CN107922952A - 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，以烟酰胺、焦磷酸或其盐和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。

Description

一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 特别涉及一种利用生物催化技术制备 烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
[0002] 烟酰胺单核苷酸 （Nicotinamide mononucleotide, 缩写成 NMN) 是生物细胞内 存在的一种生化物质， 它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物 细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD， 又称辅酶 I) ， 并且 同吋直接参与体内腺苷转移， 其在生物细胞内的水平直接影响到 NAD的浓度， 在生物细胞能量生成中扮演着重要角色， 并且对人体无危害。
[0003] 截至目前， 人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、 治疗帕金森等老 年病、 调节胰岛素分泌、 影响 mRNA的表达等诸多医疗保健用途， 更多的用途还 在不断研发出来。 随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加， 以 及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用， 市场上对烟酰胺单核苷酸的需求 量与日俱增。
[0004] 目前， NMN的制备方法主要包括以下三种： 1、 酵母菌发酵法； 2、 化学合成 法； 3、 生物催化法。 其中， 化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点 ； 而酵母菌发酵法生产的 NMN含一定有机溶剂残留； 生物催化法因不含机溶剂 残留， 也不存在手性问题且制备的 NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保 无公害的 NMN的制备方法。 现有的制备 NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和 5'- 磷酸核糖基 -1'-焦磷酸 （PRPP) 为底物， 在烟酰胺磷酸核糖转移酶 （Nicotinamid e phosphoribosyltransferase, 缩写成 Nampt) 的催化下制备 NMN。 但是， 因 PRPP 的市场价格较高且来源受限， 导致该生物催化法的生产成本较高， 严重制约了 其应用和发展。
[0005] 因此， 有必要幵发一种无需使用 PRPP作为底物的利用生物催化技术制备 NMN 的新方法。 技术问题
[0006] 针对上述背景技术中提到的现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法存在的诸多问题 ， 本发明的目的在于提供一种利用生物催化技术制备 NMN的新方法， 该方法可 避幵使用价格较高且来源受限的 PRPP作为底物， 具有价格低廉、 绿色环保无公 害、 适宜大规模工业化生产等优点。
问题的解决方案
技术解决方案
[0007] 为实验上述目的， 发明人经过长期大量的实验摸索， 终于幵发出一种制备烟酰 胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 以烟酰胺、 焦磷酸或其盐和 AMP为原料， 在 烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下发生反应， 制得 烟酰胺单核苷酸。
[0008] 根据酶的国际系统命名法， 上述方法中所使用的酶的 EC编号分别为： 烟酰胺 磷酸核糖转移酶 EC 2.4.2.12, 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 EC 2.4.2.7。
[0009] 上述方法中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、 酶冻干粉、 含酶细胞以 及各种固定化酶和固定化含酶细胞， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经 部分纯化或完全纯化的形式。
[0010] 为提高所使用酶的稳定性和重复利用率， 以更好地完成上述催化反应并更进一 步降低成本， 上述方法中优选使用固定化酶。 该固定化酶的制备方法大致为： 用洗酶缓冲液 （0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA， pH7.0溶液） 将酶稀释至蛋白含 量为 5-10mg/ml， 再将酶稀释液与 PB溶液 （2.0mol/L磷酸二氢钾， pH7.5) 等体积 混合， 然后加入酶固定化载体 （50毫克酶 /克载体） ， 于摇床 （转速 150rpm) 中 2 5°C反应 20小吋。 反应完成后用滤袋过滤， 用洗酶缓冲液清洗 5-6次， 即得固定化 酶。 其中的酶固定化载体可以选用环氧型 LX-3000、 二氧化硅、 活性炭、 玻璃珠 以及大孔型聚 N-氨乙基丙烯酰胺 -聚乙烯等。
[0011] 优选地， 焦磷酸盐为焦磷酸的钠盐， 包括焦磷酸钠， 焦磷酸二钠。
[0012] 优选地， 所述反应在温度为 30-50°C， pH值为 6.5-8.5的条件下进行。
[0013] 更优选地， 所述反应在温度为 35-45°C， pH值为 7.0-8.0的条件下进行吋转化率 最高。 [0014] 优选地， 所述反应在 Mg 2+和 K +存在的条件下进行。
[0015] 优选地， 所述反应在 Tris-HCl缓冲液中进行。
[0016] 优选地， 所述烟酰胺的浓度为 l-150mM， 所述焦磷酸或其盐的浓度为 1-lOOmM
， 所述 AMP的浓度为 l-100mM。
[0017] 优选地， 所述原料中烟酰胺、 焦磷酸或其盐、 AMP的摩尔比为 1-4:1-2:1， 按照 此种配比投放原料可使 AMP得到充分反应， 其转化率为 80<¾-100<¾。 因为在三种 原料中， 以 AMP的售价为最高， 故而此种配比可较大程度地降低生产成本。 更 优选地， 所述原料中烟酰胺、 焦磷酸或其盐、 AMP的摩尔比为 2:1.5:1， 反应以底 物 AMP计算的转化率为 100%， 且成本最低。
[0018] 反应完成后得到的烟酰胺单核苷酸粗产品溶液可采用本领域已知的常规技术手 段进行过滤、 纯化和干燥处理， 即得烟酰胺单核苷酸成品。
[0019] 优选地， 上述方法中所使用的烟酰胺磷酸核糖转移酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋 白质：
[0020] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示的蛋白质，
[0021] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且以烟酰胺和 PRPP为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的亲本高的烟 酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由 ) 衍生的蛋白质。
[0022] 上述烟酰胺磷酸核糖转移酶是发明人对来自 Meiothermus ruber DSM 1279的核 苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因进行定点突 变， PCR扩增后插入适当的载体， 随后在 LB+卡那霉素培养基上筛选而获得的一 系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体， 这些突变体的高催化活 性可极大地降低工业上应用生物催化技术生产烟酰胺单核苷酸的成本， 具有较 高的工业应用价值。
[0023] 优选地， 所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相 比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 180位、 第 182位、 第 231位 、 第 298位、 第 338位以及第 377位。
[0024] 更优选地， 所述烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述突变： F180A、 F180 W、 A182Y、 E231A、 E231Q、 D298A、 D298N、 D298E、 D338N、 D338E、 D37 7A、 D377N以及 D377E。
发明的有益效果
有益效果
[0025] 1、 与现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法相比， 本发明提供的方法既克服了化 学合成法和酵母菌发酵法的缺陷， 又成功避免了价格昂贵且来源受限的 PRPP的 使用， 该方法以底物 AMP计算的转化率高达 100%， 属于现今烟酰胺单核苷酸的 制备方法中最为绿色环保无公害、 适宜大规模工业化生产且价格低廉的一种。
[0026] 2、 本发明提供的方法中使用的烟酰胺磷酸核糖转移酶是一种经人工诱导定点 突变获得的突变体， 与现有的野生型相比， 该突变体的酶活力大大提高， 经酶 活测定， 以烟酰胺和 PRPP为底物， 该突变体的酶催化活性是亲本的 1.2-6.9倍， 如此高的催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用， 或者只须部分纯化， 这 就使得应用本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体催化生产 NMN的成本大 大降低， 具有较高的市场竞争力， 能够满足将 NMN的生物催化方法应用于大规 模工业化生产的需求。
本发明的实施方式
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例， 实施例中未注明具体条件者， 按常规条 件或制造商建议的条件进行。
[0028] 本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法的具体实施过程如下：
[0029] 将各原料溶解于水中配制底物溶液， 该底物溶液的组成为 l-150mM的烟酰胺、 1-lOOmM的焦磷酸或其盐、 1-lOOmM的 AMP、 l-30mM的 MgCl 2、 l-20mM的 KCl 以及 50-100mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 6.5-8.5。 然后向底物溶液中加入以下 催化用酶： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 l-100g/L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 1- 100g/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm ) ， 控制反应温度为 30-50°C， 维持 pH值为 6.5-8.5。 反应 l-8h后即得烟酰胺单核 苷酸粗产品溶液， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
[0030] 以下实施例中所使用的酶， 除烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是从来自 Meiother mus ruber DSM 1279的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖 转移酶经人工诱导定点突变获得的之外， 其余烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤 磷酸核糖转移酶均是从市场上直接购入的酶冻干粉。
[0031] 实施例 1
[0032] 烟酰胺单核苷酸的制备
[0033] 向反应釜中加入底物溶液， 含 ImM的烟酰胺、 ImM的焦磷酸二钠、 ImM的 AM P、 ImM的 MgCl 2、 ImM的 KC1以及 50mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 6.5-7.0。 然 后加入以下催化用酶： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 lg/L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖转 移酶 lg/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rp m) ， 控制反应温度为 30°C， 维持 pH值为 6.5-7.0。 反应 lh后即得烟酰胺单核苷酸 粗产品溶液 （含 NMN0.9mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸 成品。
[0034] 实施例 2
[0035] 烟酰胺单核苷酸的制备
[0036] 向反应釜中加入底物溶液， 含 40mM的烟酰胺、 20mM的焦磷酸、 20mM的 AMP 、 10mM的 MgCl 2、 7mM的 KC1以及 70mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然 后加入以下催化用酶： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 30g/L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖 转移酶 30g/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 5 Orpm) ， 控制反应温度为 35°C， 维持 pH值为 7.0-7.5。 反应 3h后即得烟酰胺单核 苷酸粗产品溶液 （含 NMN18.9mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核 苷酸成品。
[0037] 实施例 3
[0038] 烟酰胺单核苷酸的制备
[0039] 向反应釜中加入底物溶液， 含 lOOmM的烟酰胺、 70mM的焦磷酸钠、 70mM的 A MP、 20mM的 MgCl 2
、 15mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.5-8.0。 然后加入以下催 化用酶： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 65g/L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 65g/L底 物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制 反应温度为 40°C， 维持 pH值为 7.5-8.0。 反应 5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶 液 （含 NMN65.7mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
[0040] 实施例 4
[0041] 烟酰胺单核苷酸的制备
[0042] 向反应釜中加入底物溶液， 含 150mM的烟酰胺、 lOOmM的焦磷酸钠、 lOOmM 的 AMP、 30mM的 MgCl 2
、 20mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 8.0-8.5。 然后加入以下催 化用酶： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 100g/L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 100g/L 底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控 制反应温度为 50°C， 维持 pH值为 8.0-8.5。 反应 8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品 溶液 （含 NMN96.5mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
[0043] 实施例 5
[0044] 烟酰胺单核苷酸的制备
[0045] 制备固定化酶： 用洗酶缓冲液 （0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA， pH7.0溶液） 分别将烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶稀释至蛋白含量为 5-10m g/ml, 再将酶稀释液与 PB溶液 （2.0mol/L磷酸二氢钾， pH7.5) 等体积混合， 然 后加入酶固定化载体环氧型 LX-3000 (50毫克酶 /克载体） ， 于摇床 （转速 150Φ m) 中 25°C反应 20小吋。 反应完成后用滤袋过滤， 用洗酶缓冲液清洗 5-6次， 即 分别得到固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶和固定化腺嘌呤磷酸核糖转移酶。
[0046] 向反应釜中加入底物溶液， 含 75mM的烟酰胺、 75mM的焦磷酸二钠、 50mM的 AMP、 15mM的 MgCl 2
、 10mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然后加入以下催 化用酶： 固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶 50g/L底物溶液， 固定化腺嘌呤磷酸核糖 转移酶 50g/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 5 Orpm) ， 控制反应温度为 37°C， 维持 pH值为 7.0-8.0。 反应 5h后即得烟酰胺单核 苷酸粗产品溶液 （含 NMN48.8mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核 苷酸成品。
[0047] 实施例 6 [0048] 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
[0049] 本发明提供的方法中用到的人工诱导定点突变的烟酰胺磷酸核糖转移酶的制备 过程大致为： 首先构建含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒， 然后 设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类， 再合成适当的引物， 以含亲本 烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒为模板， PCR扩增 DNA片段、 装配所扩 增的 DNA片段以及 PCR扩增全长突变基因。 然后将该全长突变基因克隆到适当 的载体上并转化适当的宿主细胞， 经培养筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活 性的阳性克隆。 最后从阳性克隆中提取质粒 DNA， 进行 DNA序列测定分析， 以 确定引入的突变， 在确定目的片段插入到载体上后， 通过 LB+卡那霉素培养基筛 选， 从而获得一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
[0050] 在上述制备方法中， 可采用任何适用的载体， 例如： 可以为原核表达载体， 如 pRSET和 pES21等； 可以为克隆载体， 如 pUC18/19和 pBluscript-SK等。 本发明 优先选用 pRSET-A为载体， 载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细 胞， 也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
[0051] 一、 含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒的构建
[0052] 对基因库公布的来自 Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移 酶的基因序列 （GenBank登录号： CP001743.1) 进行全序列人工合成 （由商业合 成公司完成） 。 合成的产物经限制性内切酶 Ndel和 BamHI酶切后与经同样限制性 内切酶 Ndel和 BamHI酶切的载体 pRSET-A (源自 Invitrogen,
USA) 连接， 得质粒 pRSET-nampt。 经 DNA测序， 确定该被克隆的亲本烟酰胺磷 酸核糖转移酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2所示。
[0053] 二、 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
[0054] PCR扩增反应体系为： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), lO mM KCl, 10 mM (NH 4) 2 SO 4， 2 mM MgS0 4， 0.1% Triton X-100, 50 mM dATP， 50 mM dTTP， 50 mM dCTP， 50 mM dGTP， 1.5 U Pfu DNA聚合酶（Promega, USA) , 20 ng DNA模板 ， 以及 400 nM上游引物和 400 nM下游引物， 用无菌水调反应体积至 50微升。
[0055] PCR扩增反应条件为： 95°C 3分钟， 35圈循环： 95°C 50秒、 52°C 30秒和 72°C 3 分钟， 最后 72°C 5分钟。
[0056] 1、 F180A突变体的制备
[0057] 用如下引物对 F180A-F: 5'
GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'和 F180A-R: 5'
GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 F180A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-F180A。 将质粒 pRSET-F180A转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-F180A的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， F180A突变体的氨基酸序列在第 180位点由 Phe (F) 突变为 Ala (A) ， 其氨基 酸序列如 SEQ ID NO: 3所示。
[0058] 2、 F180W突变体的制备
[0059] 用如下引物对 F180W-F: 5'
GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'和 F180W-R: 5' GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 F180W突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-F180W。 将质粒 pRSET-F180W转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟 酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-F180W的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相 比， F180W突变体的氨基酸序列在第 180位点由 Phe (F) 突变为 Trp (w) 。
[0060] 3、 A182Y突变体的制备
[0061] 用如下引物对 A182Y-F: 5' 第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩 增反应条件进行高保真 PCR扩增 A182Y突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并 用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实 施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-A182Y。 将质粒 pRSET-A182Y转化感受态细 菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出 具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-A182Y的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， A182Y突变体的氨基酸序列在第 182位点由 Ala (A) 突变为 Tyr (Y)
[0062] 4、 E231A突变体的制备
[0063] 用如下弓 I物对 Ε231 A-F: 5' CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC
3'和 Ε231 A-R: 5' GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3'， 以实施例 6 第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩 增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并 用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实 施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-E231A。 将质粒 pRSET-E231A转化感受态细 菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出 具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-E231A的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， E231A突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Ala (A)
[0064] 5、 E231Q突变体的制备
[0065] 用如下弓 I物对 E231Q-F: 5' CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3'和 E231Q-R: 5' GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3'， 以实 施例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 P CR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分 离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参 考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-E231Q。 将质粒 pRSET-E231Q转化感受 态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛 选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-E231Q 的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨 基酸序列相比， E231Q突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Gin ( Q) 。
[0066] 6、 D298A突变体的制备
[0067] 用如下弓 I物对 D298A-F: 5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'和 D298A-R:
5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA
3'， 以实施例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应 体系和 PCR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D298A突变体基因， 经 1%琼脂糖 胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接
(具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298A。 将质粒 pRSET-D298A 转化感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉 素） 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET -D298A的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示 的亲本氨基酸序列相比， D298A突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突 变为 Ala (A) 。
[0068] 7、 D298N突变体的制备
[0069] 用如下弓 I物对 D298N-F: 5' GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG 3'和 D298N-R: 5' CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3'， 以实施 例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PC R扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D298N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离 并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考 实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298N。 将质粒 pRSET-D298N转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D298N的 D NA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基 酸序列相比， D298N突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Asn (
N) 。
[0070] 8、 D298E突变体的制备
[0071] 用如下引物对 D298E-F: 5'
GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3'和 D298E-R: 5' GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3'， 以实施例 6第一咅 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D298E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298E。 将质粒 pRSET-D298E转化感受态细菌细胞 E . coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D298E的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D298E突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0072] 9、 D338N突变体的制备
[0073] 用如下引物对 D338N-F: 5'
GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3'， 以实施例 6第一 部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反 应条件进行高保真 PCR扩增 D338N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商 业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6 第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D338N。 将质粒 pRSET-D338N转化感受态细菌细 胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有 烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D338N的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列 相比， D338N突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Asn (N) 。
[0074] 10、 D338E突变体的制备 [0075] 用如下弓 I物对 D338E-F: 5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC
3'和 D338E-R: 5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3'， 以实施例 6第 一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增 反应条件进行高保真 PCR扩增 D338E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用 商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施 例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D338E。 将质粒 pRSET-D338E转化感受态细菌 细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具 有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D338E的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， D338E突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0076] 11、 D377A突变体的制备
[0077] 用如下弓 I物对 D377A-F: 5' CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC
3'和 D377A-R: 5' GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3'， 以实施例 6第一咅 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D377A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D377A。 将质粒 pRSET-D377A转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟 酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377A的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相 比， D377A突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Ala (A) 。
[0078] 12、 D377N突变体的制备
[0079] 用如下引物对 D377N-F: 5'
GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3'， 以实施例 6第一咅吩 构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应条 件进行高保真 PCR扩增 D377N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试 剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第一 部分） ， 得到质粒 pRSET-D377N。 将质粒 pRSET-D377N转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377N的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D377N突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Asn (N) 。
[0080] 13、 D377E突变体的制备
[0081] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG
3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D377E。 将质粒 pRSET-D377E转化感受态细菌细胞 E . coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377E的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D377E突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0082] 14、 E231Q/D338E突变体的制备
[0083] 用如下引物对 D338E-F: 5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC
3'和 D338E-R: 5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3', 以实施例 6 第二部分的第 5小节构建的质粒 pRSET-E231Q为模板， 利用上述 PCR扩增反应体 系和 PCR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D338E突变体基因， 经 1%琼 脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A 连接 （具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-21。 将质粒 pRSET-21转 化感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素 ) 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-2 1的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本 氨基酸序列相比， E231Q/D338E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突 变为 Gin (Q) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。 [0084] 15、 E231Q/D377E突变体的制备
[0085] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG
3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 5小节构建的质粒 pRSET-E231Q为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PC R扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电 泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具 体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-22。 将质粒 pRSET-22转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-22的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， E231Q/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Gin (Q) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0086] 16、 D338E/D377E突变体的制备
[0087] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG
3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 10小节构建的质粒 pRSET-D338E为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 P CR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶 电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （ 具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-23。 将质粒 pRSET-23转化感受 态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛 选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-23的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 G1 u (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0088] 17、 E231Q/D338E/D377E突变体的制备
[0089] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG
3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 14小节构建的质粒 pRSET-21为模板， 禾 上述 PCR扩增反应体系和 PCR 扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂 糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连 接 （具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-31。 将质粒 pRSET-31转化 感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-31 的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨 基酸序列相比， E231Q/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E ) 突变为 Gin (Q) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0090] 18、 E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的制备
[0091] 用如下引物对 D298A-F: 5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'和 D298A-R ： 5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3', 以实施例 6第二部分的第 17小节 构建的质粒 pRSET-31为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应条件 进行高保真 PCR扩增 E231Q/D298A/D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电 泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具 体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-41。 将质粒 pRSET-41转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-41的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E ) 突变为 Gin (Q) 、 在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Ala (A) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。
[0092] 三、 酶的提取
[0093] 将含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的质粒 pRSET-nampt以及含烟酰胺磷酸核 糖转移酶突变体基因的质粒 pRSET-F180A、 pRSET-F180W、 pRSET-A182Y、 pR SET-E231A、 pRSET-E231Q^ pRSET-D298A、 pRSET-D298N、 pRSET-D298E、 pRSET-D338N、 pRSET-D338E、 pRSET-D377A、 pRSET-D377N、 pRSET-D377E 、 pRSET-21、 pRSET-22、 pRSET-23、 pRSET-31以及 pRSET-41分别转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上 37°C 培养 24小吋。 接种单个克隆于 50毫升 LB液体培养基 （含 50
mg/L卡那霉素） 中于 30°C培养 16-20小吋。 离心收集菌体， 称量等同量菌体按照 1 :4比例悬浮破菌液 （pH
7.5) 中。 然后用超声波裂解细菌细胞。 离心 （4-10°C， 12000rpm, 10分钟） 并 收集上清液， 即分别得到亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及一系列烟酰胺磷酸核 糖转移酶突变体的上清蛋白溶液， 可用于酶活性的测定以及烟酰胺单核苷酸的 的生物催化制备。
[0094] 四、 酶活性的测定
[0095] 配制底物溶液： 含 60mM的烟酰胺、 25mM的 PRPP、 18mM的 MgCl 2
、 15mM的 KC1和 lOOmM的 Tris buffer缓冲液， 调 pH至 7.5。 分别取底物溶液 900微 升各 19份， 然后分别加入 100微升等浓度的实施例 6第三部分得到的亲本烟酰胺 磷酸核糖转移酶以及各烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液， 于 37°C进 行 10分钟反应， 加入 10(VL25<¾三氯乙酸终止反应。 通过高效液相色谱仪 （HPL C) 测定反应液中烟酰胺单核苷酸 （NMN) 的含量， 并计算每种酶的比酶活， 以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的比酶活为参比 100， 亲本及各突变体的相对比活 性如表 1所示。
[0096] 表 1烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活
[表 1]
[0097] 五、 烟酰胺单核苷酸的制备
[0098] 向反应釜中加入底物溶液， 含 75mM的烟酰胺、 75mM的焦磷酸二钠、 50mM的 AMP、 15mM的 MgCl 2 、 10mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然后加入以下催 化用酶： 实施例 6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体 （F180A) 的上 清蛋白溶液 10ml /L底物溶液， 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 20g/L底物溶液。 搅拌均匀 后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 37°C， 维持 pH值为 7.0-8.0。 反应 5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NMN49.6mM
) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。

Claims (11)

  1. 权利要求书
  2. [权利要求 1] 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 以烟酰胺、 焦磷酸或 其盐和 AMP为原料， 在烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转 移酶的催化作用下发生反应， 制得烟酰胺单核苷酸。
  3. [权利要求 2] 根据权利要求 1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述反应在温度为 30-50°C， pH值为 6.5-8.5的条件下进行。
  4. [权利要求 3] 根据权利要求 1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述反应在 Mg <sup>2+</sup>和 K +存在的条件下进行。
  5. [权利要求 4] 根据权利要求 1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述反应在 Tris-HCl缓冲液中进行。
  6. [权利要求 5] 根据权利要求 1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述烟酰胺的浓度为 l-150mM， 所述焦磷酸或其盐的浓度为 l-100mM， 所述 AMP的浓度为 l-100mM。
  7. [权利要求 6] 根据权利要求 1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述原料中烟酰胺、 焦磷酸或其盐、 AMP的摩尔比为 1-4:1-2:1。
  8. [权利要求 7] 根据权利要求 6所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 所 述原料中烟酰胺、 焦磷酸或其盐、 AMP的摩尔比为 2:1.5:1。
  9. [权利要求 8] 根据权利要求 1至 7任一项所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征 在于所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为如下 ) 或 （b) 的蛋白质：
    (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示的蛋白质，
    (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个 氨基酸并且以烟酰胺和 PRPP为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO
    ： 2所示的亲本高的烟酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由 （a) 衍生的 蛋白质。
  10. [权利要求 9] 根据权利要求 8所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于所述 烟酰胺磷酸核糖转移酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在 选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 180位、 第 182位、 第 231位、 第 298位、 第 338位以及第 377位。 [权利要求 10] 根据权利要求 9所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于所述 烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述突变： F180A、 F180W、 Al 82Y、 Ε231Α、 E231Q、 D298A、 D298N、 D298E、 D338N、 D338E、 D377A、 D377N以及 D377E。
  11. [权利要求 9] 根据权利要求 8所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于所述 烟酰胺磷酸核糖转移酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在 选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 180位、 第 182位、 第 231位、 第 298位、 第 338位以及第 377位。 [权利要求 10] 根据权利要求 9所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法， 其特征在于所述 烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述突变： F180A、 F180W、 Al 82Y、 Ε231Α、 E231Q、 D298A、 D298N、 D298E、 D338N、 D338E、 D377A、 D377N以及 D377E。
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