CN111235126B - 一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法 - Google Patents

一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法 Download PDF

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    • C12Y205/01006—Methionine adenosyltransferase (2.5.1.6), i.e. adenosylmethionine synthetase

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法。所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型S‑腺苷甲硫氨酸合成酶中突变多个氨基酸位点，突变的多个氨基酸位点包括C9R与K224R。利用本发明的S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法，能够使突变体较野生型S‑腺苷甲硫氨酸合成酶具有更高的比活力，并能在催化制备S‑腺苷甲硫氨酸时具有更高的产物收率与更低的酶活下降。

Description

一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，简称SAM)作为生物体代谢过程的重要中间产物，存在于所有活细胞中，具有转甲基、转硫、转氨丙基作用。SAM是双手性物质，有2种异构体：(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM才具有生物活性。临床上SAM具有极高的药用价值，主要用于治疗肝内胆汁淤积，还可用于治疗病毒性肝炎、酒精性肝病，改善肝脏功能，缓解抑郁症患者的抑郁症状(具有抗抑郁作用)等。SAM还可与L-多巴联用于治疗帕金森氏病，能提高L-多巴疗效和降低副作用。SAM的市售产品如思美泰。
在生物体内，SAM是由S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosylmethioninesynthetase，EC 2.5.1.6)催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸(Met)反应合成，原理见图1。体外S-腺苷甲硫氨酸的生产主要有三种方法：化学合成法、微生物发酵法、酶法催化法。
化学法合成法主要是采用S-同型半胱氨酸和甲基供体合成，存在杂质多、收率低、产物构型复杂等缺陷而未能大规模应用。
微生物发酵法是目前应用最为广泛、成本相对低的一种方法，其主要是利用酵母细胞体内的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，通过在培养液中添加前体物质L-甲硫氨酸在酵母细胞体内进行SAM累积合成。该方法的弊端是：SAM积累主要在酵母细胞内，分离纯化过程需要进行细胞壁破碎，工序复杂，同时依然存在着产量低、收率低等问题。
酶法催化法主要是在S-腺苷甲硫氨酸合成酶的催化作用下，利用ATP和L-甲硫氨酸合成SAM。该法主要受限于高催化活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的获得，使得其成本远远高于微生物发酵法，导致目前还没有该法工业应用的报道。
上述三种方法中，酶法催化法合成SAM最具有潜在优势，因为其具有催化效率高、分离提取简单、产品纯度高、质量好等优点。但如前所述，这一方法中对酶的选择和优化是最为关键和决定性的因素，为此，很多研究人员对SAM合成酶进行了序列改造研究。如中国专利申请CN201910436026.3对大肠杆菌来源的SAM合成酶进行了序列改造，筛选获得了大肠杆菌来源的SAM合成酶的突变体，使得比活由野生型的1.82U/mg增加至4.15U/mg。又如美国专利申请US 20160264945A1将枯草芽孢杆菌来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)的317位异亮氨酸突变为缬氨酸，这能增加催化活性，同时降低产物抑制。
然而，在工业生产应用中发现，截止到目前，无论是野生型的SAM合成酶还是已报道的突变改造后的酶，均普遍存在酶比活低、产物抑制大、稳定性差、生成产物浓度低、生产成本偏高等缺陷，造成无法规模化应用，因此急需开发一种催化活性更高、底物耐受性更强、产物抑制更小的SAM合成酶突变体，以规模化应用于SAM的工业生产。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，以能够使突变体较野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有更高的比活力，并能在催化制备S-腺苷甲硫氨酸时具有更高的产物收率与更低的酶活下降。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶中突变多个氨基酸位点，突变的多个氨基酸位点包括C9R与K224R。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中突变的多个氨基酸位点还包括T163S、Q191R、A218T中的一个或多个。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-8之一所示。
本发明的第二个目的是提供编码前述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体较野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有更高的比活力，并能在催化制备S-腺苷甲硫氨酸时具有更高的产物收率与更低的酶活下降。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供编码前述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的多核苷酸。
本发明的第三个目的是提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，以能够更好的制备S-腺苷甲硫氨酸。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述的方法是在反应体系中，用前述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体催化ATP与L-甲硫氨酸之间的反应，制备S-腺苷甲硫氨酸。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其中所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是固定化的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其中所述的反应体系中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、ATP与L-甲硫氨酸的浓度分别为100-500U/L、200-500mM、250-500mM。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其中所述的反应的反应温度为25-30℃，反应pH为7.0-8.0，反应搅拌转速为150-200r/min，反应时间为30-180min。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其中所述的反应体系中还加入添加剂，选自镁盐、钾盐、巯基乙醇、磺酸盐中的一种或几种。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其中：
所述的镁盐中Mg2+的浓度为100-250mM，所述的钾盐中K+的浓度为50-100mM，所述的巯基乙醇的浓度为50-200mM，
所述的磺酸盐选自对甲苯磺酸盐、1,4-丁二磺酸盐、4-羟基乙基哌嗪乙磺酸盐、3-吗啉丙磺酸盐中的一种或几种，总浓度为300-500mM。
本发明的有益效果在于，利用本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法，能够使突变体较野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有更高的比活力，并能在催化制备S-腺苷甲硫氨酸时具有更高的产物收率与更低的酶活下降。
本发明选择大鼠肝脏来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶MATI作为出发点，其相比其它来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶有以下优势：产物抑制小、催化效率高、最终产物浓度高。在此基础上，本发明通过基因工程及酶工程技术手段，对MATI进行突变，所获得的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体较MATI具有酶比活力、催化速率和转化收率更高，产物抑制更小，酶更稳定等优点，因此更适用于S-腺苷甲硫氨酸的合成。
附图说明
图1为S-腺苷甲硫氨酸的合成原理图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
其中MATI及其突变体的酶活力的测定方法如下。
反应底物组成：10mmol/L三磷酸腺苷(ATP)、20mmol/L六水氯化镁、100mmol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液、30mmol/L L-甲硫氨酸、30mmol/L1，4-丁二磺酸盐。
发酵菌体的酶活测定：取50mL发酵菌液，12000r/min离心弃上清后收集菌体，用50mL生理盐水重悬菌体，超声破碎(每次超声时间3s，间隔时间2s，超声次数99次，超声功率500W)，完成后取2mL破碎液，加入反应底物反应(生理盐水定容至20mL)，控制温度30℃，搅拌转速150r/min，反应10min，完成后取样1mL，用HPLC进行酶活测定。
固定化酶的酶活测定：准确称取固定化酶0.2-1g，加入反应底物中进行反应(生理盐水定容至20mL)，控制温度30℃，搅拌转速150r/min，反应10min，完成后取样1mL，用HPLC进行酶活测定。
HPLC具体测定条件如下：
色谱柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)
流动相：6.8g KH2PO4溶于1000ml水中，用H3PO4调pH至2.5，取出950ml加入50ml甲醇即得。
标准液：精确称取S-腺苷甲硫氨酸标准品20-25mg，用流动相溶解并定容到100ml容量瓶中，摇匀后过滤。
检测温度：30℃
检测流速：1.0ml/min
检测波长：210nm
进样量：20μl
Figure BDA0002435343650000051
Figure BDA0002435343650000052
酶活力单位：在温度30℃，pH8.0条件下，每分钟生成1μmol的SAM所需要的酶量为一个单位(1u)。
W标：S-腺苷甲硫氨酸标准品称量，mg；
p标：S-腺苷甲硫氨酸标准品含量，％；
A样：样品HPLC检测S-腺苷甲硫氨酸峰面积；
A标:标准品HPLC检测S-腺苷甲硫氨酸峰面积；
M：S-腺苷甲硫氨酸分子量；
T：反应时间，min；
V：酶溶液取样量，ml；
W：固定化酶称量，g。
实施例1：大鼠来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶MATI原核表达菌株的构建
下载GenBank中大鼠肝脏来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶MATI的氨基酸序列(本文SEQ ID NO.1，对应GenBank登陆号：NP_036992.2)，提供给北京擎科生物技术有限公司进行编码核酸的全基因合成(采用大肠杆菌优选密码子)。合成基因C-端带有His标签，构建至原核表达载体pET30a(+)中，原核表达载体酶切位点：5’端Nde I，3’端Xho I。将构建好的质粒pET30a(+)-MATI通过CaCl2热激转化法转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，平板上生长出的菌落即为S-腺苷甲硫氨酸合成酶原核表达重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-MATI。
用灭菌枪头在上述LB固体培养基平板中小心挑取S-腺苷甲硫氨酸合成酶原核表达重组菌株单菌落，接种至含有20mL的LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200r/min，振荡过夜培养。次日按照1％的接种量将摇瓶菌液接种至含有100mL TB液体培养基的三角瓶中，37℃，220r/min，振荡培养，并每隔1h测定培养液的OD值，待培养液OD值＝1.5时，补加终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃，220rpm继续培养4h-6h，停止培养。
实施例2：大鼠来源S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MATI)的纯化与固定化
利用MATI重组蛋白中所携带His标签，采用已活化的IDA树脂(购买于安诺伦(北京)生物科技有限公司，具体型号:His.Bind Resin，Ni-charged)对实施例1得到的上清进行蛋白纯化，具体方法如下：4℃，10000r/min，离心发酵液10min，弃上清，收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)反复洗涤两次，离心后将菌体浓缩5倍重悬于20ml磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，超声破碎条件为：工作2s，间隔5s，超声功率500W。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到粗蛋白。将粗蛋白上样到已活化的IDA树脂上，用咪唑溶液(2mM-20mM)进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，收集出现的稳定的蛋白峰，即为MATI重组蛋白纯化蛋白，用于固定化酶制备。
将纯化的MATI重组蛋白用于固定化酶的制备，具体方法为：
(1)固定化载体活化：准确量取60％(m/v)的戊二醛30ml，同磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)4.76g加入600ml去离子水中，溶解后用去离子水定容至1000ml，并用磷酸溶液调节其pH为8.0。将环氧基载体ECEP(意大利Resindion S.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水冲洗2-3次后真空滤干备用。
(2)MATI重组蛋白的固定化：取一定量上述纯化后的MATI重组蛋白，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)稀释，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下固定化48h，所得固定化酶用去离子水清洗3-5次，真空滤干后即得固定化酶终品。
实施例3：MATI原核表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-MATI易错突变文库的构建
以pET30a(+)-MATI重组质粒作为PCR模板，常规的T7F/R作为通用引物(引物序列：T7F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’T7R:GCTAGTTATTGCTCAGCGG)对MATI基因进行易错PCR扩增，调整PCR扩增反应体系中Mg2+、Mn2+、dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为千分之二，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。
易错PCR反应体系：
Figure BDA0002435343650000071
易错PCR反应条件：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，共25个循环；最后72℃延伸10min。
将上述易错PCR产物取样2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测无误后用PCR产物纯化试剂盒进行纯化处理。在37℃条件下，用Nde I和Xho I限制性内切酶分别对PCR纯化产物和原核表达载体pET30a(+)进行双酶切，酶切产物切胶回收(其中回收PCR纯化产物片段大小约为1200bp，回收载体pET30a(+)片段大小约为5400bp)后按照易错PCR产物：原核表达载体pET30a(+)为3：1的摩尔比进行混合，加入T4 DNA ligase于16℃过夜连接。第二天，通过电击转化的方法将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌，即可得到一个库容量大的随机突变体文库。
实施例4：MATI原核表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-MATI易错突变文库的筛选
由S-腺苷甲硫氨酸的合成原理图(图1)可知，在合成过程中会有磷酸根生成，因此，对易错突变文库的筛选建立在对磷酸根的检测基础上(磷酸根的检测参考国家标准GB11893-89水质总磷的测定，钼酸铵分光广度法，并加以改进优化)，其筛选原理为：在酸性介质中，反应体系中所生成的磷酸根与钼酸铵反应，在锑盐的存在下生成磷钼杂多酸后，被抗坏血酸还原，最终生成蓝色的络合物，因此所筛选的突变菌株如果酶活力越高，产物抑制越小，反应体系中所生成的磷酸根就越多，筛选磷酸根生成多的克隆子，即可获得所需克隆子。具体方法如下：
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库的单菌落(每根牙签挑取1个单菌落)，分别接种于96孔细胞培养板的不同孔中(每孔中已加入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基)。将96孔细胞培养板置于恒温摇床中37℃，700rpm培养6小时，然后用8通道移液器在每孔加入终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃，250rpm诱导培养8小时。诱导培养完毕后，将96孔细胞培养板放入-86℃的超低温冰箱中冷冻2小时，取出放置于室温半小时，后4000r/min，4℃离心20分钟并每孔取上清100μL。在每孔上清100μL中，分别按1：1的体积比加入反应液(20mmol L-Met，30mmol MgCl2，15mmol KCl，20mmol ATP，2mmol SAM，0.01mol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液)，于30℃温育1个小时。然后分别先后加入50mmol/L钼酸铵溶液和100mmol/L抗坏血酸溶液，观察颜色变化，并用酶标仪(检测波长690nm)进行检测分析，选择吸光值高的孔用于进一步分析验证。
通过反复大量筛选验证(约200000个克隆子)、测序分析及酶活力测定，获得了四个酶活力高于MATI的MATI突变体的表达菌株，即MATI-1、MATI-1A、MATI-1B、MATI-1C的表达菌株，总结如下表1。
表1：易错突变文库筛选获得的MATI突变体的表达菌株
Figure BDA0002435343650000091
从表1可以看出，MATI-1的摇瓶(发酵液)酶活力和比活力相比MATI有明显提高，其中摇瓶酶活力提高4.8倍，比活力提高5.5倍；SAM合成酶突变体MATI-1A、MATI-1B、MATI-1C的摇瓶酶活力和比活力相比MATI也有提升，但不如MATI-1明显；SAM合成酶突变体MATI-1D、MATI-1E、MATI-1F、MATI-1G、MATI-1H活力相比MATI下降明显，几乎无合成活力。因此考虑在MATI-1的基础上进行其它氨基酸突变位点的叠加突变。
实施例5：不同叠加突变体菌株的构建与筛选
将表1中MATI-1表达菌株进行扩大培养，用质粒试剂盒(OMEGA)提取质粒，以质粒pET30a(+)-MATI-1为模板，将所获得的突变位点进行叠加突变，选择MATI氨基酸序列第163位、191位和/或218位，分别设计定点突变引物，进行全质粒PCR反应，全质粒PCR产物经DpnI消化后转化至表达菌株BL21(DE3)中，经测序验证无误，即获得在MATI-1突变体基础上的各叠加突变体的表达菌株，所表达与筛选的MATI突变体的具体情况见表2。
表2 MATI及其突变体的突变位点和活力
Figure BDA0002435343650000101
从表2可以看出，各叠加突变体较MATI-1活力均有明显提高。为了进一步验证各酶的催化反应能力，选择将MATI(SEQ ID NO.1)、MATI-1(SEQ ID NO.2)、MATI-2A(SEQ IDNO.3)、MATI-2B(SEQ ID NO.4)、MATI-2C(SEQ ID NO.5)、MATI-3A(SEQ ID NO.6)、MATI-3B(SEQ ID NO.7)、MATI-4(SEQ ID NO.8)的表达菌株进行发酵培养，分别将目的蛋白进行分离纯化并进行固定化后用于催化S-腺苷甲硫氨酸合成反应。
实施例6：不同MATI突变体的发酵、纯化
采用与MATI基本相同的方法进行MATI-1、MATI-2A、MATI-2B、MATI-2C、MATI-3A、MATI-3B、MATI-4的发酵与纯化，所得纯品连同实施例2得到的MATI纯品一起进行非还原SDS-PAGE电泳纯度检测(电泳条件：分离胶浓度10％，电压100V，电流50mA，电泳时间120min)，结果纯度均在95％以上。
实施例7：各固定化酶催化的S-腺苷甲硫氨酸合成反应
将MATI、MATI-1、MATI-2A、MATI-2B、MATI-2C、MATI-3A、MATI-3B、MATI-4分别制备固定化酶后(方法同实施例2)催化S-腺苷甲硫氨酸合成反应。反应条件及反应结果见表3-5。
表3各固定化酶催化SAM合成反应的部分反应条件(一)
Figure BDA0002435343650000111
Figure BDA0002435343650000121
表4各固定化酶催化SAM合成反应的部分反应条件(二)
Figure BDA0002435343650000122
Figure BDA0002435343650000131
表5各固定化酶催化SAM合成反应的部分反应条件及反应结果
Figure BDA0002435343650000132
Figure BDA0002435343650000141
由表5结果可以看出，各MATI突变体较MATI，以及各叠加突变体较MATI-1，产物浓度、产物收率、酶稳定性均有明显提高。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
序列表
<110> 湖南福来格生物技术有限公司
<120> 一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及利用其的制备方法
<130> -
<141> 2020-04-01
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 398
<212> PRT
<213> E.coli
<400> 1
Met Asn Gly Pro Val Asp Gly Leu Cys Asp His Ser Leu Ser Glu Glu
1 5 10 15
Gly Ala Phe Met Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His Pro Asp
20 25 30
Lys Ile Cys Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala His Leu Lys
35 40 45
Gln Asp Pro Asn Ala Lys Val Ala Cys Glu Thr Val Cys Lys Thr Gly
50 55 60
Met Val Leu Leu Cys Gly Glu Ile Thr Ser Met Ala Met Ile Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Arg Val Val Arg Asp Thr Ile Lys His Ile Gly Tyr Asp Asp Ser
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Asp Phe Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala Leu Glu
100 105 110
Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Cys Val His Leu Asp Arg Asn Glu
115 120 125
Glu Asp Val Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr
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225 230 235 240
Thr Ile Tyr His Leu Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro
245 250 255
Gln Gly Asp Ala Gly Val Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr
275 280 285
Thr Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val Ala Lys
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<211> 398
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<213> Artificial Sequence
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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Gln Arg Val Val Arg Asp Thr Ile Lys His Ile Gly Tyr Asp Asp Ser
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210 215 220
Glu Gln Val Ile Lys Ala Val Val Pro Ala Lys Tyr Leu Asp Glu Asp
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245 250 255
Gln Gly Asp Ala Gly Val Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr
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305 310 315 320
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325 330 335
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Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr
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Gly Ala Phe Met Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His Pro Asp
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100 105 110
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Gln Gly Asp Ala Gly Val Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr
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Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr
275 280 285
Thr Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val Ala Lys
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Ser Leu Val Lys Ala Gly Leu Cys Arg Arg Val Leu Val Gln Val Ser
305 310 315 320
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<213> Artificial Sequence
<400> 7
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65 70 75 80
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100 105 110
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Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
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245 250 255
Gln Gly Asp Ala Gly Val Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr
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370 375 380
Glu Phe Pro Trp Glu Val Pro Lys Lys Leu Val Phe Leu Glu
385 390 395

Claims (8)

1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于：所述的突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2-8之一所示。
2.一种编码权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的多核苷酸。
3.一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于：所述的方法是在反应体系中，用权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体催化ATP与L-甲硫氨酸之间的反应，制备S-腺苷甲硫氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是固定化的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、ATP与L-甲硫氨酸的浓度分别为100-500U/L、200-500mM、250-500mM。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述的反应的反应温度为25-30℃，反应pH为7.0-8.0，反应搅拌转速为150-200r/min，反应时间为30-180min。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中还加入添加剂，选自镁盐、钾盐、巯基乙醇、磺酸盐中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述的镁盐中Mg2+的浓度为100-250mM，所述的钾盐中K+的浓度为50-100mM，所述的巯基乙醇的浓度为50-200mM，
所述的磺酸盐选自对甲苯磺酸盐、1,4-丁二磺酸盐、4-羟基乙基哌嗪乙磺酸盐、3-吗啉丙磺酸盐中的一种或几种，总浓度为300-500mM。
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