TWI748408B

TWI748408B - 用於生產1,5-戊二胺之重組微生物及方法

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Publication number: TWI748408B
Application number: TW109112489A
Authority: TW
Inventors: 張嘉修; 吳意珣; 黃士芳; 林宏益; 李昇峰; 蔡珈緯; 黃智郁; 丁婉雯
Original assignee: 中國石油化學工業開發股份有限公司
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2021-12-01
Also published as: TW202138563A; US20210317483A1; US11408015B2; CN113528561A; CN113528561B

Abstract

本發明提供一種表現載體，其包括編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列表現之持續型啟動子序列。本發明另提供一種包含該表現載體之重組微生物及使用該微生物生產1,5-戊二胺之方法。

Description

用於生產1,5-戊二胺之重組微生物及方法

本發明係有關於一種生產1,5-戊二胺之微生物，且特別是有關於一種經基因重組的微生物及使用該微生物生產1,5-戊二胺的方法。

1,5-戊二胺是合成聚醯胺(即尼龍)等多聚物的重要單體。現有以微生物生產1,5-戊二胺的途徑大致可分為三種：(1)微生物代謝途徑(in vivo)的方式；(2)共培養方式，即將兩種微生物共培養，以其中一微生物的產物作為另一微生物的底物(substrate)；以及(3)全細胞催化法(in vitro)，其係利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學轉化，亦即，將微生物培養至一定細胞量，再加入底物進行催化而轉化為產物。

可用於生產1,5-戊二胺的微生物包括大腸桿菌，其可表現離胺酸脫羧酶(lysine decarboxylase，CadA)，並催化離胺酸進行轉化而產生戊二胺。經由微生物代謝途徑方式生產戊二胺之研究包括：以葡萄糖為碳源，並於剔除產物代謝基因後以含Tac啟動子之低拷貝數載體p15A表現CadA，其最高產量僅有9.6g/L[1]；以及以半乳糖作為碳源，並以高拷貝數載體pETDuet表現CadA，其最高產量亦僅有8.8g/L[2]。由上述兩個例子看來，經由調控大腸桿菌的代謝途徑並無法得到高產量的戊二胺，其可能的原因為細胞同時間生產底物及產物，因而導致產物之生成速率緩慢。

於2018年，Wang等人之團隊透過共培養的方式，將底物與產物分開由個別的菌株生產，且兩菌株所使用的碳源不同(前者使用葡萄糖，而後者則使用甘油)，彼此不互相競爭，最終發酵50小時後能達到28.5g/L之產量[3]。以共培養的方式確實能夠提升產量，但以時間效益而言，產量仍然偏低。

全細胞催化法提供另一種替代的方案，其透過高密度發酵提升菌量並累積酵素量，再催化離胺酸轉化成為戊二胺(1,5-diaminopentane，DAP；又稱為屍胺(cadaverine))。於2014年，Weichao Ma等人的團隊以pETDuet的表現系統同時表現CadA及離胺酸/戊二胺逆向轉運酶(cadaverine/lysine antiporter,CadB)，以8g/L的細胞量經過16小時的催化後，其最高產量可達221g/L[4]；另，於2015年，Kim等人的團隊以pET24m表現CadA，其酵素活性為30.27毫莫爾/細胞乾重(毫克)/分鐘(mmol/cell dry weight(mg)/min)，經催化2小時候，最終產量為142.8g/L[5]。

此外，中國專利公開編號第105316270號揭露將CadA基因及含有RBS₂₂的CadB基因插入pET28a(+)載體，並以大腸桿菌B菌株作為宿主。中國專利公開編號第104498519號另揭露以pETDuet作為載體表現CadA及CadB，其中CadB之5‘端融合有周質分泌信號肽(periplasmic pectate lyase(pelB)leader sequence)。此外，歐洲專利公開編號第1482055 號揭露將CadA構建於pUC18載體，並以大腸桿菌K-12 JM109系作為宿主。

然而，包含上述的全細胞催化法，現有的1,5-戊二胺全細胞催化生產方式多以利用大腸桿菌T7表現系統進行操作，其必須於培養時添加昂貴的誘導劑，如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，且其誘導的時間與所需的濃度皆必須精準控制，對於高量生產全細胞酵素非常不利。此外，利用T7系統之大腸桿菌宿主BL21(DE3)系對於其本身所生產的產物1,5-戊二胺的耐受度並不佳，因而限制了1,5-戊二胺的生產。

有鑑於此，有必要提供一種可有效提升生產1,5-戊二胺產能的方法，以解決習知技術所存在的問題。

為解決上述之問題，本發明提供一種表現載體，包括編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列表現之持續型啟動子序列。

於一具體實施例中，該編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%相似度且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列，例如可表現出具有離胺酸脫羧酶活性的蛋白質。於另一具體實施例中，該離胺酸脫羧酶CadA具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有保留性變異的胺基酸序列。

於一具體實施例中，該持續型啟動子係J系列持續型啟動子的其中一者。於另一具體實施例中，該J系列持續型啟動子包括啟動子J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119。於又一具體實施例中，該持續型啟動子係J23100、J23109或J23114。

於一具體實施例中，該持續型啟動子具有與SEQ ID NO：3至少有80%相似度且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列，例如同樣可作為持續型啟動子的序列。

於一具體實施例中，該表現載體具有與SEQ ID NO：4至少有80%相似度且與SEQ ID NO：4具有相同活性之序列。

本發明亦提供一種重組微生物，其包括如上述之表現載體，且該重組微生物可用於生產1,5-戊二胺。

於一具體實施例中，該微生物係屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。於另一具體實施例中，該微生物係大腸桿菌(Escherichia coli)。於又一具體實施例中，該微生物係大腸桿菌K-12 W3110菌株。

於一具體實施例中，本發明所提供的重組微生物為2019年12月19日寄存於財團法人食品工業發展研究所之菌株，寄存編號為BCRC 940690。

本發明亦提供一種生產1,5-戊二胺之方法，係包括：將上述微生物與離胺酸於溶液中混合，以將該離胺酸轉化為1,5-戊二胺；以及自該溶液中分離得到1,5-戊二胺。

於一具體實施例中，該方法進一步包括在培養基中培養上述微生物。於另一具體實施例中，該微生物之培養係以高密度發酵法進行。於又一具體實施例中，該微生物之培養係在該微生物與離胺酸於溶液中混合之前進行。

於一具體實施例中，該微生物係以於600nm波長處之吸光值(OD₆₀₀)為1至6之濃度與離胺酸於溶液中混合。於另一具體實施例中，該離胺酸於該溶液之濃度為1M至2M。於又一具體實施例中，該離胺酸於該溶液之濃度為1M、1.2M、1.4M、1.5M、1.6M、1.8M或2M。

於一具體實施例中，該溶液之pH值為4至8。於另一具體實施例中，該溶液之pH值為4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.8、7、7.5或8。

於一具體實施例中，該方法進一步包括添加輔助因子至該溶液中，其中，該輔助因子於該溶液之濃度為0.01mM至0.05mM。於另一具體實施例中，該輔助因子於該溶液之濃度為0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM或0.05mM。於又一具體實施例中，該輔助因子為磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。

本發明係透過利用非誘導型表現系統，於微生物宿主中表現離胺酸脫羧酶CadA而作為全細胞催化劑，其具有蛋白質表現量高、酵素活性高以及降解率慢等效果，可顯著提高微生物的戊二胺催化效能。此外，以該全細胞催化劑生產1,5-戊二胺時，無須添加額外的誘導劑，可降低1,5-戊二胺的生產成本，並簡化生產程序，進而提升戊二胺的產量和生產速率，使1,5-戊二胺之大規模生產得以實現。

第1A圖為持續型表現質體pSU-J23100-CadA之基因圖譜示意圖。P_J23100：J23100啟動子；B0034 RBS：核醣體結合位點；CadA：離胺酸脫羧酶CadA基因；pUC：pSU質體之複製原點序列片段；CmR：氯黴素乙醯轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase)基因；HindIII、BglII：限制酶切位。

第1B圖為質體pSU-J23100-CadA之DNA電泳圖，顯示該質體全長約4000bp，與第1A圖所示者一致。分子量標記3k、4k及5k分別表示3000、4000及5000鹼基對(base pair，bp)。

第2圖顯示三種大腸桿菌菌株對於戊二胺之耐受性。BL21、W3110、MG1655：分別為三種大腸桿菌菌株BL21、K12 W3110與MG1655；「+」：於培養基中加入戊二胺；「-」：於培養基中不加入戊二胺。

第3圖顯示轉殖株於培養12小時後之蛋白質表現量。WT：野生型W3110；JcadA：轉殖株JcadA/W3110。分子量標記的單位為kDa。

第4圖顯示轉殖株JcadA/W3110之全細胞催化生產結果。0小時為加入1M底物(即離胺酸)及0.05mM輔助因子(PLP)的起始點。W3110：野生型W3110。

第5圖顯示持續型菌株與誘導型菌株於30小時內之菌生長數及活性狀態，其中，持續型菌株為JcadA/W3110，而誘導型菌株為大腸桿菌T7cadA/BL21(DE3)。0小時為大腸桿菌BL21(DE3)-T7cadA加入IPTG 的誘導起始點。DCW：細胞乾重(dry cell weight)。

第6A及6B圖分別顯示不同代之轉殖株JcadA/W3110於培養12小時之質體拷貝數及蛋白質表現量(箭號所指處)。分子量標記之單位為kDa。

第6C及6D圖分別顯示轉殖株JcadA/W3110於不同抗性環境中培養12小時之質體拷貝數及蛋白質表現量。PCN：質體拷貝數(plasmid copy number)。

第7圖顯示不同培養方式所生產的全細胞催化劑之產量及活性狀態。

第8圖顯示全細胞催化劑於-80℃冷凍保存的天數及其活性狀態。

以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。此外，本文所有範圍和數值皆係包含及可合併的。落在本文中所述的範圍內之任何數值或點，例如任何整數，都可以作為最小值或最大值以導出下位的範圍等。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括複數個體。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

本發明提供一種表現載體，其包括編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列以及控制該離胺酸脫羧酶之核酸分子表現的持續型啟動子序列。本發明亦提供一種包含該表現載體之重組微生物及利用該微生物生產1,5-戊二胺之方法。

如本文所使用，術語「離胺酸脫羧酶」係指參與生物體生成1,5-戊二胺反應之酵素，包括兩種離胺酸脫羧酶，即離胺酸脫羧酶1(lysine decarboxylase 1，CadA)及離胺酸脫羧酶2(lysine decarboxylase 2，LdcC)，其中CadA為誘導型酵素，由缺氧、過多離胺酸供給及pH改變所誘導，而LdcC則為持續型酵素，不受外在pH改變所影響[6]。

根據本發明之具體實施例，該編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%)相似度且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列，例如可表現出具有離胺酸脫羧酶活性的蛋白質。於另一具體實施例中，該離胺酸脫羧酶CadA具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有保留性變異的胺基酸序列。

如本文所使用，術語「序列相似度百分比」係指一候選蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸殘基與一參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將所述的候選蛋白質或核酸片段與所述的蛋白質或核酸片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度。在計算相似度時，保留性變異之胺基酸殘基視為不同的殘基；簡併密碼子的核苷酸殘基也視為不同的殘基，例如同樣編碼天門冬醯胺酸的密碼子AAU和AAC之間，視為有一個不同的殘基U或C。

應理解，相較於本發明中作為參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸序列，序列中的至少一部分經修飾(如刪除、取代或添加)之候選蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸序列亦在本發明的範圍內，只要所得的候選蛋白質或核酸片段實質上具有與參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸相同的生物活性，此係歸因於密碼子簡併性(codon degeneracy)。舉例而言，在本發明所編碼CadA之核苷酸序列中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現之多肽的活性。因此，本發明所編碼CadA之核苷酸序列可為具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或與SEQ ID NO：1至少有80%序列相似度之任何核苷酸序列，只要該核苷酸序列所編碼之蛋白能夠呈現CadA的活性。同理，本發明之CadA可為具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2同源之任何蛋白質，只要該蛋白質實質上能夠呈現CadA的活性。

如本文所使用，術語「持續型啟動子」指在多數或全部組織中保持持續活性的啟動子，相對於誘導型啟動子必須受到外界信號或誘導物調控，持續型啟動子可持續表現特定基因。

適用於本發明之持續型啟動子包括屬於J系列持續型啟動子中的成員，例如：J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119。於一具體實施例中，本發明所使用的持續型啟動子可為J23100、J23109或J23114。於另一具體實施例中，該持續型啟動子具有SEQ ID NO：3之序列或與SEQ ID NO：3至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%)相似度且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列，例如同樣可作為持續型啟動子的序列。

根據本發明之具體實施例，本發明之表現載體進一步包括選自由下列所組成群組之至少一者：標記基因序列、報導基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加強子序列、終端子序列以及調節子序列。於另一具體實施例中，該表現載體具有SEQ ID NO：4之序列或與SEQ ID NO：4至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%)相似度且與SEQ ID NO：4具有相同活性之序列。

如本文所使用，術語「重組」係指以人工方式組合兩個彼此分離之序列片段。一般而言，術語「重組」係指核酸、蛋白質或微生物含有源自於多個不同來源之遺傳物質，或由源自於多個不同來源之遺傳物質編碼，諸如源自於兩種或更多種不同品系或物種的生物。

如本文所使用，術語「微生物」屬於微觀生物體，包括細菌、古細菌、病毒或真菌等。如於本文中所使用，「微生物」之引述應理解為涵蓋「細菌」。

適用於作為本發明之表現載體之微生物宿主包括，但不限於，屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)之微生物。於一具體實施例中，本發明所使用之微生物宿主能夠於體內表現離胺酸脫羧酶CadA。於另一具體實施例中，本發明所使用之微生物宿主除了能夠於體內表現離胺酸脫羧酶CadA外，對於戊二胺亦具有耐受性。

根據本發明之具體實施例，本發明用於生產1,5-戊二胺之方法包括在培養基中以足以產生離胺酸脫羧酶CadA的條件培養上述微生物宿主。於一具體實施例中，該培養基可為LB培養基。於另一具體實施例中，該方法包括以高密度發酵法培養該微生物。

根據本發明之具體實施例，該方法進一步包括調整該經培養之微生物的OD₆₀₀濃度達1至6後，將該微生物與離胺酸於溶液中混和。

根據本發明之具體實施例，該離胺酸於該溶液中之濃度為1M至2M。根據本發明之另一具體實施例，該溶液之pH值可為4至8。

根據本發明之具體實施例，該溶液中可進一步含有濃度為0.01mM至0.05mM之輔助因子。

如本文所使用，術語「輔助因子」包含為具有正常酶活性所需的非蛋白質化合物。該等化合物可為有機物或無機物，例如，適用於本發明之輔助因子包括，但不限於，磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate，PLP)。

以下係藉由特定之具體實施例進一步說明本發明之特點及功效，但非用於限制本發明之範圍。

實施例

化學製劑：

氯化鈉購自Sigma Aldrich Co.(美國)。酵母提取物購自Oxoid(台灣)。胰蛋白購自Cyrusbioscience(台灣)。洋菜膠(agar)購自BD Difco脫水培養基(法國)。洋菜糖(agarose)購自GeneDireX(台灣)。磷酸吡哆醛(PLP)、乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylenemalonate，DEEMM)和乙酸鈉購自Sigma Aldrich Co.(美國)。L-離胺酸鹽酸鹽購自Cyrusbioscience(台灣)。D(+)-葡萄糖購自Comieco(義大利)。磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀購自Showa Chemical Industry Co.(日本)。用於HPLC分析的乙腈購自Spectrum Chemical Manufacturing Corp.(美國)。PCR試劑Ex-Tag購自Takara Bio Inc.(美國)。限制酶購自New England Biolabs(美國)。T4 DNA連接酶購自Leadgene Co.,Ltd.(韓國)。引子係由Integrated DNA Technologies(美國)合成。

實施例1：重組表現載體之構建

以大腸桿菌K-12 MG1655之基因組作為模板，設計引子HindIII-CadA-F(5’-GCA AGC TTA TGA ACG TTA TTG CAA TAT TGA ATC AC-3’(SEQ ID NO：5))及BglII-CadA-R(5’-GCA GAT CTT CAT TTT TTG CTT TCT TCT TTC AAT ACC TTA ACG GTA TAG CGG CC-3’(SEQ ID NO：6))，並進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)。

PCR反應用於擴增特定DNA序列片段，所需要的材料包含 DNA模板、5’端引子、3’端引子、去氧核苷酸三磷酸(dNTP)、10x聚合酶緩衝液、聚合酶，其中在本實施例中所使用的聚合酶包括Ex-Taq。PCR產物以DNA電泳分析並割膠回收，得到擴增的離胺酸脫羧酶CadA片段。

將擴增的CadA片段以HindIII及BglII進行酶切反應，接著將CadA片段插入pSU-J23100載體內，構建成pSU-J23100-CadA質體。如第1A圖所示，該質體包含持續型啟動子J23100(Accession：LP934757)、核醣體結合位點B0034RBS(Biobrick No.BBa B0034)、以及由該啟動子J23100所控制表現之CadA基因。

進行轉形時，取一管市售DH5a勝任細胞，加入pSU-J23100-CadA質體約10μL，先於冰上放置30分鐘，再置於42℃水浴加熱1.5分鐘，之後置於冰上5至10分鐘，接著加入400μL的LB液態培養基或是SOC(super optimal broth with catabolites repression)培養基，置於37℃培養箱震盪培養約60至90分鐘，再以4000rpm離心3分鐘，去除300μL的上清液，將含有重組DNA的勝任細胞全數塗佈於含抗生素的固態培養基，並置於37℃環境下過夜培養。

由此固態培養基上所生成之菌落，選取數顆接種於含抗生素的液態試管培養基中，於37℃培養箱過夜培養。次日，自前培養液中取2mL菌液進行質體抽取，並以限制酶切割進行驗證。pSU-J23100-CadA質體之全長為4267bp，與第1B圖之DNA電泳結果一致(即箭頭所示之片段)，驗證CadA基因成功構建於pSU載體。

實施例2：表現宿主測試

為選擇對於戊二胺具有較佳耐受性之微生物作為表現宿主，選擇常見之三種大腸桿菌菌株：BL21、K-12 W3110及MG1655。

首先，將該三種菌株個別培養2小時，再將0.2M的戊二胺加入三菌株的培養液內。如第2圖所示，在不加入戊二胺的情況下，W3110及MG1655較BL21生長更為快速；而在加入戊二胺後，三菌株之生長速率皆有延遲，且菌量皆下降，但W3110於4至12小時期間之生長速率最快且下降之幅度最小，因此可認為具有較高之戊二胺耐受性，故後續選擇以大腸桿菌K-12 W3110菌株作為表現宿主。

實施例3：重組微生物之製備

將實施例1所製得並保存於選殖宿主E.coli DH5a中之pSU-J23100-CadA質體進行質體抽取，並轉殖入大腸桿菌K-12 W3110菌株，培養12小時後分析其蛋白質表現量，並以野生型W3110作為對照。

如第3圖之結果顯示，轉殖株JCadA(其後亦稱之為JcadA/W3110)相較於野生型W3110具有較高的CadA表現量(即箭頭所示之片段)。

實施例4：重組微生物之活性測試

將實施例3之轉殖株JcadA/W3110經培養後，以10,000rpm離心10分鐘，再使細胞沈澱物(pellet)懸浮於去離子水，並調整該菌液於600nm波長處之吸光值(OD₆₀₀)達到6(OD₆₀₀=6)，再將其加入含有作為底物之1M離胺酸，以及作為輔助因子之0.05mM磷酸吡哆醛(PLP)之溶液中，並置於培養箱中震盪反應(35℃、200rpm)。反應期間確認溶液中剩餘之離胺酸含量及所生成之戊二胺含量。

如第4圖所示，以轉殖株JcadA/W3110作為全細胞催化劑時，隨催化反應時間增加，離胺酸之含量減少，且戊二胺之含量增加，其顯示轉殖株JcadA/W3110可將離胺酸催化成戊二胺；反觀野生型W3110，離胺酸殘留量僅些微降低，而完全無戊二胺生成。由此可見，利用持續型表現系統作為全細胞催化劑，相較於野生型W3110確實更具CadA的活性，而可透過in vitro的方式快速催化生產1,5-戊二胺。

實施例5：誘導型與持續型微生物系統之產量與活性比較

為比較持續型表現系統之菌株與誘導型表現系統之菌株的CadA活性，將JcadA/W3110(持續型菌株)與T7cadA/BL21(DE3)(誘導型菌株)LB培養基之相同條件下以5L發酵槽(FB-6S,FIRSTEK，台灣)個別進行培養，並記錄培養33小時內之菌生長數及活性狀態。發酵槽條件為：溶氧(dissolved oxygen，DO)10至30%、空氣流率1.5 vvm、pH=6.8、32℃、100rpm，且T7cadA/BL21(DE3)之培養基中另添加有IPTG誘導劑(添加濃度為0.00167g/L)。菌數以分光光度計波長600nm進行OD值量測，而離胺酸脫羧酶CadA之活性則以BP測定法進行測量。

BP測定法之流程簡述如下：

首先將菌塊定量為OD₆₀₀=5，再進行高壓破菌得到含有離胺酸脫羧酶的可溶性蛋白樣品。經由離胺酸脫羧酶催化反應產生戊二胺量增加。BP呈色劑在波長595nm下可被偵測。使用下表1所列之反應條件測量離胺酸脫羧酶活性，藉由波長595nm差(△OD₅₉₅)與經HPLC定量之戊二胺之檢量線圖作轉換，可計算出酵素活性。

如第5圖所示，JcadA/W3110於培養時不須加人誘導劑生產CadA，因此其生物量較同時間之誘導型菌株高，且經BP測定法測量CadA之活性，結果顯示JcadA/W3110於發酵30小時後，仍能保有150g_DAP/g_DCW/h以上之CadA活性(即活性比度(specific activity))，甚至較誘導型菌株高出2倍。

實施例6：質體穩定性測試

為測試質體穩定性，將轉殖株JcadA/W3110進行繼代培養，繼代方式為由-80℃菌庫接種於培養液中培養，培養12小時後，稀釋塗佈於平板培養基進行活化，並以此作為第0代；接著，再從此經活化的平板培養基中選取單一菌落接種於培養液中培養，培養至12小時後，稀釋塗佈於平板培養基上，並以此作為第1代；之後，每隔7天皆從第0代之平板培養基中選取單一菌落接種於培養液中培養，持續1個月。

將培養12小時之細胞以滅菌水清洗兩次，再濃縮至一定量的 OD數值，再於100℃水浴槽下加熱10分鐘使細胞溶解，接著再以最高轉速離心10分鐘，以分離細胞沈澱物與細胞內所溶解出之物質。利用qPCR(quantitative PCR)進行質體拷貝數測定。

第6A圖顯示活化2周之菌落可達最大拷貝數；於2周後，拷貝數呈現下降趨勢；於活化1個月後，其拷貝數仍維持略高於最初之拷貝數。此外，第6B圖及下表2顯示，活化2周後的蛋白質表現量皆有下降趨勢，由此等結果可知，此質體之拷貝數雖有下降，但仍可維持穩定的表現。

另，將轉殖株JcadA/W3110培養於添加有抗生素的培養基中，並測試在不同的抗性濃度下，此質體能否維持其穩定性。抗性培養之方式為：由-80℃菌庫接種於培養液中培養，以此作為前培養，再接種1%的前培養菌液至4mL的養菌管中，依序添加不同濃度(0、5、10、25ppm)之氯黴素(chloramphenicol)，並於37℃培養箱中培養12小時後，收取1至2mL的菌液進行分析。

如第6C及6D圖及以下表3所顯示，在不同氯黴素濃度下生長之菌株，其質體拷貝數皆維持一定值，且蛋白質表現量仍皆一致，甚至能在不加抗性的環境下維持蛋白質的表現，此說明質體可穩定存在於JcadA/W3110菌株內。

實施例7：放大生產的產量比較：

於本實施例中，以錐形瓶、發酵槽及高密度發酵槽三種培養策略條件生產全細胞催化劑JcadA/W3110，並測試其菌量及活性狀態。菌數以分光光度計波長600nm進行OD值量測，離胺酸脫羧酶活性則以BP測定法進行測量。培養基之組成及培養條件分別如下表4及表5所示：

第7圖顯示三種培養方式所生產的全細胞催化劑之產量及活性狀態，其量化數據另顯示於下表6。由此等結果顯示可知，相較於錐形瓶及發酵槽，利用高密度發酵槽之培養不但能夠提高菌量，還能夠提升單位菌量之活性。更具體地，利用高密度發酵法可大幅提升菌量，並生成30克/升且活性達170U/mg/小時的離胺酸脫羧酶，可用於製備具有高離胺酸脫羧酶活性之1,5-戊二胺全細胞催化劑。

實施例8：冷凍保存活性降解率測試

將發酵槽所生產之全細胞催化劑JcadA/W3110於-80℃冷凍保存，並在保存第20天及第130天時分別取出進行培養，並測試其活性狀態。解凍時將菌塊進行OD值定量破菌，並以BP測定法測量其活性。

第8圖顯示冷凍保存20天後，JcadA/W3110仍具有與未經冷凍時相同的CadA活性，且在冷凍保存130天後，仍具有約一半之酵素活性，其剩餘活性仍存有誘導型菌株的95%活性。由此可見，利用非誘導型表現系統於W3110所表現之離胺酸脫羧酶確實具有蛋白質表現量高、酵素活性高且降解率慢等效果。

上述實施例僅為例示性說明，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不違背本發明之精神及範圍下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發明之權利保護範圍係由所附之申請專利範圍所定義，只要不影響本發明之效果及實施目的，應涵蓋於此公開技術內容中。

參考文獻

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【生物材料寄存】

財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2019年12月19日，寄存編號為BCRC940690。

<110> 中國石油化學工業開發股份有限公司

<120> 用於生產1,5-戊二胺之重組微生物及方法

<130> 115196

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1932

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 715

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子J23100

<400> 3

<210> 4

<211> 4239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSU-J23100-CadA

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HindIII-CadA-F

<400> 5

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BglII-CadA-R

<400> 6

Claims

一種表現載體，包括編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列表現之持續型啟動子序列，其中，該持續型啟動子係J系列持續型啟動子的其中一者，且該J系列持續型啟動子係選自由啟動子J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之表現載體，其中，該編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%相似度且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列。
如申請專利範圍第1項所述之表現載體，其中，該編碼離胺酸脫羧酶CadA之核苷酸序列為SEQ ID NO：1。
如申請專利範圍第1項所述之表現載體，其中，該持續型啟動子係J23100、J23109或J23114。
一種生產1,5-戊二胺之微生物，係包括如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之表現載體，且係屬於大腸桿菌屬(Escherichia)。
如申請專利範圍第5項所述之微生物，係經過重組的大腸桿菌K-12 W3110菌株。
如申請專利範圍第5項所述之微生物，係寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940690。
一種生產1,5-戊二胺之方法，係包括：將如申請專利範圍第5至7項中任一項所述之微生物與離胺酸於溶液中混合，以將該離胺酸轉化為1,5-戊二胺；以及自該溶液中分離得到1,5-戊二胺。
如申請專利範圍第8項所述之方法，進一步包括在該溶液中與該離胺酸混合之前，以高密度發酵法培養該微生物。
如申請專利範圍第8項所述之方法，進一步包括於該溶液中添加輔助因子。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該輔助因子為磷酸吡哆醛。