TWI798706B - 重組微生物及其用於生產1,5-戊二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種重組微生物，其包含表現載體，該表現載體包括編碼磷酸吡哆醛基因之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列表現的持續型啟動子序列。本揭露另提供使用該微生物生產1,5-戊二胺的方法。

Description

重組微生物及其用於生產1,5-戊二胺的方法

本揭露有關於一種生產1,5-戊二胺的微生物，且特別是有關於一種經基因重組的微生物及使用該微生物生產1,5-戊二胺的方法。

1,5-戊二胺是化工產業中用以合成多聚物的重要原料，其生產及製備方法的改良及效率提升為該領域一直以來的主要課題。

全細胞催化法(in vitro whole-cell biotransformation)是現有以微生物生產1,5-戊二胺的其中一種方法，其利用完整的生物有機體作為催化劑而進行化學轉化，亦即，將微生物培養至一定細胞量後，再加入基質進行催化，進而轉化為產物。例如，使用基因重組微生物使其表現離胺酸脫羧酶(lysine decarboxylase，CadA)，並透過高密度發酵提升菌量，藉以增加離胺酸脫羧酶的表現量，進而提升其催化離胺酸的轉化效率以生產戊二胺。然而，以全細胞催化法生產1,5-戊二胺時，還必須在反應系統中添加昂貴的磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate，PLP)活化離胺酸脫羧酶(CadA)，以進一步提升全細胞催化法的效率。

磷酸吡哆醛(PLP)是維生素B6的活性形式，大腸桿菌細胞中具有兩條磷酸吡哆醛的自生成途徑，分別是從頭合成法，即利用葡萄糖生產磷 酸吡哆醛，而另一條則稱為超級救援途徑，即利用維生素B6的前體，如吡哆醛(pyridoxal，PL)和吡哆醇(pyridoxine，PN)等經催化生成磷酸吡哆醛。

於先前技術中，已揭露於催化過程中添加維生素B6的前體以取代磷酸吡哆醛的方法，如中國專利公開編號第109536542號，其揭露在反應系統中加入濃度為0.05至0.5mM的吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等輔酶；另外，中國專利公開編號第109097408號則揭露在連續酶反應器中加入離胺酸脫羧酶和維生素B6輔酶；而中國專利公開編號第108997141號另揭露在離胺酸和離胺酸脫羧酶混合系統中加入吡哆胺、吡哆醇、吡哆醛、磷酸吡哆醛等維生素B6輔酶。然而，上述直接添加磷酸吡哆醛前體對於生產1,5-戊二胺的效果不佳，仍需開發其他提升1,5-戊二胺產能的全細胞催化法。

於2015年，中國南京工業大學研究團隊(Ma,W.,Cao,W.,Zhang,B.,Chen,K.,Liu,Q.,Li,Y.,& Ouyang,P.(2015).Engineering a pyridoxal 5’-phosphate supply for cadaverine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis.Scientific Reports,5(1),1-10)嘗試利用表現從頭合成途徑中的基因以提升戊二胺的產量，而韓國Kim等人的團隊(Kim,J.H.,Kim,J.,Kim,H.J.,Sathiyanarayanan,G.,Bhatia,S.K.,Song,H.S.& Yang,Y.H.(2017).Biotransformation of pyridoxal 5’-phosphate from pyridoxal by pyridoxal kinase(pdxY)to support cadaverine production in Escherichia coli.Enzyme and Microbial Technology,104,9-15)則經由表現PdxY並添加PL作為前體的方法，其獲得最高33g/L的戊二胺，生產率為5.5g/L/h，但該等方法的產能及生產效率並不符合需求，故仍需能進一步提高1,5-戊二胺產量的方法。

有鑑於此，本揭露所屬技術領域對可有效提升生產1,5-戊二胺產能的方法仍有需求，以解決習知技術所存在的問題。

為解決上述的問題，本揭露提供一種生產1,5-戊二胺的重組微生物，其包括至少兩個基因，且該至少兩個基因的其中至少一者係位於表現載體上，其中，該至少兩個基因包括編碼離胺酸脫羧酶的基因以及編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的基因。於本揭露的至少一個具體實施例中，該重組微生物所包括的離胺酸脫羧酶以及生成磷酸吡哆醛之酵素的基因表現係經增強者。

於本揭露的至少一個具體實施例中，生產1,5-戊二胺的重組微生物包括至少兩個外源基因，其中，該外源基因係編碼離胺酸脫羧酶(CadA)的基因及編碼生成磷酸吡哆醛(PLP)之酵素的基因。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的基因為pdxH、pdxY、pdK或其任意組合。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該重組微生物係包含表現載體，其中，該表現載體包括至少一個編碼離胺酸脫羧酶(CadA)、編碼生成磷酸吡哆醛之PdxH、PdxY或PdxK之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列表現之持續型啟動子序列。

於本揭露的至少一個具體實施例中，在該重組微生物所包含的表現載體中，該編碼離胺酸脫羧酶(CadA)之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：11至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：11具有相同活性之序列，該編碼PdxH之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列，該編碼PdxY之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：3至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列，該編碼PdxK之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：5至少有80%相似度且與SEQ ID NO：5具有相同活性之序列。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該持續型啟動子係J系列持續型啟動子的其中一者。於本揭露的一些具體實施例中，該J系列持續型啟動子包括J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119。於本揭露的一些具體實施例中，該持續型啟動子為J23100、J23109或J23114。

於本揭露的一些具體實施例中，該持續型啟動子為PlacI持續型啟動子。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該微生物屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。於本揭露的一些具體實施例中，該微生物為大腸桿菌K-12 W3110菌株或BL21菌株。

於本揭露的至少一個具體實施例中，本揭露所提供的重組微生物於2020年12月10日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940691。

本揭露亦提供一種生產1,5-戊二胺的方法，其包括：將上述微生物與離胺酸於第一溶液中混合，以將該離胺酸轉化為1,5-戊二胺；以及自該第一溶液中分離得到1,5-戊二胺。

於本揭露的一些具體實施例中，該方法進一步包括添加輔助因子至該第一溶液中。於本揭露的一些具體實施例中，該輔助因子為磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate，PLP)或其前體，如吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN)。於本揭露的至少一個具體實施例中，該第一溶液中離胺酸的濃度為0.1M至2M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8 M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該方法進一步包括：在分離得到1,5-戊二胺後，回收溶液中的微生物；將回收的微生物加入包含離胺酸的第二溶液中；於第二溶液中加入前述微生物；以及自該第二溶液中分離得到1,5-戊二胺。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該第二溶液中離胺酸的濃度為0.1M至2M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M。

於本揭露的至少一個具體實施例中，該微生物加入至第二溶液中的量以OD₆₀₀值計為1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，且不以此為限。

本揭露透過使用非誘導型表現系統，於微生物宿主中同時表現離胺酸脫羧酶(CadA)及生成磷酸吡哆醛(PLP)而作為全細胞催化劑，免除額外添加PLP作為輔酶的步驟及成本，並進一步提高微生物的戊二胺催化效能及產量。該全細胞催化劑還可回收並循環利用，更進一步降低1,5-戊二胺的生產成本。以該全細胞催化劑生產1,5-戊二胺時，無須添加額外的磷酸吡哆醛(PLP)輔酶，可因而降低1,5-戊二胺的生產成本，並簡化生產程序，進而提升戊二胺的產量和生產速率，使1,5-戊二胺的大規模生產得以實現。

圖1顯示在W3110及BL21菌株中添加吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN)等不同的前體，以包含自發型啟動子pSU-J23100或pSU-PlacI的持續型 質體驅動pdxH、pdxY或pdxK基因的蛋白質表現。圖中分別以箭頭指出PdxH(25.5KDa)、PdxY(31.7KDa)及PdxK(31.2KDa)於蛋白質電泳中的位置。JH：以pSU-J23100啟動子驅動pdxH基因的表現；PH：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxH基因的表現；JY：以pSU-J23100啟動子驅動pdxY基因的表現；PY：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxY基因的表現；JK：以pSU-J23100啟動子驅動pdxK基因的表現；PK：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxK基因的表現。

圖2顯示在W3110及BL21菌株中，在添加吡哆醛(PL)或吡哆醇(PN)下，以包含自發型啟動子pSU-J23100或pSU-PlacI的持續型質體驅動pdxH、pdxY或pdxK基因的PLP生成量。WT：未經任何質體轉形的原始菌株；JH：以pSU-J23100啟動子驅動pdxH基因的表現；PH：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxH基因的表現；JY：以pSU-J23100啟動子驅動pdxY基因的表現；PY：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxY基因的表現；JK：以pSU-J23100啟動子驅動pdxK基因的表現；PK：以pSU-PlacI啟動子驅動pdxK基因的表現。DCW：細胞乾重(dry cell weight)。* P<0.05。

圖3A至圖3C顯示包含CadA質體及PdxY或PdxK質體的雙質體BL21菌株的戊二胺生產情形。圖3A顯示細胞的生長情形；圖3B顯示戊二胺的產量；圖3C顯示胞內PLP的自生成量。DCW：細胞乾重(dry cell weight)。* P<0.05。

圖4顯示共表現CadA及PdxY或PdxK的雙質體BL21菌株在不同濃度離胺酸中的戊二胺生產量及離胺酸消耗率。

圖5顯示PLP自生成菌株經pSU-J23100-CadA質體轉殖後(JcadA-Wmut菌株)的離胺酸脫羧酶(CadA)的活性分析。柱狀圖中的白色柱代表添加磷酸吡哆醛(PLP)作為輔助因子，淺灰色柱代表添加吡哆醇 (PN)作為輔助因子，深灰色柱代表添加吡哆醛(PL)作為輔助因子。DAP：戊二胺(1,5-diaminopentane)

圖6顯示PLP自生成菌株經pSU-J23100-CadA質體轉殖後(JcadA-Wmut菌株)，利用PN或PL作為前體時催化離胺酸(1.2M)生產戊二胺(1,5-diaminopentane，DAP)的產量與轉化率。

圖7顯示PLP自生成菌株經pSU-J23100-CadA質體轉殖後(JcadA-Wmut菌株)循環利用的離胺酸轉化率。

以下藉由特定的具體實施例說明本揭露的實施方式，熟習此技藝的人士可由本說明書所揭示的內容輕易地瞭解本揭露的優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同的實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本揭露所揭示的範圍下賦予不同的修飾與變更。此外，本文所有範圍和數值皆為包含及可合併的。落在本文中所述範圍內的任何數值或點，例如任何整數，都可以作為最小值或最大值以導出下位的範圍。

除非文中另有說明，否則本揭露說明書及所附申請專利範圍中所使用的單數形式「一」及「該」包括複數個體。

除非文中另有說明，否則本揭露說明書及所附申請專利範圍中所使用的術語「或」包括「及/或」的含義。

本揭露提供一種表現載體，其包括編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的基因，其包括pdxH、pdxY及pdxK的核苷酸序列，以及控制該離胺酸脫羧酶的核酸分子表現的持續型啟動子序列。本揭露亦提供一種包含該表現載體的重組微生物，以及利用該微生物生產1,5-戊二胺的方法。

如本文中所使用，術語「磷酸吡哆醛」(PLP)是指催化生物體反應生成1,5-戊二胺的離胺酸脫羧酶的輔酶(或稱為輔助因子)，磷酸吡哆醛為維生素B6的活性形式。如前所述，在大腸桿菌細胞內存在2條PLP的自生成途徑，分別為從頭合成法，即利用葡萄糖生產PLP，而另一條為超級救援途徑，即利用維生素B6的前體，包括吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)等經催化生成PLP。

根據本揭露的至少一個具體實施例，編碼生成磷酸吡哆醛之pdxH基因的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性的序列，例如可表現出具有生成磷酸吡哆醛之PdxH活性的蛋白質。於本揭露的一些具體實施例中，生成磷酸吡哆醛之PdxH具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有保留性變異的胺基酸序列。

根據本揭露的至少一個具體實施例，編碼生成磷酸吡哆醛之pdxY基因的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：3至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性的序列，例如可表現出具有生成磷酸吡哆醛之PdxY活性的蛋白質。於本揭露的一些具體實施例中，生成磷酸吡哆醛之PdxY具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4具有保留性變異的胺基酸序列。

根據本揭露的至少一個具體實施例，編碼生成磷酸吡哆醛之pdxK基因的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：5至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：5具有相同活性的序列，例如可表現出具有生成磷酸吡哆醛之 PdxK活性的蛋白質。於本揭露的一些具體實施例中，生成磷酸吡哆醛之PdxK具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或與SEQ ID NO：6具有保留性變異的胺基酸序列。

如本文中所使用，術語「序列一致性百分比」是指一候選蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸殘基與一參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可先將候選蛋白質或核酸片段與所述的蛋白質或核酸片段並排(align)，並於必要時引入間隙(gap)，以使二序列形成最高的序列一致性。在計算序列一致性時，保留性變異的胺基酸殘基將視為不同的殘基；簡併密碼子的核苷酸殘基也將視為不同的殘基，例如同樣編碼天門冬醯胺酸的密碼子AAU和AAC之間，將視為有一個不同的殘基U或C。

應當理解，相較於本揭露中作為參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸序列，序列中的至少一部分經修飾(如刪除、取代或添加)的候選蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸序列亦在本揭露的範圍內，只要所得的候選蛋白質或核酸片段實質上具有與參考蛋白質或核酸片段的胺基酸或核苷酸相同的生物活性，此因密碼子的簡併性(codon degeneracy)。舉例而言，在本揭露所編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的核苷酸序列中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現的多肽的活性。因此，本揭露所編碼生成磷酸吡哆醛之pdxH基因的核苷酸序列可為具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性的任何核苷酸序列，只要該核苷酸序列所編碼的蛋白質能夠呈現生成磷酸吡哆醛之PdxH的活性。同理，本揭露中生成磷酸吡哆醛之PdxH可為具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2同源的任何蛋白質，只要該蛋白質實質上能夠呈現生成磷酸吡哆醛之PdxH的活性。

如本文中所使用，術語「持續型啟動子」是指在多數或全部組織中保持持續活性的啟動子，相對於誘導型啟動子必須受到外界信號或誘導物而調控，持續型啟動子可持續表現特定基因。

適用於本揭露的持續型啟動子包括屬於J系列持續型啟動子中的成員，例如：J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119。於至少一個具體實施例中，本揭露所使用的持續型啟動子可為J23100、J23109或J23114。於一些具體實施例中，本揭露所使用的持續型啟動子具有SEQ ID NO：7的序列或與SEQ ID NO：7至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：7具有相同活性的序列，例如同樣可作為持續型啟動子的序列。

適用於本揭露的持續型啟動子另包括PlacI持續型啟動子。於一些具體實施例中，該持續型啟動子具有SEQ ID NO：8的序列或與SEQ ID NO：8至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：8具有相同活性的序列，例如同樣可作為持續型啟動子的序列。

根據本揭露的至少一個具體實施例，本揭露的表現載體進一步包括選自由下列所組成群組的至少一者：標記基因序列、報導基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加強子序列、終端子序列以及調節子序列。

於一些具體實施例中，本揭露的表現載體具有SEQ ID NO：9的序列或與SEQ ID NO：9至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：9具有相同活性的 序列。於一些具體實施例中，本揭露的表現載體具有SEQ ID NO：10的序列或與SEQ ID NO：10至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：10具有相同活性的序列。

如本文中所使用，術語「離胺酸脫羧酶」是指參與生物體生成1,5-戊二胺反應的酵素，包括兩種離胺酸脫羧酶，即離胺酸脫羧酶1(lysine decarboxylase 1，CadA)及離胺酸脫羧酶2(lysine decarboxylase 2，LdcC)，其中CadA為誘導型酵素，由缺氧、過多離胺酸供給及pH改變所誘導，而LdcC則為持續型酵素，不受外在pH改變所影響。

根據本揭露的至少一個具體實施例，該編碼離胺酸脫羧酶CadA的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：11至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：11具有相同活性的序列，例如可表現出具有離胺酸脫羧酶活性的蛋白質。於一些具體實施例中，該離胺酸脫羧酶CadA具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12具有保留性變異的胺基酸序列。於本揭露至少一個具體實施例所提供的表現載體，其包括編碼離胺酸脫羧酶CadA的核苷酸序列，以及控制該離胺酸脫羧酶的核酸分子表現的持續型啟動子序列。於本揭露的一些具體實施例中，提供有一種包含該離胺酸脫羧酶CadA表現載體的重組微生物，以及利用該微生物生產1,5-戊二胺的方法。於本揭露的一些具體實施例中，該表現載體具有SEQ ID NO：13的序列或與SEQ ID NO：13至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：13具有相同活性的序列。

根據本揭露的至少一個具體實施例，本揭露提供一種包含兩種或兩種以上不同表現載體的微生物，其包括表現離胺酸脫羧酶CadA的表現載 體以及表現生成磷酸吡哆醛之PdxH、PdxY或PdxK的重組微生物。於一些具體實施例中，本揭露所提供的重組微生物可同時表現離胺酸脫羧酶CadA及生成磷酸吡哆醛，生成該磷酸吡哆醛之酵素為pdxH、pdxY或pdxK基因所編碼的生成磷酸吡哆醛的PdxH、PdxY或PdxK。於一些具體實施例中，本揭露提供一種可自行生成磷酸吡哆醛的重組微生物。

如本文中所使用，術語「重組」是指以人工方式組合兩個彼此分離的序列片段。一般而言，術語「重組」是指核酸、蛋白質或微生物含有源自於多個不同來源的遺傳物質，或由源自於多個不同來源的遺傳物質編碼，諸如源自於兩種或更多種不同品系或物種的生物。

如本文中所使用，術語「外源基因」是指源自於一個或多個不同來源的遺傳物質編碼，諸如源自於兩種或更多種不同品系或物種的生物，可以利用習知的基因重組技術將外源基因於選定的宿主中表現，例如，使用表現載體在宿主中表現外源基因。

如本文中所使用，術語「微生物」屬於微觀生物體，包括細菌、古細菌、病毒或真菌等。如於本文中所使用，「微生物」的引述應理解為涵蓋「細菌」。

適用於作為本揭露的表現載體的微生物宿主包括，但不限於，屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物。於一些具體實施例中，本揭露所使用的微生物宿主能夠於體內表現離胺酸脫羧酶CadA及pdxK、pdxH或pdxY所編碼的磷酸吡哆醛生成酵素。於一些具體實施例中，本揭露所使用的微生物宿主除了能夠於體內表現離胺酸脫羧酶CadA及pdxK、pdxH或pdxY所編碼的磷酸吡哆醛生成酵素外，對於戊二胺亦具有耐受性。

如本文中所使用，術語「輔酶」或「輔助因子」包含正常酶活性所需的非蛋白質化合物。該等化合物可為有機物或無機物，例如，適用於本揭露的輔酶或輔助因子包括，但不限於，磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)等維生素B6的前體。

以下藉由特定的具體實施例進一步說明本揭露的特點及功效，但非用於限制本揭露的範圍。

實施例

實施例1：構建表現載體

以大腸桿菌K-12 MG1655的基因組作為模板，設計帶有HindIII及SpeI切位的引子以構建持續型啟動子表現PLP的超級救援基因pdxH、pdxY及pdxK，所使用的引子如下表一所示。

表一、用於構建表現載體的引子

以MG1655基因組作為模板並使用上述引子進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)，得到相關基因的特定DNA序列擴增片段。用於擴增特定DNA序列片段的PCR反應所需要的材料包含DNA模板、5’端引子、3’端引子、去氧核苷酸三磷酸(dNTP)、10x聚合酶緩衝液以及聚合酶，其中在本實施例中所使用的聚合酶包括Ex-Taq。PCR產物以DNA電泳分析並經割膠回收，得到擴增的PLP超級救援基因pdxH、pdxY及pdxK片段。

將擴增的基因片段以HindIII及SpeI進行酶切反應，接著將擴增的PLP超級救援基因片段插入pSU-J23100或pSU-PlacI載體內，構建成pSU-J23100-pdxH(以JH表示，即以pSU-J23100啟動子驅動pdxH基因表現)、pSU-PlacI-pdxH(以PH表示，即以pSU-PlacI啟動子驅動pdxH基因表現)、pSU-J23100-pdxY(以JY表示，即以pSU-J23100啟動子驅動pdxY基因表現)、pSU-PlacI-pdxY(以PY表示，即以pSU-PlacI啟動子驅動pdxY基因表現)、pSU-J23100-pdxK(以JK表示，即以pSU-J23100啟動子驅動pdxK基因表現)、以及pSU-PlacI-pdxK(以PK表示，即以pSU-PlacI啟動子驅動pdxK基因表現)等質體，再將質體轉形送入DH5α菌株。

進行熱轉化轉形時，取一管市售的DH5α勝任細胞，加入上述所得的質體約10μL，先於冰上放置30分鐘，再置於42℃水浴加熱1.5分鐘，之後置於冰上5至10分鐘，接著加入400μL的LB(Luria Bertani)液態培養基或是SOC(super optimal broth with catabolites repression)培養基，置於37℃培養箱震盪培養約60至90分鐘，再以4,000rpm離心3分鐘，去除300μL的上清液，將含有重組DNA的勝任細胞全數塗佈於含抗生素的固態培養基上，並置於37℃環境下過夜培養。由此固態培養基上所生成的菌落，選取數顆接種於含抗生素的液態培養基中，於37℃培養箱過夜培養，獲得含有各種質體的DH5α菌 液。

實施例2：持續型自生成PLP菌株的製備及其PLP表現量

抽取實施例1所製得並保存於DH5α細胞中的各質體pSU-J23100-pdxH、pSU-PlacI-pdxH、pSU-J23100-pdxY、pSU-PlacI-pdxY、pSU-J23100-pdxK及pSU-PlacI-pdxK，經熱轉化轉形送入大腸桿菌BL21或W3110菌株，將含有上述質體的BL21或W3110菌株的勝任細胞塗佈於含抗生素的固態培養基上，並置於37℃環境下過夜培養，再取數顆接種於含抗生素的液態培養基中，於37℃培養箱過夜培養，獲得含有各質體的BL21或W3110菌株，即為持續型自生成PLP的菌株。

將前述製得的持續型自生成PLP的菌株培養於液態培養基中，在其中添加0.2mM的吡哆醇(PN)或吡哆醛(PL)進行培養，之後利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析各菌株的蛋白質表現量，並以野生型的BL21或W3110作為對照。

在此進一步說明SDS-PAGE蛋白質分析法的步驟。首先，收集細胞並調整至OD₆₀₀為4，以去離子水洗滌2次後，抽取細胞蛋白質。取30μL蛋白質樣品後混合10μL的蛋白質染劑，以100℃加熱10分鐘，於SDS膠片樣品槽中加入15μL的樣品溶液，即可進行SDS-PAGE電泳分析。SDS-PAGE的設定程序為先以80V進行30分鐘，再以120V進行60分鐘，待藍色指示線跑出膠片的底端時停止，再以考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色40分鐘至60分鐘，並脫色約40分鐘，視實際染色情況更換脫色液。待背景藍色完全脫去後，換上去離子水，待背景顏色清楚後進行掃描。結果如圖1所示，各種質體在不同宿主菌株及添加PN或PL等不同前體所獲得的蛋白質表現量不同，例如，添加PL前體時，含有JY、PY及PK質體的BL21菌株具有較高的PLP 蛋白質表現。

進一步針對菌株的胞內PLP進行定量。將過夜培養細胞定量至OD₆₀₀為20，以無菌水洗滌3次，再以12,000rpm離心3分鐘，再將細胞回溶於1mL無菌水中。利用高壓破碎儀以30KPsi破碎細胞，得到胞內代謝物，加入10%三氯醋酸，劇烈震盪後在冰上靜置10分鐘，以14,000g離心10分鐘後去除蛋白質，取上清液以高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)定量持續型自生成PLP菌株中的PLP產量。

HPLC定量PLP的方式和分析條件包括將待分析樣品通過0.2μm濾膜以進行過濾，使用的管柱為反相色譜C18(YMC-C18色譜柱，4.6×250mm，粒徑為5μm)，洗提緩衝液為0.1M的磷酸二氫鉀(pH 6.6)，洗提時間為0至20分鐘，流速設為0.8mL/min，進樣量為50μL。管柱溫度維持在35℃，並且在340nm的波長處測量PLP。以不同濃度標準品PLP作為對照，即可測得樣品中的PLP濃度。

圖2顯示BL21或W3110菌株中以不同質體驅動PLP表現的PLP定量結果，其顯示pSU-J23100-pdxH(JH)質體於W3110菌株宿主中的表現量相較於未經任何質體轉形的原始菌株(WT)具有顯著差異，而pSU-J23100-pdxH(JH)、pSU-PlacI-pdxH(PH)、pSU-J23100-pdxY(JY)與pSU-PlacI-pdxK(PK)質體於BL21菌株宿主中的表現量相較於未經任何質體轉形的原始菌株(WT)具有顯著差異。

實施例3：雙質體菌株的製備及活性和產量的測試

建構pSIT-CadA表現載體，從大腸桿菌MG1655(GenBank：NC_000913)的基因組DNA中擴增離胺酸脫羧酶基因，使用限制性內切酶BamHI和NotI切出粘性末端，再以連接酶接進pSIT載體(pSIT載體購自 Addgene，載體商品名稱：pSKDuet16，編號：#41684)以生成pSIT-CadA(SEQ ID NO.20)。將pSIT-CadA與pSU-J23100-pdxY或pSU-PlacI-pdxK同時送入BL21細胞，並於含有卡那黴素(kanamycin)與氯黴素(chloramphenicol)的雙抗性培養基進行篩選，以建構雙質體菌株。

接著，進行生物發酵法，亦即，將上述雙質體系統在液態培養基中培養於37℃，並以200rpm震盪，當細胞培養至OD₆₀₀到達0.6時，添加0.01mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、0.2mM的PN與50g/L的離胺酸，並將細胞改至30℃，並以200rpm震盪培養。定時取樣，以測量細胞生長情形、離胺酸的消耗量與戊二胺的生成量。

如圖3A的結果所示，含有pSIT-CadA與pSU-J23100-pdxY(AJY)和含有pSIT-CadA與pSU-PlacI-pdxK(APK)的雙質體系統在第10小時後，其生物質(biomass)均較僅含有pSIT-CadA(A)的菌株多，代表其生長情形較佳。圖3B顯示AJY可在短時間內促進戊二胺的生產，而APK則可以達到最大的轉化。圖3C另顯示雙質體系統具有較高的自生成PLP能力。

以雙質體系統進行全細胞轉化，其步驟包括將過夜培養的細胞以8,000g離心5分鐘後收集，使用純水清洗2次後投入不同濃度的離胺酸溶液中，在37℃下，以200rpm的震盪條件進行全細胞催化反應。於一定時間後將反應液置於100℃下水煮10分鐘，再以高速離心取上清液，並以HPLC定量分析離胺酸消耗率與戊二胺生成率。

以HPLC定量分析離胺酸與戊二胺衍生化體系由340μL的0.05M硼酸緩衝液(pH 9)、240μL的100%甲醇、6μL的樣品和12μL的200mM的乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylenemalonate，DEEMM)組成。將上述樣品在70℃下加熱2小時，以完全降解過量的DEEMM和衍生化副 產物。使用DEEMM進行衍生化後，再利用HPLC進行分析。C18柱(YMC-C18柱，4.6×250mm，粒徑5μm)維持在35℃。流動相A由100%乙腈組成，流動相B由25mM乙酸鈉水溶液(pH 4.8)組成。使用0.8mL/min的流速，並採用以下梯度程序：0-2分鐘，20-25%A；2-32分鐘，25-60%A；32-40分鐘，60-20%A。檢測在284nm進行。

圖4顯示雙質體系統於不同濃度離胺酸的催化效果，結果顯示，APK系統催化能力最佳，且具有最高的戊二胺產率及離胺酸消耗率。

實施例4：自生成PLP馴化菌株活性比較

以馴化方式獲得一持續型自生成PLP菌株，包括將含有pSU-J23100-CadA的W3110菌株培養於含有高濃度吡哆醛(PL)的LB液態培養基中，此處吡哆醛(PL)的濃度為10至150μM，過夜培養後將該菌株接種於新鮮的含有高濃度的吡哆醛(PL)的培養基中，如此反復繼代10次。將上述菌株均勻塗佈在含有20g/L離胺酸和100μM吡哆醛(PL)的LB瓊脂培養基上(pH 5.0)，挑選所得到的單菌落，進行CadA酶活性測試，從中篩選出酶活性最高之菌株，而獲得同時表現CadA及PLP相關基因的自生成PLP菌株(本文後以JcadA-Wmut代表此經馴化的菌株)。

將過夜培養的細胞以8000 x g離心共5分鐘後進行收集，使用純水清洗2次後投入1.2M的離胺酸溶液中，並添加PLP、PN或PL等不同的前體，在37℃、200rpm震盪的條件下進行全細胞催化反應，並參考文獻以溴甲酚紫分析法(bromophenol purple test，BP test)測定CadA活性(Ting,W.W.,Huang,C.Y.,Wu,P.Y.,Huang,S.F.,Lin,H.Y.,Li,S.F.,Chang,J.S.& Ng,I.S.(2021).Whole-cell biocatalyst for cadaverine production using stable,constitutive and high expression of L-lysine decarboxylase in recombinant Escherichia coli W3110. Enzyme and Microbial Technology,109811)。

測定離胺酸脫羧酶(CadA)活性的BP分析步驟如下，首先取得OD₆₀₀定量為5的液體培養後所得的細菌細胞，進行高壓破菌(30Kpsi)後，以12,000rpm離心5分鐘，可得到含有離胺酸脫羧酶的可溶性蛋白樣品。初步測試不同濃度離胺酸對最大反應速率之關係，發現初始離胺酸濃度為40mM時可得到戊二胺與HPLC結果最佳的關聯性。BP分析法在鹼性會呈現紫色，在酸性則會呈現黃色。經過離胺酸脫羧酶的反應，可增加戊二胺，並使pH上升，故BP分析法可偵測在波長595nm下的呈色，以測定離胺酸脫羧酶(CadA)的活性。

使用下表二中的反應條件測量離胺酸脫羧酶的活性，最後加入3%的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)使離胺酸脫羧酶所進行的反應終止，並藉由波長595nm之變化(△OD₅₉₅)經由HPLC戊二胺的定量得到檢量線。

表二、離胺酸脫羧酶活性測量方法的反應條件

如圖5所示，JcadA-Wmut的CadA活性以添加PL作為輔助因子時為最高，甚至高於添加PLP作為輔助因子者。

另外，如圖6所示，使用PL作為前體，並使用JcadA-Wmut作為生物催化劑時，可催化1.2M離胺酸完全轉化為戊二胺，而不需添加輔助因子PLP，最終可達95%以上的戊二胺轉化率及124g/L的戊二胺產量。

實施例5：使用JcadA-Wmut作為循環利用催化劑

將上述於2M離胺酸的全細胞催化液中的細胞以12,000rpm離心1分鐘後回收，再投入至2M的離胺酸溶液中，並添加新的JcadA-Wmut菌株細胞，添加量以OD₆₀₀值計分別為1、2、3及5，如此循環利用2次。每次催化時間為4小時。催化後的溶液使用HPLC定量離胺酸與戊二胺濃度。

結果如圖7所示，JcadA-Wmut在每次補料OD₆₀₀值為5的條件下，可以循環利用至少2次，且仍維持95%以上的離胺酸轉化率。

上述實施例僅為例示性說明，而非用於限制本揭露。任何熟習此技藝的人士均可在不違背本揭露的範圍下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本揭露的權利保護範圍將由所附的申請專利範圍所定義，只要不影響本揭露的效果及實施目的，皆應涵蓋於本揭露的內容中。

【生物材料寄存】

財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2020年12月10日，寄存編號為BCRC 940691。

<110> 中國石油化學工業開發股份有限公司

<120> 重組微生物及其用於生產1,5-戊二胺的方法

<130> 115589

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 864

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 852

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 283

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子序列

<400> 7

<210> 8

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子序列

<400> 8

<210> 9

<211> 3077

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體序列

<400> 9

<210> 10

<211> 3230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體序列

<400> 10

<210> 11

<211> 2148

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 11

<210> 12

<211> 715

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 12

<210> 13

<211> 4267

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體序列

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 15

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 16

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 19

<210> 20

<211> 5926

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體序列

<400> 20

Claims (13)

1. 一種生產1,5-戊二胺的重組微生物，其包括至少兩個基因，且該至少兩個基因的其中至少一者係位於表現載體上，其中，該至少兩個基因包括編碼離胺酸脫羧酶的基因以及編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的基因，以及其中，該表現載體包括編碼離胺酸脫羧酶、編碼生成磷酸吡哆醛之酵素或其組合之核苷酸序列以及控制該核苷酸序列之表現的持續型啟動子序列，並且其中，該持續型啟動子為J系列持續型啟動子中的其中一者或PlacI持續型啟動子。
2. 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼離胺酸脫羧酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：11至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：11具有相同活性之序列。
3. 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼生成磷酸吡哆醛之酵素的基因之核苷酸序列為表現PdxH、PdxY、PdxK或其任意組合之核苷酸序列。
4. 如請求項3所述的重組微生物，其中：該編碼表現PdxH之核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列；該編碼表現PdxY之核苷酸序列具有與SEQ ID NO：3至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列；或該編碼表現PdxK之核苷酸序列具有與SEQ ID NO：5至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：5具有相同活性之序列。
5. 如請求項1所述的重組微生物，其中，該J系列持續型啟動子為J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118或J23119。
6. 如請求項1所述的重組微生物，其屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。
7. 如請求項6所述的重組微生物，其為經過重組的大腸桿菌K-12 W3110菌株或BL21菌株。
8. 如請求項7所述的重組微生物，其寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940691。
9. 一種生產1,5-戊二胺的方法，包括：將如請求項1至8中任一項所述的重組微生物與離胺酸於第一溶液中混合，以將該離胺酸轉化為1,5-戊二胺；以及自該第一溶液中分離得到1,5-戊二胺。
10. 如請求項9所述的方法，進一步包括於該第一溶液中添加輔助因子。
11. 如請求項10所述的方法，其中，該輔助因子為磷酸吡哆醛、吡哆醛、吡哆醇或其任意組合。
12. 如請求項9所述的方法，進一步包括：在分離得到1,5-戊二胺後，回收溶液中的微生物；將回收的該微生物加入包含離胺酸的第二溶液中；於該第二溶液中加入如請求項1至8中任一項所述的重組微生物；以及自該第二溶液中分離得到1,5-戊二胺。
13. 如請求項12所述的方法，其中，該微生物加入該第二溶液中的量以OD₆₀₀值計為1至10。

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