CN110129305B

CN110129305B - 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体

Info

Publication number: CN110129305B
Application number: CN201910450365.7A
Authority: CN
Inventors: 彭友兵
Original assignee: Hebei Kenny Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Kenny Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110129305A

Abstract

本发明公开了一种头孢菌素C酰化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。相比假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL‑7‑ACA酰化酶SEQ ID NO:1，酶活力提高了52倍，可用于一步酶法生产7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)，当纯酶催化头孢菌素C反应时，产物生成率超过97％。

Description

一种用于制备7-ACA的头孢菌素C酰化酶突变体

技术领域

本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体、及其用于一步酶法生产7-ACA(7-氨基头孢烷酸)的用途。

背景技术

目前头孢类抗生素是应用最广泛的β-内酰胺类抗生素，占到了全球抗生素市场40％的份额。该类抗生素大部分是通过7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，简称为7-ACA)合成的7-ACA衍生物，7-ACA是重要的母核。

7-ACA制备的方法有两种，第一种方法是化学合成法，但由于化学合成法工艺复杂、能耗高，污染严重，近些年来，化学合成法基本已被生物酶法所取代。第二种方法是生物酶法，即采用生物酶催化裂解头孢菌素C(Cephalosporin C，简称为CPC)，脱去分子侧链而获得。生物酶法又分为两步酶法和一步酶法。两步酶法主要用到D-氨基酸氧化酶(简称为DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(简称为GL-7-ACA)酰化酶，CPC在DAAO的作用下生成GL-7-ACA，然后再在GL-7-ACA酰化酶的作用下生成7-ACA。该方法中DAAO催化反应的副产物H₂O₂对CPC有降解作用，且为两步催化反应，步骤较为复杂，成本相对较高，因此工业化程度一直不高。一步酶法制备7-ACA，即利用CPC酰化酶催化CPC脱去侧链，生成7-ACA。自然界中发现的天然CPC酰化酶(头孢菌素C酰化酶)最适底物一般都是GL-7-ACA、而不是CPC本身，它们对CPC底物的酶活力均比较低，只有以GL-7-ACA为底物时催化活力的2-4％。迄今为止，自然界尚未发现催化活力高的野生型CPC酰化酶，无法满足工业生产的要求。利用基因工程来改造野生型CPC酰化酶、或者野生型GL-7-ACA酰化酶的氨基酸序列或空间折叠结构从而提高酶活力或者性质是一种研究开发趋势。

发明内容

为了克服现有一步酶法生产7-ACA技术中的上述缺陷，得到酶活性更高的CPC酰化酶，本发明利用基因工程技术来对假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶进行改造和筛选，构建高酶活性的突变体头孢菌素C酰化酶(简称CPC酰化酶)，从而有利于实现一步酶法生产7-ACA的工业化。

为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对假单胞菌GK16(Pseudomonassp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶(SEQ ID NO:1)进行改造，获得以CPC作为特异性底物的高酶活的CPC酰化酶，以便高效地将CPC催化生成7-ACA。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产7-ACA的高酶活力的CPC酰化酶。

本发明的第二个目的在于提供编码上述CPC酰化酶的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

本发明的第五个目的在于提供上述CPC酰化酶或微生物在生产7-ACA中的用途。

为了达到上述目的，本发明提供如下头孢菌素C酰化酶：

一种头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第201位的F替换为S的突变体，其氨基酸序列为：

MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYSTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTVNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTAVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；或者

SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第201位的F替换为S、第215位的I替换为V、第228位的F替换为V、第240位的V替换为F、第323位的Y替换为T的突变体，其氨基酸序列为：

MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYSTYYEAHLVTPDFEVYGATQIGLPVIRVAFNQRMGITNTFNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTAVAVRVAGLDRPGMLEQTFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP。

优选上述头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

一种编码上述头孢菌素C酰化酶的基因。

优选地，编码上述头孢菌素C酰化酶SEQ ID NO:4的基因可以是下述核苷酸序列：

ATGGAACCGACCTCTACCCCGCAGGCTCCGATCGCTGCTTACAAACCGCGTTCTAACGAAATCCTGTGGGACGGTTACGGTGTTCCGCACATCTACGGTGTTGACGCTCCATCGGCGTTCTACGGTTACGGCTGGGCTCAGGCTCGTTCTCACGGTGACAACATCCTGCGTCTGTACGGTGAAGCTCGTGGTAAAGGTGCTGAATACTGGGGTCCGGACTACGAACAGACCACCGTTTGGCTGCTGACCAACGGTGTTCCGGAACGTGCTCAGCAGTGGTACGCTCAGCAGTCTCCGGACTTCCGTGCTAACCTGGACGCTTTCGCTGCTGGTATCAACGCTTACGCTCAGCAGAACCCGGACGACATCTCTCCGGAAGTTCGTCAAGTTCTGCCGGTAAGCGGTGCTGACGTTGTTGCTCACGCTCACCGTCTGATGAACTTCCTGTACGTTGCTTCTCCGGGTCGTACCCTGGGTGAAGGTGACCCGCCGGACCTGGCTGACCAGGGTTCTAACTCTTGGGCTGTTGCTCCGGGTAAAACCGCTAACGGTAACGCTCTGCTGCTGCAGAACCCGCACCTGTCTTGGACCACCGACTACTCTACCTACTACGAAGCTCACCTGGTTACCCCGGACTTCGAAGTTTACGGTGCTACCCAGATCGGTCTGCCGGTTATCCGTGTTGCTTTCAACCAGCGTATGGGTATCACCAACACCTTCAACGGTATGGTTGGTGCTACCAACTACCGTCTGACCCTGCAGGACGGTGGTTACCTGTACGACGGTCAGGTTCGTCCGTTCGAACGTCGTCAGGCTTCTTACCGTCTGCGTCAGGCTGACGGTACCACCGTTGACAAACCGCTGGAAATCCGTTCTTCTGTTCACGGTCCGGTTTTCGAACGTGCTGACGGTACCGCTGTTGCTGTTCGTGTTGCTGGTCTGGACCGTCCGGGTATGCTGGAACAGACCTTCGACATGATCACCGCTGACTCTTTCGACGACTACGAAGCTGCTCTGGCTCGTATGCAGGTTCCGACCTTCAACATCGTTTACGCTGACCGTGAAGGTACCATCAACTACTCTTTCAACGGTGTTGCTCCGAAACGTGCTGAAGGTGACATCGCTTTCTGGCAGGGTCTGGTTCCGGGTGACTCTTCTCGTTACCTGTGGACCGAAACCCACCCGCTGGACGACCTGCCGCGTGTTACCAACCCGCCAGGCGGCTTCGTTCAGAACTCGAACGACCCGCCGTGGACCCCGACCTGGCCGGTTACCTACACCCCGAAAGACTTCCCGTCTTACCTGGCTCCGCAGACCCCGCACTCTCTGCGTGCTCAGCAGTCTGTTCGTCTGATGTCTGAAAACGACGACCTGACTCTCGAAAGGTTCATGGCTCTGCAGCTGTCTCACCGTGCTGTTATGGCTGACCGTACCCTGCCGGACCTGATCCCGGCTGCTCTGATCGACCCGGACCCGGAAGTTCAGGCTGCTGCTCGTCTGCTGGCTGCTTGGGACCGTGAATTCACCTCTGACTCTCGTGCTGCTCTGCTGTTCGAAGAATGGGCTCGTCTGTTCGCTGGTCAGAACTTCGCTGGTCAGGCTGGTTTCGCTACCCCGTGGTCTCTCGACAAGCCGGTAAGCACCCCGTACGGTGTTCGTGACCCGAAAGCTGCTGTTGACCAGCTGCGTACCGCTATCGCTAACACCAAACGTAAATACGGTGCTATCGACCGTCCGTTCGGTGACGCTTCTCGTATGATCCTGAACGACGTTAACGTTCCGGGTGCTGCTGGTTACGGTAACCTGGGTTCTTTCCGTGTTTTCACCTGGTCTGACCCGGACGAAAACGGTGTTCGTACCCCGGTTCACGGTGAAACCTGGGTTGCTATGATCGAATTCTCTACCCCGGTTCGTGCTTACGGTCTGATGTCTTACGGTAACTCTCGTCAGCCGGGTACCACCCACTACTCTGACCAGATCGAACGTGTTTCTCGTGCTGACTTCCGTGAACTGCTGCTGCGTCGTGAACAGGTTGAAGCTGCTGTTCAGGAACGTACCCCGTTCAACTTCAAACCG(SEQ ID NO:5)。

一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET28a，但并不受限于此。

一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述头孢菌素C酰化酶。

优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

上述头孢菌素C酰化酶或者上述微生物可以用于生产7-ACA、尤其是一步酶法生产7-ACA。

在生产7-ACA中，以头孢菌素C为底物原料，用上述头孢菌素C酰化酶或者微生物作为催化剂来催化反应。

作为一种可选的实施方式，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，作为酰化反应的催化剂。

生产7-ACA可采用常规的工艺条件，比如，反应体系中头孢菌素C(CPC)的浓度可选择1～3wt％，优选2wt％；反应温度选择10～37℃，优选12～35℃，更优选12～30℃，更优选14～25℃，最优选15±0.5℃。

相较野生型GL-7-ACA酰化酶SEQ ID NO:1，本发明构建的突变体CPC酰化酶SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4催化CPC反应的酶活性有明显提高，比如SEQ ID NO:4的酶活力提高了52倍。当CPC酰化酶突变体应用于一步酶法生产7-ACA时，7-ACA生成率可达97％，具有工业化开发和应用前景。

附图说明

图1为用于表达野生型GL-7-ACA酰化酶的重组质粒pET28a-GK-wt的结构示意图。

图2为野生型CPC酰化酶和突变体的SDS-PAGE凝胶电泳照片。图中泳道1：野生型GL-7-ACA酰化酶；泳道2：CPC酰化酶突变体SEQ ID NO:4；泳道3：蛋白质分子量Marker。

图3为CPC酰化酶SEQ ID NO:4催化底物头孢菌素C反应生成7-ACA的HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明构建的头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)是野生型戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA酰化酶)SEQ ID NO:1的突变体，是SEQ ID NO:1序列中个别氨基酸发生替换后的新蛋白质。因此，本文中的术语“头孢菌素C酰化酶”或“CPC酰化酶”也可以称为“头孢菌素C酰化酶突变体”或“CPC酰化酶突变体”、“突变体头孢菌素C酰化酶”或“突变体CPC酰化酶”、“戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶突变体”或“GL-7-ACA酰化酶突变体”、“突变体戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶”或“突变体GL-7-ACA酰化酶”，它们表示相同的意义，可以互换使用。

为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

丙氨酸	Alanine	A或Ala	脂肪族类
				精氨酸	Arginine	R或Arg	碱性氨基酸类
天冬酰胺	Asparagine	N或Asn	酰胺类
				天冬氨酸	Aspartic acid	D或Asp	酸性氨基酸类
半胱氨酸	Cysteine	C或Cys	含硫类
				谷氨酰胺	Glutamine	Q或Gln	酰胺类
谷氨酸	Glutamic acid	E或Glu	酸性氨基酸类
				甘氨酸	Glycine	G或Gly	脂肪族类
组氨酸	Histidine	H或His	碱性氨基酸类
				异亮氨酸	Isoleucine	I或Ile	脂肪族类
亮氨酸	Leucine	L或Leu	脂肪族类
				赖氨酸	Lysine	K或Lys	碱性氨基酸类
蛋氨酸	Methionine	M或Met	含硫类
				苯丙氨酸	Phenylalanine	F或Phe	芳香族类
脯氨酸	Proline	P或Pro	亚氨基酸
				丝氨酸	Serine	S或Ser	羟基类
苏氨酸	Threonine	T或Thr	羟基类
				色氨酸	Tryptophan	W或Trp	芳香族类
酪氨酸	Tyrosine	Y或Tyr	芳香族类
				缬氨酸	Valine	V或Val	脂肪族类

作为构建头孢菌素C酰化酶突变体的基础模板，假单胞菌Pseudomonas sp.GK16来源的野生型GL-7-ACA酰化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。其编码基因是序列表中的SEQID NO:2。

为了获得酶活性更高的CPC酰化酶，本发明对野生酶SEQ ID NO:1的基因序列SEQID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个氨基酸201位苯丙氨酸位点取代的突变体氨基酸序列，然后采用组合突变的技术，将包括201位苯丙氨酸、215位的异亮氨酸、第228位苯丙氨酸、第240位的缬氨酸、第323位的酪氨酸进行组合突变，获得本发明中具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的突变体。

其中，SEQ ID NO:3是两个氨基酸序列SEQ ID NO:3-4的共同序列，这两个氨基酸序列都是在SEQ ID NO:1的基础上进行1个、或5个氨基酸的替换而获得的突变体，这些突变体氨基酸序列保持了99％以上的同源性。

在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型GL-7-ACA酰化酶SEQ ID NO:1。为了与突变体相区别和表述方便起见，在本发明中可以将野生型GL-7-ACA酰化酶称为“野生(型)头孢菌素C酰化酶”或者“野生(型)CPC酰化酶”。

本发明的CPC酰化酶突变体的氨基酸数量只有692个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以使任何适合表达CPC酰化酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产7-ACA时，本发明的CPC酰化酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的CPC酰化酶分离纯化技术也是本领域技术人员所熟知的。

作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述CPC酰化酶的微生物菌体作为酶催化反应的生物催化剂。微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，因为当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物头孢菌素C和反应产物7-ACA都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

底物CPC和产物7-ACA的HPLC测定条件：

Waters symmetry C18，5μm，4.6×250mm；检测波长254nm；流动相A：20mM醋酸钠(pH5.5)；流动相B：乙腈；97％流动相A：3％流动相B；温度25℃。

实施例1野生型GL-7-ACA酰化酶基因重组大肠杆菌的构建

对于Pseudomonas sp.GK16来源的GL-7-ACA酰化酶，以SEQ ID NO:1为基础进行密码子优化，全基因合成基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nco I和XhoI，亚克隆到载体pET28a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET28a-GK-wt，其结构如图1所示。将重组质粒pET28a-GK-wt转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型GL-7-ACA酰化酶的重组大肠杆菌GK-wt。

实施例2通过易错PCR法构建随机突变点库及筛选

2.1易错PCR法构建随机突变点库

以野生型酶的基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物GK-F为5’-ATGGAACCGACCTCTACCCCGCAGGCTC-3’，反向引物GK-R为5’-CGGTTTGAAGTTGAACGGGGTACG-3’。

50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板pET28a-GK-wt，30pmol一对引物GK-F和GK-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(fermentas公司)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

2.2突变体库的高通量筛选

选取突变体库中的转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，置于-20℃冷冻4h，室温融化30min。加入100μL含1mg/mL溶菌酶的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μL上清，用于CPC活力测定。

2.3高通量CPC酰化酶活力测定

酶活力定义：在37℃下每分钟催化底物CPC产生1微摩尔(μmol)7-ACA所需要的酶量定义为1个单位(U)。

将上述步骤2.2中处理的上清20μL加入10μL底物反应液(2％头孢菌素C钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0))，在37℃的条件下反应过夜，加入200μL终止反应液(0.05MNaOH，20％冰醋酸)，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，加入40μL显色液(0.5％PDAB甲醇溶液)，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度。

在随机突变库，通过对约6000个突变体克隆筛选，结果显示SEQ ID NO:1中至少第169、201、215、228、240、258、323、404位等多个位点的氨基酸突变可以明显改变SEQ ID NO:1的酶活力，有提高、也有降低。例如，F201S这个突变(菌株编号GK-M1)能够提高CPC酰化酶的酶活力近6倍。

表2随机突变菌在37℃下的发酵液相对比活结果

菌种编号	突变位点	SEQ ID NO:	发酵液相对比活
				GK-wt	-	1	1.0
GK-M1	F201S	3	6.8

实施例3通过定点组合突变技术进行菌种构建

尝试了数十种定点突变的组合方案，不同的组合效果各有差异，相对于SEQ IDNO:1的酶活力有提高、也有降低。例如，以GK-M1菌株(表达F201S突变体)的质粒为模板，将I215V、F228V、V240F、Y323T这四个点通过定点突变组合技术构建突变菌株GK-M2(表达F201S、I215V、F228V、V240 F、Y323T突变体)。构建过程中所用的引物见表3。

表3、引物列表

3.1通过定点突变组合技术构建突变菌株

以215-F1和228-R1为引物对，直接进行A片段扩增，然后以GK-M1质粒为模板，以240-F2和323-R2为引物对进行B片段PCR扩增，再以215-F1和323-R2为引物对通过A和B片段的over-lapping PCR扩增出大片段A+B，然后以A+B大片段为引物进行MegaPrimerPCR，构建定点突变组合菌株GK-M2。

A片段50μL PCR反应体系包括：100pmol的引物对，1×KOD plus buffer，0.2mMdNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

A片段PCR反应条件为：95℃1min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp；30个循环；68℃10min。PCR产物回收片段A。

B片段50μL PCR反应体系包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1×KODplusbuffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

B片段PCR反应条件为：95℃1min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp；30个循环；68℃10min。胶回收片段B。

以片段A和片段B为模板，以215-F1和323-R2为引物进行第二轮over-lappingPCR，获得片段A+B，切胶回收。

PCR反应条件为：95℃3min；98℃10s，60℃30s，68℃1min/kbp；25个循环；68℃10min。

以片段A+B作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，化学转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，对阳性克隆菌株GK-M2进行摇瓶培养，抽提质粒，质粒测序确定组合突变菌株构建成功。

3.2摇瓶发酵

从GK-M2的TB培养平板上挑取单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD₆₀₀ 0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。

3.3酶的提取

菌体用50mL平衡缓冲液(50mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH8.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体于4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。上清以1mL/min的速率加入含10mL Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有30mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质。最后用含有500mM咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值洗脱液。

洗脱液经截留分子量为10kDa的超滤管进行脱盐处理，得纯酶。通过SDS-PAGE凝胶电泳对CPC酰化酶突变体进行分析，结果见图2。其中泳道2是CPC酰化酶突变体SEQID NO:4的蛋白质条带。

3.4纯酶比活力测定

按照步骤2.3中的方法测定酶活力。

将步骤3.3中的脱盐溶液20μL加入10μL底物反应液，在37℃的条件下反应5min后，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，加入40μL显色液，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度，与7-ACA定量标准曲线进行比较定量。

同时采用Thermo Scientific公司的BCA Protein Assay Kit试剂盒测定纯酶的蛋白浓度，从而获得纯酶的比活力。

表4、CPC酰化酶突变体SEQ ID NO:4的酶活力测定结果

菌种编号	突变位点	氨基酸序列号	相对比活
				GK-WT	-	1	1.0
GK-M2	F201S、I215V、F228V、V240 F、Y323T	4	53

由表4可以看出，相比野生型酶SEQ ID NO:1，本发明的头孢菌素C酰化酶突变体SEQ ID NO:4的酶活力提高了52倍。

实施例4一步酶法生产7-ACA

将头孢菌素C钠盐溶解于水中至2wt％，加入10mg/ml上述步骤3.3中制备的CPC酰化酶SEQ ID NO:4，于15℃、pH8.0下搅拌反应。反应过程中控制温度15±0.5℃，pH 8.0±0.2，反应2个小时。通过HPLC检测反应样品，结果参见图3。

HPLC检测结果显示，在反应2个小时后，反应体系中头孢菌素C钠盐的转化率超过了97％。

综上所述，相比野生型GL-7-ACA酰化酶SEQ ID NO:1，本发明构建的CPC酰化酶突变体SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4催化头孢菌素C4反应生成7-ACA的酶活力有了明显提高，其中SEQ ID NO:4提高了52倍，具有工业化开发和应用前景。

序列表

<110> 河北凯恩利生物技术有限公司

<120> 一种用于制备7-ACA的头孢菌素C酰化酶突变体

<130> SHPI1910290

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> Pseudomonas sp. GK16

<400> 1

Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro

1 5 10 15

Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr

20 25 30

Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala

35 40 45

Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly

50 55 60

Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp

65 70 75 80

Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln

85 90 95

Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile

100 105 110

Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg

115 120 125

Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg

130 135 140

Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu

145 150 155 160

Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro

180 185 190

His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu

195 200 205

Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro

210 215 220

Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val

225 230 235 240

Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly

245 250 255

Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala

260 265 270

Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu

275 280 285

Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu

305 310 315 320

Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu

325 330 335

Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala

340 345 350

Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys

355 360 365

Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp

370 375 380

Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro

385 390 395 400

Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro

405 410 415

Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro

420 425 430

Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser

435 440 445

Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met

450 455 460

Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro

465 470 475 480

Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser

500 505 510

Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln

515 520 525

Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys

530 535 540

Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp

545 550 555 560

Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile

565 570 575

Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn

580 585 590

Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe

595 600 605

Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly

610 615 620

Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr

625 630 635 640

Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr

645 650 655

Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu

660 665 670

Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe

675 680 685

Asn Phe Lys Pro

690

<210> 2

<211> 2076

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggaaccga cctctacccc gcaggctccg atcgctgctt acaaaccgcg ttctaacgaa 60

atcctgtggg acggttacgg tgttccgcac atctacggtg ttgacgctcc atcggcgttc 120

tacggttacg gctgggctca ggctcgttct cacggtgaca acatcctgcg tctgtacggt 180

gaagctcgtg gtaaaggtgc tgaatactgg ggtccggact acgaacagac caccgtttgg 240

ctgctgacca acggtgttcc ggaacgtgct cagcagtggt acgctcagca gtctccggac 300

ttccgtgcta acctggacgc tttcgctgct ggtatcaacg cttacgctca gcagaacccg 360

gacgacatct ctccggaagt tcgtcaagtt ctgccggtaa gcggtgctga cgttgttgct 420

cacgctcacc gtctgatgaa cttcctgtac gttgcttctc cgggtcgtac cctgggtgaa 480

ggtgacccgc cggacctggc tgaccagggt tctaactctt gggctgttgc tccgggtaaa 540

accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aacccgcacc tgtcttggac caccgactac 600

tttacctact acgaagctca cctggttacc ccggacttcg aaatttacgg tgctacccag 660

atcggtctgc cggttatccg ttttgctttc aaccagcgta tgggtatcac caacaccgtc 720

aacggtatgg ttggtgctac caactaccgt ctgaccctgc aggacggtgg ttacctgtac 780

gacggtcagg ttcgtccgtt cgaacgtcgt caggcttctt accgtctgcg tcaggctgac 840

ggtaccaccg ttgacaaacc gctggaaatc cgttcttctg ttcacggtcc ggttttcgaa 900

cgtgctgacg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggaccgtcc gggtatgctg 960

gaacagtact tcgacatgat caccgctgac tctttcgacg actacgaagc tgctctggct 1020

cgtatgcagg ttccgacctt caacatcgtt tacgctgacc gtgaaggtac catcaactac 1080

tctttcaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttctg gcagggtctg 1140

gttccgggtg actcttctcg ttacctgtgg accgaaaccc acccgctgga cgacctgccg 1200

cgtgttacca acccgccagg cggcttcgtt cagaactcga acgacccgcc gtggaccccg 1260

acctggccgg ttacctacac cccgaaagac ttcccgtctt acctggctcc gcagaccccg 1320

cactctctgc gtgctcagca gtctgttcgt ctgatgtctg aaaacgacga cctgactctc 1380

gaaaggttca tggctctgca gctgtctcac cgtgctgtta tggctgaccg taccctgccg 1440

gacctgatcc cggctgctct gatcgacccg gacccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500

ctggctgctt gggaccgtga attcacctct gactctcgtg ctgctctgct gttcgaagaa 1560

tgggctcgtc tgttcgctgg tcagaacttc gctggtcagg ctggtttcgc taccccgtgg 1620

tctctcgaca agccggtaag caccccgtac ggtgttcgtg acccgaaagc tgctgttgac 1680

cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatacg gtgctatcga ccgtccgttc 1740

ggtgacgctt ctcgtatgat cctgaacgac gttaacgttc cgggtgctgc tggttacggt 1800

aacctgggtt ctttccgtgt tttcacctgg tctgacccgg acgaaaacgg tgttcgtacc 1860

ccggttcacg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattct ctaccccggt tcgtgcttac 1920

ggtctgatgt cttacggtaa ctctcgtcag ccgggtacca cccactactc tgaccagatc 1980

gaacgtgttt ctcgtgctga cttccgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040

gctgttcagg aacgtacccc gttcaacttc aaaccg 2076

<210> 3

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro

1 5 10 15

Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr

20 25 30

Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala

35 40 45

Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly

50 55 60

Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp

65 70 75 80

Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln

85 90 95

Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile

100 105 110

Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg

115 120 125

Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg

130 135 140

Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu

145 150 155 160

Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro

180 185 190

His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Ser Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu

195 200 205

Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro

210 215 220

Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val

225 230 235 240

Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly

245 250 255

Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala

260 265 270

Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu

275 280 285

Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu

305 310 315 320

Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu

325 330 335

Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala

340 345 350

Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys

355 360 365

Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp

370 375 380

Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro

385 390 395 400

Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro

405 410 415

Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro

420 425 430

Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser

435 440 445

Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met

450 455 460

Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro

465 470 475 480

Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser

500 505 510

Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln

515 520 525

Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys

530 535 540

Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp

545 550 555 560

Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile

565 570 575

Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn

580 585 590

Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe

595 600 605

Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly

610 615 620

Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr

625 630 635 640

Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr

645 650 655

Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu

660 665 670

Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe

675 680 685

Asn Phe Lys Pro

690

<210> 4

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro

1 5 10 15

Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr

20 25 30

Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala

35 40 45

Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly

50 55 60

Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp

65 70 75 80

Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln

85 90 95

Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile

100 105 110

Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg

115 120 125

Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg

130 135 140

Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu

145 150 155 160

Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro

180 185 190

His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Ser Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu

195 200 205

Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro

210 215 220

Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Phe

225 230 235 240

Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly

245 250 255

Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala

260 265 270

Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu

275 280 285

Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu

305 310 315 320

Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu

325 330 335

Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala

340 345 350

Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys

355 360 365

Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp

370 375 380

Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro

385 390 395 400

Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro

405 410 415

Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro

420 425 430

Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser

435 440 445

Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met

450 455 460

Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro

465 470 475 480

Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser

500 505 510

Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln

515 520 525

Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys

530 535 540

Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp

545 550 555 560

Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile

565 570 575

Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn

580 585 590

Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe

595 600 605

Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly

610 615 620

Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr

625 630 635 640

Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr

645 650 655

Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu

660 665 670

Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe

675 680 685

Asn Phe Lys Pro

690

<210> 5

<211> 2076

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggaaccga cctctacccc gcaggctccg atcgctgctt acaaaccgcg ttctaacgaa 60

atcctgtggg acggttacgg tgttccgcac atctacggtg ttgacgctcc atcggcgttc 120

tacggttacg gctgggctca ggctcgttct cacggtgaca acatcctgcg tctgtacggt 180

gaagctcgtg gtaaaggtgc tgaatactgg ggtccggact acgaacagac caccgtttgg 240

ctgctgacca acggtgttcc ggaacgtgct cagcagtggt acgctcagca gtctccggac 300

ttccgtgcta acctggacgc tttcgctgct ggtatcaacg cttacgctca gcagaacccg 360

gacgacatct ctccggaagt tcgtcaagtt ctgccggtaa gcggtgctga cgttgttgct 420

cacgctcacc gtctgatgaa cttcctgtac gttgcttctc cgggtcgtac cctgggtgaa 480

ggtgacccgc cggacctggc tgaccagggt tctaactctt gggctgttgc tccgggtaaa 540

accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aacccgcacc tgtcttggac caccgactac 600

tctacctact acgaagctca cctggttacc ccggacttcg aagtttacgg tgctacccag 660

atcggtctgc cggttatccg tgttgctttc aaccagcgta tgggtatcac caacaccttc 720

aacggtatgg ttggtgctac caactaccgt ctgaccctgc aggacggtgg ttacctgtac 780

gacggtcagg ttcgtccgtt cgaacgtcgt caggcttctt accgtctgcg tcaggctgac 840

ggtaccaccg ttgacaaacc gctggaaatc cgttcttctg ttcacggtcc ggttttcgaa 900

cgtgctgacg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggaccgtcc gggtatgctg 960

gaacagacct tcgacatgat caccgctgac tctttcgacg actacgaagc tgctctggct 1020

cgtatgcagg ttccgacctt caacatcgtt tacgctgacc gtgaaggtac catcaactac 1080

tctttcaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttctg gcagggtctg 1140

gttccgggtg actcttctcg ttacctgtgg accgaaaccc acccgctgga cgacctgccg 1200

cgtgttacca acccgccagg cggcttcgtt cagaactcga acgacccgcc gtggaccccg 1260

acctggccgg ttacctacac cccgaaagac ttcccgtctt acctggctcc gcagaccccg 1320

cactctctgc gtgctcagca gtctgttcgt ctgatgtctg aaaacgacga cctgactctc 1380

gaaaggttca tggctctgca gctgtctcac cgtgctgtta tggctgaccg taccctgccg 1440

gacctgatcc cggctgctct gatcgacccg gacccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500

ctggctgctt gggaccgtga attcacctct gactctcgtg ctgctctgct gttcgaagaa 1560

tgggctcgtc tgttcgctgg tcagaacttc gctggtcagg ctggtttcgc taccccgtgg 1620

tctctcgaca agccggtaag caccccgtac ggtgttcgtg acccgaaagc tgctgttgac 1680

cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatacg gtgctatcga ccgtccgttc 1740

ggtgacgctt ctcgtatgat cctgaacgac gttaacgttc cgggtgctgc tggttacggt 1800

aacctgggtt ctttccgtgt tttcacctgg tctgacccgg acgaaaacgg tgttcgtacc 1860

ccggttcacg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattct ctaccccggt tcgtgcttac 1920

ggtctgatgt cttacggtaa ctctcgtcag ccgggtacca cccactactc tgaccagatc 1980

gaacgtgttt ctcgtgctga cttccgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040

gctgttcagg aacgtacccc gttcaacttc aaaccg 2076

Claims

1.一种头孢菌素C酰化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

2.编码如权利要求1所述头孢菌素C酰化酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列为SEQ ID NO:5。

4.包含如权利要求3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述头孢菌素C酰化酶或者如权利要求6所述微生物在生产7-ACA中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以头孢菌素C为底物、用权利要求1所述头孢菌素C酰化酶或者如权利要求6所述微生物催化生产7-ACA。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中头孢菌素C的浓度为1-3wt％。