、aspC和tetA多核苷酸以增加赖氨酸的表达。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有至少70％的氨基酸序列相同性，或至少80％、至少85％、或至少90％的序列相同性。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有至少95％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO：1-4中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，嗜温微生物宿主细胞是细菌。在一些实施方案中，宿主细胞来自埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒杆菌属。在示例性实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌。

另一方面，本发明提供一种生产尸胺的方法，该方法包括：(a)在约20℃至约50℃的温度培养如前段所述的嗜温微生物宿主细胞，持续一段足以积累赖氨酸的时间；(b)在步骤(a)之后，在高于约55℃且低于约110℃的温度孵育(a)的培养物。在一些实施方案中，在约25℃至约45℃的温度进行步骤(a)。在其他实施方案中，在约30℃至约40℃的温度进行步骤(a)。在进一步的实施方案中，在约35℃至约39℃的温度进行步骤(a)。在一些实施方案中，在约55℃至约90℃的温度进行步骤(b)。在其他的实施方案中，在约60℃至约75℃的温度进行步骤(b)。在进一步的实施方案中，在约60℃至约70℃的温度进行步骤(b)。

另一方面，本发明提供了一种生产尸胺的方法，该方法包括在高于约55℃且低于约110℃的温度在体外反应中将含赖氨酸组合物与嗜热赖氨酸脱羧酶孵育。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶由嗜温微生物表达。在一些实施方案中，将嗜热赖氨酸脱羧酶固定在固体支持物上。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有至少70％的氨基酸序列相同性，或至少80％、至少85％、或至少90％的序列相同性。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有至少95％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO：1-4中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，温度高于约55℃且低于约90℃。在其他实施方案中，温度为约60℃至约75℃。在进一步的实施方案中，温度为约60℃至约70℃。

附图说明

图1显示了大肠杆菌LdcC和CadA多肽序列与来自Tepidanaerobactersyntrophicus(SEQ ID NO：1，由GenBank ID GAQ24853.1编码)、Geobacilluskaustophilus(SEQ ID NO：2，由GenBank ID BAD75350.1编码)、Thermosynechoccuselongatus(SEQ ID NO：3，由GenBank ID BAC09418.1编码)和Thermomicrobium roseum(SEQ ID NO：4，由GenBank ID ACM05730.1编码)的赖氨酸脱羧酶多肽序列的CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比对。

具体实施方式

在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以进行改变。还应该理解此处使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，而并非进行限制。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物和登录号均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

术语

如在本公开的上下文中所使用的，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”是指来自嗜热生物的催化L-赖氨酸的脱羧以产生尸胺的PLP依赖性赖氨酸脱羧酶。嗜热赖氨酸脱羧酶在高于约55℃时发挥最佳功能。有助于热稳定性的结构机制描述于，例如Vieille&ZeikusMicrobiology and Molecular Biology Reviews,65(1),p.1-43,2001中。嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的特征结构域包括吡哆醛5'-磷酸结合袋和保守结构域：OKR_DC_1_C(Orn/Lys/Arg脱羧酶、C-末端结构域；PFAM 03711；超家族cl27246)。这些酶是本领域已知的。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶包括Tepidanaerobacter syntrophicus赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号GAQ24853)、Geobacillus kaustophilus赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号BAD75350)、Thermosynechoccus elongatus赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号BAC09418)；Thermomicrobium roseum赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号ACM05730)；Geobacilluskaustophilis赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号BAD74308)；Gracilibacillus halophiles赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号ENH96106)；Geobacillus thermoleovorans赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号AEV18557)；Ruminiclostridium thermocellus赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号ADU75593)；Caldicellulosiruptor obsidians赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号ADL43096)；Parageobacillus genomesp.1赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号EZP77891)；和Anoxybacillus flavithermus赖氨酸脱羧酶(GenBank登录号EMT45272)。

在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶来自Tepidanaerobacter syntrophicus、Geobacillus kaustophilus、Thermosynechoccus elongatus或Thermomicrobium roseum；或这种赖氨酸脱羧酶的酶的生物活性变体。生物活性变体包括多肽的等位基因、片段和种间同源物。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列包括来自以下的赖氨酸脱羧酶：Tepidanaerobacter syntrophicus(SEQ ID NO：1，由GenBank ID GAQ24853.1编码)、Geobacillus kaustophilus(SEQ ID NO：2，由GenBank ID BAD75350.1编码)、Thermosynechoccus elongatus(SEQ ID NO：3，由GenBank ID BAC09418.1编码)和Thermomicrobium roseum(SEQ ID NO：4，由GenBank ID ACM05730.1编码)。

在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在至少约200、300、或400或更多氨基酸的区域上与天然存在的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列具有至少60％的氨基酸序列相同性，通常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％的相同性；常常至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在序列的长度上与天然存在的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列具有至少90％的相同性；常常至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的多肽的长度上具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％，94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。

如本文所用的“嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸”是指编码如前段中所述的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸。编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸或多核苷酸是指基因、前mRNA、mRNA等，包括编码变体、等位基因和片段的核酸。编码SEQ ID NO：1、2、3和4的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列的示例性核酸序列分别在SEQ ID NO：5、6、7和8中提供。

如本文所用，在产生氨基酸衍生物(例如，尸胺)的背景下，术语“增强的”或“改进的”是指与未经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的相同菌株的对照对应微生物相比，由遗传修饰的嗜温微生物产生的氨基酸衍生物的产生增加，该微生物经修饰以在约50℃但低于约110℃的温度表达如本文所述的嗜热赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，对照对应微生物属于相同菌株，但与经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的菌株相比，其经修饰以过表达嗜温赖氨酸脱羧酶。在一个实施方案中，与对照相比，由遗传修饰的微生物产生的氨基酸衍生物(例如，尸胺)改进了至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多。可以通过在相同条件下通过测量由经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞和对照细胞的氨基酸衍生物(例如，尸胺)的产生来评估生产的增加，所述相同的条件包括在约50℃和低于约110℃的温度孵育培养物或培养细胞的提取物，例如，持续至少一小时，例如2、3、4、5或6小时的一段时间。举例来说，在一些实施方案中，相比于经修饰以表达嗜温赖氨酸脱羧酶的相同菌株的对照细胞，通过在嗜温条件下(例如，在30°至40℃)培养经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞持续一段时间(例如，过夜，足以产生赖氨酸)，来测试氨基酸衍生物(例如，尸胺)的产生。然后裂解宿主细胞。将来自裂解细胞的上清液的等分试样在嗜热温度(例如，65℃)与赖氨酸-HCl和PLP一起孵育4小时至终浓度为160g/L和0.1mM。然后可以测量和比较来自对照细胞和经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的细胞的细胞裂解物的尸胺生产。在实施例部分中提供了示例性测定。

当在编号给定氨基酸或多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“参照...编号”，或“对应于”或“参照...确定”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时的特定参考序列的残基的编号。例如，变体嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列的位置在当变体多肽以最大比对与参考多肽序列比对时“对应于”参考多肽序列SEQ ID NO：1中的位置(或在SEQ IDNO：2、3、4或9的参考多肽序列的位置)。

关于嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的术语“野生型”、“天然的”和“天然存在的”在本文中用于指具有天然存在的序列的嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且是指从5'至3'末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。用于本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，但在某些情况下，可以使用可具有替换骨架(包含例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstei，Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach,Oxford University Press))；带正电的骨架；非离子骨架和非核糖骨架的核酸类似物。核酸或多核苷酸还可包括允许聚合酶正确连读的修饰的核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括核酸的有义链和反义链，以及单独的单链或双链体。如本领域技术人员所理解的，单链的描述也定义了互补链的序列；因此，本文描述的序列也提供序列的互补序列。除非另有说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂交体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。

在本公开的上下文中用于两种核酸或多肽的术语“基本上相同”是指与参考序列具有至少50％序列相同性的序列。百分比相同性可以是从50％到100％之间的任何整数。与使用本文所述程序的参考序列相比，一些实施方案包括至少：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；优选使用标准参数进行BLAST，如下所述。

如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列在如下所述进行最大对应比对时是相同的，则称两个核酸序列或多肽序列是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的情况中，术语“相同”或百分比“相同性”是指当在比较窗口进行最大对应比较和比对时(如使用以下序列比较算法或通过人工比对和目检所测量的)，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。

对于序列比较，通常一条序列充当参考序列,测试序列与之比较。当利用序列比较算法时，将测试和参考序列都输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，也可指定替代参数。然后，依据程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。

一种可用于确定嗜热赖氨酸脱羧酶多肽是否与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的任一个具有序列相同性的算法是BLAST算法，其描述于Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-10。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，网址ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。用于进行蛋白质序列比对的示例性软件包括ClustalW2和BLASTP。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字大小(W)为3，期望阈值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。在本公开中，通常使用默认参数的BLASTP Align Sequence确定多肽序列相同性。

如本文所用，“比较窗口”包括指选自以下的连续位置的任何一个数量的区段：20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数量连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman&Wunsch，Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的检索相似性方法进行，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)进行，或通过人工比对和目检进行。通常使用默认参数的BLASTP进行最佳比对。

与参考序列基本上相同的核酸或蛋白质序列包括“保守修饰的变体”。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或实质相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指实质相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。

如本文所用的术语“多肽”包括指含有天然存在的氨基酸和氨基酸主链以及非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物的多肽。

关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到在编码序列中改变单个氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列中的各个取代是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致一个氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。以这种方式定义的氨基酸基团的实例可包括：“带电荷/极性组”包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳香族或环状组”包括Pro(脯氨酸或P)、Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)和Trp(色氨酸或W)；以及“脂肪族组”包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每组中，也可以鉴定亚组。例如，带电荷/极性氨基酸组可以细分为亚组，包括：包含Lys、Arg和His的“带正电荷亚组”；包含Glu和Asp的“带负电亚组”；和包含Asn和Gln的“极性亚组”。在另一个实例中，芳香族或环状组可以细分为亚组，包括：包含Pro、His和Trp的“氮环亚组”；和包含Phe和Tyr的“苯基亚组”。在另一个实例中，脂肪族组可以细分为亚组，包括：包含Val、Leu和Ile的“大脂肪族非极性亚组”；包含Met、Ser、Thr和Cys的“脂肪族微极性亚组”；包含Gly和Ala的“小残基亚组”。保守突变的实例包括上述亚组内氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：Arg取代Lys，或反之亦然，使得可以保持正电荷；Asp取代Glu，或反之亦然，使得可以保持负电荷；Thr取代Ser，或反之亦然，使得可以保持游离的-OH；和Asn取代Gln，或反之亦然，使得可以保持游离的-NH2。以下六组各自含有氨基酸，其进一步提供彼此的示例性保守取代。1)Ala、Ser、Thr；2)Asp、Glu；3)Asn、Gln；4)Arg、Lys；5)Ile、Leu、Met、Val；和6)Phe、Try和Trp(参见例如Creighton，Proteins(1984))。在一些实施方案中，保守取代用于产生在谷氨酸残基以外的位点具有取代的Cada变体。

如本文所用，术语“启动子”是指能够驱动核酸序列在细胞中转录的多核苷酸序列。因此，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式和反式作用转录控制元件和调节序列，其参与调节或调控基因转录的时间和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、阻遏物结合序列等。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调节、调控等)基因转录。大多数情况下，核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更常见的是在1kbp内，并且通常位于翻译起始位点的500bp或200bp或更少以内。按照惯例，通常以启动子序列控制的基因编码链上的序列提供启动子序列。在本申请中，启动子通常通过其天然调节表达的基因的名称来指代。用于本发明的表达构建体的启动子用基因名称指代。通过名称指代启动子包括野生型、天然启动子，以及保留诱导表达能力的启动子的变体。通过名称指代启动子不限于特定物种，还包括来自其他物种中相应基因的启动子。

本发明中的“组成型启动子”是指能够在细胞中的大多数条件下，例如在不存在诱导分子的情况下启动转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导剂分子存在时启动转录。

如果多核苷酸源自外来物种，或者如果多核苷酸来自相同物种但在其原始形式上进行修饰，则该多核苷酸对于生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，当称编码多肽序列的多核苷酸与异源启动子可操作地连接时，它意味着编码所述多肽的所述多核苷酸编码序列衍生自一个物种，而所述启动子序列衍生自另一个不同物种；或者，如果两者都衍生自相同物种，则所述编码序列不与所述启动子天然相关(例如是基因工程化的编码序列，例如来自相同物种中的不同基因，或来自不同物种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生多肽，则该多肽对于该宿主细胞是“异源的”。

术语“外源”通常是指不天然存在于野生型细胞或生物体中但通常通过分子生物学技术引入细胞(即工程化以产生重组微生物)的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。

术语“内源”是指天然存在的多核苷酸序列或多肽，其可以在给定的野生型细胞或生物体中发现。在这方面，还应注意，即使生物体可包含给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，引入编码该序列的质粒或载体如过表达所编码蛋白质或以其他方式调节所编码蛋白质的表达代表了该基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝。本文描述的任何通路、基因或酶可以利用或依赖“内源”序列，其可以一种或多种“外源”多核苷酸序列提供，或以两种提供。

如本文所用的“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指核酸聚合物，其中以下的至少一种是真实的：(a)核酸序列对于给定的宿主细胞是外源的(即在给定宿主细胞中并非天然发现的)；(b)该序列可以在给定的宿主细胞中天然存在，但是以非天然(例如大于预期)的量存在；或(c)核酸序列包含两个或更多个在自然界中彼此没有相同关系的子序列。例如，对于(c)情况，重组核酸序列可以具有来自无关基因的两个或更多个序列，其被排列以产生新的功能性核酸。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调控DNA或RNA序列的转录，则所述启动子或增强子序列与所述DNA或RNA序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与所述转录序列是物理地邻近，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要物理地邻近或不需要位于与其增强转录的编码序列非常接近的位置。

术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”是指核酸构建体，当其被引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在表达转基因的情况下，技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不需要是相同的，但可以仅与衍生它的基因的序列基本上相同。如本文所解释的，这些基本上相同的变体在提及特定核酸序列时被特别涵盖。表达盒的一个实例是多核苷酸构建体，其包含编码与启动子(例如其天然启动子)可操作地连接的本发明多肽的多核苷酸序列，其中表达盒被引入异源微生物中。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸靶向微生物基因组中的位置，使得所述多核苷酸序列的表达由存在于所述微生物中的启动子驱动。

在本发明中使用的术语“宿主细胞”是指微生物并且包括可以是或已经是本发明的任何(一或多个)重组载体或(一或多个)分离的多核苷酸的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的、或有意的突变和/或变化，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或在总DNA互补序列上)。宿主细胞包括已经引入了本发明的重组载体或多核苷酸的细胞，所述引入包括通过转化、转染等。

术语“分离的”是指基本上或实质上不含有在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”可以指与在其天然存在状态或基因组状态时在其侧翼的序列分离的多核苷酸，例如DNA片段，其从通常与该片段相邻的序列取出，例如通过克隆到载体中。例如，如果将多核苷酸克隆到不是自然环境一部分的载体中，或者如果以与其天然存在状态不同的方式人工引入到细胞的基因组中，则认为多核苷酸是分离的。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等可以指不含细胞其他组分的多肽分子，即它与体内细胞物质不相关。

本发明采用各种常规重组核酸技术。通常，下文描述的重组DNA技术中的命名法和实验室程序是本领域通常采用的。可以获得许多提供进行重组DNA操作指导的手册，例如Sambrook&Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd Ed，2001)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人,John Wiley and Sons,New York,2009-2016)。

本公开某些方面的概述

在一个方面，本发明提供经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的遗传修饰的嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1、2、3或4的嗜热赖氨酸脱羧酶；或者如本文所述其中的部分。

嗜热赖氨酸脱羧酶多肽

嗜热赖氨酸脱羧酶是已知的，并且是如上所述的充分表征的脱羧酶家族的一部分。通过举例说明本发明，提供了来自四种具有非常不同的遗传背景的嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶多肽。四种示例性嗜热生物是Tepidanaerobacter syntrophicus(GenBank IDGAQ24853.1)、Geobacillus kaustophilus(GenBank ID BAD75350.1)、Thermosynechoccuselongatus(GenBank ID BAC09418.1)和Thermomicrobium roseum(GenBank IDACM05730.1)。由基因编码的多肽序列分别在SEQ ID NO：1、2、3和4中提供。来自这四种嗜热生物的赖氨酸脱羧酶的酶和来自大肠杆菌的CadA和LdcC的蛋白质序列比对在蛋白质序列中显示微小的相似性(图1)。虽然大肠杆菌CadA和LdcC具有69％的序列相同性，但四种嗜热赖氨酸脱羧酶、CadA和LdcC之间的序列相同性范围为23.61％至38.44％。嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质序列也显著短于它们的嗜温对应物。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶长度为420至500个氨基酸，而嗜温赖氨酸脱羧酶长度超过700个氨基酸。

尽管这六种蛋白质之间共享的总体序列相同性低且它们的大小不同，但仍存在保守结构域和结构基序。首先，在嗜温赖氨酸脱羧酶中发现的氨基酸位置367处的保守赖氨酸残基(用大肠杆菌CadA多肽序列(SEQ ID NO：9)测定)是保守的。此外，对于结合嗜温酶中的PLP重要的七个残基中的四个在四种嗜热酶：S364、H366、T398、S400中也是保守的。此外，对于结合PLP(S221和T399)重要的七个氨基酸残基中的两个在嗜热酶的相应位置具有丝氨酸或苏氨酸。对于结合PLP(T220)重要的七个氨基酸残基中的最后一个在嗜热酶中也具有丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。此外，对增强PLP拉电子(electron withdrawing)能力重要的三个残基中，有两个是保守的-D330和H245。虽然W333不是保守的，但是其被具有相似极性强度的氨基酸-嗜热多肽序列中的色氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸置换。因此，尽管嗜热和嗜温酶的大小存在显著差异，但在活性位点残基中存在高度保守性。对ppGpp抑制CadA重要的氨基酸残基，例如R206、R558、R565和R568在嗜热酶中不是保守的，这表明嗜热对应物不受警报素(alarmone)ppGpp的抑制。

在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含前段中描述的保守或半保守残基(SEQ ID NO：9的T220、S221、H245、D330、W333、S364、H366、K367、T398、T399和S400，其分别对应于SEQ ID NO：1的氨基酸A94、T95、H119、D199、Q202、S226、H228、K229、T261、S262和S263)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在SEQ ID NO：1的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。

在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(SEQ ID NO：9的T220、S221、H245、D330、W333、S364、H366、K367、T398、T399和S400，其分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸T90、S91、H115、D195、H198、S223、H225、K226、T258、T259和S260)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在SEQID NO：2的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。

在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(SEQ ID NO：9的T220、S221、H245、D330、W333、S364、H366、K367、T398、T399和S400，其分别对应于SEQ ID NO：3的氨基酸A56、T57、H81、D161、H164、S189、H191、K192、T224、S225和S226)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在SEQID NO：3的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。

在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(SEQ ID NO：9的T220、S221、H245、D330、W333、S364、H366、K367、T398、T399和S400，其分别对应于SEQ ID NO：4的氨基酸S92、T93、H117、D197、W200、S225、H227、K228、T260、T261和S262)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在SEQID NO：4的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。

编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸

可通过许多技术完成嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列的分离或生成。在一些实施方案中，寡核苷酸探针和基于本文公开的序列可用于鉴定来自所需细菌物种的cDNA或基因组DNA文库中的所需多核苷酸。为了生成嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的变体，可以使用合适的引物将所需的取代引入编码天然嗜热赖氨酸脱羧酶序列的多核苷酸序列中。

用于鉴定嗜热微生物中的赖氨酸脱羧酶多核苷酸的合适的引物和探针可以通过比较本文提供的序列产生，或基于来自另一细菌的CadA多核苷酸序列产生。有关PCR的一般综述，请参阅PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.and White,T.,eds.),Academic Press,San Diego(1990)。示例性引物序列显示在实施例部分的引物表中。

编码用于本公开的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸序列包括通过使用示例性核酸序列(例如，SEQ ID NO：5-8中的任何一个的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列)，通过技术例如杂交和/或序列分析鉴定和表征的基因和基因产物。在一些实施方案中，通过引入与SEQID NO：5-8中任一个的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸具有至少60％相同性，或至少70％、75％、80％、85％或90％相同性，或95％相同性或更高的核酸序列来遗传修饰宿主细胞。

编码根据本发明的嗜热赖氨酸脱羧酶的核酸序列可另外进行密码子优化以在所需的嗜温宿主细胞中表达。可以采用的方法和数据库是本领域已知的。例如，可以确定与单个基因、一组共同功能或起源的基因、高表达的基因中的密码子使用，整个生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率，相关生物体的聚集蛋白编码区密码子频率或其组合相关的优选密码子。参见例如Henaut and Danchin的"Escherichia coli and Salmonella,"Neidhardt,et al.Eds.,ASM Pres,Washington D.C.(1996),pp.2047-2066；NucleicAcids Res.20:2111-2118；Nakamura et al.,2000,Nucl.Acids Res.28:292)。编码SEQ IDNO：1-4的多肽的示例性密码子优化的核酸序列分别在SEQ ID NO：5-8中提供。

用作本发明中使用的嗜热生物赖氨酸脱羧酶序列来源的嗜热生物可以是任何嗜热微生物，包括但不限于嗜热生物Aeropyrum pernix、Caldococcus litoralis；焦球菌属(Pyrococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、Gracilibacillus属、Tepidanaerobacter属、Thermosynechoccus属和Thermomicrobium属的嗜热物种；以及产水菌目(Aquificales)、热袍菌目(Thermotogales)、硫化叶菌目(Sulfolobales)、热变形菌目(Thermoproteales)、脱硫球菌目(Desulfurococcales)、Pyrodictiales目、热球菌目(Thermococcales)、古球菌目(Archaeoglobales)、Methanococales目、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)的嗜热物种。

重组载体的制备

可以使用本领域熟知的方法制备用于表达嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质的重组载体。例如，编码嗜热赖氨酸脱羧酶的DNA序列可以与转录和其他调节序列组合，所述调节序列将指导来自基因的序列在预期的嗜温宿主细胞(例如细菌细胞如蜂房哈夫尼菌、大肠杆菌、或谷氨酸棒杆菌)中的转录。在一些实施方案中，包含表达盒的表达载体还包含与编码多肽的核酸序列可操作地连接的启动子，其中该表达盒包含编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的基因。在其他实施方案中，指导编码赖氨酸脱羧酶多肽的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸的转录的启动子和/或其他调节元件对宿主细胞是内源的，并且例如通过同源重组引入包含该基因的表达盒，使得外源基因与内源启动子可操作地连接，并且表达由内源启动子驱动。

如上所述，编码嗜热赖氨酸脱羧酶变体多肽的多核苷酸的表达可以许多调节序列(包括启动子，其可以是组成型或诱导型；并且，任选地，如果需要，可以包括阻遏物序列)控制。合适的启动子，特别是在细菌宿主细胞中的实例是从大肠杆菌lac操纵子获得的启动子，和衍生自参与其他糖(例如阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和麦芽糖)代谢的基因的其他启动子。额外的实例包括启动子，例如trp启动子、bla启动子、噬菌体λPL、tet启动子和T5。另外，可以使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利号4,551,433)。启动子的其他实例包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因。Ausubel和Sambrook&Russell(同上)中描述了合适的启动子。额外的启动子包括Jensen&Hammer,Appl.Environ.Microbiol.64:82,1998；Shimada,等人,J.Bacteriol.186:7112,2004；和Miksch等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:312,2005描述的启动子。

表达载体还可以包含影响编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸表达的额外序列。此类序列包括增强子序列、核糖体结合位点或其他序列例如转录终止序列等。

表达编码本发明的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体(例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体)复制。载体可包含保证自我复制的任何方式。或者，载体可以是这样的载体，当其被引入宿主时，整合到基因组中并与其整合进的(一或多个)染色体一起复制。因此，表达载体可额外含有允许载体整合到宿主基因组中的(一或多个)元件。

本发明的表达载体优选含有一个或多个选择标记，其允许容易地选择转化的宿主。例如，表达载体可以包含赋予重组宿主生物体(例如细菌细胞，如大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌)抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。

尽管可以使用任何合适的表达载体掺入所需序列，但容易获得的细菌表达载体包括但不限于：质粒，例如pSClO1、pBR322、pBBR1MCS-3、pUR、pET、pEX、pMR1OO、pCR4、pBAD24、p15a、pACYC、pUC，例如pUC18或pUC19，或衍生自这些质粒的质粒；和噬菌体，例如M1 3噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定表达载体是否适合于任何给定的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞中，然后监测载体中包含的序列的存活力和表达。

可以使用任何数量熟知的方法将本发明的表达载体引入宿主细胞，包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其他方法。

宿主细胞

本发明提供了经遗传修饰的嗜温宿主细胞，其被工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽。相对于不具有一种额外遗传修饰的对照菌株(例如野生型菌株、或没有一种额外遗传修饰的相同菌株的细胞)，本发明的遗传修饰的嗜温宿主菌株通常包含至少一种额外的遗传修饰以增强氨基酸或氨基酸衍生物的产生。“增强氨基酸或氨基酸衍生物产生的额外的遗传修饰”可以是任何遗传修饰。在一些实施方案中，遗传修饰是引入表达参与氨基酸或氨基酸衍生物合成的酶的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含多种修饰，以相对于野生型宿主细胞增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生。

在一些方面，嗜温宿主细胞用以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的遗传修饰与修饰宿主细胞以过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽一起进行。本文中使用的术语“过表达”是指与不具有遗传修饰的对应细胞(即没有修饰的相同菌株的细胞)中的多肽量相比较，遗传修饰的细胞(例如，引入了编码赖氨酸生物合成多肽的表达构建体的细胞)中赖氨酸生物合成多肽的量增加。表达水平的增加通常为与对应的未修饰细胞相比，至少5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。未修饰的细胞不需要表达多肽。因此，术语“过表达”还包括其中多肽在不天然表达该多肽的宿主细胞中表达的实施方案。可以通过任何数量的测定来评估多肽表达的增加，包括但不限于测量从编码多肽的基因转录的RNA水平、多肽水平和/或多肽活性水平。

在一些实施方案中，可以对宿主细胞进行遗传修饰以表达影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽。赖氨酸生物合成多肽的实例包括大肠杆菌基因SucA、Ppc、AspC、LysC、Asd、DapA、DapB、DapD、ArgD、DapE、DapF、LysA、Ddh、PntAB、CyoABE、GadAB、YbjE、GdhA、GltA、SucC、GadC、AcnB、PflB、ThrA、AceA、AceB、GltB、AceE、SdhA、MurE、SpeE、SpeG、PuuA、PuuP和YgjG，或来自其他生物体的相应基因。这些基因是本领域已知的(参见例如Shah等人,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents on Biotechnol.1:11-24,2007)。还参见Kind等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011，其综述与尸胺产生有关的基因。编码赖氨酸生物合成多肽的示例性基因如下。

在一些实施方案中，可以对宿主细胞进行遗传修饰以减弱或降低影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽的表达。此类多肽的实例包括大肠杆菌基因Pck、Pgi、DeaD、CitE、MenE、PoxB、AceA、AceB、AceE、RpoC和ThrA，或来自其他生物体的相应基因。这些基因是本领域已知的(参见例如Shah等人,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.RecentPatents on Biotechnol.1:11-24,2007)。还参见Kind等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011，其综述基因减弱以增加尸胺产成。编码多肽(其减弱增加赖氨酸生物合成)的示例性基因如下。

编码赖氨酸生物合成多肽的核酸可与编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸一起引入宿主细胞中，例如，在单一表达载体上编码，或以多个表达载体同时引入。或者，可以在遗传修饰宿主细胞表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽之前或之后，对宿主细胞进行遗传修饰过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。

在一些实施方案中，经工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞经工程化以表达一种或多种包含编码用于赖氨酸产生的蛋白质的多种基因的赖氨酸合成操纵子。这些基因可以掺入多于一个的合成操纵子中，例如，每个操纵子可以包含约3kb的长度。因此，例如，示例性赖氨酸合成操纵子(I和II)可包括六个基因，例如链霉菌属(Streptomyces)lysC、大肠杆菌dapAB、lysA、asd、aspC和tetA核酸序列，其中每个操纵子包含三个基因。

工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的宿主细胞通常是细菌宿主细胞。在典型的实施方案中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，细菌是肠细菌。在本发明的一些实施方案中，细菌是棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Cronobacter、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、哈夫尼菌属(Hafnia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、摩根氏菌属(Morganella)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)分类学纲的物种。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属(Shewanella)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒杆菌属(Corynebacterium)的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。在一些实施方案中，宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)；或另一芽孢杆菌属物种，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、B.amovovorans、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、B.caldolyticus、环状芽孢杆菌(B.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或B.vulgatis。

如本文所述，可以针对增加的赖氨酸或赖氨酸衍生物(例如尸胺)的产生筛选根据本发明修饰的宿主细胞。

在一些实施方案中，可以从表达变体多肽的宿主细胞中回收嗜热赖氨酸脱羧酶多肽。在一些实施方案中，可以将回收的变体蛋白固定在固体基质或惰性材料上。

产生赖氨酸衍生物的方法。

如本文所用，术语“约”在用于修饰温度范围中的数值时表示该数值与该值的合理偏差(例如，在该范围中所述的值以下或以上1°或2°以内)在所述值或范围的预期含义内。

经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的嗜温宿主细胞可用于产生赖氨酸或赖氨酸衍生物，例如，尸胺。为了产生尸胺，可以在适于允许多肽表达和编码用于产生赖氨酸的酶的基因表达的条件下培养如本文所述的经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的宿主细胞。使嗜温宿主细胞产生赖氨酸的培养在适合于嗜温宿主细胞生长的温度进行。在一些实施方案中，在约20℃至约50℃的温度培养嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，在约25℃至约45℃的温度培养宿主。在一些实施方案中，在约30℃至约42℃或约30℃至约40℃的温度培养嗜温宿主细胞。宿主细胞通常在适于产生赖氨酸的温度培养足够长的时间以使赖氨酸产生完成。在典型的实施方案中，允许细胞生长直至稳定期，此时可以监测培养基中葡萄糖的量。然后将培养物在所需时间(例如，当葡萄糖被最低限度检测时)转变到嗜热赖氨酸脱羧酶有活性的较高温度。

如上所述，在适合于嗜温生物生长以产生赖氨酸的温度下培养遗传修饰的宿主细胞，然后在嗜热赖氨酸脱羧酶有活性的温度(例如，在高于约55℃但低于约110℃的温度)孵育宿主细胞。在一些实施方案中，在高于约55℃至约90℃的温度范围培养细胞。在一些实施方案中，在约60℃至约70℃的温度范围培养细胞。

根据本发明修饰的嗜温宿主细胞在适于嗜温细胞生长的较低温度培养一段足以累积赖氨酸的时间，然后在适于支持由宿主细胞表达的嗜热赖氨酸脱羧酶活性的温度培养，该培养例如通过降低赖氨酸脱羧酶活性对细胞生长的毒副作用改善赖氨酸的产生。

可以使用熟知的技术培养宿主细胞(参见例如实施例部分中提供的示例性条件)。

在一些实施方案中，使用非盐(例如硫酸铵或氯化铵)的氮源(例如氨或尿素)培养宿主细胞。

然后使用已知技术分离和纯化赖氨酸或赖氨酸衍生物。根据本发明生产的赖氨酸或赖氨酸衍生物例如尸胺，然后可以用于任何已知方法，例如生产聚酰胺。

在一些实施方案中，可以使用化学催化剂，或通过使用酶和化学催化剂，将赖氨酸转化为己内酰胺。

本发明将通过具体实施例被更详细地描述。提供以下实施例用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键参数，其可以被改变或修改以产生基本相同的结果。

实施例

实施例1：构建编码CadA的质粒载体。

含有野生型大肠杆菌cadA(SEQ ID NO：10)(其编码赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ IDNO：9))的质粒载体使用PCR引物cadA-F和cadA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA中扩增，使用限制酶SacI和XbaI消化该质粒，并连接到pUC18中以产生质粒pCIB60。使用PCR引物cadA-F2和cadA-R2优化cadA基因上游的5'序列以产生pCIB71。使用引物cat-HindIII-F和cat-NdeI-R扩增氯霉素抗性基因cat，并将其克隆到pCIB71中的cadA后以产生pCIB128。

实施例2：构建表达来自Tepidanaerobacter syntrophicus的赖氨酸脱羧酶多肽 的质粒载体。

来自T.syntrophicus的赖氨酸脱羧酶(TsLDC)的氨基酸序列获自NCBI(GenBankID GAQ24853.1)。编码TsLDC的核酸经密码子优化(SEQ ID NO：5)用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(SEQ ID NO：1)。根据Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic Acids Research 30:10,2002进行密码子优化和DNA组装。用PCR引物TsLDC-SacI-F和TsLDC-XbaI-R扩增合成的DNA产物，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18中。使用PCR引物TsLDC-F和cadA-R2优化TsLDC基因上游的5'序列以产生质粒pCIB370。

实施例3：构建表达来自Geobacillus kaustophilus的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒 载体。

来自G.kaustophilus的赖氨酸脱羧酶(GkLDC)的氨基酸序列获自NCBI(GenBankID BAD75350.1)。编码GkLDC序列的核酸序列经密码子优化(SEQ ID NO：6)，用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(SEQ ID NO：2)。根据Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic AcidsResearch 30:10,2002进行密码子优化和DNA组装。用PCR引物GkLDC-SacI-F和GkLDC-XbaI-R扩增合成的DNA产物，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18中。使用PCR引物GkLDC-F和cadA-R2优化GkLDC基因上游的5'序列以产生质粒pCIB371。

实施例4：构建表达来自Thermosynechoccus elongatus的赖氨酸脱羧酶多肽的质 粒载体。

来自T.elongatus的赖氨酸脱羧酶(TeLDC)的氨基酸序列获自NCBI(GenBank IDBAC09418.1)。编码TeLDC序列的核酸序列经密码子优化(SEQ ID NO：7)用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(SEQ ID NO：3)。根据Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic Acids Research30:10,2002进行密码子优化和DNA组装。用PCR引物TeLDC-SacI-F和TeLDC-XbaI-R扩增合成的DNA产物，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18中。使用PCR引物TeLDC-F和cadA-R2优化TeLDC基因上游的5'序列以产生质粒pCIB372。

实施例5：构建表达来自Thermomicrobium roseum的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒载 体。

来自T.roseum的赖氨酸脱羧酶(TrLDC)的氨基酸序列获自NCBI(GenBank IDACM05730.1)。编码TrLDC的核酸序列经密码子优化(SEQ ID NO：8)，用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(SEQ ID NO：4)。根据Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic Acids Research 30:10,2002进行密码子优化和DNA组装。用PCR引物TrLDC-SacI-F和TrLDC-XbaI-R扩增合成的DNA产物，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18中。使用PCR引物TrLDC-F和cadA-R2优化TrLDC基因上游的5'序列以产生质粒pCIB373。

实施例6：在37℃和65℃赖氨酸脱羧酶活性的比较。

用质粒pCIB71、pCIB370、pCIB371、pCIB372或pCIB373转化大肠杆菌BL21。将来自每次转化的单个菌落在37℃的含有羧苄青霉素(100μg/mL)的100mL LB培养基中生长过夜。第二天，用弗氏压碎器裂解每个样品。将裂解的样品离心，并将上清液与沉淀物分离，以进行体外实验。将来自每个样品的等量酶在37℃或65℃与赖氨酸-HCl和PLP一起孵育4小时至终浓度分别为160g/L和0.1mM。使用NMR对来自每个样品的尸胺生产进行定量，并通过将所产生的尸胺的摩尔量除以加入的赖氨酸的摩尔量来计算产率。各样品的产率列于表1中。

表1通过来自大肠杆菌、T.syntrophicus、G.kaustophilus、T.elongatus和T.roseum的赖氨酸脱羧酶的尸胺产生。

表1显示野生型嗜温赖氨酸脱羧酶CadA(pCIB71)与在65℃相比在37℃显示出显著更高的活性。然而，含有来自嗜热微生物(pCIB370-373)的赖氨酸脱羧酶的质粒与在37℃相比在65℃显示出更高的活性。即使嗜热赖氨酸脱羧酶在65℃的活性不如嗜温赖氨酸脱羧酶在37℃的活性那么高，但其活性仍然高于嗜温酶在65℃的活性。

实施例7：在37℃和65℃赖氨酸脱羧酶稳定性的比较。

在37℃和65℃孵育不同时间段后测定赖氨酸脱羧酶的活性，以确定酶是否能够在功能所需的不同温度维持结构完整性。用质粒pCIB71、pCIB370、pCIB371、pCIB372或pCIB373转化大肠杆菌BL21。将来自每次转化的单个菌落在37℃的含有羧苄青霉素(100μg/mL)的100mL LB培养基中生长过夜。第二天，用弗氏压碎器裂解每个样品。将裂解的样品离心，并将上清液与沉淀物分离，以进行体外实验。将来自每个样品的等量酶在37℃孵育20、30和40小时。在特定温度和特定时间段孵育后，将样品在37℃或65℃与赖氨酸-HCl和PLP一起孵育4小时至最终浓度分别为160g/L和0.1mM。使用NMR对来自每个样品的尸胺生产进行定量，并通过将所产生的尸胺的摩尔量除以加入的赖氨酸的摩尔量来计算产率。各样品的产率列于表2中。

表2在37℃孵育不同时间后，通过不同赖氨酸脱羧酶的尸胺产生。

表2显示37℃的嗜温CadA稳定性是所测试的六种蛋白质中最低的。在孵育40小时后，其在37℃的活性降低超过50％。与37℃相比，其在65℃的活性也显著下降。来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶在37℃都显示出很小的活性，类似于CadA在65℃的活性。然而，即使在37℃孵育40小时后，来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶在65℃都显示出相对稳定的活性。这表明来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶的生产和维持可以在37℃进行，而对其在65℃的活性没有太大影响。

实施例8：在37℃从共过表达编码嗜热赖氨酸脱羧酶的基因和赖氨酸合成操纵子I 和II的大肠杆菌产生尸胺。

用pCIB71、pCIB370、pCIB371、pCIB372或pCIB373转化CIB103-3(来自MODIFIEDMEMBRANE PERMEABILIY PCT/CN2015/094121或WO2017079872A1)。将来自每次转化的三个单菌落在37℃的4mL含有4％葡萄糖、0.1％KH₂PO₄、0.1％MgSO₄、1.6％(NH₄)₂SO₄、0.001％FeSO₄、0.001％MnSO₄、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和羧苄青霉素(100μg/mL)的培养基中生长过夜。第二天，将每种培养物接种到50mL含有0.7％CaCO₃的新鲜培养基中，并在37℃生长72小时，此时测定每种培养物中赖氨酸和尸胺的浓度(表3)。

表3通过含有合成操纵子I和II并在37℃共同产生赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生赖氨酸和尸胺。

如表3中所示，当宿主细胞在37℃生长时，嗜温赖氨酸脱羧酶CadA(pCIB103-3，pCIB71)在能够产生赖氨酸的宿主中的过表达导致产生尸胺，并有痕量赖氨酸。嗜热赖氨酸脱羧酶(pCIB103-3，pCIB370-373)的过表达导致赖氨酸积累，并几乎没有产生尸胺，如未过量表达任何赖氨酸脱羧酶(pCIB103-3)的对照宿主。

实施例9：在65℃从共过表达编码嗜热赖氨酸脱羧酶的基因和赖氨酸合成操纵子I 和II的大肠杆菌产生尸胺。

用pCIB71、pCIB370、pCIB371、pCIB372或pCIB373转化CIB103-3。将来自每次转化的三个单菌落在37℃的4mL含有4％葡萄糖、0.1％KH₂PO₄、0.1％MgSO₄、1.6％(NH₄)₂SO₄、0.001％FeSO₄、0.001％MnSO₄、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和羧苄青霉素(100μg/mL)的培养基中生长过夜。第二天，将每种培养物接种到50mL含有0.7％CaCO₃的新鲜培养基中，并在37℃生长48小时，此时将培养温度升至65℃。将细胞再培养24小时，然后测定每种培养物中赖氨酸和尸胺的浓度(表4)。

表4通过含有合成操纵子I和II并在65℃共同产生赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生赖氨酸和尸胺。

如表4中所示，当在没有赖氨酸脱羧酶过表达时(pCIB103-3)，或者当嗜温CadA过表达时，在发酵的最后24小时期间宿主细胞在65℃孵育导致赖氨酸或尸胺产生没有显著变化。然而，在将宿主细胞在65℃孵育一段时间后，嗜热赖氨酸脱羧酶(pCIB103-3，pCIB370-373)的过表达导致尸胺而不是赖氨酸在发酵培养基中积累。

实施例中使用的质粒表

实施例中使用的引物序表。

名称	序列(5’-3’)
		cadA-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccatgaacgttattgcaatattgaatcac
cadA-R	ggctctagaccacttcccttgtacgagc
		cadA-F2	atttcacacaggaaacagctatgaacgttattgcaatattgaat
cadA-R2	agctgtttcctgtgtgaaat
		cat-HindIII-F	ggcaagcttgagaaaaaaatcactggatatacc
cat-NdeI-R	ggccatatgtaagggcaccaataactgcc
		TsLDC-SacI-F	ggcgagctcatggagaagcaagagattaacaag
TsLDC-XbaI-R	ggctctagattagaaatcggttacaacctgaatg
		TsLDC-F	atttcacacaggaaacagctatggagaagcaagagattaacaag
GkLDC-SacI-F	ggcgagctcatgtctcagctcgagacccctc
		GkLDC-XbaI-R	ggctctagattaacgaattggtttgtattctttaatgac
GkLDC-F	atttcacacaggaaacagctatgtctcagctcgagacccctc
		TeLDC-SacI-F	ggcgagctcatggaacctctgctgcgtgc
TeLDC-XbaI-R	ggctctagattaaactttgcagatacgcagag
		TeLDC-F	atttcacacaggaaacagctatggaacctctgctgcgtgc
TrLDC-SacI-F	ggcgagctcatgtctgaagaacagcaacg
		TrLDC-XbaI-R	ggctctagattaggcacgaacgacacgga
TrLDC-F	atttcacacaggaaacagctatgtctgaagaacagcaacg

示例性核酸和多肽序列：

SEQ ID NO:1与CadA相比，T.syntrophicus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基

MEKQEINKFSKTPLIQALKEYEKKDSLRFHMPGHKGRCPKGVFCDIKENLFGWDVTEIPGLDDFAQPEGPIKEAQEKLSALYGADTSYFLVNGATSGIISMMAGALSEKDKILIPRTSHKSVLSGLILTGASAAYIMPERCEELGVYAQVEPCAITNKLIENPDIKAILVTNPVYQGFCPDIARVAEIAKERGTTLLADEAQGPHFGFSKKVPQSAGKFADAWVQSPHKMLTSLTQSAWLHIKGNRIDKERLEDFLHIVTTSSPSYILMASLDGTRELIEENGNSYIEKAVELAQKARYEINNSTVFYAPGQEILGKYGISSQDPLHLMVNVSCAGYTGYDIEKALREDFSIYAEYADLCNVYFLITFSNTLEDIKGLLAVLSHFKPLKNKVKPCFWIKDLPKVALEPKKAFKLPAKSVPFKDSAGSVSKRPLVPYPPGAPLVMPGEIIEKEHIEMINEILNSGGYCQGVTSEKFIQVVTDF

SEQ ID NO:2与CadA相比，G.kaustophilus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基

MSQLETPLFTGLLEHMKKNPVQFHIPGHKKGAGMDPEFRAFIGDNALAIDLINISPLDDLHHPKGMIKRAQELAAEAFGADYTFFSVQGTSGAIMTMVMSVAGPGDKIIVPRNVHKSVMSAIVFSGATPIFIHPEIDKELGISHGITPQAVEKALRQHPDAKGVLVINPTYFGIAGDLKKIVDIAHSYNVPVLVDEAHGVHIHFHEDLPLSAMQAGADMAATSVHKLGGSLTQSSILNVREGLVSAKHVQAILSMLTTTSTSYLLLASLDVARKQLATKGRELIDKAIRLADWTRRQINEIPYLYCVGEEILGTEATYDYDPTKLIISVKELGLTGHDVERWLRETYNIEVELSDLYNILCIITPGDTEREASLLVEALRRLSKQFSHQAEKGIKPKVLLPDIPALALTPRDAFYAETEVVPFHESAGRIIAEFVMVYPPGIPIFIPGEIITEENLKYIETNLAAGLPVQGPEDDTLQTLRVIKEYKPIR

SEQ ID NO:3与CadA相比，T.elongatus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基

MEPLLRALWGTALEQDLSELPGLDNLAQPTGVLAEAQAVVAATVGSDRAWFLVNGATGGLLAALLATVGPGDRVLVGRNVHRSVIAGLVLAGAKPVYLGVGVDPQWGLPWPVTRDVVAAGLAAYPDTKAVVLVSPTYEGLCSPLLEIAQCVHNHGVPLIVDEAHGSHFAYHPAFPVTALAAGADVVVQSWHKTLGTLTQTAVLHLKGERVSAERLSQALNLVQTSSPNYWLLAALEGAGVQMAQQGEQIYGRLLQWVKTFEWPLPRWQPPGIPQDPLRLTLGTWPIGLTGFALDELLQPQIIAEFPSGRSLTFCLGLGTTQTMLETLADRLKSVYTEYCHNAPLPPLAIPSIPSCQEPALSPREAYFCPQRSIPLRAALNEISAETIAPYPPGIPTVIAGERFTESVIATLQTLQELGAE MVGASDPTLQTLRICKV

SEQ ID NO:4与CadA相比，T.roseum赖氨酸脱羧酶多肽序列--T.elongatus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基

MSEEQQRAPYLEQWLAYVDECVIPFTTPGHKQGRGAPPEFVAAFGERALALDIPHDGGTFDAHLEHDPLVAAERLAAALWGARDAVFLVNGSTTGNLAALLTLGRPGQPIVVTRAMHKSLLAGLVLSGARPVYVVPAVHPESGILLDLPPESVAQALAAWPDATAVALVSPTYTGVTSDTAELAALCHAHGVPLFVDEAWGPHLPFHPALPAAAIPSGADLAVTSLHKLAGSLTQTALLLMAGNLVDQAQLRAATAMVQTTSPAAFLYASLDAARRRLALEGEQLLARTLELAEHARRELAAIPGLEVVGPEIVAGRPGAGFDRTRLVVDVQGFGLTGLEVKRILRRDFRIAAEMADLVSVVFLITIGDTPETIAALVAAFRALAADRTRPDCAAGRRAVRALLRSTGPIVAGAPQAMTPREAFFAPAERVPLADAVGRVAAEPVTPYPPGIPVLAPGEVVRPEVVEFLQAGRAAGMRFNGASDPTLATL RVVRA

SEQ ID NO:5T.syntrophicus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列

ATGGAGAAGCAAGAGATTAACAAGTTCTCTAAGACCCCGCTCATCCAAGCGCTGAAAGAATACGAGAAAAAGGATTCTCTGCGTTTCCACATGCCAGGTCACAAAGGCCGTTGTCCAAAAGGTGTTTTTTGCGATATTAAGGAGAACCTGTTCGGTTGGGATGTTACCGAAATCCCGGGTCTGGATGACTTCGCTCAACCGGAAGGTCCGATCAAGGAAGCACAGGAGAAACTGTCTGCGCTGTACGGTGCCGACACCTCCTATTTCCTCGTTAATGGTGCAACCTCTGGTATCATTTCTATGATGGCGGGTGCTCTGTCCGAAAAGGACAAAATCCTGATCCCGCGTACCAGCCATAAGAGCGTACTCTCTGGTCTGATTCTCACTGGCGCCTCTGCGGCGTACATCATGCCGGAGCGTTGCGAAGAGCTGGGTGTTTACGCACAGGTGGAACCTTGTGCCATCACCAACAAACTGATCGAGAACCCGGATATCAAAGCGATTCTGGTTACCAACCCAGTGTACCAGGGTTTCTGCCCGGACATCGCGCGTGTTGCGGAAATCGCGAAAGAACGCGGTACCACCCTGCTCGCAGACGAAGCGCAAGGCCCACATTTCGGCTTTTCCAAGAAAGTTCCGCAGTCTGCGGGTAAGTTCGCGGATGCGTGGGTTCAGTCCCCTCACAAAATGCTGACGAGCCTGACCCAATCTGCGTGGCTGCACATCAAGGGCAATCGTATCGACAAGGAACGTCTGGAAGACTTTCTCCACATCGTTACCACCTCTTCTCCGTCTTACATCCTCATGGCGTCTCTGGACGGTACCCGCGAGCTGATTGAAGAAAACGGTAACTCCTACATTGAAAAGGCGGTTGAACTGGCTCAGAAAGCGCGTTATGAAATCAACAACTCTACTGTTTTCTACGCGCCAGGCCAGGAGATTCTCGGTAAATACGGTATTTCTTCTCAGGACCCGCTGCATCTGATGGTTAATGTTTCTTGCGCGGGTTACACGGGCTACGACATCGAAAAAGCCCTGCGTGAGGACTTTTCTATCTACGCCGAATACGCGGACCTGTGTAACGTTTACTTCCTCATTACGTTTAGCAATACCCTGGAGGACATTAAAGGTCTCCTCGCGGTTCTGTCTCACTTCAAACCGCTCAAAAACAAAGTTAAACCGTGCTTCTGGATCAAAGACCTGCCGAAAGTTGCGCTGGAGCCAAAGAAGGCGTTCAAACTGCCGGCGAAATCTGTGCCTTTCAAAGATTCTGCTGGTAGCGTTTCTAAACGCCCGCTGGTTCCGTATCCGCCAGGTGCGCCACTCGTGATGCCGGGTGAGATCATTGAGAAAGAGCACATCGAGATGATTAATGAAATTCTCAACTCTGGCGGCTACTGCCAGGGTGTTACGTCTGAAAAGTTCATTCAGGTTGTAACCGATTTCTAA

SEQ ID NO:6G.kaustophilus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列

ATGTCTCAGCTCGAGACCCCTCTGTTCACCGGTCTGCTCGAACACATGAAGAAAAACCCGGTCCAGTTTCACATTCCAGGTCACAAGAAAGGTGCTGGTATGGACCCTGAGTTCCGTGCGTTTATCGGTGATAACGCGCTCGCGATCGACCTGATCAACATCTCCCCTCTCGACGACCTCCACCACCCGAAAGGCATGATCAAACGTGCGCAGGAACTGGCTGCGGAAGCGTTTGGCGCGGACTACACGTTCTTCAGCGTTCAAGGCACCAGCGGTGCCATCATGACGATGGTAATGTCTGTTGCGGGTCCGGGCGATAAGATCATCGTCCCTCGTAACGTTCACAAATCTGTTATGTCTGCCATCGTTTTCTCTGGCGCGACCCCTATTTTCATCCACCCGGAAATCGATAAGGAGCTGGGTATTAGCCACGGTATTACCCCGCAGGCCGTGGAGAAAGCCCTGCGTCAACACCCTGATGCTAAAGGCGTTCTGGTAATCAACCCGACTTATTTCGGTATCGCGGGTGACCTCAAAAAGATCGTTGACATCGCGCACTCTTATAATGTGCCGGTCCTGGTAGATGAAGCGCACGGTGTTCATATTCACTTCCACGAGGACCTCCCACTCAGCGCAATGCAGGCGGGTGCGGATATGGCGGCGACGTCCGTGCACAAGCTGGGCGGTAGCCTGACTCAGTCTTCCATTCTGAACGTACGCGAAGGTCTGGTTTCTGCTAAACACGTGCAAGCGATTCTCTCTATGCTGACCACCACTTCTACCTCTTATCTGCTGCTGGCTTCCCTGGACGTAGCGCGTAAACAGCTGGCAACCAAAGGTCGTGAACTCATCGACAAAGCCATCCGCCTCGCGGATTGGACCCGTCGCCAGATTAACGAGATCCCGTACCTCTACTGCGTGGGTGAAGAGATCCTGGGTACCGAAGCAACCTACGACTACGATCCGACTAAACTGATCATCAGCGTAAAAGAACTCGGTCTCACTGGCCATGACGTTGAGCGTTGGCTCCGTGAAACCTACAATATCGAAGTTGAACTGTCTGACCTCTATAACATCCTCTGCATCATCACCCCGGGTGATACTGAGCGCGAAGCGTCTCTCCTGGTGGAAGCACTGCGCCGTCTGTCTAAACAATTCTCCCATCAGGCCGAAAAGGGTATCAAACCTAAGGTTCTCCTGCCGGATATTCCTGCCCTCGCCCTGACGCCTCGTGACGCGTTCTATGCGGAAACCGAAGTCGTTCCGTTCCATGAGTCCGCCGGTCGTATCATCGCGGAGTTTGTAATGGTTTACCCACCGGGCATCCCAATCTTCATCCCTGGCGAGATTATCACTGAGGAAAACCTGAAATACATCGAAACCAACCTGGCGGCTGGCCTCCCGGTTCAGGGCCCAGAAGACGACACGCTGCAGACCCTCCGTGTCATTAAAGAATACAAACCAATTCGTTAA

SEQ ID NO:7T.elongatus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列

ATGGAACCTCTGCTGCGTGCGCTGTGGGGTACTGCACTCGAACAAGACCTGTCTGAGCTGCCGGGTCTCGATAACCTGGCGCAACCGACCGGTGTTCTCGCAGAAGCGCAGGCTGTTGTTGCGGCAACTGTAGGTTCTGACCGTGCGTGGTTTCTGGTTAATGGTGCAACGGGCGGTCTCCTCGCCGCACTCCTGGCCACCGTAGGTCCTGGTGATCGTGTGCTGGTTGGCCGTAATGTTCACCGTTCTGTTATCGCAGGTCTCGTTCTGGCAGGTGCAAAGCCGGTTTACCTGGGTGTTGGTGTAGATCCGCAATGGGGTCTGCCGTGGCCGGTAACTCGTGATGTGGTAGCCGCTGGTCTGGCCGCATATCCGGACACCAAAGCGGTTGTGCTCGTTTCTCCGACGTATGAAGGCCTGTGCAGCCCACTGCTGGAGATCGCGCAATGCGTTCACAACCACGGTGTCCCGCTGATCGTTGACGAAGCACATGGTTCTCACTTCGCGTATCACCCAGCTTTCCCGGTGACGGCGCTCGCTGCTGGCGCTGACGTTGTCGTACAGTCTTGGCATAAAACCCTGGGTACGCTGACCCAGACGGCGGTTCTCCACCTCAAAGGTGAGCGTGTTTCCGCCGAACGTCTGTCTCAGGCTCTGAACCTGGTTCAAACCTCTTCCCCGAACTACTGGCTGCTCGCAGCACTGGAAGGTGCAGGCGTCCAAATGGCTCAGCAGGGTGAGCAGATTTACGGTCGCCTGCTCCAGTGGGTAAAGACCTTCGAATGGCCACTCCCGCGTTGGCAGCCGCCTGGCATCCCTCAGGACCCTCTCCGTCTCACTCTGGGCACTTGGCCTATTGGTCTGACGGGTTTCGCGCTCGACGAACTCCTCCAGCCGCAGATCATCGCGGAGTTCCCGTCCGGTCGTTCCCTCACGTTTTGCCTCGGTCTCGGTACCACCCAAACCATGCTCGAAACGCTGGCGGACCGCCTGAAATCTGTTTACACCGAATACTGCCACAACGCCCCTCTGCCTCCTCTCGCGATTCCATCTATCCCGTCTTGCCAGGAACCTGCTCTCAGCCCGCGTGAAGCGTACTTCTGCCCGCAGCGCTCTATTCCGCTCCGCGCAGCTCTCAACGAAATCTCTGCGGAGACCATCGCGCCGTATCCACCGGGTATCCCGACCGTGATCGCGGGTGAACGTTTCACGGAATCTGTCATCGCAACCCTCCAGACCCTGCAAGAACTCGGTGCAGAAATGGTCGGTGCGAGCGACCCTACGCTGCAGACTCTGCGTATCTGCAAAGTTTAA

SEQ ID NO:8T.roseum赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列

ATGTCTGAAGAACAGCAACGTGCTCCGTACCTGGAGCAATGGCTGGCGTACGTTGACGAGTGCGTTATCCCGTTTACCACTCCGGGTCACAAACAAGGTCGCGGTGCGCCACCGGAGTTCGTTGCGGCGTTCGGTGAACGTGCGCTCGCTCTGGACATTCCGCATGACGGTGGCACCTTTGACGCGCATCTGGAACATGACCCGCTCGTTGCCGCCGAACGTCTGGCTGCCGCACTGTGGGGTGCACGCGATGCGGTGTTTCTGGTTAACGGTTCCACCACTGGTAACCTGGCGGCTCTGCTCACTCTCGGTCGCCCAGGTCAGCCGATTGTTGTTACTCGTGCCATGCATAAGAGCCTGCTGGCAGGTCTGGTCCTGAGCGGTGCTCGCCCTGTCTACGTTGTACCGGCCGTACACCCAGAATCCGGTATCCTCCTCGATCTCCCTCCGGAATCTGTTGCGCAGGCGCTGGCCGCGTGGCCTGATGCGACGGCTGTAGCTCTGGTGTCCCCGACCTACACTGGCGTTACCTCTGACACTGCTGAACTGGCAGCCCTCTGTCACGCTCATGGTGTTCCACTGTTTGTTGATGAAGCGTGGGGTCCGCACCTCCCGTTCCATCCAGCACTCCCAGCAGCAGCTATTCCGTCTGGTGCCGATCTGGCGGTTACTTCTCTGCACAAACTGGCGGGTTCCCTCACCCAAACCGCTCTCCTCCTGATGGCAGGCAACCTCGTAGACCAAGCCCAGCTGCGTGCAGCCACGGCAATGGTGCAAACCACCAGCCCTGCAGCCTTCCTGTACGCGTCCCTGGATGCTGCCCGTCGCCGTCTCGCGCTCGAAGGTGAACAGCTCCTCGCACGTACTCTCGAGCTGGCTGAGCACGCTCGCCGTGAACTCGCCGCCATCCCGGGTCTGGAGGTGGTCGGTCCAGAAATTGTTGCGGGTCGTCCGGGTGCCGGCTTCGATCGTACTCGCCTCGTTGTTGACGTTCAGGGTTTCGGTCTGACTGGCCTCGAAGTAAAGCGTATCCTGCGTCGTGACTTCCGTATTGCAGCTGAAATGGCAGATCTCGTCTCTGTTGTTTTCCTCATCACCATCGGTGACACCCCAGAGACCATCGCTGCCCTGGTAGCAGCTTTCCGTGCACTCGCTGCTGACCGTACCCGTCCAGACTGTGCTGCCGGTCGTCGTGCAGTACGCGCCCTCCTCCGTTCTACCGGTCCGATCGTCGCGGGTGCTCCTCAGGCGATGACCCCGCGTGAAGCTTTCTTCGCTCCAGCTGAGCGCGTTCCGCTCGCGGATGCCGTCGGTCGTGTTGCAGCCGAGCCGGTTACCCCATATCCGCCTGGTATTCCGGTACTGGCCCCAGGTGAAGTGGTTCGCCCGGAGGTAGTTGAATTCCTCCAGGCAGGCCGTGCCGCTGGTATGCGTTTCAATGGCGCGTCTGACCCGACTCTGGCGACCCTCCGTGTCGTTCGTGCCTAA

SEQ ID NO：9CadA多肽序列

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK

SEQ ID NO：10大肠杆菌cadA核酸序列

ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA

序列表

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司

<120> 嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途

<130> IBPA17002

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 482

<212> PRT

<213> Tepidanaerobacter syntrophicus

<400> 1

Met Glu Lys Gln Glu Ile Asn Lys Phe Ser Lys Thr Pro Leu Ile Gln

1 5 10 15

Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Lys Lys Asp Ser Leu Arg Phe His Met Pro

20 25 30

Gly His Lys Gly Arg Cys Pro Lys Gly Val Phe Cys Asp Ile Lys Glu

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Asn Leu Phe Gly Trp Asp Val Thr Glu Ile Pro Gly Leu Asp Asp Phe

50 55 60

Ala Gln Pro Glu Gly Pro Ile Lys Glu Ala Gln Glu Lys Leu Ser Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Gly Ala Asp Thr Ser Tyr Phe Leu Val Asn Gly Ala Thr Ser

85 90 95

Gly Ile Ile Ser Met Met Ala Gly Ala Leu Ser Glu Lys Asp Lys Ile

100 105 110

Leu Ile Pro Arg Thr Ser His Lys Ser Val Leu Ser Gly Leu Ile Leu

115 120 125

Thr Gly Ala Ser Ala Ala Tyr Ile Met Pro Glu Arg Cys Glu Glu Leu

130 135 140

Gly Val Tyr Ala Gln Val Glu Pro Cys Ala Ile Thr Asn Lys Leu Ile

145 150 155 160

Glu Asn Pro Asp Ile Lys Ala Ile Leu Val Thr Asn Pro Val Tyr Gln

165 170 175

Gly Phe Cys Pro Asp Ile Ala Arg Val Ala Glu Ile Ala Lys Glu Arg

180 185 190

Gly Thr Thr Leu Leu Ala Asp Glu Ala Gln Gly Pro His Phe Gly Phe

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Ser Lys Lys Val Pro Gln Ser Ala Gly Lys Phe Ala Asp Ala Trp Val

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Gln Ser Pro His Lys Met Leu Thr Ser Leu Thr Gln Ser Ala Trp Leu

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His Ile Lys Gly Asn Arg Ile Asp Lys Glu Arg Leu Glu Asp Phe Leu

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His Ile Val Thr Thr Ser Ser Pro Ser Tyr Ile Leu Met Ala Ser Leu

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Asp Gly Thr Arg Glu Leu Ile Glu Glu Asn Gly Asn Ser Tyr Ile Glu

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Lys Ala Val Glu Leu Ala Gln Lys Ala Arg Tyr Glu Ile Asn Asn Ser

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Ser Ser Gln Asp Pro Leu His Leu Met Val Asn Val Ser Cys Ala Gly

325 330 335

Tyr Thr Gly Tyr Asp Ile Glu Lys Ala Leu Arg Glu Asp Phe Ser Ile

340 345 350

Tyr Ala Glu Tyr Ala Asp Leu Cys Asn Val Tyr Phe Leu Ile Thr Phe

355 360 365

Ser Asn Thr Leu Glu Asp Ile Lys Gly Leu Leu Ala Val Leu Ser His

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Phe Lys Pro Leu Lys Asn Lys Val Lys Pro Cys Phe Trp Ile Lys Asp

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Leu Pro Lys Val Ala Leu Glu Pro Lys Lys Ala Phe Lys Leu Pro Ala

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Lys Ser Val Pro Phe Lys Asp Ser Ala Gly Ser Val Ser Lys Arg Pro

420 425 430

Leu Val Pro Tyr Pro Pro Gly Ala Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Ile

435 440 445

Ile Glu Lys Glu His Ile Glu Met Ile Asn Glu Ile Leu Asn Ser Gly

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Gly Tyr Cys Gln Gly Val Thr Ser Glu Lys Phe Ile Gln Val Val Thr

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Asp Phe

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<211> 490

<212> PRT

<213> Geobacillus kaustophilus

<400> 2

Met Ser Gln Leu Glu Thr Pro Leu Phe Thr Gly Leu Leu Glu His Met

1 5 10 15

Lys Lys Asn Pro Val Gln Phe His Ile Pro Gly His Lys Lys Gly Ala

20 25 30

Gly Met Asp Pro Glu Phe Arg Ala Phe Ile Gly Asp Asn Ala Leu Ala

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Ile Asp Leu Ile Asn Ile Ser Pro Leu Asp Asp Leu His His Pro Lys

50 55 60

Gly Met Ile Lys Arg Ala Gln Glu Leu Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Thr Phe Phe Ser Val Gln Gly Thr Ser Gly Ala Ile Met Thr

85 90 95

Met Val Met Ser Val Ala Gly Pro Gly Asp Lys Ile Ile Val Pro Arg

100 105 110

Asn Val His Lys Ser Val Met Ser Ala Ile Val Phe Ser Gly Ala Thr

115 120 125

Pro Ile Phe Ile His Pro Glu Ile Asp Lys Glu Leu Gly Ile Ser His

130 135 140

Gly Ile Thr Pro Gln Ala Val Glu Lys Ala Leu Arg Gln His Pro Asp

145 150 155 160

Ala Lys Gly Val Leu Val Ile Asn Pro Thr Tyr Phe Gly Ile Ala Gly

165 170 175

Asp Leu Lys Lys Ile Val Asp Ile Ala His Ser Tyr Asn Val Pro Val

180 185 190

Leu Val Asp Glu Ala His Gly Val His Ile His Phe His Glu Asp Leu

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Pro Leu Ser Ala Met Gln Ala Gly Ala Asp Met Ala Ala Thr Ser Val

210 215 220

His Lys Leu Gly Gly Ser Leu Thr Gln Ser Ser Ile Leu Asn Val Arg

225 230 235 240

Glu Gly Leu Val Ser Ala Lys His Val Gln Ala Ile Leu Ser Met Leu

245 250 255

Thr Thr Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Ala Ser Leu Asp Val Ala

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Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Gly Arg Glu Leu Ile Asp Lys Ala Ile

275 280 285

Arg Leu Ala Asp Trp Thr Arg Arg Gln Ile Asn Glu Ile Pro Tyr Leu

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Tyr Cys Val Gly Glu Glu Ile Leu Gly Thr Glu Ala Thr Tyr Asp Tyr

305 310 315 320

Asp Pro Thr Lys Leu Ile Ile Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Thr Gly

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His Asp Val Glu Arg Trp Leu Arg Glu Thr Tyr Asn Ile Glu Val Glu

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Leu Ser Asp Leu Tyr Asn Ile Leu Cys Ile Ile Thr Pro Gly Asp Thr

355 360 365

Glu Arg Glu Ala Ser Leu Leu Val Glu Ala Leu Arg Arg Leu Ser Lys

370 375 380

Gln Phe Ser His Gln Ala Glu Lys Gly Ile Lys Pro Lys Val Leu Leu

385 390 395 400

Pro Asp Ile Pro Ala Leu Ala Leu Thr Pro Arg Asp Ala Phe Tyr Ala

405 410 415

Glu Thr Glu Val Val Pro Phe His Glu Ser Ala Gly Arg Ile Ile Ala

420 425 430

Glu Phe Val Met Val Tyr Pro Pro Gly Ile Pro Ile Phe Ile Pro Gly

435 440 445

Glu Ile Ile Thr Glu Glu Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Thr Asn Leu Ala

450 455 460

Ala Gly Leu Pro Val Gln Gly Pro Glu Asp Asp Thr Leu Gln Thr Leu

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Arg Val Ile Lys Glu Tyr Lys Pro Ile Arg

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<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> Thermosynechoccus elongatus

<400> 3

Met Glu Pro Leu Leu Arg Ala Leu Trp Gly Thr Ala Leu Glu Gln Asp

1 5 10 15

Leu Ser Glu Leu Pro Gly Leu Asp Asn Leu Ala Gln Pro Thr Gly Val

20 25 30

Leu Ala Glu Ala Gln Ala Val Val Ala Ala Thr Val Gly Ser Asp Arg

35 40 45

Ala Trp Phe Leu Val Asn Gly Ala Thr Gly Gly Leu Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Leu Ala Thr Val Gly Pro Gly Asp Arg Val Leu Val Gly Arg Asn Val

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His Arg Ser Val Ile Ala Gly Leu Val Leu Ala Gly Ala Lys Pro Val

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Tyr Leu Gly Val Gly Val Asp Pro Gln Trp Gly Leu Pro Trp Pro Val

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Thr Arg Asp Val Val Ala Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Pro Asp Thr Lys

115 120 125

Ala Val Val Leu Val Ser Pro Thr Tyr Glu Gly Leu Cys Ser Pro Leu

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Leu Glu Ile Ala Gln Cys Val His Asn His Gly Val Pro Leu Ile Val

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Asp Glu Ala His Gly Ser His Phe Ala Tyr His Pro Ala Phe Pro Val

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Thr Ala Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Val Val Gln Ser Trp His Lys

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Thr Leu Gly Thr Leu Thr Gln Thr Ala Val Leu His Leu Lys Gly Glu

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Arg Val Ser Ala Glu Arg Leu Ser Gln Ala Leu Asn Leu Val Gln Thr

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Ser Ser Pro Asn Tyr Trp Leu Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ala Gly Val

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Gln Met Ala Gln Gln Gly Glu Gln Ile Tyr Gly Arg Leu Leu Gln Trp

245 250 255

Val Lys Thr Phe Glu Trp Pro Leu Pro Arg Trp Gln Pro Pro Gly Ile

260 265 270

Pro Gln Asp Pro Leu Arg Leu Thr Leu Gly Thr Trp Pro Ile Gly Leu

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Gln Thr Met Leu Glu Thr Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ser Val Tyr Thr

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Glu Tyr Cys His Asn Ala Pro Leu Pro Pro Leu Ala Ile Pro Ser Ile

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Pro Gln Arg Ser Ile Pro Leu Arg Ala Ala Leu Asn Glu Ile Ser Ala

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Glu Arg Phe Thr Glu Ser Val Ile Ala Thr Leu Gln Thr Leu Gln Glu

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<210> 4

<211> 495

<212> PRT

<213> Thermomicrobium roseum

<400> 4

Met Ser Glu Glu Gln Gln Arg Ala Pro Tyr Leu Glu Gln Trp Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Val Asp Glu Cys Val Ile Pro Phe Thr Thr Pro Gly His Lys Gln

20 25 30

Gly Arg Gly Ala Pro Pro Glu Phe Val Ala Ala Phe Gly Glu Arg Ala

35 40 45

Leu Ala Leu Asp Ile Pro His Asp Gly Gly Thr Phe Asp Ala His Leu

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Glu His Asp Pro Leu Val Ala Ala Glu Arg Leu Ala Ala Ala Leu Trp

65 70 75 80

Gly Ala Arg Asp Ala Val Phe Leu Val Asn Gly Ser Thr Thr Gly Asn

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Leu Ala Ala Leu Leu Thr Leu Gly Arg Pro Gly Gln Pro Ile Val Val

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Thr Arg Ala Met His Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu Val Leu Ser Gly

115 120 125

Ala Arg Pro Val Tyr Val Val Pro Ala Val His Pro Glu Ser Gly Ile

130 135 140

Leu Leu Asp Leu Pro Pro Glu Ser Val Ala Gln Ala Leu Ala Ala Trp

145 150 155 160

Pro Asp Ala Thr Ala Val Ala Leu Val Ser Pro Thr Tyr Thr Gly Val

165 170 175

Thr Ser Asp Thr Ala Glu Leu Ala Ala Leu Cys His Ala His Gly Val

180 185 190

Pro Leu Phe Val Asp Glu Ala Trp Gly Pro His Leu Pro Phe His Pro

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Ala Ala Ile Pro Ser Gly Ala Asp Leu Ala Val Thr

210 215 220

Ser Leu His Lys Leu Ala Gly Ser Leu Thr Gln Thr Ala Leu Leu Leu

225 230 235 240

Met Ala Gly Asn Leu Val Asp Gln Ala Gln Leu Arg Ala Ala Thr Ala

245 250 255

Met Val Gln Thr Thr Ser Pro Ala Ala Phe Leu Tyr Ala Ser Leu Asp

260 265 270

Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Gly Glu Gln Leu Leu Ala Arg

275 280 285

Thr Leu Glu Leu Ala Glu His Ala Arg Arg Glu Leu Ala Ala Ile Pro

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Gly Leu Glu Val Val Gly Pro Glu Ile Val Ala Gly Arg Pro Gly Ala

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Gly Phe Asp Arg Thr Arg Leu Val Val Asp Val Gln Gly Phe Gly Leu

325 330 335

Thr Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Leu Arg Arg Asp Phe Arg Ile Ala

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Ala Glu Met Ala Asp Leu Val Ser Val Val Phe Leu Ile Thr Ile Gly

355 360 365

Asp Thr Pro Glu Thr Ile Ala Ala Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Leu

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Ala Ala Asp Arg Thr Arg Pro Asp Cys Ala Ala Gly Arg Arg Ala Val

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Arg Ala Leu Leu Arg Ser Thr Gly Pro Ile Val Ala Gly Ala Pro Gln

405 410 415

Ala Met Thr Pro Arg Glu Ala Phe Phe Ala Pro Ala Glu Arg Val Pro

420 425 430

Leu Ala Asp Ala Val Gly Arg Val Ala Ala Glu Pro Val Thr Pro Tyr

435 440 445

Pro Pro Gly Ile Pro Val Leu Ala Pro Gly Glu Val Val Arg Pro Glu

450 455 460

Val Val Glu Phe Leu Gln Ala Gly Arg Ala Ala Gly Met Arg Phe Asn

465 470 475 480

Gly Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Thr Leu Arg Val Val Arg Ala

485 490 495

<210> 5

<211> 1449

<212> DNA

<213> Tepidanaerobacter syntrophicus

<400> 5

atggagaagc aagagattaa caagttctct aagaccccgc tcatccaagc gctgaaagaa 60

tacgagaaaa aggattctct gcgtttccac atgccaggtc acaaaggccg ttgtccaaaa 120

ggtgtttttt gcgatattaa ggagaacctg ttcggttggg atgttaccga aatcccgggt 180

ctggatgact tcgctcaacc ggaaggtccg atcaaggaag cacaggagaa actgtctgcg 240

ctgtacggtg ccgacacctc ctatttcctc gttaatggtg caacctctgg tatcatttct 300

atgatggcgg gtgctctgtc cgaaaaggac aaaatcctga tcccgcgtac cagccataag 360

agcgtactct ctggtctgat tctcactggc gcctctgcgg cgtacatcat gccggagcgt 420

tgcgaagagc tgggtgttta cgcacaggtg gaaccttgtg ccatcaccaa caaactgatc 480

gagaacccgg atatcaaagc gattctggtt accaacccag tgtaccaggg tttctgcccg 540

gacatcgcgc gtgttgcgga aatcgcgaaa gaacgcggta ccaccctgct cgcagacgaa 600

gcgcaaggcc cacatttcgg cttttccaag aaagttccgc agtctgcggg taagttcgcg 660

gatgcgtggg ttcagtcccc tcacaaaatg ctgacgagcc tgacccaatc tgcgtggctg 720

cacatcaagg gcaatcgtat cgacaaggaa cgtctggaag actttctcca catcgttacc 780

acctcttctc cgtcttacat cctcatggcg tctctggacg gtacccgcga gctgattgaa 840

gaaaacggta actcctacat tgaaaaggcg gttgaactgg ctcagaaagc gcgttatgaa 900

atcaacaact ctactgtttt ctacgcgcca ggccaggaga ttctcggtaa atacggtatt 960

tcttctcagg acccgctgca tctgatggtt aatgtttctt gcgcgggtta cacgggctac 1020

gacatcgaaa aagccctgcg tgaggacttt tctatctacg ccgaatacgc ggacctgtgt 1080

aacgtttact tcctcattac gtttagcaat accctggagg acattaaagg tctcctcgcg 1140

gttctgtctc acttcaaacc gctcaaaaac aaagttaaac cgtgcttctg gatcaaagac 1200

ctgccgaaag ttgcgctgga gccaaagaag gcgttcaaac tgccggcgaa atctgtgcct 1260

ttcaaagatt ctgctggtag cgtttctaaa cgcccgctgg ttccgtatcc gccaggtgcg 1320

ccactcgtga tgccgggtga gatcattgag aaagagcaca tcgagatgat taatgaaatt 1380

ctcaactctg gcggctactg ccagggtgtt acgtctgaaa agttcattca ggttgtaacc 1440

gatttctaa 1449

<210> 6

<211> 1473

<212> DNA

<213> Geobacillus kaustophilus

<400> 6

atgtctcagc tcgagacccc tctgttcacc ggtctgctcg aacacatgaa gaaaaacccg 60

gtccagtttc acattccagg tcacaagaaa ggtgctggta tggaccctga gttccgtgcg 120

tttatcggtg ataacgcgct cgcgatcgac ctgatcaaca tctcccctct cgacgacctc 180

caccacccga aaggcatgat caaacgtgcg caggaactgg ctgcggaagc gtttggcgcg 240

gactacacgt tcttcagcgt tcaaggcacc agcggtgcca tcatgacgat ggtaatgtct 300

gttgcgggtc cgggcgataa gatcatcgtc cctcgtaacg ttcacaaatc tgttatgtct 360

gccatcgttt tctctggcgc gacccctatt ttcatccacc cggaaatcga taaggagctg 420

ggtattagcc acggtattac cccgcaggcc gtggagaaag ccctgcgtca acaccctgat 480

gctaaaggcg ttctggtaat caacccgact tatttcggta tcgcgggtga cctcaaaaag 540

atcgttgaca tcgcgcactc ttataatgtg ccggtcctgg tagatgaagc gcacggtgtt 600

catattcact tccacgagga cctcccactc agcgcaatgc aggcgggtgc ggatatggcg 660

gcgacgtccg tgcacaagct gggcggtagc ctgactcagt cttccattct gaacgtacgc 720

gaaggtctgg tttctgctaa acacgtgcaa gcgattctct ctatgctgac caccacttct 780

acctcttatc tgctgctggc ttccctggac gtagcgcgta aacagctggc aaccaaaggt 840

cgtgaactca tcgacaaagc catccgcctc gcggattgga cccgtcgcca gattaacgag 900

atcccgtacc tctactgcgt gggtgaagag atcctgggta ccgaagcaac ctacgactac 960

gatccgacta aactgatcat cagcgtaaaa gaactcggtc tcactggcca tgacgttgag 1020

cgttggctcc gtgaaaccta caatatcgaa gttgaactgt ctgacctcta taacatcctc 1080

tgcatcatca ccccgggtga tactgagcgc gaagcgtctc tcctggtgga agcactgcgc 1140

cgtctgtcta aacaattctc ccatcaggcc gaaaagggta tcaaacctaa ggttctcctg 1200

ccggatattc ctgccctcgc cctgacgcct cgtgacgcgt tctatgcgga aaccgaagtc 1260

gttccgttcc atgagtccgc cggtcgtatc atcgcggagt ttgtaatggt ttacccaccg 1320

ggcatcccaa tcttcatccc tggcgagatt atcactgagg aaaacctgaa atacatcgaa 1380

accaacctgg cggctggcct cccggttcag ggcccagaag acgacacgct gcagaccctc 1440

cgtgtcatta aagaatacaa accaattcgt taa 1473

<210> 7

<211> 1314

<212> DNA

<213> Thermosynechoccus elongatus

<400> 7

atggaacctc tgctgcgtgc gctgtggggt actgcactcg aacaagacct gtctgagctg 60

ccgggtctcg ataacctggc gcaaccgacc ggtgttctcg cagaagcgca ggctgttgtt 120

gcggcaactg taggttctga ccgtgcgtgg tttctggtta atggtgcaac gggcggtctc 180

ctcgccgcac tcctggccac cgtaggtcct ggtgatcgtg tgctggttgg ccgtaatgtt 240

caccgttctg ttatcgcagg tctcgttctg gcaggtgcaa agccggttta cctgggtgtt 300

ggtgtagatc cgcaatgggg tctgccgtgg ccggtaactc gtgatgtggt agccgctggt 360

ctggccgcat atccggacac caaagcggtt gtgctcgttt ctccgacgta tgaaggcctg 420

tgcagcccac tgctggagat cgcgcaatgc gttcacaacc acggtgtccc gctgatcgtt 480

gacgaagcac atggttctca cttcgcgtat cacccagctt tcccggtgac ggcgctcgct 540

gctggcgctg acgttgtcgt acagtcttgg cataaaaccc tgggtacgct gacccagacg 600

gcggttctcc acctcaaagg tgagcgtgtt tccgccgaac gtctgtctca ggctctgaac 660

ctggttcaaa cctcttcccc gaactactgg ctgctcgcag cactggaagg tgcaggcgtc 720

caaatggctc agcagggtga gcagatttac ggtcgcctgc tccagtgggt aaagaccttc 780

gaatggccac tcccgcgttg gcagccgcct ggcatccctc aggaccctct ccgtctcact 840

ctgggcactt ggcctattgg tctgacgggt ttcgcgctcg acgaactcct ccagccgcag 900

atcatcgcgg agttcccgtc cggtcgttcc ctcacgtttt gcctcggtct cggtaccacc 960

caaaccatgc tcgaaacgct ggcggaccgc ctgaaatctg tttacaccga atactgccac 1020

aacgcccctc tgcctcctct cgcgattcca tctatcccgt cttgccagga acctgctctc 1080

agcccgcgtg aagcgtactt ctgcccgcag cgctctattc cgctccgcgc agctctcaac 1140

gaaatctctg cggagaccat cgcgccgtat ccaccgggta tcccgaccgt gatcgcgggt 1200

gaacgtttca cggaatctgt catcgcaacc ctccagaccc tgcaagaact cggtgcagaa 1260

atggtcggtg cgagcgaccc tacgctgcag actctgcgta tctgcaaagt ttaa 1314

<210> 8

<211> 1488

<212> DNA

<213> Thermomicrobium roseum

<400> 8

atgtctgaag aacagcaacg tgctccgtac ctggagcaat ggctggcgta cgttgacgag 60

tgcgttatcc cgtttaccac tccgggtcac aaacaaggtc gcggtgcgcc accggagttc 120

gttgcggcgt tcggtgaacg tgcgctcgct ctggacattc cgcatgacgg tggcaccttt 180

gacgcgcatc tggaacatga cccgctcgtt gccgccgaac gtctggctgc cgcactgtgg 240

ggtgcacgcg atgcggtgtt tctggttaac ggttccacca ctggtaacct ggcggctctg 300

ctcactctcg gtcgcccagg tcagccgatt gttgttactc gtgccatgca taagagcctg 360

ctggcaggtc tggtcctgag cggtgctcgc cctgtctacg ttgtaccggc cgtacaccca 420

gaatccggta tcctcctcga tctccctccg gaatctgttg cgcaggcgct ggccgcgtgg 480

cctgatgcga cggctgtagc tctggtgtcc ccgacctaca ctggcgttac ctctgacact 540

gctgaactgg cagccctctg tcacgctcat ggtgttccac tgtttgttga tgaagcgtgg 600

ggtccgcacc tcccgttcca tccagcactc ccagcagcag ctattccgtc tggtgccgat 660

ctggcggtta cttctctgca caaactggcg ggttccctca cccaaaccgc tctcctcctg 720

atggcaggca acctcgtaga ccaagcccag ctgcgtgcag ccacggcaat ggtgcaaacc 780

accagccctg cagccttcct gtacgcgtcc ctggatgctg cccgtcgccg tctcgcgctc 840

gaaggtgaac agctcctcgc acgtactctc gagctggctg agcacgctcg ccgtgaactc 900

gccgccatcc cgggtctgga ggtggtcggt ccagaaattg ttgcgggtcg tccgggtgcc 960

ggcttcgatc gtactcgcct cgttgttgac gttcagggtt tcggtctgac tggcctcgaa 1020

gtaaagcgta tcctgcgtcg tgacttccgt attgcagctg aaatggcaga tctcgtctct 1080

gttgttttcc tcatcaccat cggtgacacc ccagagacca tcgctgccct ggtagcagct 1140

ttccgtgcac tcgctgctga ccgtacccgt ccagactgtg ctgccggtcg tcgtgcagta 1200

cgcgccctcc tccgttctac cggtccgatc gtcgcgggtg ctcctcaggc gatgaccccg 1260

cgtgaagctt tcttcgctcc agctgagcgc gttccgctcg cggatgccgt cggtcgtgtt 1320

gcagccgagc cggttacccc atatccgcct ggtattccgg tactggcccc aggtgaagtg 1380

gttcgcccgg aggtagttga attcctccag gcaggccgtg ccgctggtat gcgtttcaat 1440

ggcgcgtctg acccgactct ggcgaccctc cgtgtcgttc gtgcctaa 1488

<210> 9

<211> 715

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 9

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 10

<211> 2148

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 10

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-F

<400> 11

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa cgttattgca atattgaatc ac 52

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-R

<400> 12

ggctctagac cacttccctt gtacgagc 28

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-F2

<400> 13

atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaat 44

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-R2

<400> 14

agctgtttcc tgtgtgaaat 20

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cat-HindIII-F

<400> 15

ggcaagcttg agaaaaaaat cactggatat acc 33

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cat-NdeI-R

<400> 16

ggccatatgt aagggcacca ataactgcc 29

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TsLDC-SacI-F

<400> 17

ggcgagctca tggagaagca agagattaac aag 33

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TsLDC-XbaI-R

<400> 18

ggctctagat tagaaatcgg ttacaacctg aatg 34

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TsLDC-F

<400> 19

atttcacaca ggaaacagct atggagaagc aagagattaa caag 44

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer GkLDC-SacI-F

<400> 20

ggcgagctca tgtctcagct cgagacccct c 31

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer GkLDC-XbaI-R

<400> 21

ggctctagat taacgaattg gtttgtattc tttaatgac 39

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer GkLDC-F

<400> 22

atttcacaca ggaaacagct atgtctcagc tcgagacccc tc 42

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TeLDC-SacI-F

<400> 23

ggcgagctca tggaacctct gctgcgtgc 29

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TeLDC-XbaI-R

<400> 24

ggctctagat taaactttgc agatacgcag ag 32

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TeLDC-F

<400> 25

atttcacaca ggaaacagct atggaacctc tgctgcgtgc 40

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TrLDC-SacI-F

<400> 26

ggcgagctca tgtctgaaga acagcaacg 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TrLDC-XbaI-R

<400> 27

ggctctagat taggcacgaa cgacacgga 29

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer TrLDC-F

<400> 28

atttcacaca ggaaacagct atgtctgaag aacagcaacg 40

<210> 29

<211> 713

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 29

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

Claims (9)

1.一种生产尸胺的方法，所述方法包括：

(a)在30℃至40℃的温度将生产赖氨酸并经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶并过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽的嗜温微生物宿主细胞培养足以积累赖氨酸的一段时间，其中所述嗜热赖氨酸脱羧酶由SEQ ID NO：1-4任一个的氨基酸序列组成；以及

(b)在步骤(a)之后，在60℃至75℃的温度温育(a)的培养物。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在35℃至39℃的温度进行。

3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)在60℃至70℃的温度进行。

4.权利要求1所述的方法，其中修饰所述宿主细胞以过表达至少六种赖氨酸生物合成多肽。

5.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌。

6.权利要求5所述的方法，其中所述宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒杆菌属(Corynebacteria)。

7.权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。

8.权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。

9.权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriaglutamicum)。

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