CN116064493B - 一种腺苷酸环化酶突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用 - Google Patents

一种腺苷酸环化酶突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种腺苷酸环化酶tcAC突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用，属于生物催化领域。本发明所述的腺苷酸环化酶tcAC突变体是在野生型腺苷酸环化酶tcAC的基础上进行第93位、115位、296位、298位氨基酸突变获得。采用本发明所述的腺苷酸环化酶tcAC突变体生产环磷酸腺苷，能够明显提高其催化活性，提高环磷酸腺苷的产量，为环磷酸腺苷的工业化生产提供了新的思路与方法。

Description

一种腺苷酸环化酶突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种腺苷酸环化酶tcAC突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用。
背景技术
环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是人体内广泛存在的一种具有重要生理活性的物质，其作为细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成等发挥着重要的调节作用。临床上cAMP用于治疗慢性充血性心力衰竭、肺心病、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。cAMP也可作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。cAMP亦可用于畜禽饲料添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。
cAMP的生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三种，目前国内外产业化生产全部采用以AMP为原料的化学合成法。化学合成法所涉及的试剂昂贵，且采用大量的吡啶作为溶剂，对人体的皮肤及呼吸道有刺激性，对人体危害很大，且易造成环境污染，而且合成对工艺要求很高。化学合成法生产原料和试剂价格较高、生产成本也偏高。利用液化短杆菌、小杆菌、棒状杆菌、节杆菌等以发酵法制备cAMP也存在限制，例如产率较低，且关键酶腺苷酸环化酶的高效表达机制不清，离子环境与细胞活性的关系以及调节机制有待进一步研究。例如，专利CN201710343368.1公开了一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，将活化后的活性炭柱酸洗至pH值2.0-3.0，并将微生物发酵滤清液调节pH值1.5-2.2，上柱吸附后用碱性溶液洗脱解吸，洗脱液浓缩、调pH值，结晶、干燥即得环磷酸腺苷。
酶法即以腺苷酸环化酶为酶源或以含有腺苷酸环化酶的重组菌为催化剂催化生产cAMP，腺苷酸环化酶(E.C.4.6.1.1)在Mg2+参与下，可催化ATP生成cAMP和PPi，是cAMP生物合成的关键酶。例如，专利CN202011015223.7公开了一种腺苷酸环化酶制备环磷酸腺苷的方法，该方法包括：以腺苷酸环化酶为催化剂，以三磷酸腺苷为底物，在Mg2+的存在下，获得含有环磷酸腺苷的反应液，以实现cAMP的工业化生产。
因此，进一步研究采用酶法以提高环磷酸腺苷的产量，对于环磷酸腺苷的工业化生产具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种腺苷酸环化酶tcAC突变体及其在制备环磷酸腺苷中的应用。采用本发明所述的腺苷酸环化酶tcAC突变体生产环磷酸腺苷，能够明显提高其催化活性，提高环磷酸腺苷的产量，为环磷酸腺苷的工业化生产提供了新的思路与方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种腺苷酸环化酶的突变体，所述的腺苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的突变包括：SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸(G93C)或苏氨酸(G93T)、SEQ ID NO.2所示氨基酸的第115位亮氨酸突变为半胱氨酸(L115C)或苏氨酸(L115T)、SEQ ID NO.2所示氨基酸的第296位异亮氨酸突变为亮氨酸(I296L)或甲硫氨酸(I296M)、和/或第298位精氨酸突变为天冬氨酸(R298D)中的一个位点突变或多个位点突变的组合。
具体地，所述的突变为：
(1)SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸或苏氨酸(G93C或G93T)；或，
(2)SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸或苏氨酸(G93C-L115C或G93C-L115T)；或，
(3)SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第296位异亮氨酸突变为亮氨酸或甲硫氨酸(G93CS-I296L或G93C-I296M)；或，
(4)SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，且第296位异亮氨酸突变为亮氨酸或甲硫氨酸(G93C-L115C-I296L或G93C-L115C-I296M)；或，
(5)SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，且第296位异亮氨酸突变为亮氨酸，第298位精氨酸突变为天冬氨酸(G93C-L115C-I296L-R298D)。
进一步具体地，所述的突变为：SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，且第296位异亮氨酸突变为亮氨酸，第298位精氨酸突变为天冬氨酸(G93C-L115C-I296L-R298D)。
具体地，所述的腺苷酸环化酶为母本腺苷酸环化酶tcAC。
进一步具体地，所述的腺苷酸环化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本发明提供了一种编码上述突变体的核酸分子。
具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
又一方面，本发明提供了一种载体，所述的载体包含上述核酸分子。
具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
进一步具体地，所述的载体为pET-28A。
又一方面，本发明提供了一种包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
进一步具体地，所述的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得腺苷酸环化酶突变体粗酶液，催化特性均优于母本腺苷酸环化酶。
又一方面，本发明提供了上述核酸分子、载体或宿主细胞在制备腺苷酸环化酶突变体中的应用。
具体地，所述的应用为：构建含所述腺苷酸环化酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腺苷酸环化酶突变体的菌体细胞，与野生型氨腺苷酸环化酶相比，具有更高的催化活性。
又一方面，本发明提供了一种腺苷酸环化酶突变体的制备方法，所述的方法包括以下步骤：构建含所述腺苷酸环化酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腺苷酸环化酶突变体的菌体细胞，与野生型氨腺苷酸环化酶相比，具有更高的催化活性。
又一方面，本发明提供了上述腺苷酸环化酶突变体、核酸分子、载体或宿主细胞在生产环磷酸腺苷中的应用。
具体地，所述的应用为：利用上述腺苷酸环化酶突变体或上述核酸分子、载体或宿主细胞生产的腺苷酸环化酶突变体，催化底物三磷酸腺苷生产环磷酸腺苷。
又一方面，本发明提供了一种生产环磷酸腺苷的方法，所述的方法包括以下步骤：利用上述腺苷酸环化酶突变体或上述核酸分子、载体或宿主细胞生产的腺苷酸环化酶突变体，催化底物三磷酸腺苷生产环磷酸腺苷。
具体地，所述的方法包括以下步骤：利用上述腺苷酸环化酶突变体或上述核酸分子、载体或宿主细胞生产的腺苷酸环化酶突变体作为催化剂，在Mg2+的存在下，35℃条件下催化底物ATP生成环磷酸腺苷cAMP。
进一步具体地，上述反应体系中，底物三磷酸腺苷的终浓度为10-200g/L、甘氨酸为1-100g/L、六水合氯化镁1-200g/L、氢氧化钠1-20g/L、所述的腺苷酸环化酶突变体的浓度为1-10U/mg。
在某些实施例中，本发明所述的腺苷酸环化酶突变体的制备方法包括以下步骤：将含腺苷酸环化酶突变体基因的重组共表达基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，加入终浓度为5g/L的葡萄糖和20g/L乳糖，37℃、220rpm培养OD600达到0.8-1.2(优选0.9)，变温至28℃，以220rpm培养14h后，4℃、8000rpm/分钟离心10分钟，获得含腺苷酸环化酶突变体的湿菌体。随后，湿菌体用纯水进行重悬，在冰水混合物上超声破碎15分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎3秒、暂停5秒。破碎后获得的粗酶液经离心后，取上清过镍柱进行纯化，收集纯化液作为催化剂。
在某些实施例中，本发明所述的野生型氨腺苷酸环化酶(或母本腺苷酸环化酶)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为1065bp，从第一个碱基起至第1065个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
在某些实施例中，本发明所述的腺苷酸环化酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对所述SEQ ID NO.1腺苷酸环化酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导菌体回收，利用粗酶液催化腺苷三磷酸二钠制备环磷酸腺苷，具体方法如下：第一步将原始菌活化，获得了母本E.coli BL21(DE3)pET28A-tcac，提取质粒模板pET28A-tcac，并保存待用。第二步通过NCBI与tcAC进行搜索，获得同源建模的模板蛋白PDB编号，在PDB数据库中查找模板蛋白晶体结构，利用Modeller9.20同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是催化位点附近和底物结合口袋附近的氨基酸残基，设计突变的引物，以pET28A-tcac为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体测序检测并保存。
本领域技术人员需知的是，本发明所述的腺苷酸环化酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，磷酸氢二钾9.4g/L，磷酸二氢钾2.2g/L，4mL甘油，蒸馏水溶解，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
在前述研究中，通过利用生物信息学和基因工程的手段，已经从高温单胞杆菌Thermomonospora catenispora挖掘到了腺苷酸环化酶基因，并在大肠杆菌中实现了异源过量表达。然而，野生型的腺苷酸环化酶往往活力较低、稳定性较差，从而限制了其工业化应用。因此，本发明通过已报道的腺苷酸环化酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的氨基酸位点，通过定点突变技术提高了腺苷酸环化酶对腺苷酸(ATP)的催化活力，提高了将具有较强的工业应用价值。
本发明所述的腺苷酸环化酶tcAC突变体生产环磷酸腺苷，其比酶活更高，可明显提高其催化活性，从而提高环磷酸腺苷的产量，为环磷酸腺苷的工业化生产提供了新的思路与方法。本发明所述的腺苷酸环化酶tcAC突变体与野生型氨腺苷酸环化酶相比更具有工业应用前景。
附图说明
图1为腺苷酸环化酶突变体tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D催化腺苷三磷酸二钠合成环磷酸腺苷的反应示意图。
图2为腺苷酸环化酶的定点饱和突变的核酸电泳图，其中，M：1Kb DNA marker；泳道1：tcAC-G93饱和突变产物；泳道2：tcAC-L115饱和突变产物；泳道3：tcAC-I296饱和突变产物；泳道4：tcAC-R298饱和突变产物；泳道6：tcAC-G93C/L115C定点突变产物；泳道7：tcAC-G93C/I296L定点突变产物；泳道8：tcAC-G93C/R298D定点突变产物；泳道9：tcAC-G93C/L115C/R298D定点突变产物；泳道10：tcAC-G93C/L115C/I296L定点突变产物；泳道10：tcAC-G93C/L115C/I296L/R298D定点突变产物。
图3为腺苷酸环化酶突变体纯酶液的SDS-PAGE图，其中，M：标准蛋白分子量；泳道1：tcAC破碎后的上清液；泳道2：tcAC纯化过程中的穿刺液；泳道3：tcAC纯化后的蛋白。泳道4：tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D破碎后的上清液；泳道2：tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D纯化过程中的穿刺液；泳道3：tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D纯化后的蛋白。
图4为腺苷酸环化酶突变体催化腺苷三磷酸二钠制备环磷酸腺苷的时间进程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、全质粒PCR、PCR产物纯化、筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应产品的说明书进行操作。
实施例1：腺苷酸环化酶突变体文库构建及筛选
将腺苷酸环化酶基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列SEQ ID NO.2所示)构建表达载体pET28A-tcAC，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28A-tcAC。
腺苷酸环化酶突变体文库的制备通过4轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1。第一轮，以载体pET28A-tcAC为模板，以表1中G93-F和G93-R为引物，经饱和突变PCR，将SEQID NO.2所示腺苷酸环化酶氨基酸序列的第93位甘氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得腺苷酸环化酶突变体tcAC-G93C。第二轮以突变体tcAC-G93C为模板，以表1中L115-F和L115-R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得腺苷酸环化酶突变体tcAC-G93C-L115C。第三轮以突变体tcAC-G93C-L115C为模板，以表1中I296-F和I296-R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得腺苷酸环化酶突变体tcAC-G93C-L115C-I296L。第四轮以突变体tcAC-G93C-L115C-I296L为模板，以表1中R298-F和R298-R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得腺苷酸环化酶突变体tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D，后期实验中其余优势单突变体tcAC-L115C，tcAC-I296L，tcAC-R298D均由相似方法构建。
突变PCR体系(50μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH2O至50μL。PCR条件为：95℃预变性5min，经30个循环：90℃30s，69℃30s，72℃6min，最后72℃终延伸10min。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳进行阳性验证，随后利用DpnI酶对PCR产物消化模板，37℃，15min，65℃，1min灭活，将PCR产物热击转化，并将转化后的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、220转/分钟，培养1h，涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。
表1.腺苷酸环化酶定点饱和突变引物设计
实施例2：腺苷酸环化酶母本、突变体的诱导表达
将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28A-tcAC及其突变菌株分别接种到含有含终浓度50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，加入终浓度为5g/L的葡萄糖和20g/L乳糖，37℃、220rpm培养OD600达到0.8-1.2(优选0.9)，变温至28℃，以220rpm培养14h后，4℃、8000rpm/分钟离心10分钟，获得含腺苷酸环化酶及其突变体的湿菌体。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，以纯酶液催化腺苷三磷酸二钠制备环磷酸腺苷。
实施例3：突变文库筛选
将实施例2诱导表达的突变株湿菌体离心、按照菌体总量40g/L的量加入纯水中重悬，在冰水混合物上破碎20min。超声破碎条件为：200W，破碎5s，暂停7s，破碎后得到突变体粗酶液。
将突变株粗酶液或出发柱粗酶液为催化剂，以三磷酸腺苷为底物，以六水合氯化镁为辅底物进行催化实验。反应体系选择为10mL，催化剂用量以破碎前湿菌体总浓度计10g/L，底物终浓度40g/L，六水合氯化镁终浓度30g/L，Gly-NaOH缓冲液终浓度为0.4M(pH＝9.0)，55℃、静止反应15min取样，取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，再取稀释后的样品100μL，以超纯水补足至1mL(稀释100倍)，过0.22μM滤膜，作为HPLC检测样品。以产物相对含量为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2。从结果可以看到，单点突变G93C、G93T的催化性能都有不同程度的提升，产物cAMP的相对含量分别为20.852％、19.247％，相比于对照菌含量提升了49％、37％。在此基础上进行双点组合突变G93C-L115C/L115T，其催化性能提升较高，产物cAMP的相对含量分别为25.022％、23.198％，相比于对照菌浓度提升了79％、65％。其他的双点组合都呈负突变，同时，G93C-I296L/I296M双点组合突变也具有较强的催化潜力，产物cAMP的相对含量分别为24.274％、21.156％，相较对照菌含量提升了73％、51％。在双点组合突变的基础上，继续做三点组合突变和四点组合突变，最终得到了催化性能最优的tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D，产物cAMP的相对含量为31.426％，比对照菌提高了124％。
ATP及cAMP液相检测条件：色谱柱C18(4.6×250mm，Acchrom，China)柱，流动相乙腈:0.1M PBS(pH7.0)体积比为7:93，流速1.0mL/min，检测波长259nm，进样量20μL，柱温25℃。
表2.tcAC及其突变体的催化性能
菌株 ATP浓度(mM) 粗酶液浓度(g/L) cAMP(％)
tcAC 66.77 10 14.011
tcAC-G93C 66.77 10 20.852
tcAC-G93T 66.77 10 19.247
tcAC-G93R 66.77 10 0.149
tcAC-G93L 66.77 10 7.148
tcAC-G93C-L115C 66.77 10 25.022
tcAC-G93C-L115T 66.77 10 23.198
tcAC-G93C-L115M 66.77 10 6.706
tcAC-G93C-L115D 66.77 10 1.136
tcAC-G93C-I296L 66.77 10 24.274
tcAC-G93C-I296M 66.77 10 21.156
tcAC-G93C-L115C-I296L 66.77 10 26.058
tcAC-G93C-L115C-I296M 66.77 10 25.411
tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D 66.77 10 31.426
实施例4：腺苷酸环化酶母本及其突变体的纯化
首先，将实施例3获得的优势突变体(见表2)tcAC的重组静息细胞用缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎15分钟(冰浴，功率400W，破碎3秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化后的腺苷酸环化酶；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。
母本腺苷酸环化酶tcAC纯酶采用相同的条件进行纯化及收集。收集完的tcAC及其突变体酶进行SDS-PAGE验证其纯化。如图3所示，纯化后的母本腺苷酸环化酶tcAC及其突变体酶tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D的泳道中无杂条带出现，说明其纯度较高。
实施例5：母本腺苷酸环化酶及其突变体酶比酶活测定
酶活单位(U)定义为：在55℃、pH9.0条件下，每分钟每生成1μmol的cAMP所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。
酶活检测标准条件：66.77mM ATP，150mM MgCl2·6H2O，适量酶液，55℃、pH9.0(0.4M Gly-NaOH缓冲液)条件下反应10分钟，样品处理并进行HPLC检测分析。
蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(上海生工生物科技发展有限公司，上海)测定。
母本腺苷酸环化酶及其突变体酶比酶活如表3所示，由表3可知，本发明所述的腺苷酸环化酶突变体比酶活明显升高。
表3.比酶活
酶 Relative activity(％)
tcAC 100
tcAC-G93C 121.1±4.2
tcAC-L115C 148.1±2.1
tcAC-I296L 177.3±8.0
tcAC-R298D 158.0±7.3
tcAC-G93C-L115C 171.0±10.0
tcAC-G93C-I296L 201.6±1.1
tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D 233.0±3.2
实施例6：利用腺苷酸环化酶突变体制备环磷酸腺苷
根据实施例4的描述，取纯化后的纯酶液，反应体系为100mL，设置两个平行样，加入终浓度90g/L的ATP-Na2，终浓度67.5g/L的MgCl2·6H2O，终浓度30g/L的甘氨酸以及终浓度10g/L NaOH构成反应体系，突变体酶tcAC-G93C-L115C-I296L-R298D加量为0.5U/mL，在35℃下进行反应，反应过程中间歇性加入NaOH调节pH。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物cAMP的生成，反应进程曲线如图4所示。反应8h，环磷腺苷的转化率分别为91.98％和92.51％。表明本发明所述的腺苷酸环化酶突变体最大底物三磷酸腺苷投料可达到90g/L，该腺苷酸环化酶突变体相比于野生型腺苷酸环化酶更具工业应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (15)

1.一种腺苷酸环化酶的突变体，其特征在于：所述的腺苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，所述的突变为：SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述的突变体的突变为以下（1）-（4）中的任意一项：
（1）SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，且第115位亮氨酸突变为半胱氨酸或苏氨酸；或，
（2）SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，且第296位异亮氨酸突变为亮氨酸或甲硫氨酸；或，
（3）SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，且第296位异亮氨酸突变为亮氨酸或甲硫氨酸；或，
（4）SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，第296位异亮氨酸突变为亮氨酸，且第298位精氨酸突变为天冬氨酸。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：所述的突变为：SEQ ID NO.2所示氨基酸的第93位甘氨酸突变为半胱氨酸，第115位亮氨酸突变为半胱氨酸，第296位异亮氨酸突变为亮氨酸，且第298位精氨酸突变为天冬氨酸。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述的腺苷酸环化酶为母本腺苷酸环化酶tcAC。
5.一种编码权利要求1-4任一项所述的突变体的核酸分子。
6.一种载体，其特征在于：所述的载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述的载体包括质粒和病毒。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于：所述的载体为pET-28a。
9.一种包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6-8任一项所述的载体的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞包括微生物、植物或动物细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌。
12.权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的载体或权利要求9-11任一项所述的宿主细胞在制备腺苷酸环化酶突变体中的应用。
13.权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的载体或权利要求9-11任一项所述的宿主细胞在生产环磷酸腺苷中的应用。
14.一种生产环磷酸腺苷的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：利用权利要求1-4任一项所述的腺苷酸环化酶突变体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的载体或权利要求9-11任一项所述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶突变体，催化底物三磷酸腺苷生产环磷酸腺苷。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：利用权利要求1-4任一项所述的腺苷酸环化酶突变体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的载体或权利要求9-11任一项所述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶突变体作为催化剂，在Mg2+的存在下，35℃条件下催化底物ATP生成环磷酸腺苷cAMP。
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