CN116064494B - 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因及其应用，属于生物技术领域。该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过祖先酶序列重建策略获取了一个热稳定性显著提升的GAD突变体。与野生型相比，该突变体最适反应温度提升了17℃；在55℃条件下的半衰期t 1/2为321.4 min，是野生型GAD 23.7 min的13.6倍；突变体的T 50 15为60.1℃，比野生型的56.5℃提高了3.6℃；所述突变体热稳定性显著提升，具有大规模工业应用的前景。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因及其应用。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）是一种四碳非蛋白氨基酸，在动物、植物及微生物中广泛存在。作为哺乳动物中枢神经系统中的重要抑制性神经递质，GABA具有降血压、利尿、抗抑郁、改善睡眠、促进生长及抗衰老等多种重要的生理功能，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase, GAD; EC 4.1.1.15）是生物法合成GABA的关键酶，其能够以磷酸吡哆醛（PLP）为辅酶，专一、不可逆地催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠脱去α-羧基生成GABA并释放出CO2。筛选或构建具有良好催化性能的GAD是实现生物法高效合成GABA的重要前提。
目前，来源于大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短促生乳杆菌（原短乳杆菌）、清酒乳杆菌、米曲霉及绿色木霉等不同微生物染色体上的GAD基因被克隆和异源表达，其酶学性质亦被研究（Ning Xu, Liang Wei & Jun Liu.Biotechnological advances and perspectives of gamma-aminobutyric acidproduction,World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 33:64）。然而，天然的GAD普遍存在热稳定性差的缺陷。近年来，包括发明人在内的国内外研究者通过定点突变、脯氨酸效应、拉氏图信息、同源建模、蛋白质表面电荷优化及序列一致性等方法在一定程度上提升了GAD的热稳定性（申请号CN202010442372.5、CN202210086071.2、CN201910572205.X、CN201710196715.2、CN202110238958.4），但在大规模酶法合成GABA的工业应用中仍受到较大制约。因此，如何进一步提升GAD的稳定性具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
为解决谷氨酸脱羧酶稳定性差的问题，本发明提供了一种基于祖先酶序列重构策略的谷氨酸脱羧酶突变体以及制备方法和应用。与野生型GAD相比，其热稳定型显著提升。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其野生蛋白为来源于短促生乳杆菌CGMCC No.1306表达的酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明提供了一种如上所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，野生型谷氨酸脱羧酶的编码基因如SEQ ID No.1所示。
本发明以前期晶体结构已解析的短促生乳杆菌源谷氨酸脱羧酶（GAD；PDB ID:5GP4）为模板蛋白，基于祖先酶序列重构策略通过FireProtASR系统（https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/）构建GAD突变体，然后验证突变体的热稳定，得到了一个热稳定性显著提升的GAD突变体，命名为AncGAD。
本发明中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为编码上述模板蛋白的基因序列，即来源于短促生乳杆菌CGMCC No.1306的GAD1407基因；SEQ ID No.3所示的氨基酸序列是GAD1407基因所编码的蛋白GAD（GeneBank ID: ADG02973.1），即野生型酶。
本发明还提供了一种表达单元，所述表达单元包括SEQ ID No.2。
本发明还提供了一种包含所述表达单元的重组质粒。
本发明还提供了包含所述重组质粒的基因工程菌。
将上述目的基因片段整合到基因工程菌的染色体基因组上，以获得稳定表达GAD突变体（AncGAD）的基因工程菌，也可以通过重组质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的宿主菌株，优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠脱去α-羧基生成GABA中的应用。
进一步地，本发明提供了一种催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠生成GABA的方法，包括以下步骤：
（1）构建表达谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，所述谷氨酸脱羧酶突变体如权利要求1所述；
（2）培养所述基因工程菌，破碎细胞，获取谷氨酸脱羧酶酶液；
（3）将所述谷氨酸脱羧酶酶液加入至含有底物L-谷氨酸或其钠盐及PLP的缓冲体系中进行反应，得到GABA。
（4）将所述基因工程菌加入至含有底物L-谷氨酸的水溶液中进行反应，得到GABA。
本发明与现有技术相比的有益效果：
（1）本发明获得了稳定性显著提升的GAD突变体（AncGAD）。该突变体与野生型GAD的序列一致性为70.24%。与野生型相比，该突变体最适反应温度提升了17℃；在55℃条件下的半衰期t 1/2为321.4 min，是野生型GAD（23.7 min）的13.6倍；突变体的T 50 15为60.1℃，比野生型（56.5℃）提高了3.6℃。本发明所得的GAD突变体稳定性优异，更加适合工业化的生产需求。（2）本发明还运用分子动力学模拟技术证实了AncGAD较野生型酶具有更高的热稳定性能。（3）本发明通过祖先酶序列重构策略提升了GAD的催化性能，不仅为GAD的工业应用提供了可靠方法，同时为提高其它酶的催化性能提供了指导。
附图说明
图1为实施例1中野生型酶与突变体的序列一致性分析图；
图2为重组载体pET28a-AncGAD双酶切验证图。其中，M为DNA marker，1为经NdeI和SalI酶切后的产物。
图3为GAD突变体（AncGAD）在E. coli BL21(DE3)中可溶性表达的SDS-PAGE分析图。其中，（M），蛋白Marker；（1）：IPTG诱导的E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD细胞破碎离心上清液；（2）：纯化后的AncGAD；（3）IPTG诱导的E. coli BL21(DE3)/ pET28a-GAD1407细胞破碎离心上清液；（4）：纯化后的野生型GAD（GAD1407）；（5）：未诱导E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD全细胞。
图4为野生型GAD及AncGAD催化底物L-谷氨酸生成GABA的液相色谱图；
图5为不同温度及pH对酶活性的影响图。其中，（A）：温度对野生型GAD及AncGAD活性的影响图；（B）：pH对野生型GAD及AncGAD活性的影响图。
图6为野生型GAD及突变体AncGAD的稳定性检测结果图。其中，A为野生型GAD及突变体AncGAD在不同温度条件下孵育15 min后相对活性分析（T 50 15）；B为野生型GAD及突变体AncGAD在55℃条件下孵育不同时间后的相对活性分析（t 1/2）。
图7为pH 5.0、328 K条件下野生型GAD及突变体AncGAD的RMSD值对比图。
图8为基因工程菌株游离细胞催化L-谷氨酸生成GABA的性能分析图。其中，A为E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD的催化性能分析图；B为E. coli BL21(DE3)/pET28a-GAD的催化性能分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下列实施例涉及的材料均可从商业途径获得，实验操作为常规分子生物学方法及生化分析。
1、谷氨酸脱羧酶突变体的获取
于NCBI数据库中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到晶体结构已解析的短促生乳杆菌源GAD的氨基酸序列（GeneBank ID: ADG02973.1），核苷酸序列如SEQ ID No: 1，利用FireProtASR系统（https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/）构建GAD系统发育树，进化树的内部节点即为假定的祖先酶序列。而后，以进化树最初节点为目标突变体，下载该突变体氨基酸序列，如SEQ ID No: 4所示。该突变体酶命名为AncGAD。随后，基于SEQID No: 4序列，以E. coli为目标表达宿主，采用密码子优化系统（http://www.jcat.de/）获取编码该突变体的目的基因序列，如SEQ ID No: 2所示，野生型酶的核苷酸序列与突变体的序列一致性分析如图1。而后，将目的基因序列送至安徽通用生物系统有限公司进行化学合成。
2、过表达GAD突变体基因工程菌的获取
（1）以化学合成的AncGAD基因为模板，设计引物AncGAD-F（5’-GGAATTCCATATGCTGTACTCTAAAAAAAACAAAGAAAAC-3’）与AncGAD-R（5’-ACGCGTCGACTTAGTGGGTGAAACCGTAAACTTTTTTG-3’），PCR克隆获取目的基因；
（2）使用PCR产物纯化试剂盒，参照说明书纯化该目的基因；
（3）利用限制性内切酶NdeI和SalI处理该基因与表达载体pET28a，37℃酶切30min；
（4）利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的基因片段，切胶回收目的条带，并使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切后的目的基因与载体片段；
（5）使用T4-DNA连接酶将酶切并胶回收纯化后的目的基因和质粒pET28a于25℃条件下连接15 min；
（6）利用“热击转化法”将构建好的重组载体导入E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，于含有50 μg/mL卡纳霉素的LB固体平板中培养12 h，菌落PCR初步筛选重组子，而后进行DNA酶切和测序验证，获取正确的基因工程菌株，即为表达AncGAD的工程菌E .coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD。重组载体pET28a-AncGAD的双酶切验证图谱如图2所示。
3、酶的表达及分离纯化
挑取转化的单克隆菌落接种于5 mL含有终浓度为50 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养12 h。随后，以2%（V/V）接种量接种于200 mL含有终浓度为50 μg/mLKan的LB液体培养基中，37℃、220 rpm条件下继续培养细胞。当菌悬液OD600值达到0.5-0.7时，加入终浓度为0 .5 mM的IPTG进行诱导。25℃、150 rpm条件下诱导8 h-12 h，,6000rpm、4℃离心15 min收集菌体细胞，并采用无菌生理盐水离心洗涤2次。进一步，取经IPTG诱导后的E. coli菌体细胞，采用10%培养体积的破胞缓冲液（0.1 M PBS，1 mM PMSF，pH 7.5）溶解细胞沉淀，随后置于冰水浴中进行超声破碎（输出功率：300 w， 超声3 s，间隔6 s，90个循环）。超声处理完毕后，将细胞破碎液进行离心（13,000×g，10 min，4℃），获取上清液，即粗酶液。粗酶液经0.45 μm的滤膜过滤后，采用镍离子亲和层析法（Ni-NTA Agarose）对目的蛋白进行分离纯化。
4、蛋白含量及纯度的测定
参照改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书建立蛋白含量标准曲线，测定纯酶的浓度。采用SDS-PAGE方法鉴定纯化后蛋白的纯度和分子量，浓缩胶与分离胶分别为5%和12%。
5、GABA含量测定
采用柱前衍生化RP-HPLC法测定样品中GABA含量。衍生化条件如下：将100 µL经0.5 M NaHCO3稀释后的待测样品，200 µL 0.5 mol/L NaHCO3溶液，100 µL 4 g/L DNS-Cl丙酮溶液，置于40℃下避光衍生1 h后用0.22 µm微孔滤膜过滤。HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm），紫外检测波长设置为254 nm，进样量为10 µL，流速为1 mL/min，流动相A为含0.01%三氯乙酸的甲醇溶液，流动相B为四氢呋喃：甲醇：0.05M醋酸钠（pH 6.2）（5:75:420, v/v）。梯度洗脱程序见下表1。
表1 高效液相色谱梯度洗脱程序
Figure 793453DEST_PATH_IMAGE001
6、GAD酶学特性分析
配置不同pH的底物溶液（0.2 M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 3.6-5.6；0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 6.0-8.0；内含0.01 mM PLP与100 mM L-Glu）；取480 μL底物溶液，向其加入20 μL纯酶于不同温度及pH条件下反应10 min；利用0.2 M NaHCO3溶液（pH 9.8）终止反应并采用HPLC法测定反应生成的GABA含量。动力学参数于含有不同底物浓度的反应体系中测定，反应温度与pH分别为40℃和pH 5.0。酶活（U）为每分钟生成1 μmol GABA所需的酶量。
如图4所示，与野生型GAD一样，突变体AncGAD具备催化底物L-Glu合成GABA的能力。
如图5中的A所示，野生型GAD的最适反应温度为48℃，突变体AncGAD的最适反应温度为65℃，较野生型提升了17℃。如图5中的B所示，野生型GAD与突变体AncGAD的最适反应pH在pH 4.8-5.0之间，两者相近。酶促反应动力学参数如下表1所示，突变体AncGAD与野生型GAD的k cat/K m分别为0.88 s-1 mM-1和0.79 s-1 mM-1，表明该突变体催化效率为野生型的1.11倍。
表1 野生型GAD及突变体AncGAD动力学参数
Figure 710594DEST_PATH_IMAGE002
7、动力学稳定性的测定
7.1 半失活温度（T 50 15）的测定：T 50 15是指纯酶在不同温度条件下孵育15 min后，酶残余活力降低到50%时所对应的温度。将纯化后的野生酶GAD及突变体AncGAD分别在0-75℃条件下孵育15 min，孵育结束后迅速放置冰上冷却5 min，而后，测定GAD及突变体AncGAD的残余活力。以温度为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，运用Origin2021软件中的Boltzmann s型函数拟合曲线，计算野生酶GAD及突变体AncGAD的T 50 15。
如图6A所示，突变体AncGAD的T 50 15为60.1℃，比野生型（56.5℃）提高了3.6℃。
7.2半衰期（t 1/2）的测定：将纯酶分别在55℃下孵育不同时间后，迅速放到冰上冷却5 min，而后采用如上所述方法测定残余酶活。以未经孵育处理的酶活为100%，利用Origin 2021软件的ExpGro1型函数拟合曲线，计算当酶活力降至50%时所对应的时间，即为t 1/2。
如图6B所示，突变体AncGAD在55℃条件下的半衰期t 1/2为321.4 min，是野生型GAD（23.7 min）的13.6倍，突变体的热稳定性显著提升。
8、分子动力学模拟
分子动力学模拟（MD）是分析蛋白质稳定性及催化机制的有效方法。骨架原子的均方根偏差（RMSD）表示整个蛋白质的稳定性，与酶的热稳定性呈负相关。
以短促生乳杆菌CGMCC 1306的GAD晶体结构（PDB ID：5GP4）为模板，利用AlphaFold2系统构建突变体AncGAD的三维结构。而后，利用Discovery studio 2020软件对蛋白晶体结构进行能量最小化处理，并使用Yasara软件中的Amber 14力场于328 K、pH 5.0条件下对野生型及突变体酶进行长达25 ns的分子动力学模拟。过程为：将PDB格式的野生型和突变体三维结构载入YASARA软件，结构经加氢处理后置于水密度为0.998 mg/L以及边长为10 Å的立方体中，钠离子和氯离子作为反离子使体系呈电中性。范德华力相互作用的截断距离为7.86 Å。模拟的时间步长为2.5 fs，模拟的三维结构构象每25 ps保存一次。
由图7可知， AncGAD约在10 ns时达到平衡，而野生型GAD在20 ns后达到平衡；且10 ns后，AncGAD的平均RMSD值明显低于野生型GAD，表明该突变体具有更高的稳定性。
9. 基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD游离细胞催化L-谷氨酸合成GABA的性能分析
如图8中的A所示，以IPTG诱导后的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD细胞作为催化剂，反应体系为2 L，溶剂为纯水，底物L-谷氨酸初始添加量为883 g，游离细胞浓度OD600调整为20，反应过程中不控制反应体系pH。结果表明，随着反应的进行，反应体系的pH逐渐上升，伴随着GABA快速合成；反应0.25-2 h时的GABA时空产率相对较高，最高值为161.91 g/L/h；反应4 h后，pH值上升至6.9，GABA产量高达301.46 g/L，转化率则超过99%；与之相比，E. coli BL21(DE3)/pET28a-GAD细胞作为催化剂时催化效率则相对较低，如图8中的B所示，反应4 h后，pH值上升至6.0，GABA产量为243.74 g/L，转化率为80.1%。因此，基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-AncGAD呈现出良好的工业应用前景。
：野生谷氨酸脱羧酶基因
atggctatgttatatggtaaacacacgcatgaaacagatgagacgctcaaaccaatcttcggggccagcgctgaacgccacgacctccccaaatataaattggcaaagcacgcgctcgagccccgtgaagccgatcgattggttcgcgatcaactattggatgaaggaaactcgcggctgaatctcgccacgttctgtcagacttacatggaaccggaagcggttgaactcatgaaagatacactggagaaaaacgccatcgataaatccgagtatcctcggaccgctgaaattgaaaatcgttgcgttaatatcattgccaacctctggcatgctccagaagctgagtcgttcactggcacctcgacgattggttcctccgaggcctgcatgctggccggtttggcgatgaagtttgcttggcgtaagcgcgccaaagcgaacggtcttgacttaactgcccatcaacctaatattgtcatctcagccggttatcaagtttgttgggaaaaattctgtgtctattgggacatcgacatgcatgtcgttcccatggacgatgaccacatgtccttgaatgtcgatcacgtgttagattacgtggatgactacaccattggtatcgttggcattatgggcatcacttatactggacaatacgacgatttagcccgattagatgccgttgtagagcggtacaatcggacgactaagttcccggtatatatccatgtcgatgccgcttccggcggattttacacgccgtttattgaacccgagctcaagtgggacttccgtttaaacaacgtgatttccatcaatgcctccggccacaaatatggcttggtttatcccggagtcggctgggtaatctggcgtgaccaacagtatctaccaaaagagctggtctttaaggtcagctacttgggtggtgaactacctacgatggccatcaacttctcccacagtgcctcccaattaatcggtcagtattacaactttattcgctttggttttgatggctatcgtgaaattcaagaaaaaactcacgacgttgcccgctatctcgcgaaatcgctcactaaattagggggcttttccctcattaatgacggccacgagttaccgctgatctgttatgaactcactgccgattctgatcgcgaatggaccctctacgatttatccgatcggttattaatgaagggctggcaggttcccacctatcccttaccaaaaaacatgacggaccgcgttattcaacggatcgtggttcgggctgactttggtatgagtatggcccacgactttattgatgatctaacccaagccattcacgatctcgaccaagcacacatcgttttccatagtgatccgcaacctaaaaaatacggattcactcactaa。
：谷氨酸脱羧酶突变体基因
Atgctgtactctaaaaaaaacaaagaaaacgaagaatcttacctggaaccgatcttcggttcttctgaagaagaccaggacatcccgaaatacaaactgaacaaagaaccgatcgaaccgcgtatcgcttaccgtctggttaaagacgaactgctggacgaaggtaacgctcgtcagaacctggctaccttctgccagacctacatggaaccggaagctaccaaactgatgtctgaaaccctggaaaaaaacgctatcgacaaatctgaatacccgcgtaccgctgaaatcgaaaaccgttgcgttaacatcatcgctgacctgtggcacgctccgaaagacgaaaaattcatgggtacctctaccgttggttcttctgaagcttgcatgctgggtggtatggctatgaaattcgcttggcgtaaccgtgctgaaaaactgggtctggacatcaacgctcagaaaccgaacctggttatctctagtggctaccaggtatgctgggagaaattctgcgtttactgggacatcgaaatgcgtaccgttccgatggacaaagaacacatgtctctggacgttgacaaagttatggactacgttgacgaatacaccatcggtatcgttggtatcctgggtatcacctacaccggtaaattcgacgacatcaaagctctggacgaaaaagttgaagaatacaaccagaccaccgaatacaaagtttacatccacgttgacgctgcttctggtggtctgttcaccccgttcgttgacccggaactggaatgggacttccgtctgaaaaacgttatctctatcaacacctctggtcacaaatacggtctggtttacccgggtatcggttggatcctgtggcgtgacgaatcttacctgccgaaagaactgatcttcgaagtttcttacctgggtggtgaaatgccgaccatggctatcaacttctctcgttctgcttctcagatcatcggtcagtactacaacttcctgcgtttcggtttcgaaggttaccgtgaaatccaccagcgtaccaaagacgttgctatgtacctggctaaagaaatcgaaaaaaccggtctgttcgaaatctacaacgacggttctaacctgccgatcgtttgctacaaactgaaagacgacgctaacgttaaatggaccctgtacgacctggctgaccgtctgcagatgaaaggttggcaggttccggcttacccgctgccgaaaaacctggaaaacatcatcatccagcgtttcgtttgccgtgctgacttcggtatgaacatggctgaagaattcatcgaagacttcaaaaccgctatcaaagaactgaacaacgctcacatcctgttccacgacaaacagaacaaaaaagtttacggtttcacccactaa。
：野生谷氨酸脱羧酶
MAMLYGKHTHETDETLKPIFGASAERHDLPKYKLAKHALEPREADRLVRDQLLDEGNSRLNLATFCQTYMEPEAVELMKDTLEKNAIDKSEYPRTAEIENRCVNIIANLWHAPEAESFTGTSTIGSSEACMLAGLAMKFAWRKRAKANGLDLTAHQPNIVISAGYQVCWEKFCVYWDIDMHVVPMDDDHMSLNVDHVLDYVDDYTIGIVGIMGITYTGQYDDLARLDAVVERYNRTTKFPVYIHVDAASGGFYTPFIEPELKWDFRLNNVISINASGHKYGLVYPGVGWVIWRDQQYLPKELVFKVSYLGGELPTMAINFSHSASQLIGQYYNFIRFGFDGYREIQEKTHDVARYLAKSLTKLGGFSLINDGHELPLICYELTADSDREWTLYDLSDRLLMKGWQVPTYPLPKNMTDRVIQRIVVRADFGMSMAHDFIDDLTQAIHDLDQAHIVFHSDPQPKKYGFTH。
：谷氨酸脱羧酶突变体
MLYSKKNKENEESYLEPIFGSSEEDQDIPKYKLNKEPIEPRIAYRLVKDELLDEGNARQNLATFCQTYMEPEATKLMSETLEKNAIDKSEYPRTAEIENRCVNIIADLWHAPKDEKFMGTSTVGSSEACMLGGMAMKFAWRNRAEKLGLDINAQKPNLVISSGYQVCWEKFCVYWDIEMRTVPMDKEHMSLDVDKVMDYVDEYTIGIVGILGITYTGKFDDIKALDEKVEEYNQTTEYKVYIHVDAASGGLFTPFVDPELEWDFRLKNVISINTSGHKYGLVYPGIGWILWRDESYLPKELIFEVSYLGGEMPTMAINFSRSASQIIGQYYNFLRFGFEGYREIHQRTKDVAMYLAKEIEKTGLFEIYNDGSNLPIVCYKLKDDANVKWTLYDLADRLQMKGWQVPAYPLPKNLENIIIQRFVCRADFGMNMAEEFIEDFKTAIKELNNAHILFHDKQNKKVYGFTH。

Claims (6)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.4；其野生蛋白为来源于生物保藏号为CGMCC No.1306短促生乳杆菌表达的酶，所述野生蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种编码权利要求1所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，野生型谷氨酸脱羧酶的编码基因如SEQ ID No.1所示。
3.一种表达单元，其特征在于，所述表达单元包含权利要求2所述的SEQ ID No.2。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求3所述表达单元。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含权利要求4所述重组质粒。
6.一种谷氨酸脱羧酶突变体的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
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