CN112391372A

CN112391372A - 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN112391372A
Application number: CN202011294113.9A
Authority: CN
Inventors: 吕常江; 黄�俊; 梅乐和; 胡升; 赵伟睿; 陈贵才; 胡伟莲; 李业; 樊芳芳; 姚丽莉
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Current assignee: Hangzhou Meiliu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112391372B

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用。该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过蛋白质工程改造植物乳杆菌源的谷氨酸脱羧酶，拓宽了该蛋白催化pH活性范围；改造后的GadB基因与GadC基因共同连接于pNZ8149载体中，在乳酸乳球菌NZ3900中表达；在发酵罐中培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149‑gadB_ΔC11C，用于转化谷氨酸钠生产食品级GABA，转化周期48h，产量高达33.52g/L，谷氨酸钠摩尔转化率达到91.64％；为基于乳酸菌代谢改造及发酵技术制备食品级GABA提供了优良菌株和方法支撑。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸，具有降血压、利尿、抗抑郁和改善睡眠等多种重要的生理功能，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。目前，有关GABA的制备方法主要包含化学合成法与生物合成法两大类。而依据催化剂种类的不同，后者又可进一步细分为植物转化法、微生物转化法和酶法。利用微生物转化谷氨酸(L-Glu)或谷氨酸盐制备GABA，不受资源、环境和空间等限制，是人们目前研究的一个主要方向。

迄今为止，大量具有GABA合成能力的微生物被筛选和鉴定。其中，最为引人关注的是乳酸菌，因其食品安全级(generally recognized as safe,GRAS)属性，已成为制备GABA的最佳选择之一。乳酸菌细胞合成GABA的过程由谷氨酸脱羧酶系统所介导，包含两个关键蛋白：位于细胞质中的谷氨酸脱羧酶GadB和位于细胞膜上的L-Glu/GABA反向转运蛋白GadC。前者负责将进入胞内的L-Glu脱羧反应生成GABA及CO₂，同时消耗一个“H⁺”；后者负责胞外L-Glu的转入与胞内GABA的外排。

值得关注的是，目前所报道的微生物源GAD最适反应pH值一般在4-5之间，而当pH大于6.0时，几乎失去活性。实际上，这种现象与GAD系统的功能相符合，该系统被认为是细菌抵抗极端酸性环境的应激途径之一。然而，乳酸菌细胞正常生长繁殖时通常维持胞内pH近中性。因此，在强化GAD系统表达的基础上，如何协调细胞最适生长pH与胞内GAD的催化活性pH范围之间的差异，是提升乳酸菌GABA合成速率所面临的一个共性瓶颈问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用。该谷氨酸脱羧酶突变体和基因工程菌具有催化效率及转化率高的特点；本发明方法通过蛋白质工程改造拓宽谷氨酸脱羧酶催化活性pH范围，并利用基因工程菌发酵制备GABA，操作简便，适用于工业化生产食品级GABA。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。该谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列为植物乳杆菌源GAD的C-末端切除11个氨基酸残基后剩余的氨基酸序列。

本发明提供了一种如上所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。

进一步地，所述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种包含如上所述编码基因的重组载体。

进一步地，所述的重组载体，其原始表达载体为pNZ8149。

本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的GAD突变体基因，和核苷酸序列如SEQID NO:3所示的乳酸乳球菌源谷氨酸/γ-氨基丁酸反向转运蛋白GadC基因。

进一步地，所述宿主细胞为乳酸乳球菌NZ3900；所述目的基因插入至原始表达载体中再转入宿主细胞，所述原始表达载体为pNZ8149。

所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pNZ8149为载体，将SEQ ID NO:2所示基因及SEQ ID NO:3所示基因与载体连接，在L.lactis NZ3900中重组表达SEQ ID NO:5所示谷氨酸脱羧酶及SEQ ID NO:6所示L-Glu/GABA反向转运蛋白。

本发明还提供了所述的基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

本发明还提供了一种高产食品级γ-氨基丁酸的方法，包括：

(1)将如权利要求6或7任一项所述的基因工程菌接种于发酵培养基中，进行扩大培养；

(2)待扩大培养后的菌悬液OD₆₀₀在0.3-0.4之间时，向菌悬液中加入诱导剂，进行发酵培养；

(3)步骤(2)发酵培养7～10h后，调节发酵液pH至5.0，并将发酵液维持在该pH值上，发酵培养一段时间后，得到高产食品级γ-氨基丁酸的发酵液。

进一步地，以体积比计，基因工程菌接种于发酵培养基时的接种量为2％；扩大培养的条件为：搅拌转速100rpm，培养温度30℃；所述诱导剂为终浓度为5.0ng/mL的nisin；发酵8h后，采用H₂SO₄和NaOH调控发酵液的pH，发酵48h后结束发酵。

具体的方法为：将所述基因工程菌按照2％接种量(v/v)接种于发酵培养基，培养温度30℃，搅拌转速100rpm，菌悬液OD₆₀₀在0.3-0.4时加入终浓度为5.0ng/mL的nisin；发酵8h后采用3M H₂SO₄和3M NaOH调控pH至5.0，并维持在该数值，发酵培养48h后结束发酵。

其中，所述发酵培养基为的成分为(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25、葡萄糖10.0、谷氨酸钠60，pH 7.2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过对植物乳杆菌源的谷氨酸脱羧酶进行蛋白质工程改造得到了谷氨酸脱羧酶突变体，该突变体具有较宽的催化pH活性范围及较高的催化效率；该酶在pH 6.0条件下的相对酶活性是野生型酶的4.68倍；且在pH 6.5及pH 7.0条件下，仍保持有18.22％(5.06μM/min/mg protein)及7.79％(2.16μM/min/mg protein)的相对活性，而野生型酶在上述pH条件下未检测到明显酶活。

(2)本发明所提供的基因工程菌具有较高的GABA合成能力，发酵所制备的GABA为食品级。在如上所述的转化体系中，转化率达到91.64％，产量达到33.52g/L，为目前基于乳酸乳球菌细胞催化合成GABA的最高产量报道，能够满足工业化生产食品级GABA的需求。

附图说明

图1为重组植物乳杆菌源GadB在E.coli BL21(DE3)中可溶性表达的SDS-PAGE分析；

其中，(M)，蛋白Marker；(a)：未诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB全细胞，(b)：IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB全细胞；(c)：IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB细胞破碎离心上清液；(d)：纯化后的GadB。

图2为植物乳杆菌源GadB凝胶过滤色谱图(TSK gel G-3000SW_XL)；

其中，a-g标准蛋白分别为：甲状球蛋白(669kDa)，铁蛋白(440kD)，肌球蛋白(200kDa)，醛缩酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，卵清蛋白(45kDa)，碳酸酐酶(29kDa)。

图3为不同温度、pH、PLP及金属离子对酶活性的影响；

其中，(A)：温度对GadB活性的影响；(B)：pH对GadB活性的影响；(C)：外源添加PLP对GadB活性的影响；(D)：金属离子(1mM)对GadB活性的影响。

图4为植物乳杆菌源GadB结构模拟；

其中，A和B为不同表现形式下的C-末端结构域特征；C，GadB活性中心保守残基。

图5为近中性条件下GadB及突变体GadB_ΔC11酶活性比较。

图6为非控酸发酵条件下基因工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C发酵产GABA分析。

图7为两阶段pH调控条件下基因工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C产GABA分析；

其中，前8h为非控酸发酵；8h后维持发酵体系pH至5.0，直至48h发酵结束。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下列实施例涉及的材料均可从商业途径获得，实验操作为常规分子生物学方法及生化分析。涉及的实验方法如下：

重组GAD的纯化：取经IPTG诱导后的E.coli菌体细胞，采用10％培养体积的破胞缓冲液(0.1M PBS，1mM PMSF，pH 7.5)溶解细胞沉淀，随后置于冰水浴中进行超声破碎(输出功率：300w，超声3s，间隔6s，90个循环)。超声处理完毕后，将细胞破碎液进行离心(13,000×g，10min，4℃)，获取上清液，即粗酶液。粗酶液经0.45μm的滤膜过滤后，采用镍离子亲和层析法(Ni-NTA Agarose)对目的蛋白进行分离纯化。

GAD酶学特性分析：配置不同pH的底物溶液(0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 3.6-5.6；0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.0-8.0；内含0.01mM PLP与100mM L-Glu)；取480μL底物溶液，向其加入20μL纯酶于不同温度及pH条件下反应10min；利用0.2M NaHCO₃溶液(pH 9.8)终止反应并采用HPLC法测定反应生成的GABA含量。动力学参数于含有不同底物浓度的反应体系中测定，反应温度与pH分别为40℃和pH 5.0。

GABA含量测定：采用柱前衍生化RP-HPLC法测定样品中GABA含量。衍生化条件如下:将100μL经0.5M NaHCO₃稀释后的待测样品，200μL 0.5mol/L NaHCO₃溶液，100μL 4g/LDNS-Cl丙酮溶液，置于40℃下避光衍生1h后用0.22μm微孔滤膜过滤。HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18(250mm×4.6mm)，紫外检测波长设置为254nm，进样量为10μL，流速为1mL/min，流动相A为含0.01％三氯乙酸的甲醇溶液，流动相B为四氢呋喃：甲醇：0.05M醋酸钠(pH 6.2)(5:75:420,v/v)。梯度洗脱程序见下表1。

表1高效液相色谱梯度洗脱程序

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉浸取物5.0、酵母提取物4.0、吐温80 1.0、葡萄糖20.0、K₂HPO₄ 2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸三铵2.0、MgSO₄·7H₂O 0.2、MnSO₄·4H₂O 0.05，pH6.2。

M17培养基(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25，pH 7.2。

GM17培养基(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25、葡萄糖5.0，pH 7.2。

种子培养基(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25、葡萄糖10.0、谷氨酸钠20.0，pH 7.2。

发酵培养基(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25、葡萄糖10.0、谷氨酸钠60.0，pH 7.2。

实施例1植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的获取

(1)将植物乳杆菌接种于5mL MRS液体培养基中，30℃静置孵育24h，离心收集0.5mL菌体细胞，使用细菌基因组提取试剂盒获取其基因组DNA；

(2)采用引物gadB-F(5’-CGCGGATCCATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATG-3’)与gadB-R(5’-ACGCGTCGACTCAGTGTGTGAATCCGTATTTC-3’)从基因组DNA中克隆获取谷氨酸脱羧酶基因gadB；

(3)使用PCR产物纯化试剂盒纯化该基因；

(4)利用限制性内切酶BamHI和SalI处理该基因与表达载体pET28a，37℃酶切30min；

(5)切胶回收目的条带，并使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切后的目的基因与载体片段；

(6)使用T4-DNA连接酶将酶切并胶回收纯化后的目的基因和质粒pET28a于25℃条件下连接15min；

(7)利用“热击转化法”将构建好的重组载体导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，于含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体平板中培养12h，菌落PCR初步筛选重组子，而后进行DNA测序验证，获取正确的基因工程菌株，即为表达谷氨酸脱羧酶基因的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-gadB。

得到基因序列如SEQ ID NO:1，对应氨基酸序列如SEQ ID NO:4。

实施例2植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶蛋白质工程改造

(1)IPTG诱导基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB，并采用采用镍离子亲和层析法纯化重组的植物乳杆菌源GadB，而后基于凝胶过滤色谱(TSK gel G-3000 SW_XL)测定GAD分子量。重组植物乳杆菌源的GadB在E.coli BL21(DE3)中可溶性表达的SDS-PAGE分析如附图1所示；凝胶过滤色谱图如附图2所示，结果表明该蛋白为同源二聚体，分子量约为109.60kDa。

(2)测定不同温度、pH、外源添加磷酸吡哆醛(PLP)及金属离子对GadB活性的影响，结果如附图3所示。表明该蛋白最适温度及pH分别为40℃和pH 5.0；重组蛋白大部分以GadB-PLP复合体形式存在；Ca²⁺、Zn²⁺及Mg²⁺对其具有激活作用，而Fe³⁺、Fe²⁺、Mn²⁺及Cu²⁺对其具有抑制作用。

(3)以基于X-Ray衍射所解析的大肠杆菌GAD晶体结构(PDB ID:2DGK)为模板，使用FoldX软件中的“BuildModel”模块进行同源建模，利用Accelrys Discovery Studio 2020软件中的CDOCKER对L-Glu与GadB进行分子对接，采用PyMOL(http://www.pymol.org)软件呈现所模拟结构，如附图4所示。

(4)基于上述模拟结果，采用蛋白质工程手段分别截除谷氨酸脱羧酶C-末端10、11、12及13个氨基酸残基，所用引物如表2所示，构建方法如实施例1所述；并分别测定野生型及突变体在pH 5.0与40℃条件下的酶促反应动力学参数，如表3所示。

结果表明：截断C-末端11个氨基酸残基的突变体较野生型呈现出相对更好的底物亲和力和催化效率。突变体GadB_ΔC11的基因序列如SEQ ID NO:2，对应氨基酸序列如SEQ IDNO:5。

表2突变体构建所需的引物序列及相应酶切位点

表3野生型GadB及突变体酶促反应动力学参数

(5)选取GadB_ΔC11为目标突变体，测定其在近中性pH条件下的催化性能，结果如附图5所示，在pH 6.0时，突变体GadB_ΔC11的酶活为10.40μM/min/mg，为野生型的4.68倍；且在pH 6.5及pH 7.0条件下仍保持有5.06μM/min/mg与2.16μM/min/mg的酶活，而野生型未检测到相应酶活。表明突变体GadB_ΔC11具有相对较宽催化pH活性范围。

实施例3高GAD活性的L.lactis基因工程菌株获取

(1)参照实施例1，使用细菌基因组提取试剂盒分别提取植物乳杆菌与乳酸乳球菌基因组DNA；

(2)基于细菌质粒提取试剂盒(于Buffer 1中加入10mg/mL溶菌酶，37℃孵育15min，后续步骤参照说明书)，提取pNZ8149质粒；

(3)设计引物，如表4所示，分别克隆获取gadB、gadB_ΔC11、gadC及pNZ8149片段；

(4)利用无缝克隆试剂盒分别构建重组载体pNZ8149-gadB、pNZ8149-gadBC、pNZ8149-gadB_ΔC11及pNZ8149-gadB_ΔC11C；

(5)采用电击转化法将重组载体导入L.lactis NZ3900感受态细胞中，于Elliker固体平板上筛选重组子，重组载体采用酶切及测序验证，相对应的基因工程菌株分别命名为：L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB、L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11、L.lactisNZ3900/pNZ8149-gadBC及L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C；

(6)经GM17活化后的上述基因工程菌株转接至种子培养基中(2％(v/v))，30℃条件下静置培养过夜；种子液进一步以2％(v/v)比例转接至含有60g/L谷氨酸钠的发酵培养基中，继续静置培养；待菌悬液OD₆₀₀约为0.3-0.4时，加入诱导剂nisin至终浓度为5.0ng/mL；定时取样，测定基因工程菌细胞GAD活性。每g(以干重计)细胞每分钟催化生成1μmol的GABA为一个酶活单位(U)。不同的基因工程菌株在对数期(EXP.；12h)与平衡期(STAT.；24h)时细胞表观GAD活性如表5所示。结果表明于L.lactis中过表达gadB_ΔC11能够明显提升细胞GABA合成能力，且共表达植物乳杆菌源谷氨酸脱羧酶突变体基因gadB_ΔC11与乳酸乳球菌源gadC的基因工程菌呈现出最高的GAD活性。

表4基因克隆引物序列

表5基因工程菌表观GAD活性

实施例4基因工程菌株产食品级GABA

(1)将实施例3中所构建的基因工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C接种于GM17培养基中，30℃静置培养24h；

(2)将上述活化后的菌悬液以2％(v/v)比例转接至种子培养基中，30℃静置培养过夜；

(3)种子液进一步以2％(v/v)比例转接至发酵培养基中，继续30℃静置培养，待菌悬液OD₆₀₀约为0.3-0.4时，加入终浓度为5.0ng/mL的诱导剂nisin，定时取样，测定培养体系中的生物量、pH及GABA含量变化。

结果如附图6所示：随着发酵的进行，菌体生物量逐渐增加，发酵体系pH逐渐降低；发酵6h时，GABA开始逐渐产生；至8h，由于GABA的不断积累，培养体系pH不再降低；而随着发酵的进行，GABA快速积累并伴随pH逐渐上升；36h发酵结束时，GABA产量高达19.01g/L，pH升高至pH 5.6。

实施例5两阶段pH调控过程对基因工程菌株产GABA的影响

(1)参照实施例4中步骤1、2对实施例3中所获取的基因工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C进行活化；

(2)种子液以2％(v/v)比例转接至容积为5L的发酵罐中，发酵培养基装液量为2L，搅拌转速为100rpm，培养温度为30℃，待菌悬液OD₆₀₀约为0.3-0.4时加入终浓度为5.0ng/mL的诱导剂nisin；

(3)至8h时调控体系pH值至5.0，并采用3M H₂SO₄和3M NaOH调控发酵体系pH维持在该数值至发酵结束；结果如附图7所示，与实施例4相比，两阶段pH调控条件下基因工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB_ΔC11C产GABA能力显著提升；36h时，GABA产量为31.67g/L，为实施例4中产量的1.67倍；而48h发酵结束时GABA产量为33.52g/L，底物谷氨酸钠转化率为91.64％，为目前基于乳酸乳球菌细胞催化合成GABA的最高产量报道。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神与范围内，均可做各种改动与调整，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 浙江科技学院

浙大宁波理工学院

<120> 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60

ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120

cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180

aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaacccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240

acgctggcta agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300

cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360

acctctacga ttggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420

tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaatg cccatcgacc taacctcgtt 480

atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540

cacgtggtcc caatggatga gcaacacatg gtccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600

gtggacgaat acacaattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660

gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720

ccagtctaca ttcacgttga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780

caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840

tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900

ccagaattag tcttcaaagt tagttattta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960

ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020

gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080

ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140

taccaactag ccccgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200

ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttacctg ctaatctgga acaacaagtc 1260

atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320

gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcatgacgcg 1380

gcacctaaga aatacggatt cacacactga 1410

<210> 2

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60

ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120

cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180

aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaacccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240

acgctggcta agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300

cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360

acctctacga ttggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420

tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaatg cccatcgacc taacctcgtt 480

atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540

cacgtggtcc caatggatga gcaacacatg gtccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600

gtggacgaat acacaattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660

gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720

ccagtctaca ttcacgttga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780

caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840

tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900

ccagaattag tcttcaaagt tagttattta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960

ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020

gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080

ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140

taccaactag ccccgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200

ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttacctg ctaatctgga acaacaagtc 1260

atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320

gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcattga 1377

<210> 3

<211> 1512

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 3

atgaatcaaa aaaaattatc attattcggt tttttcgcat taaccgcttc aatggttttg 60

actgtctatg agtatccgac ttttgccacg tcaaaattac atttggtgtt ctttttactt 120

ctcggaggac tactatggtt tttgcctgta gcgctctgcg cagcagaaat ggcgacggtt 180

gaaggctgga aaaatggtgg aatctttagt tgggtcagtc aaactttagg tgagcgcttt 240

ggttttgcag ccatattttt tcagtggttc caaattacag taggttttgt cactatgatc 300

tatttcattt taggggccct ctcttatgtg ttaaattttc aggcgctcaa tacagatcca 360

ttgataaaat ttattggttt actaatcatt ttttggggat tgactttttc tcaattaggt 420

gggacgcaac ggactgccaa attagtaaaa gctggctttg tagttggaat agtgattcca 480

tcggttatct tgtttggatt agcagcggca tactttatcg gaggcaatcc tatagaaata 540

ccaattaaca gccatgcttt tgtaccagat ttttcacagg tatcaacttt agtagttttt 600

gtttctttta ttctggctta tatgggggta gaagcctcag cttcacatat taatgaactt 660

gaaaatccaa aacgaaatta tcccttagca atgattttat tagtaatttt ggctatttct 720

ttagatgcca taggtggatt ttctgtagca gcagttattc ctcaaaaaga gttatcatta 780

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tggttagtta aagtgattgc actaatgatt gcctttgggg ttatgggaga agtgagttca 900

tgggttgttg gtccttctag agggatgttt gcagcagcac aaagaggttt attaccaaaa 960

tttttacgta aaacgaatac acatgaagtc cctgttcctt tagttatgat tcaaggaatc 1020

attgttacac tttggggcgc tgtattaact tttggaggag gaggaaataa tttatctttc 1080

ttagttgcca tttcactgac tgtagtgatt tatttggtgg gttacctctt gttctttatt 1140

gtttactttg ttttaatcta taaaaaacaa aatttaaagc gtacttataa tgttccaggt 1200

aaaataatag gaaaaacaat cattgcagga attggattct tattatcaat ttttgctcta 1260

tttatttcct ttgttcctcc agcatcaatt gcgaaaaatg aaactcacac ctatcaaatg 1320

atacttctta taagttttgt tgtgaccgct atcttgccat ttattattta tgaattgcat 1380

gataaaaagg gacatgatac tattgaagaa ccaacacact ttaaagcagg agatgtgaac 1440

cctgcgattt atccagcagc tcgtggagag catcatatta ttaaaaaaga agaacatatc 1500

ttaaaacatt ga 1512

<210> 4

<211> 469

<212> PRT

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 4

Met Ala Met Leu Tyr Gly Lys His Asn His Glu Ala Glu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Glu Pro Val Phe Gly Ala Pro Ser Glu Gln His Asp Leu Pro Lys Tyr

20 25 30

Arg Leu Pro Lys His Ser Leu Ser Pro Arg Glu Ala Asp Arg Leu Val

35 40 45

Arg Asp Glu Leu Leu Asp Glu Gly Asn Ser Arg Leu Asn Leu Ala Thr

50 55 60

Phe Cys Gln Thr Tyr Met Glu Pro Glu Ala Val Glu Leu Met Lys Asp

65 70 75 80

Thr Leu Ala Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Ala

85 90 95

Glu Ile Glu Asn Arg Cys Val Asn Ile Ile Ala Asn Leu Trp His Ala

100 105 110

Pro Asp Asp Glu His Phe Thr Gly Thr Ser Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Met Lys Phe Ala Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ala His Arg Pro Asn Leu Val

145 150 155 160

Ile Ser Ala Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Val Tyr Trp

165 170 175

Asp Val Asp Met His Val Val Pro Met Asp Glu Gln His Met Val Leu

180 185 190

Asp Val Asn His Val Leu Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Thr Ile Gly Ile

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Val Gly Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Asp Leu Ala

210 215 220

Ala Leu Asp Lys Val Val Thr His Tyr Asn His Gln His Pro Lys Leu

225 230 235 240

Pro Val Tyr Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Pro

245 250 255

Phe Ile Glu Pro Gln Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Ala Asn Val Val

260 265 270

Ser Ile Asn Ala Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val

275 280 285

Gly Trp Val Val Trp Arg Asp Arg Gln Phe Leu Pro Pro Glu Leu Val

290 295 300

Phe Lys Val Ser Tyr Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn

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Phe Ser His Ser Ala Ala Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Ile

325 330 335

Arg Phe Gly Met Asp Gly Tyr Arg Glu Ile Gln Thr Lys Thr His Asp

340 345 350

Val Ala Arg Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Asp Lys Val Gly Glu Phe Lys

355 360 365

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370 375 380

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Leu Met Asn Gly Trp Gln Val Pro Thr Tyr Pro Leu Pro Ala Asn Leu

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420 425 430

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435 440 445

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Tyr Gly Phe Thr His

465

<210> 5

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Met Leu Tyr Gly Lys His Asn His Glu Ala Glu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Glu Pro Val Phe Gly Ala Pro Ser Glu Gln His Asp Leu Pro Lys Tyr

20 25 30

Arg Leu Pro Lys His Ser Leu Ser Pro Arg Glu Ala Asp Arg Leu Val

35 40 45

Arg Asp Glu Leu Leu Asp Glu Gly Asn Ser Arg Leu Asn Leu Ala Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Leu Ala Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Ala

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Glu Ile Glu Asn Arg Cys Val Asn Ile Ile Ala Asn Leu Trp His Ala

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Ile Ser Ala Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Val Tyr Trp

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245 250 255

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Glu Gln Gln Val Ile Gln Arg Ile Val Val Arg Ala Asp Phe Gly Met

420 425 430

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<212> PRT

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 6

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35 40 45

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Ser Val Ile Leu Phe Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Phe Ile Gly Gly Asn

165 170 175

Pro Ile Glu Ile Pro Ile Asn Ser His Ala Phe Val Pro Asp Phe Ser

180 185 190

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195 200 205

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275 280 285

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgcgtcgac tcagtcatga tgatagacaa tgtgg 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgcgtcgac tcaatgatag acaatgtggg cgt 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgcaggcat gcggtaccac tag 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtgagtgcc tccttataat tta 23

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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<210> 17

<211> 40

<212> DNA

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<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

accgcatgcc tgcagtcaat gatgatagac aatgtgggcg 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

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<400> 19

aaggaggcac tcaccatggc aatgttatac ggtaaacaca 40

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggattcacac actgactgca gatgaatcaa aaaaaattat cattattc 48

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

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<400> 22

accgcatgcc tgcagtcaat gttttaagat atgttcttct 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaggaggcac tcaccatggc aatgttatac ggtaaacaca 40

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<212> DNA

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<400> 24

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<210> 25

<211> 48

<212> DNA

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<400> 25

gtctatcatc attgactgca gatgaatcaa aaaaaattat cattattc 48

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accgcatgcc tgcagtcaat gttttaagat atgttcttct 40

Claims

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种包含如权利要求2所述编码基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，原始表达载体为pNZ8149。

6.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的GAD突变体基因，和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的乳酸乳球菌源谷氨酸/γ-氨基丁酸反向转运蛋白GadC基因。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为乳酸乳球菌NZ3900；所述目的基因插入至原始表达载体中再转入宿主细胞，所述原始表达载体为pNZ8149。

8.如权利要求6或7任一项所述的基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

9.一种高产食品级γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括：

10.如权利要求9所述的高产食品级γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，以体积比计，基因工程菌接种于发酵培养基时的接种量为2％；扩大培养的条件为：搅拌转速100rpm，培养温度30℃；所述诱导剂为终浓度为5.0ng/mL的nisin；发酵8h后，采用H₂SO₄和NaOH调控发酵液的pH，发酵48h后结束发酵。