CN101134948A - S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码该突变体的dna以及突变体的应用 - Google Patents

S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码该突变体的dna以及突变体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明披露利用基因突变技术改良的耐热高催化活性Methanococcus jannaschii S－腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，该突变体的特征在于，以说明书中所附的序列2为参考序列，其具有选自第102位、第93位、第230位和第357位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸为底物其具有比亲本高出至少70％的S－腺苷甲硫氨酸合成酶催化活性。该S－腺苷甲硫氨酸合成酶突变体可用于生产S－腺苷甲硫氨酸。

Description

S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码该突变体的DNA以及突变体的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用基因突变技术制备S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的方法、所获得的突变体及其应用。
背景技术：
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，EC2.5.1.6)催化三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸合成S—腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl Methionine，SAM或SAMe)。SAM存在于所有生物细胞内。SAM有(S，S)和(R，S)两种构型，但只有(S，S)构型才有活性。S—腺苷甲硫氨酸为生物体内蛋白质、脂肪、核糖核酸和维生素B12提供甲基，参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质、和磷脂等100多个生物合成和代谢反应，是维护细胞膜正常功能和人体正常代谢和健康不可或缺的重要生化物质(见Chiang PK，et al.FASEB J1996，10：471-480；Bottiglieri T.Am J Clin Nutr.2002，76：1151S-1157S)。SAM还是人体内的清道夫和解毒剂(Mato JM.Pharmacol Ther.1997，73：265-280；Lu SC.Gastroenterology.1998，114：403-407)。SAM在体内的含量随着人的年龄增长而下降，因此，人体补充SAM对健康是十分有益的。美国于廿世纪90年代后期将SAM作为一种天然饮食补充品。
一种生产SAM是体外酶催化转化法。体外酶催化转化法是将细菌表达的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在体外将前体甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)催化合成SAM，如张克勤(见专利公开号CN1483829，2004)描述了一种体外酶催化生产SAM的方法。在CN1483829描述的方法中，将前体甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)催化合成SAM的步骤必需在30-35℃进行。另外，由于所用的S-腺苷甲硫氨酸合成酶是粗提物，该粗提物中存在大量其它可降解ATP和甲硫氨酸的酶，令昂贵的前体ATP和甲硫氨酸大量消耗，从而增加SAM的生产成本。另外，由于粗提物中存在的杂酶降解ATP和甲硫氨酸而导致产物成份复杂，因而增加分离纯化成本。
因此，提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力、缩短反应周期和使用较纯的S-腺苷甲硫氨酸合成酶以避免前体的无谓消耗是降低SAM生产成本的关键因素。
发明内容：
本发明的目的在于提供耐热并高催化活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因的DNA。本发明的再一目的在于将本发明的突变体应用于以DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在较高温度下生产S—腺苷甲硫氨酸。
为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，
通过对M.jannaschii S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在MacConkey培养基上筛选，从而获得了一系列耐热并具高催化活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，该突变体能以DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在较高温度下高效率催化生成S—腺苷甲硫氨酸。
本发明获得了一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，以说明书中所附的序列2为参考序列，其具有选自第102位、第93位、第230位和第357位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸为底物其具有比亲本高出至少70％的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化活性。
优选的是，所述亲本序列中的第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)或苏氨酸(Thr)；所述亲本序列中的第93位的苏氨酸突变成半胱氨酸(Cys)、或赖氨酸(Lys)、或精氨酸(Arg)；所述亲本序列中的第230位的异亮氨酸突变成缬氨酸(Val)、或甘氨酸(Gly)；和/或所述亲本序列中的第357位的谷氨酸突变成天冬氨酸(Asp)、或苏氨酸(Thr)。
这些突变体具有高的催化活性。例如，在本发明获得的一系列突变体中，一个具有单点突变的突变体N102S的比活性较亲本高出79％，且在65℃热处理16小时后仍保持至少88％的活力。另一个具有双突变的突变体T93C的比活性较亲本高出262％，且在65℃热处理16小时后仍保持至少78.5％的活力。
另一方面，本发明还提供了一种DNA，其含有编码本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的核苷酸序列。
又一方面，本发明还涉及S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的应用，其应用于以三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸为底物制备腺苷甲硫氨酸。体可用于以L-甲硫氨酸或DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在较高温度下生产S—腺苷甲硫氨酸。所述的腺苷甲硫氨酸为腺苷甲硫氨酸盐的形式，其中该腺苷甲硫氨酸盐的形式可以为硫酸腺苷甲硫氨酸盐、对甲苯磺酸腺苷甲硫氨酸盐或丁二磺酸腺苷甲硫氨酸盐。
所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体可以未经纯化以粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶。如果需要，还可利用本领域已知的固化技术将本发明S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。
由于本发明的突变体的酶活力较高，即使使用该酶的粗提物，反应也会以较高的速率进行。另外，由于本发明的突变体可以耐受较高的温度，例如，一些优选的突变体还可以耐受高达65℃的高温，因此在宿主细菌中表达后，可以用热处理方式而除去粗提物中的杂酶，从而获得较高纯度的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，用于体外生产SAM。
此外，本发明的突变体可以在相对较高的温度例如40-52℃下用于工业化生产SAM，这样可以保证酶突变体保持较高的活力，使反应速率保持较高的水平，缩短反应时间，从而使反应底物因反应时间过长导致的降解得以抑制。
附图的简要说明：
图1S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本与突变体N102S之聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中从左至右的四条泳道依次为牛血清白蛋白、蛋白分子量标准、亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶粗提蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体N102S粗提蛋白(S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本与突变体N102S粗提蛋白的制备见实施例8-9)。
图2S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本SAM与突变体在65℃的热稳定。其中N102S、N102Q和N102I是含单个点突变的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，而T93C是含双突变的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，具体参见实施例12-13。
具体实施方式：
为了获得本发明的突变体，可以利用本领域已知的技术，先构建含有亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。在本发明S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的制备方法中，可采用任何适当的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy，pRSET和pES21；包括但不限于真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。在本发明制备S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的方法中，所获得的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。
在本发明制备S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌、M.jannaschii和链霉菌(如Streptomyces diastaticus M1033)。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GS115/9891)。
本申请文本中所用的术语“亲本”系指来自M.jannaschii(扬氏甲烷球菌)ATCC43067的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM)，其核苷酸序列如序列1所示，氨基酸序列如序列2所示。本发明中亲本基因的核苷酸序列与公布的M.jannaschii S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因序列(Lee et al.，Journal of General Microbiology，139：1227-1234，1993；GenBank NC000909)相比有两个核苷酸的差异，即与基因库(GenBank NC000909)的核苷酸序列相比，本发明中亲本基因第1031位为G，相应的第344位氨基酸序列为半胱氨酸(Cys)，GenBankNC000909对应处、第1031位核苷酸序列为A，相应的第344位氨基酸序列为酪氨酸(Tyr)；本发明中亲本基因第1044位为T，相应的第348位氨基酸序列为苯丙氨酸(Phe)，GenBank NC000909对应处、第1044位核苷酸序列为A，相应的第348位氨基酸序列为亮氨酸(Leu)。
本申请文本中所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，系指序列表中的序列1，当其为氨基酸序列时，是指序列表中的序列2。在将参考序列和突变的S-腺苷甲硫氨酸合成酶序列进行排序比较时，可以手工进行，也可以用计算机进行(目前有许多可供利用的计算机软件，例如CLUSTALW，AMAS，DIALIGN程序等)。
本申请文本中所用的术语“S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体”是指这样一种以序列表中序列2所示氨基酸序列为参考序列，存在选自第102位、第93位、第230位和第357位的至少一个突变，并且以DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物生产S—腺苷甲硫氨酸时其具有比亲本高出至少70％的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化活性的酶。因此，在本专利申请中，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的变体，包括对序列2所示氨基酸序列中除第102位、第93位、第230位和第357位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些变体形式也包括在本发明的范围内。
在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9-37，1984)。
以下用具体的实施例对本发明制备的突变体及其性能进行说明。下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1：亲本基因的扩增及pGEMT-SAM的构建
根据基因库(GenBank NC000909)基因序列设计引物S1和S2(见表1)。用引物对S1和S2从M.jannaschii ATCC43067(购自ATCC，USA)中扩增S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本基因。
扩增条件为：20mM Tris-HC1(pH8.8)，10mM KC1，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μMdTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1，400nM引物S2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许M.jannaschii菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。
PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，40圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟。扩增的产物长约1.3kb。将该扩增产物经限制性内切酶PacI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶PacI和AscI酶切的载体pGEMT-Easy(购自Promega，USA)连接，得质粒pGEMT-SAM。经DNA测序，确定该被克隆的亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。
实施例2：S-腺苷甲硫氨酸合成酶位点102之定点突变
定点突变技术参考Ho et al.Gene.1989，77：51-59和White et al.PCR Protocol：current methods and applications.Totowa，N.J.，HumanaPress，1993)之描述。具体过程如下：
为了将亲本氨基酸序列中第102位点的Asn(N)突变为Ser(S)获得突变体N102S，以质粒pGEMT-SAM(见实施例1)为模板，设计引物对102SF和102SR(见表1)。
用引物对S1和102SR，扩增S1SR片段，用引物对102SF和S2，扩增SFS2片段。引物对S1和S2的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HC1(pH8.8)，10mM KC1，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ngpGEMT-SAM，以及400nM引物S1和400nM引物102SR(或者，400nM引物102SF和400nM引物S2)，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到S1SR片段和SFS2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HC1(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM S2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng SlSR片段与20ng SFS2片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到全长突变基因N102S。将N102S与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-N102S。将质粒pGEMT-N102S转入感受态细菌细胞E.coli HB101(购自Promega，USA)，在1％MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mML-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上筛选具S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的克隆。从阳性克隆中提取质粒pGEMT-N102S DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。N102S的氨基酸序列见序列表中的序列3。
按照类似步骤构建突变体N102D、N102H、N102I、N102P、N102Q和N102T，所用引物见表1。所得诸突变体的氨基酸序列见序列表中的序列4-9。
实施例3：对S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体N102S的位点93之定点突变
定点突变技术参考Ho et al.Gene.1989，77：51-59和White et al.PCR Protocol：current methods and applications.Totowa，N.J.，HumanaPress，1993)之描述。
为了将N102S的氨基酸序列中第93位点的Thr(T)突变为Cys(C)获得突变体T93C，以质粒pGEMT-N102S(见实施例2)为模板，设计引物对93CF和93CR(见表1)。
用引物对S1和93CR，扩增S1CR片段，引物对93CF和S2，扩增CFS2片段。引物S1和S2的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM引物93CR，或400nM引物93CF和400nM引物S2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pGEMT-N102S，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到S1CR片段和CFS2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM S2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng SlCR片段与20ng CFS2片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因T93C。将T93C与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-T93C。将质粒pGEMT-T93C转入感受态细菌细胞E.coli HB101，在1％MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mM L-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的克隆。从阳性克隆中提取质粒pGEMT-T93C DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。突变体T93C含N102S和T93C双突变。T93C的氨基酸序列见序列表中的序列10。
按照类似步骤构建突变体T93K和T93R，所用引物见表1。突变体T93K含N102S和T93K双突变。突变体T93R含N102S和T93R双突变。所得的两个突变体的氨基酸序列分别列于序列表中的序列11-12。
实施例4：S-腺苷甲硫氨酸合成酶位点230之定点突变
定点突变技术参考Ho et al.Gene.1989，77：51-59和White et al.PCR Protocol：current methods and applications.Totowa，N.J.，HumanaPress，1993)之描述。
为了将N102S的氨基酸序列中第230位点的Ile(I)突变为Val(V)获得突变体I230V，以质粒pGEMT-N102S(见实施例2)为模板，设计引物对230VF和230VR(见表1)。
用引物对S1和230VR，扩增S1VR片段，引物对230VF和S2，扩增VFS2片段。引物S1和S2的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM引物230VR，或400nM引物230VF和400nM引物S2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pGEMT-N102S，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到S1VR片段和VFS2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μMdGTP，400nM引物S1和400nM S2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngSlVR片段与20ng VFS2片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到全长突变基因I230V。将I230V与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-I230V。将质粒pGEMT-I230V转入感受态细菌细胞E.coli HB101，在1％MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mM L-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的克隆。从阳性克隆中提取质粒pGEMT-I230V DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。突变体I230V含N102S和I230V双突变。I230V的氨基酸序列见序列表中的序列13。
按照类似步骤构建突变体I230G，所用引物见表1。突变体I230G含N102S和I230G双突变。突变体I230G的氨基酸序列见序列表中的序列14。
实施例5：S-腺苷甲硫氨酸合成酶位点357之定点突变
定点突变技术参考Ho et al.Gene.1989，77：51-59和White et al.PCR Protocol：current methods and applications.Totowa，N.J.，HumanaPress，1993)之描述。
为了将N102S的氨基酸序列中第357位点的Glu(E)突变为Asp(D)获得突变体E357D，以质粒pGEMT-N102S(见实施例2)为模板，设计引物对357DF和357DR(见表1)。
用引物对S1和357DR，扩增S1DR片段，引物对357DF和S2，扩增DFS2片段。引物S1和S2的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM引物357DR，或400nM引物357DF和400nM引物S2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pGEMT-N102S，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到SlDR片段和DFS2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μMdGTP，400nM引物S1和400nM S2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngS lDR片段与20ng DFS2片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到全长突变基因E357D。将E357D与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-E357D。将质粒pGEMT-E357D转入感受态细菌细胞E.coli HB101，在1％MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mM L-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-E357D DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。突变体E357D含N102S和E357D双突变。所得突变体的氨基酸序列见序列表中的序列15。
按照类似步骤构建突变体E357T，所用引物见表1。突变体E357T含N102S和E357T双突变。所得突变体的氨基酸序列见序列表中的序列16。
实施例6：S-腺苷甲硫氨酸合成酶三突变组合SAM3cv和SAM3cd之构建
定点突变技术参考Ho et al.Gene.1989，77：51-59和White et a1.PCR Protocol：current methods and applications.Totowa，N.J.，HumanaPress，1993)之描述。
以质粒pGEMT-T93C(见实施例3)为模板，采用引物对用引物对S1和230VR，以及引物对230VF和S2，将T93C的氨基酸序列中第230位点的Ile(I)突变为Val(V)，获得突变体SAM3cv。引物S1、S2、230VF和230VR的具体序列，见表1。具体过程如下：
用引物对S1和230VR，扩增S1230VR片段，引物对230VF和S2，扩增230VFS2片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM引物230VR，或400nM引物230VF和400nM引物S2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pGEMT-T93C，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到S1230VR片段和230VFS2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物S1和400nM S2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng S1230VR片段与20ng230VFS2片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因SAM3cv。将SAM3cv与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-SAM3cv。将质粒pGEMT-SAM3cv转入感受态细菌细胞E.coli HB101，在1％MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mM L-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的克隆。从阳性克隆中提取质粒pGEMT-SAM3cv DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。突变体SAM3cv含N102S、T93C和1230V三突变。SAM3cv的氨基酸序列见序列表中的序列17。
按照类似步骤构建突变体SAM3cd，所用引物见表1。突变体SAM3cd含N102S、T93C和E357D三突变。所得突变体的氨基酸序列见序列表中的序列18。
扩增亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶(亲本)与实施例2-7所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体所用的引物如下表1所列：
表1
目标产物名称 引物对
亲本 S1：5’AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGAA ACATAATTGTAAA3’S2：5’ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTTTTCCTTCA3’
突变体N102S 102SF：5’AAGGAGAAAAGCGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102SR：5’TATAACTTCGCTTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102D 102DF：5’AAGGAGAAAGATGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102DR：5’TATAACTTCATCTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102H 102HF：5’AAGGAGAAACATGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102HR：5’TATAACTTCATGTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102I 102IF：5’AAGGAGAAAATTGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102IR：5’TATAACTTCAATTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102P 102PF：5’AAGGAGAAACCGGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102PR：5’TATAACTTCGCCTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102Q 102QF：5’AAGGAGAAACAGGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102QR：5’TATAACTTCCTGTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体N102T 102TF：5’AAGGAGAAAACCGAAGTTATAAAGCTCCCAGTA3’102TR：5’TATAACTTCGGTTTTCTCCTTATCTAAGATTTC3’
突变体T93C 93CF：5’GGAAGAGCATGCATGGAAATCTTAGATAAGGA3’93CR：5’GATTTCCATGCATGCTCTTCCAGATAATAAAAT3’
突变体T93K 93KF：5’GGAAGAGCAAAAATGGAAATCTTAGATAAGGA3’93KR：5’GATTTCCATTTTTGCTCTTCCAGATAATAAAAT3’
突变体T93R 93RF：5’GGAAGAGCACGTATGGAAATCTTAGATAAGGA3’93RR：5’GATTTCCATACGTGCTCTTCCAGATAATAAAAT3’
突变体I230V 230VF：5’GTTAAAAATGTGGAGGAATATAAGGAAGTTATTG3’230VR：5’ATATTCCTCCACATTTTTAACATACCTATCAAC3’
突变体I230G 230GF：5’GTTAAAAATGGCGAGGAATATAAGGAAGTTATTG3’230GR：5’ATATTCCTCGCCATTTTTAACATACCTATCAAC3’
突变体E357D 357DF：5’CCAATCAATGATCCAAAGGCTTTAGATATAGA3’357DR：5’AGCCTTTGGATCATTGATTGGCTTACCAATTT3’
突变体E357T 357TF：5’CCAATCAATACCCCAAAGGCTTTAGATATAGA3’357TR：5’AGCCTTTGGGGTATTGATTGGCTTACCAATTT3’
突变体SAM3cv S1：5’AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGAAACATAATTGTAAA3’S2：5’ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTTTTCCTTCA3’230VF：5’GTTAAAAATGTGGAGGAATATAAGGAAGTTATTG3’230VR：5’ATATTCCTCCACATTTTTAACATACCTATCAAC3’
突变体SAM3cd S1：5’AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGAAACATAATTGTAAA3’S2：5’ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTTTTCCTTCA3’357DF：5’CCAATCAATGATCCAAAGGCTTTAGATATAGA3’357DR：5’AGCCTTTGGATCATTGATTGGCTTACCAATTT3’
实施例7：亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶的提取与纯化
S-腺苷甲硫氨酸合成酶的提取与纯化主要参考Cabrero C，et al.Eur J Biochem.1987，170：299-304。具体过程如下：
将含亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的质粒pGEMT-SAM转化感受态细菌细胞E.coli HB101，在MacConkey平板(含10mM三磷酸腺苷二钠盐、1.0mM L-甲硫氨酸和50mg/L氨苄青霉素)上37℃培养36小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养40小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中，加KCl和MgCl2至终浓度分别为100mM和20mM。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17，800g，15分钟)并收集上清液为粗提蛋白。粗提蛋白经65℃热处理20分钟后，离心(10℃，17，800g，15分钟)去沉淀物，即为部分纯化的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，可用于酶活性的测定和制备腺苷甲硫氨酸。
实施例8：S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的提取与纯化
S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体N102S的提取与纯化与实施例7同，惟所用质粒为pGEMT-N102S。
图1显示了S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本与经部分纯化的突变体N102S之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
实施例9：亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的测定
配制底物溶液A：含8mM的三磷酸腺苷二钠盐(ATP)和32mM的DL-甲硫氨酸、100mM Tris盐酸缓冲液、终浓度为100mM之KCl和终浓度为20mM之MgCl2，调pH至7.5。取底物溶液A250微升，然后加入150微升重蒸水，再加入100微升按实施例8制备的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。反应于58℃进行20分钟。加入300微升10％三氯醋酸(TCA)以终止反应。离心(10℃，17，800g，15分钟)并收集上清液，即为反应产物S-腺苷甲硫氨酸。通过高压液相色谱(HPLC)测定S-腺苷甲硫氨酸的量。HPLC测定用色谱柱为C18反相柱(Waters，USA)，流动相为乙腈-水(85∶15)，流速为0.5毫升/分钟。探测器为ELSD500。进样量为10微升。用CoomassiePlus Protein AssayReagent Kit(PIERCE，USA)并结合SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔三磷酸腺苷(ATP)和一微摩尔DL-甲硫氨酸为S-腺苷甲硫氨酸所需之酶量。下列表2显示亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶之比活性。
实施例10：S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体活性的测定
S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体活性测定与实施例9同。下表2显示S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体与亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶(亲本)比活性之差异。
表2S-腺苷甲硫氨酸合成酶亲本与突变体比活性之差异
酶的名称 氨基酸序列的序列号 比活
亲本 SEQ ID NO.：2 100
突变体N102S SEQ ID NO.：5 179
突变体N102D SEQ ID NO.：6 184
突变体N102H SEQ ID NO.：7 220
突变体N102I SEQ ID NO.：8 266
突变体N102P SEQ ID NO.：9 258
突变体N102Q SEQ ID NO.：10 238
突变体N102T SEQ ID NO.：11 211
突变体T93C SEQ ID NO.：12 362
突变体T93K SEQ ID NO.：13 210
突变体T93R SEQ ID NO.：14 243
突变体I230V SEQ ID NO.：15 208
突变体I230G SEQ ID NO.：16 223
突变体E357T SEQ ID NO.：18 278
突变体SAM3cv SEQ ID NO.：19 232
突变体SAM3cd SEQ ID NO.：20 232
实施例11：亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶热稳定性测定
将按实施例7获得的经部分纯化的亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶的1400微升酶液置于7个1.5毫升离心管中。每个离心管含有200微升的酶液，并向其中加入200微升矿物油。将离心管置于65℃水浴中，在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和16小时的时间点分别取出一管酶液，离心(10℃，17，800g，20分钟)后，取上清液，按实施例9所述测定S-腺苷甲硫氨酸合成酶残余蛋白和残余比活性。图2显示亲本S-腺苷甲硫氨酸合成酶在65℃的热稳定。
实施例12：S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体热稳定性测定
S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体N102S和T93C之热稳定性测定与实施例11同。图2显示S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体N102S和T93C在65℃的热稳定。在65℃热处理16小时后，突变体N102I仍保持100％的活力，突变体N102Q仍保持99％的活力，突变体N102S仍保持88％的活力，突变体T93C保持78.5％的活力，而亲本SAM则只剩下41.9％的活力。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
序列表
<110>  百瑞全球有限公司
<120>  S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码该突变体的DNA以及突变体的应用
<130>  FI-060639-59
<160>  18
<170>  Patentln version 3.3
<210>  1
<211>  1221
<212>  DNA
<213>  Methanococcus jannaschii
<400>  1
Figure A20061012763600201
<210>  2
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Methanococcus jannaschii
<400>  2
Figure A20061012763600211
Figure A20061012763600221
<210>  3
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
       Ser。
<400>  3
Figure A20061012763600222
Figure A20061012763600231
<210>  4
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
        Asp。
<400>  4
Figure A20061012763600232
Figure A20061012763600241
<210>  5
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
Figure A20061012763600251
Figure A20061012763600261
<210>  6
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
       lle。
<400>  6
Figure A20061012763600262
Figure A20061012763600271
<210>  7
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
        Pro。
<400>  7
Figure A20061012763600281
Figure A20061012763600291
<210>  8
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
        Glu。
<400>  8
Figure A20061012763600292
Figure A20061012763600301
Figure A20061012763600311
<210>  9
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 of the parent has been changed to
        Thr。
<400>  9
Figure A20061012763600312
Figure A20061012763600331
<210>  10
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Thr residue at position 93 and the Asn residue at position
        102 of the parent have been changed to Cys and Ser，respectively。
<400>  10
Figure A20061012763600332
Figure A20061012763600351
<210>  11
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Thr residue at position 93 and the Asn residue at position
       102 of the parent have been changed to Lys and Ser。
       respectively。
<400>  11
Figure A20061012763600371
<210>  12
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Thr residue at posItion 93 and the Asn residue at position
       102 of the parent have been changed to Arg and Ser，respectively。
<400>  12
Figure A20061012763600381
Figure A20061012763600391
<210>  13
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 and the lle residue at position
        230 have been changed to Ser and Val，respectively。
<400>  13
Figure A20061012763600392
Figure A20061012763600401
Figure A20061012763600411
<210>  14
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 and the lle residue at position
       230 have been changed to Ser and Gly，respectively。
<400>  14
Figure A20061012763600412
<210>  15
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 and the Glu residue at position
       357 of the parent have been changed to Ser and Asp，respectively。
<400>  15
Figure A20061012763600432
Figure A20061012763600441
<210>  16
<211>  406
<212>  PRT
<213>  ArtificiaI
<220>
<223>  The Asn residue at position 102 and the Glu resjdue at position
       357 of the parent have been changed to Ser and Thr，respectively。
<400>  16
Figure A20061012763600461
Figure A20061012763600471
<210>  17
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Thr residue at position 93。the Asn residue at position 102
       and the lle residue at position 230 of the parent have been
       changed to Cys，Ser and Val，respectively。
<400>  17
Figure A20061012763600481
<210>  18
<211>  406
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  The Thr residue at position 93.the Asn residue at position 102
       and the Glu residue at position 357 of the parent have been
       changed to Cys，Ser and Asp，respectively。
<400>  18
Figure A20061012763600491
Figure A20061012763600501

Claims (14)

1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，以说明书中所附的序列2为参考序列，其具有选自第102位、第93位、第230位和第357位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸为底物其具有比亲本高出至少70％的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化活性。
2.权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)、或天冬氨酸(Asp)、或组氨酸(His)、或异亮氨酸(Ile)、或脯氨酸(Pro)、或谷氨酰胺(Gln)、或苏氨酸(Thr)。
3.权利要求2所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)，同时第93位的苏氨酸突变为半胱氨酸(Cys)、或赖氨酸(Lys)、或精氨酸(Arg)。
4.权利要求3所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)，同时第93位的苏氨酸突变为半胱氨酸(Cys)以及第230位的异亮氨基酸突变为缬氨酸(Val)。
5.权利要求3所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)，同时第93位的苏氨酸突变为半胱氨酸(Cys)以及第357位的谷氨酸突变为天冬氨酸(Asp)。
6.权利要求2所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)，同时第230位的异亮氨酸突变为缬氨酸(Val)、或甘氨酸(Gly)。
7.权利要求2所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其中第102位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)，同时第357位的谷氨酸突变为天冬氨酸(Asp)、或苏氨酸(Thr)。
8.权利要求1所述的的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其具有说明书所附序列表中SEQ ID NO.：3至SEQ ID NO.：18之一所示的氨基酸序列。
9.一种DNA，其含有编码权利要求1-8任一项所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的核苷酸序列。
10.权利要求1-8任一项所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的应用，其应用于以三磷酸腺苷(ATP)和甲硫氨酸为底物制备腺苷甲硫氨酸。
11.权利要求10所述的应用，其中所述的甲硫氨酸为L-甲硫氨酸。
12.权利要求10所述的应用，其中所述的甲硫氨酸是DL-甲硫氨酸。
13.权利要求10所述的应用，其中所述的腺苷甲硫氨酸为腺苷甲硫氨酸盐的形式。
14.权利要求13所述的应用，其中所述的腺苷甲硫氨酸盐的形式为硫酸腺苷甲硫氨酸盐、对甲苯磺酸腺苷甲硫氨酸盐或丁二磺酸腺苷甲硫氨酸盐。
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