CN101177688A

CN101177688A - 突变青霉素g酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株

Info

Publication number: CN101177688A
Application number: CNA2006101180420A
Authority: CN
Inventors: 黄鹤; 张磐; 王金刚; 袁中一; 杨晟; 姜卫红
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Weiqida Pharmaceutical Co., Ltd. of China National Pharmaceutical Industry Corporation Ltd.
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2006-11-08
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2026-11-08
Also published as: CN101177688B

Abstract

本发明通过基因定点突变的方法获得的青霉素G酰化酶合成性能提高的基因、突变质粒、工程菌，并可在将工程菌发酵纯化后，获得青霉素G酰化酶合成性能提高的突变酶。本发明先用Kpn I和Pst I双酶切pUC18，然后用T4 polymerase补平，自连得到pZ01；用EcoR I酶切pZ01，再和同样用EcoR I酶切的pEES102连接，获得重组质粒pY020；再以pY020为模板质粒，利用TaKaRa MuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变，从而获得青霉素G酰化酶合成性能提高的突变质粒。将该突变质粒转化枯草杆菌获得需要的工程菌。将该工程菌放大发酵，纯化后可获得合成产物/水解产物的比值及7－ADCA最大转化率提高的突变酶。

Description

突变青霉素G酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及通过基因定点突变方法获得合成性能提高的青霉素G酰化酶的基因、突变质粒、工程菌以及突变酶。

背景技术

青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是一种异二聚体N-端亲核丝氨酸水解酶(Duggleby et al.，Nature，373(6511)，264-268，1995)。青霉素G酰化酶是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要用酶，该酶主要用途在于分别水解青霉素G和头孢菌素G，生成相应的化合物母核，6-氨基青霉烷酸(6-AminoPenicillinic acid，6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-Amino-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA)(Abian et al.，Biotechnol Prog，2003，19(6)，1639-42，2003)。青霉素G酰化酶的新用途是催化母核6-APA或7-ADCA与各种D-氨基酸发生侧链反应，生成新的半合成β-内酰胺抗生素，如半合成青霉素和半合成头孢霉素等(Gabor，De Vries，and Janssen，Enzyme And MicrobialTechnology，2005，36(2-3)，182-190)。

酶法合成β-内酰胺抗生素研究开始于上世纪60年代。相对于化学法(Wegman et al.，Advanced Synthesis & Catalysis，343(6-7)，559-576，2001)，由于其具有不用有机溶剂、反应条件温和以及环保等优点，酶法合成β-内酰胺抗生素逐渐成为了β-内酰胺抗生素工业研究中的一个热点(Giordano，Ribeiro，and Giordano，Biotechnology Advances，24(1)，27-41，2006)。理论上，β-内酰胺类抗生素的酶法合成可通过两种方法(Kasche.Enzyme andMicrobial Technology，8(1)，4-16，1986)，即1)热力学控制，即逆转水解反应，和2)动力学控制，即酰基转移，实现。动力学控制的催化机制，涉及酶和酰基供体反应，形成酰基酶中间体，当中间体遇到β-内酰胺母核即可发生耦合，形成半合成β-内酰胺抗生素；而水作为竞争性亲核性试剂，引起反应物和产物的水解，当产物合成速率与产物水解速率相当时，该合成产物量达到最大值。

近年来，利用酶法催化动力学控制母核6-APA或者7-ADCA的酰基化的研究已有所报道(Bruggink，Roos，and de Vroom.Organic Process Research & Development，2(2)，128-133，1998)。与传统的化学合成法比较，β-内酰胺抗生素的酶法合成面临的主要问题，是在合成抗生素的同时又发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体；2)水解生成的抗生素；从而导致酰基供体和生成的抗生素的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产物(S/H)的比值偏低。虽然可以通过改善该酶促反应的反应条件，例如pH值优化(Nam，Ryu，and Ryu.Journal Of Microbiology And Biotechnology，11(2)，329-332，2001)，采用过饱和的底物和改变各种反应底物的投料比(Youshko et al.，Biotechnol Bioeng，85(3)，323-9，2004)，以及媒介工程改造(Fernandez-Lafuente，Rosell，and Guisan.，Biotechnol ApplBiochem，24(Pt 2)，139-43，1996)等，来改善上述问题，但是酶自身的特性对S/H值的影响依然是最重要的(Alkema et al.，Eur.J.Biochem，270(18)，3675-83，2003)。

利用蛋白质工程改造的方法改善青霉素G酰化酶的合成性能已有报道(Alkema et al，Protein Eng.，13(12)，857-63，2000)。在大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶中，αY 145，αF146和β F24这三种氨基酸位于酰化酶与青霉素G结合的口袋位置。当酰化酶与青霉素G结合时，αY145和αF146的构象会发生很大的变化，远离活性中心：αY145通过两个水分子，利用氢键与青霉素G的羧酸基团相互作用，增加其亲核能力；αF146通过范德华力与底物的β内酰胺环相互作用。而，β F24则在E.coli PGA中与底物的苯环结构发生疏水相互作用，从而有利于酰化酶与底物的结合，当把αF146和βF24氨基酸残基分别突变为Leu和Ala后，氨苄青霉素和头孢氨苄的合成性能得到提高(Alkema et al.，ProteinEngineering Design & Selection，17(5)，473-480，2004)。利用有利设计和定向进化结合的方法，青霉素G酰化酶PAS2把αR160，αF161和βF24这三个氨基酸筛选到在氨苄青霉素和头孢氨苄合成时性能大大提高的工程菌中(Gabor，E.M.and D.B.Janssen，Protein Eng DesSel，2004，17(7)，571-9)。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种运用定点突变的方法获得的选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列。

本发明的第二个目的在于提供一种含有上述选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列的重组表达质粒。

本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的青霉素G酰化酶生产菌株。

本发明的第四个目的在于提供一种利用上述青霉素G酰化酶生产菌株生产的青霉素G酰化酶的突变酶。

为达到上述目的，本发明采用以下手段：

首先以大肠杆菌和Providencia rettgeri来源的青霉素G酰化酶结构作为模板，利用Swiss-Model模建巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的青霉素G酰化酶(BmPGA)；然后利用E.coli PGA与青霉素G(PG)的复合物的结构，通过叠加BmPGA和青霉素G获得了BmPGA-PG的复合物的结构，最后用GROMOS96对复合物的结构进行了能量优化，选择到合适的突变位点。

并根据巨大芽孢杆菌来源的PGA基因序列，设计出了合成突变引物；再以包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的重组质粒为模板质粒，以上述的合成突变引物为引物，利用TaKaRa公司的TaKaRa MuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变，从而获得合成性能提高了的青霉素G酰化酶的突变质粒，同时对突变质粒的DNA序列进行测定，经验证，确定该突变质粒的DNA序列为我们设计的选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列。

本发明再将突变后的质粒，通过自身环化后，转化枯草杆菌感受态细胞，从而获得合成性能提高了的青霉素G酰化酶的工程菌。

本发明挑选该工程菌的单菌落进行培养，并放大发酵，纯化，从而获得了青霉素G酰化酶突变酶。

本发明还对获得的突变酶的性能进行了测定，包括水解酶活力、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率等的测定。

测定结果显示，我们获得的突变酶的合成性能、合成产物/水解产物值(S/H值)及7-ADCA最大转化率均得到了提高。

附图说明

图1是巨大芽孢杆菌来源的青霉素G酰化酶与头孢氨苄复合物及大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶复合物电子模拟示意图。

图2是各工程菌发酵液上清电泳图，其中，1代表在β24位点上的缬氨酸和在α144位点上的酪氨酸同时分别被突变为苯丙氨酸和精氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAβ24F+α144R)，2代表在β24位点上的缬氨酸被突变为苯丙氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAβ24F)，3代表在α145位点上的苯丙氨酸被突变为酪氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAα145Y)，4代表α145位点上的苯丙氨酸被突变为亮氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAα145L)，5代表α145位点上的苯丙氨酸被突变为丙氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAα145A)，6代表α144位点上的酪氨酸被突变为精氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAα144R)，7代表野生型BmPGA，8代表蛋白质分子量Marker。

图3是各工程菌的头孢氨苄的动态控制合成示意图，其中，A代表是野生型BmPGA，B代表BmPGAα145Y，C代表BmPGAα144R，D代表BmPGAβ24F，E代表BmPGAβ24F+α144R。

图4是BmPGA发酵培养的细菌生长量及水解酶的酶活力与时间的关系示意图。

图5是野生型BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R的合成产物/水解产物比率示意图。

图6是野生型BmPGA和BmPGAβ24F+α144R的头孢氨苄的最大生成率示意图，其中A代表野生型BmPGA，B代表BmPGAβ24F+α144R。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明以大肠杆菌和普雷斯登菌来源的青霉素G酰化酶结构作为模板，利用Swiss-Model模建巨大芽孢杆菌来源的PGA；然后利用E.coli PGA与青霉素G的复合物的结构，通过叠加BmPGA和青霉素G(PG)获得了BmPGA-PG的复合物的结构，最后用GROMOS96对复合物的结构进行了能量优化，选择合适的位点，并根据巨大芽孢杆菌来源的PGA基因序列，设计出了合成突变引物；再以包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的重组质粒为模板质粒，以上述的合成突变引物为引物，利用TaKaRa公司的TaKaRaMuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变。再将突变后的质粒在自身环化后转化枯草杆菌感受态细胞。并挑选单菌落培养，放大发酵，纯化，获得了青霉素G酰化酶突变酶，最后还对获得的突变酶的性能进行了测定，包括水解酶活力、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率等的测定。

本发明使用的菌株和质粒为：包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的质粒pEES102(CGMCC No.0398)，枯草芽孢杆菌WB600(Wu，XC，Lee，W，Tran，L，Wong，SL(1991).JBacteriol 173：4952-4958)，质粒pUC18购自Promega公司，大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。

本发明使用的酶和试剂为：限制性内切酶(EcoR I、Kpn I、ClaI、ApaI和PstI)，Pyrobest DNA聚合酶，T4连接酶，TaKaRa基因定点突变试剂盒，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)购自TaKaRa公司，PCR纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自华舜生物制品有限公司，7-ADCA由哈尔滨制药集团赠送，D-苯甘酰胺(D-PGA)购自上海实业化工有限公司，7-ADCA标准品，头孢氨苄(CEX)标准品，D-PGA标准品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)，6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)购自东风试剂有限公司，琼脂购自西巴斯生物技术有限公司，其它常规试剂均为国产或进口分装。

本实施例中酶的检测项目的测定方法：

1)水解酶活力的测定方法(NIPAB法)：

按Yang S et al.(Yang S，et al.，Protein Expression And Purification，2001，21(1)，60-64)描述的方法，用NIPAB测定PGA的活力。其具体操作步骤如下：

取10μl酶液，加入490μl pH7.5的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，置于37℃水浴恒温器中保温10分钟；然后再向该溶液中加入1ml已于37℃预热的、0.09％(w/v)的6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)溶液，混匀，反应4min后，向反应液中加入1ml无水乙醇，以终止反应，取1ml终止反应液；以不加酶的反应液作为空白对照，测定该终止反应液的OD₄₀₅数值。

酶活力＝7×OD₄₀₅(U)

酶活力单位(U)定义为：37℃，pH7.5条件下，每分钟水解1μmol的NIPAB所需的PGA的量为1U。

2)酶合成活力测定方法：

按照周政(Zhou Z，et al.，Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，2003，35(5)，416-422)建立的测定方法，测定酶合成活力。其具体操作步骤如下：

取1.2ml含有200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，用盐酸将该底物反应液的pH值调至7.0±0.02，然后再加入0.5mg纯化酶，于30℃反应；分别在开始反应后的第15，30和45分钟取样，每次取样量为30μl，并将样品在用50mM的磷酸二氢钠溶液稀释40倍，灭活后，用HPLC测定产物生成量。

酶合成活力单位定义为：30℃，pH7.0条件下，每分钟生成1μmol的头孢氨苄所需的固定化PGA的量为1SU。

3)S/H值测定方法：

取1.2ml含200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，将其pH调至7.0±0.02。向该反应体系中加入纯化后的酶，使反应体系中的酶的合成活力控制为0.2SU/ml。于30℃，pH7.0条件下，反应120分钟；并于反应过程中，每隔15分钟取样一次，每次取样的量为30μl反应液；在每次取样后，迅速将样品用50mM的磷酸二氢钾溶液稀释40倍，以终止反应，然后取终止反应后的反应液5μl，HPLC测定样品中的产物头孢氨苄和苯甘氨酸的生成摩尔量以及底物7-ADCA的剩余摩尔量，并计算样品的S/H值。

S/H值为：样品中的7-ADCA消耗达10％时，样品中所含的产品头孢氨苄的摩尔数与副产品苯甘氨酸的摩尔数的比值。

4)7-ADCA最大转化率的测定方法：

取1.2ml含有200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，将其pH调至7.0±0.02。向该反应体系中加入纯化后的酶，使反应体系中的酶的合成活力控制为1SU/ml。于30℃，pH7.0条件下，反应120分钟；并于反应过程中，每隔15分钟取样一次，每次取样的量为30μl反应液；在每次取样后，迅速将样品用50mM的磷酸二氢钾溶液稀释40倍，以终止反应，然后取终止反应后的反应液5μl，用HPLC测定样品中的产物头孢氨苄生成的摩尔量，并计算样品的7-ADCA最大转化率。

7-ADCA最大转化率为：当头孢氨苄的浓度开始下降时，此时测定的样品中的产物头孢氨苄的生成量与头孢氨苄的理论最大生成量的比值。

实施例1、确定定点突变基因序列

1.1、BmPGA-配体复合物的结构模建

以大肠杆菌(E.coli)和普雷斯登菌(Providencia rettgeri)来源的青霉素G酰化酶的结构为模板，利用Swiss-Model模型(Kaplan and Littlejohn，Swiss-PDB Viewer，2001，http://www.expasy.org/spdbv/)，模建巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的PGA(BmPGA)；然后利用模建的E.coli PGA和青霉素G的复合物结构，通过叠加BmPGA和青霉素G(PG)获得BmPGA-PG的复合物结构。

1.2、突变位点的选择

运用分子动力学软件GROMOS96(van Gunsteren WF，Billeter SR，EA，Hünenberger PH，Krüger R，Mark AE，S，1996，http://www.igc.ethz.ch/gromos/manual.html)对BmPGA-PG复合物的结构进行能量优化，以选择适合的突变位点和突变方向。

模建并优化后的结果如图1所示，根据图1的结果，确定定点突变的位点为：α144，α145和β24，突变方向为：位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，位点α145上的苯丙氨酸被丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸替代，位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代。

实施例2、突变质粒的构建

2.1、引物设计

根据巨大芽孢杆菌来源的PGA的基因序列(SEQ ID NO：1)，以及选定的突变位点α144、α145、β24，设计下列7个突变引物：

α144R：5`-G AGA TTT ATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA-3`；

α145Y：5`-G TAT TATATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA-3`；

α145A：5`-G TAT GCTATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA-3`；

α145L：5`-G TAT CTT ATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA-3`；

β24F2：5`-AA TTT GGT TTT GTT GCT CCT GGA TTT-3`；

α145U：5`-GT CAT CGA TAC CAT ATA AAC ACG GAC A-3`；

(Cla I)

β24F1：5`-G GGG CCC ACT GAA TAA TAA AGC ATT T-3`；

(Apa I)

其中，引物中的下划线表示为引入的突变序列。引物α145U和β24F1为同义突变，用于鉴定突变是否成功。

2.2、重组质粒pY020的构建

先用内切酶Kpn I和内切酶Pst I对质粒pUC18(具有氨苄霉素抗性，和Kpn I酶和Pst I酶的酶切位点)进行双酶切，电泳回收2.6 kb的DNA大片断，然后用T4聚合酶将该片段的酶切缺口补平，并自连，得到pZ01；

再用内切酶EcoR I酶切质粒pZ01，并和同样预先经内切酶EcoR I酶切后的pEES102(CGMCC No.0398)连接，获得重组质粒pY020。

2.3、BmPGA的定点突变

以重组质粒pY020为模板质粒，参照TaKaRa生物产品及操作手册，利用TaKaRaMuTanBEST突变试剂盒，利用设计的相应突变引物对，PCR扩增出BmPGA的定点突变序列，具体操作步骤如下：

(1)反应体系(200μl)：

10×Pfu聚合酶缓冲液 10μl

10mmol/L dNTP溶液 2μl

上游引物 40 pmoles

下游引物 40pmoles

Pfu DNA聚合酶 5U

质粒DNA模板 200-400pg

加水至200μl

(2)PCR条件：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 300s，30个循环，72℃ 10min。

以α144R/α145U作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGAα144R(α144上的酪氨酸被精氨酸替代)。

以α145Y/α145U作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGAα145Y(α145上的苯丙氨酸被丙氨酸替代)；以α145A/α145U或α145L/α145U作为定点突变的上/下游引物，则PCR获得BmPGAα145A或BmPGAα145L(α145上的苯丙氨酸被亮氨酸或酪氨酸替代)。

以β24F2/β24F1作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGA β24F(β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代)。

参考TAKARA公司操作手册，对PCR获得的DNA片断的5’末端进行磷酸化，然后将磷酸化的突变引物进行自身环化，接着转化DH5α感受态细胞，并涂布于加入氨苄抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h。能在加入氨苄抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。最后对转化子进一步培养以对重组质粒进行扩增，并抽提扩增的重组质粒。

在获得定点突变的BmPGAα144R的基础上，进一步以BmPGAα144R质粒作为定点突变的模板，并以β24F2/β24F1作为上/下游引物，PCR获得BmPGAα144R+β24F(α144上的酪氨酸被精氨酸替代+β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代)，PCR方法同上，并按照上述同样的方法获得扩增的重组质粒。

突变位点验证：

1)用Cla I酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，如大小约为9.1kb的片段为线性化质粒，则表明在α144和α145位点发生了突变。

2)再用Apa I进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，如大小约为9.1kb的片段为线性化质粒，则表明在β24位发生了突变。

突变序列鉴定：

分别对筛选到的突变质粒进行测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。

虽然本申请为在确定的位点α144，α145和β24进行的定点突变，但是该3个位点的定点突变与其他位点的无义突变或同义突变的组合，获得的产物具有与本申请所要求保护的产物具有同样的功能，这对本领域的人员来说是显而易见的。

实施例3、工程菌的获得

参照TAKARA公司的操作手册，分别将突变后的4种质粒(BmPGA α144R、BmPGAα145Y、BmPGAβ24F、BmPGAα144R+β24F)用EcoR I酶切，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，然后用T4连接酶e自身环化，再转化枯草杆菌感受态细胞WB600，获得基因工程菌株BmPGAα144R/WB600、BmPGAα145Y/WB600、BmPGAβ24F/WB600和BmPGAα144R+β24F/WB600，具体如下：

3.1、突变质粒环化

1)在37℃条件下，在100μl EcoR I酶的酶切体系(30μl获得突变质粒，1/10体积的TaKaRa公司的H缓冲液，EcoR I酶(终浓度为0.05U/μl)，补双蒸水到100μl)中，酶切突变质粒，2小时后，跑琼脂糖凝胶电泳，参照操作手册，用华瞬公司的胶回收试剂盒回收6.3kb大小的片断。

2)取8μl以上1)获得的DNA片段，在16℃条件下，在10μlT4连接酶的连接体系(1/10体积的TaKaRa公司的T4连接酶缓冲液，T4连接酶(终浓度为0.1U/μl)，补双蒸水到10μl)中反应6小时，获得环化的带突变酶基因的重组质粒BmPGAα144R、BmPGAα145Y、BmPGA β24F和BmPGAα144R+β24F。

测序鉴定获得的重组质粒的序列为正确。

3.2、转化工程菌

参照Harwood，CR，Cutting，SM(1990)Molecular biological methods for Bacillus.Sussex：Wiley中所介绍的方法，将重组质粒转化枯草杆菌感受态细胞WB600，分别获得基因工程菌株BmPGA α144R/WB600、BmPGA α145Y/WB600、BmPGA β24F/WB600和BmPGAα144R+β24F/WB600。最后将获得的工程菌株分别涂布于加入氨苄抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h，能在加入氨苄抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。

实施例4、工程菌发酵培养

从LB选择性培养平板上挑单菌落，接种至3ml LB液体培养基中，加入卡那霉素，至其终浓度为100μg/ml，于37℃，250r/min，培养过夜；

取2ml培养过夜的培养液，接种至200 ml的LB液体培养基中，于37℃，250r/min，培养12h，获得种子菌液；

取200ml种子菌液，接种至(已预先加入了1ml泡敌，并在121℃下，湿热灭菌20min的)3L淀粉培养基中，发酵培养(发酵条件为37℃，1.33vvm，300r/min)；每隔1h，取3ml发酵液，测定发酵液中的细菌生长量及水解酶的酶活力。

水解酶的酶活力与时间的关系如图4所示。

根据图4所示，待发酵至水解酶的酶活力达到最大，即大约在44小时后，即可停止发酵。

细菌生长量测定：

取1ml发酵液，根据菌浓度不同，用双蒸水稀释相应不同倍数(1-100倍)，以使测定的OD600的数值在0.2到0.6之间。发酵结束时，OD600数值在30到40之间，可认为发酵正常。

水解酶的酶活力测定：参见上文提到的“水解酶活力的测定方法(NIPAB法)”，其中，用发酵液替换“酶液”。

实施例5、酶的纯化

参照Yang S et al(Yang，S，et al.，Protein Expression And Purification，2001，21(1)，60-64)中描述的BmPGAs的纯化方法进行酶的纯化。

在纯化过程中，检测总蛋白浓度、酶活，并计算总酶活和酶的比活，从而确定回收率和纯化程度。

总蛋白浓度测定：以小牛血清为标准品，根据Bradford检测法计算。

野生型酶(BmPGA)和四种突变酶BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R分别在枯草杆菌中分泌表达，五种酶(BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R)用两步法纯化后水解比活分别浓缩了2.4倍，5.5倍，3.5倍，3.3倍和3.3倍，纯化结果见表1。

表1：四种BmPGA的纯化结果

a：总蛋白含量通过Brandford法测定，小牛血清为标准品；b：总酶活通过NIPAB测定

实施例6、纯化后酶的性质的测定

参照前述方法，测定水解酶活、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率。

6.1、水解酶酶活测定

水解酶酶活的测定的方法，见上文提到的“水解酶活力的测定方法(NIPAB法)”。各酶的水解酶酶活结果见表1。

如表1所示，与野生型酶BmPGA相比较，BmPGAβ24F+α144R的比活下降很大，BmPGAα145Y和BmPGAβ24F比活下降比较大，BmPGAα144R的比活稍有下降。

6.2、酶合成活力测定

酶合成活力的测定的方法，见上文提到的“酶合成活力测定”。

根据测定的野生型BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F以及BmPGAβ24F+α144R的液体酶催化头孢氨苄合成计算出了他们的合成活力，其合成活力的结果见表2。

表2：五种BmPGAs的合成活力

6.3、S/H值测定

S/H值测定的方法，见上文提到的“S/H值测定”，测定结果见图5。

如图5所示，五种青霉素G酰化酶BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R的S/H值分别是：BmPGA的S/H值为2.3，BmPGAα145Y的S/H值为0.40，BmPGAα144R的S/H值为2.9，BmPGAβ24F的S/H值为5.5，BmPGAβ24F+α144R的S/H值为6.8。

根据图示结果，突变酶BmPGAα145Y的S/H值相对于野生型BmPGA下降了，突变酶BmPGAα144R的S/H值比野生型BmPGA提高了约26％，BmPGAβ24F的S/H值比野生型BmPGA提高了约140％，而双突变酶BmPGAβ24F+α144R的S/H值大约是野生型BmPGA的三倍。

6.4、7-ADCA最大转化率测定

7-ADCA最大转化率测定的方法：见上文所提到的“7-ADCA最大转化率测定”。测定结果见图6。

如图6所示，野生型BmPGA的最大转化率为31.1％(图6-A)，双突变酶BmPGAβ24F+α144R的最大转化率为59.0％(图6-B)，其转化率大约是野生型BmPGA的转化率的两倍。

综上所述，通过以上步骤获得的突变酶的合成性能、合成产物/水解产物值(S/H值)及7-ADCA最大转化率均得到了提高。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>定点突变提高青霉素G酰化酶合成性能的工程菌

<130>061825N

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2409

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌

<400>1

atgaagatga agtggctaat atcagtcata atcctatttg ttttcatttt tcctcaaaat 60

ctagtttttg ctggggagga taagaatgaa ggggtcgaag tagtacgtga taattttgga 120

gtaccccatt tatacgctaa aaataaaaaa gatttatatg aagcgtatgg atatgttatg 180

gcaaaggatc gactatttca gttggaaatg ttccgtcgcg gaaatgaggg gaccgtttca 240

gaaatttttg gagaagatta tctttcaaaa gatgagcaat ccagaagaga tggatatagt 300

aataaagaaa ttaaaaaaat gattgacggt ctggatcgtc agccaaaaga attaatagca 360

aaatttgctg aaggtatttc acgttatgta aatgaagctt taaaagatcc agatgataag 420

ctttcgaagg agtttcatga atatcagttt ttaccgcaaa aatggacttc aacagatgtt 480

gtccgtgttt atatggtatc catgacctat tttatggata atcaccagga gttaaaaaac 540

gcagagatac ttgcaaagct agaacatgaa tatgggacag aagtttcccg gaaaatgttc 600

gatgatttag tgtggaaaaa tgatcctagc gctcctacaa gcattgtaag cgaggggaaa 660

ccaaaaaggg actcgtcttc tcaatccctt caaatactgt cttcagctgt aatcaaagct 720

tctgaaaaag tcggaaagga aagggagaat tttgtccaaa catctgaaga acttggatta 780

ccgttaaaga taggcagtaa tgccgccata gtcggttccg agaaatctgc aacaggaaat 840

gctttattat tcagtggacc acaagtaggt tttgttgctc ctggattttt gtacgaggta 900

ggtttgcatg cgccaggttt tgatatggaa ggttcaggat tcataggcta tcctttcatc 960

atgttcggag ccaacaatca ctttgctcta agtgctacag ctgggtacgg aaatgtaacc 1020

gatatctttg aggaaaaatt gaatgcgaag aactcttccc agtatttata caaagggaag 1080

tggagagaca tggaaaagag gaaggaatct ttcacagtca aaggagacaa tggagaaaag 1140

aaaacagtag aaaagattta ttatcggaca gtacatggtc ctgtaattag tagagatgaa 1200

acaaataaag tggcttacag taagtcgtgg tctttccgtg gaactgaggc ccaaagcatg 1260

tcggcttaca tgaaagcgaa ttgggcaaaa aacttaaaag aatttgagaa tgcagctagt 1320

gaatatacga tgtctttgaa ttggtattat gcggataaga agggtgatat agcgtattat 1380

catgtaggaa gatatccagt aagaaacagc aaaattgatg aaagaatccc tacaccagga 1440

acaggagaat atgagtggaa aggttttatt ccttttaaag agaaccctca tgtaatcaat 1500

ccgaagaatg gctatgtagt taattggaac aataagcctt ctaaagagtg ggtaaatggt 1560

gaatatagtt tttattgggg agaggataat cgagtccaac aatatatcaa tgggatggaa 1620

gcgagaggga aagttacatt agaagatatt aatgaaatta attatacggc aagctttgca 1680

cagcttcgag caaacctctt taaacagtta ttgattgatg tgttggacaa gaataaatca 1740

accaacggga actacatcta tttaattgaa aaactggaag aatggaataa tctaaaagaa 1800

gacgaaaata aagatggata ttatgacgca gggattgcgg cattctttga tgaatggtgg 1860

aataatctcc atgataaact ctttatggat gaattgggag acttctatgg aataacgaaa 1920

gaaattaccg atcatcgcta tggggcttca ttagcatata aaatattaaa caaggaatct 1980

acaaactata aatgggtgaa cgtagatcag gaaaaaataa taatggaaag cacaaatgaa 2040

gtacttgcta aattgcaatc agaaaaaggg ttgaaagcag aaaaatggcg tatgcctata 2100

aaaacgatga cttttggtga aaaatcattg attggtattc cccacgggta tggctcaatg 2160

actccaatta ttgaaatgaa tcgtggaagt gaaaatcatt atattgaaat gactccgaca 2220

gggccgagtg gctttaacat cacaccgcct ggtcaaattg gatttgtaaa aaaagatgga 2280

acgataagtg accactatga tgaccaacta gttatgttcg ccgaatggaa attcaagcca 2340

tacttattta acaagaaaga tattaataaa gcagctaaaa atgttagcgc attaaatatg 2400

agtaagtag 2409

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>引物α144R

<400>2

gagatttatg gataatcacc aggagtta 28

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>引物α145Y

<400>3

gtattatatg gataatcacc aggagtta 28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>引物α145A

<400>4

gtatgctatg gataatcacc aggagtta 28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>引物α145L

<400>5

gtatcttatg gataatcacc aggagtta 28

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>引物β24F2

<400>6

aatttggttt tgttgctcct ggattt 26

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>引物α145U

<400>7

gtcatcgata ccatataaac acggaca 27

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>引物β24F1

<400>8

ggggcccact gaataataaa gcattt 26

Claims

1.一种青霉素G酰化酶的突变DNA序列，其特征在于，其表达蛋白的氨基酸序列与巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的氨基酸序列相比，在位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，或位点α145上的苯丙氨酸被丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸替代，或位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代或以上这些突变位点的组合，以及这些突变位点与其它无义突变或同义突变的组合。

2.如权利要求1所述的突变DNA序列，其特征在于，其表达蛋白的氨基酸序列与巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的氨基酸序列相比，在位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，同时在位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代。

3.如权利要求1或2所述的DNA序列，其特征在于，该序列是通过对巨大芽孢杆菌来源的PGA的DNA序列进行定点突变而获得的。

4.一种突变质粒，其特征在于，该突变质粒含有如权利要求1-3中任一项所述的基因序列。

5.如权利要求4所述的突变质粒，其特征在于，该突变质粒还含有氨苄霉素抗性基因。

6.一种具有青霉素G酰化酶合成性能的工程菌，其特征在于，该工程菌转化有权利要求4或5所述的突变质粒。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，该工程菌为枯草杆菌。

8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，该工程菌为枯草杆菌WB600。

9.一种权利要求1-3中任一项所述的突变DNA序列所表达的青霉素G酰化酶突变酶。

10.如权利要求9所述的突变酶，其特征在于，该酶由权利要求6-8任一项所述的工程菌经发酵而获得。