CN109161540A

CN109161540A - 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用

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Publication number: CN109161540A
Application number: CN201811135223.3A
Authority: CN
Inventors: 黄斌; 赵强; 周晶辉; 许岗
Original assignee: Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hu'nan Fulaige Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109161540B

Abstract

本发明提供了一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。对Bacillus sphaericus来源的青霉素V酰化酶进行突变，获得的突变体PVA‑3的比活提高了9倍，固定化活力由92U/g提高到820U/g，在浓度为30％的青霉素V钾盐条件下孵育1小时，活性残余89.1％；固定化突变体PVA‑3应用于pH6.0，25℃条件下裂解25％浓度的青霉素V制备6‑APA的反应时间由180分钟缩短到60分钟，底物转化率提高至99.5％以上，且连续使用600批次以上，活力无明显的损失，具有很好的操作稳定性。突变后的PVA‑3极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。

Description

一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。

背景技术

青霉素V是早期使用的一种青霉素类抗生素，其对多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、个别革兰阴性杆菌(如嗜血杆菌属)、螺旋体和放线菌均有抗菌活性，但对产β-内酰胺酶类的菌株无抗菌作用。目前，发酵生产的青霉素V(PenV)多半是用作生产β-内酰胺类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid，6-APA)的原料。6-APA是合成阿莫西林和氨苄西林的一种重要中间体。

当前，β-内酰胺类抗生素工业生产6-APA主要是利用青霉素G酰化酶(penicillinG acylase，PGA，EC 3.5.1.11)水解青霉素G钾盐来获得，同时还有一部分厂家通过化学法或利用青霉素V酰化酶(penicillin V acylase，PVA，EC 3.5.1.11)水解青霉素V钾盐的方式获得6-APA，青霉素V酰化酶的反应原理如下图所示。

相对于利用PGA酶法生产6-APA，利用PVA酶法生产6-APA具有以下优点：(1)能催化更高的底物浓度。青霉素G钾盐的底物浓度最高为8％，其转化率为97.5％，而青霉素V钾盐的底物浓度可以达到12％，转化率为99％左右，6-APA产量更高；(2)具有更好的反应pH。PGA的反应pH在8.0左右，在该pH条件下产生更多的副产物，而PVA的最适反应pH在5.5—8.5之间，酸性偏中性pH值副产物更少，6-APA更稳定；(3)产品6-APA的品质更佳。PGA生产的6-APA其副产物苯乙酸难于分离，易带入下游合成的抗生素中，引起过敏反应，而PVA生产的6-APA其副产物为苯氧乙酸，苯氧乙酸很容易就能与6-APA分离开，其得到的6-APA纯度更高、品质更好。因此，抗生素工业中开发一种优良的青霉素V酰化酶具有很好的市场前景。

野生型的青霉素V酰化酶广泛分布于各类微生物中。许多野生型的PVA被国内外科研工作者筛选、克隆并表达出其编码的基因，如中国专利CN1132251公开了一种尖孢镰孢来源的新型青霉素V酰化酶编码基因并进行了异源宿主表达，其活力为130U/ml；冯瑛、董志扬等对来源于尖镰孢FP941的青霉素V酰化酶进行了发酵、纯化和固定化研究，其固定化酶活力为210U/g，使用25批次后，酶活力保留90％；专利WO2005/066336公开了一种来源于Bacillus sphaericus的青霉素V酰化酶基因并进行了大肠杆菌重组表达，其发酵活性达到203.68U/g细胞干重；Demin Zhang等公开了一种来源于Streptomyces mobaraensis的新型青霉素V酰化酶编码基因并对该酶进行了性质研究；Jesus Torres-Bacete等对Streptomyces lavendulae来源的PVA进行了固定化研究，连续使用50批次，活力没有明显减弱；V.S.Avinash等对Pectobacterium atrosepticum来源的青霉素V酰化酶进行了大肠杆菌重组表达，其比活力可达430U/g。

随着基因工程和蛋白工程技术的发展，对野生型青霉素V酰化酶的克隆与表达有很多报道，而对青霉素V酰化酶的突变与性质改造鲜有报道。目前，在原料药企业应用青霉素V酰化酶酶法中试生产6-APA的过程中发现，由于野生型青霉素V酰化酶催化活性低、反应时间长、使用批次少等缺点，严重制约该酶的推广和应用，因此开发一种催化活性高、反应速率快及操作稳定性好的新型青霉素V酰化酶具有很好的市场前景。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种高活性青霉素V酰化酶突变体。突变体是通过随机突变、定点突变等非理性及理性设计的酶工程改造技术对Bacillus sphaericus来源的青霉素V酰化酶进行突变获得，其反应活性更高，反应速率更快，稳定性更好，可以更有效，快速地将青霉素V转化为6-APA。

具体地说，本发明的

突变体至少将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第91位的苏氨酸突变成丙氨酸。

优选将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的青霉素V酰化酶第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，优选的突变体命名为PVA-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该突变体的活性高于野生型青霉素V酰化酶。

进一步的，至少将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸。

优选将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，优选的突变体命名为PVA-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该突变体是满足高活性要求的同时，还具有高浓度青霉素V耐受性。

更进一步的，至少将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第110位的丝氨酸突变成半胱氨酸，优选将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第110位的丝氨酸突变成半胱氨酸，优选的突变体命名为PVA-3，其氨基酸序列如SEQID NO.8所示。该突变体是满足高活性要求的同时，具有更好的高浓度青霉素V耐受性，稳定性更好，其水解活性远高于突变体PVA-2。

本发明的第二个目的是提供上述编码青霉素V酰化酶突变体的基因序列。

所述的序列为所述的青霉素V酰化酶突变体中的任一种的基因序列。

进一步地，所述青霉素V酰化酶突变体的基因序列为a～d中的任一种，

a)具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

b)具有序列表中SEQ ID NO.5的核苷酸序列；

c)具有序列表中SEQ ID NO.7的核苷酸序列；

d)在严格条件下可与a、b或c任一项限定的核苷酸序列杂交且编码具有青霉素V酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；

本发明的第三个目的是提供上述编码青霉素V酰化酶突变体的基因序列的重组表达载体。

具体是含有所述编码基因中的一种或几种的重组表达载体。

本发明第四个目的在于提供上述青霉素V酰化酶突变体的编码基因序列重组表达载体的基因工程菌。

具体是含有上述重组表达载体中的一种或几种的基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种固定化青霉素V酰化酶突变体。具体是利用环氧基载体或氨基载体将上述的青霉素V酰化酶突变体进行固定化。

本发明的第六个目的是提供一种青霉素V酰化酶突变体的应用，使用上述的青霉素V酰化酶突变体，或者上述的固定化青霉素V酰化酶突变体催化水解青霉素V制备6-APA。

具体是在所述固定化青霉素V酰化酶突变体水解青霉素V制备6-APA时，其转化条件为：底物青霉素V浓度(W/V)为15％～30％，优选为20％～30％，更优选为25％。转化温度为20～25℃，pH为6.0～6.5。

本发明前述突变型青霉素V酰化酶的制备方法，包括以下步骤：

a)将具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列进行随机突变、饱和突变、迭代饱和突变等步骤得到可编码SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8氨基酸序列的突变基因；

b)将突变基因插入到质粒中得到表达载体；

c)将表达载体转化进入菌株中得到重组基因工程菌；

d)将重组基因工程菌用1％乳糖诱导进行发酵得到青霉素V酰化酶。

进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将产青霉素V酰化酶重组基因工程菌破碎、离心、收集后通过固定化金属螯合亲和层析法进行纯化得到青霉素V酰化酶纯酶。

进一步地，还包括酶的固定化步骤，固定化步骤为将上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，直至吸附饱和，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。

载体的活化处理过程：准确量取60％的戊二醛30ml、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)4.76g溶解于600ml去离子水中，最后用去离子水定容至1000ml，同时用磷酸溶液调节其pH为6.0，灭菌后备用；将环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S(意大利Resindion S.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水反复冲洗2～3次后真空滤干备用。

进一步地，固定化载体为环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S。

进一步地，质粒优选为pET30a(+)，菌株优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明通过随机突变、定点突变等酶工程改造技术对Bacillus sphaericus来源的青霉素V酰化酶进行突变，获得了催化活力提高，高浓度底物抑制减弱及稳定性增强的PVA突变体，可以更有效，快速地催化水解青霉素V制备6-APA。

首先获得了优选的突变体命名为PVA-1，青霉素V酰化酶第91位的苏氨酸突变成丙氨酸。该突变体的活性高于野生型青霉素V酰化酶。进一步优选获得了青霉素V酰化酶第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸的突变体命名为PVA-2。该突变体是满足高活性要求的同时，还具有高浓度青霉素V耐受性。尤其是本发明获得的突变体PVA-3(将青霉素V酰化酶第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第110位的丝氨酸突变成半胱氨酸)的比活提高了9倍，固定化活力由92U/g提高到820U/g，在浓度为30％的青霉素V钾盐条件下孵育1小时，活性残余89.1％；固定化突变体PVA-3应用于pH6.0，25℃条件下裂解25％浓度的青霉素V制备6-APA的反应时间由180分钟缩短到60分钟，底物转化率提高至99.5％以上，且连续使用600批次以上，活力无明显的损失，具有很好的操作稳定性。突变后的PVA-3极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，但并不构成对本发明的不当限定。

附图说明

图1是本发明实施例的重组表达载体pET-pva-wt构建流程图；

具体实施方式

以下实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。

1、下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。突变引物以及序列测序均为泰和永昌(长沙)生物技术有限公司完成。大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21(DE3)购于Merck公司，大肠杆菌宿主菌还可以是E.coli BL21(DE3)plys，购于天根公司，原核表达载体pET30a(+)购于Merck公司。DNA内切酶Dpn I购于Fermentas公司。全自动电位滴定仪购于瑞士万通公司，型号为8系列购于梅特勒-托利多公司，其余材料均为市售。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表1)。

表1氨基酸中英文名称及其缩写和代号

中文名称

英文名称

缩写

代号

中文名称

英文名称

缩写

代号

丙氨酸

Alanine

Ala

A

脯氨酸

Proline

Pro

P

精氨酸

Arginine

Arg

R

亮氨酸

Leucine

Leu

L

天冬酰胺

Asparagine

Asn

N

异亮氨酸

Isoleucine

Ile

I

天冬氨酸

Aspartic acid

Asp

D

甘氨酸

Glycine

Gly

G

半胱氨酸

Cysteine

Cys

C

苯丙氨酸

Phenylalanine

Phe

F

谷氨酰胺

Glutamine

Gln

Q

蛋氨酸

Methionine

Met

M

谷氨酸

Glutamicacid

Glu

E

赖氨酸

Lysine

Lys

K

苏氨酸

Threonine

Thr

T

组氨酸

Histidine

His

H

色氨酸

Tryptophan

Trp

W

缬氨酸

Valine

Val

V

丝氨酸

Serine

Ser

S

酪氨酸

Tyrosine

Tyr

Y

2、青霉素V酰化酶酶活力的检测

(1)滴定法

原理：青霉素V在青霉素V酰化酶作用下转化成6-APA和苯氧乙酸，用NaOH溶液中和苯氧乙酸，根据NaOH的消耗量计算青霉素V酰化酶活力。

具体操作方法：在1.5ml离心管中预先加入玻璃珠，当玻璃珠达到离心管刻度1.0ml处停止，精确量取0.5ml实施例1～3中的青霉素V酰化酶于离心管中，在振荡频率为1500/min的MS3振荡器上振荡10min后，将样品连同玻璃珠一起，加至已装有预热至25℃的30ml的1％青霉素V钾盐底物溶液的反应器中，调节水浴恒温25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至6.00时开始计时，保持pH为6.00的条件搅拌反应5分钟，用全自动电位滴定仪检测氢氧化钠滴定液的消耗量。滴定法中酶活力的计算公式为：

其中V_NaOH：氢氧化钠滴定液的消耗量，ml。

C_NaOH：氢氧化钠滴定液的摩尔浓度为0.1mol/L。

T：反应时间，min。

V样：酶液样品体积，ml。

W样：固定化酶样品重量，g。

1000：由mmol转为μmol。

酶活力单位(U)定义为：在25℃，pH6.0条件下，在1min内催化底物青霉素V生成1μmol苯氧乙酸时所需的酶量为1U。

(2)高效液相色谱(HPLC)法

精确量取20μl的实施例1～5中的青霉素V酰化酶进行离心过滤取上清液。将上清液与含有5％(W/V)的青霉素V的0.01mol/L、pH6.00磷酸盐缓冲液混合至终体积200μl，得到反应初始时体系。将反应初始时体系在25℃反应10min后，加入200μl的40％的冰醋酸终止反应，得反应结束时体系。将反应初始时体系和反应结束时体系分别进行HPLC分析。

溶样相配制：称取1.542g乙酸铵加950ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，混合均匀后备用。

流动相配制：称取1.542g乙酸铵加965ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，加入50ml色谱纯的乙腈，混合均匀后脱气30min。

检测波长：254nm。

柱子类型：BDS C18 200mm×4.6mm。

总流速：1.0ml/min。

进样量：20μl。

酶活力单位(U)定义为：在25℃，pH6.0条件下，在1min内催化底物青霉素V生成1μmol产物6-APA的所需的酶量为1U。

实施例1：野生型PVA重组基因工程菌的构建、表达及重组蛋白的纯化和固定化

1-1野生型PVA原核表达载体的构建及重组基因工程菌的构建

本发明采用的野生型PVA基因及氨基酸序列是来源于Bacillus sphaericus(GeneBank登录号：P12256.1)，通过大肠杆菌密码子偏爱性将该编码基因进行优化并进行全基因合成，并将该野生型青霉素V酰化酶命名为PVA-WT，其编码基因命名为pva-wt，核苷酸序列及氨基酸序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

参照图1，将全基因合成的野生型PVA编码基因pva-wt与原核表达载体pET30a(+)分别进行EcoR I和Xho I双酶切，酶切3小时后分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4DNA ligase于16℃过夜连接。将连接产物5μl转入50μl的DH5α感受态大肠杆菌中，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养。挑选单菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养，提质粒，进行EcoR I和Xho I双酶切验证，将大小正确的克隆子送往测序公司进行DNA测序验证，序列比对正确后，将该重组表达载体命名为pET-pva-wt，这样就得到了在N端和C端都带有一个His-tag的质粒，其表达的野生型PVA蛋白带有两个组氨酸标签，可用固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的方式进行蛋白纯化。

通过化学转化的方法将上述重组表达载体pET-pva-wt转化入E.coliBL21(DE3)或者E.coli BL21(DE3)plys感受态细胞，转化细胞涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养即获得重组野生型PVA基因工程菌。

1-2重组野生型PVA蛋白的表达

将上述重组基因工程菌接种于含50μg/ml卡那霉素100ml LB培养基的摇瓶中(接种3个摇瓶)进行于37℃的摇床中进行发酵培养，待其OD600值为0.8-1.2时，加入0.5mM的IPTG诱导表达8小时。取一定菌液测定重组基因工程的PVA酶的活性，结果显示：野生型的PVA酶活力为5U/ml。

1-3重组野生型PVA蛋白的分离纯化及固定化

(1)重组野生型PVA蛋白的分离纯化

由于在表达载体构建过程中引入了原核表达载体pET30a(+)中的N和C端的2个His-tag，因此，本发明人利用该组氨酸标签进行固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来纯化重组蛋白，具体方法如下。

取100mL过夜诱导后的野生型PVA发酵液，离心后弃上清收集菌体(10 000rpm、4℃、10min)，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0、0.1mol/L)反复洗涤菌体两次，离心收集菌体，浓缩5倍重悬于20ml磷酸盐缓冲液(pH 6.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，其中的超声破碎条件为：工作2s，间隔5s。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12,000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到重组野生型PVA蛋白，将该粗重组蛋白进样到已活化并结合Ni⁺的IDA树脂上，用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现稳定的蛋白峰时，开始收集直到该峰消失为止。重组酶蛋白经过分离纯化后密封于无菌袋中放置于4℃冰箱以备后续实验，经测定，该野生型PVA的比活为6U/mg。

(2)重组野生型PVA蛋白的固定化

A、固定化载体的活化

准确量取60％的戊二醛30ml、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)4.76g溶解于600ml去离子水中，最后用去离子水定容至1000ml，同时用磷酸溶液调节其PH为6.0，灭菌后备用；将环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S(意大利ResindionS.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水反复冲洗2～3次后真空滤干备用。

B、酶的固定化

取一定量上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH 6.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。精确称取1g上述固定化酶进行活力测定，以ECEP和ECHA/S为载体的固定化酶酶活力分别为92U/g和71U/g，环氧基ECEP固定化酶活力明显高于氨基载体ECHA/S固定化酶，因此，选择ECEP作为青霉素V酰化酶的固定化载体。

实施例2：高活力PVA突变体的制备

2-1PVA突变体文库的构建

为了提高野生型PVA的活力，本发明人以重组表达载体pET-pva-wt为DNA模板，其中引物为T7通用引物(SEQ ID NO：9和10)，通过易错PCR的方法构建一个随机突变体文库，并通过调整易错PCR反应体系中Mg²⁺和Mn²⁺浓度以及dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率为千分之五，即保证一个突变体有1到3个氨基酸发生突变，构建突变体文库的具体过程如下。

易错PCR反应体系：

将上述得到的易错PCR产物进行电泳并切胶回收纯化，将纯化后的产物与原核表达载体pET30a(+)分别进行EcoR I和Xho I双酶切，酶切3小时分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4 DNA ligase于16℃过夜连接。第二天，按照实施例1-1的方法构建工程菌，即可得到一个库容量大的随机突变体文库。

2-2高活力PVA突变体文库的高通量筛选及突变体制备

用消毒牙签，将PVA突变体文库中的单菌落接种于装有LB培养基的96孔细胞培养板母板中，其中LB培养基体积为200μL/孔，且含有50μg/ml的卡那霉素，于37℃，250rmp的恒温摇床中培养8个小时后，取50μL菌液于另一块新的96孔细胞培养板中作为子板放置于4℃冰箱进行保种。保种后，加入0.5mM的IPTG于母板中，于25℃，250rmp的恒温摇床中再诱导培养8小时。诱导完毕后，将96孔细胞培养板放入-86℃的超低温冰箱中冻融2个小时，取出放置于室温中半个小时，后置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。在上述酶液中，按1：2体积比加入0.05mol/L，pH 6.0的磷酸缓冲液，于25℃温育1个小时。

取10μL上清加入含有100μL浓度(W/V)为10％青霉素V钾盐的96孔酶标板中，放置于25℃的恒温恒湿培养箱中反应2个小时，加入终止液160μL后，置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。

取50μL上清液加入含有100μL显色液的酶标板中进行显色3分钟后，置于酶标仪中，于波长405nm处测定其吸光值。

终止液：先分别配置100mmol/L NaOH和40％醋酸，按照1:2的比例混合。

显色液:0.5％(W/V)的对二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶液。

从上述突变子文库中筛选了约20000个克隆，得到10个颜色变化明显且数值比野生型PVA高的突变子。接着对这10个突变子进行复筛，具体过程为：将这10个突变子接种于含100ml LB培养基的500ml摇瓶中进行发酵及诱导，并通过滴定法测定活力，得到1个比对照活力高2倍克隆子，命名为PVA-1，经过测序结果显示PVA-1在第91位点氨基酸发生了改变，由T突变成了A。

实施例3：高底物浓度耐受性PVA突变体的制备

由于野生型PVA活性受青霉素V的浓度抑制，为了得到青霉素V高浓度耐受的突变体，提高其催化效率，本发明人在上述突变体PVA-1的基础上再次进行定向进化突变，按照上述实施例中的方法构建突变体文库并进行筛选(青霉素V钾盐浓度(W/V)由10％提高到20％)。从上述突变子文库中筛选了约20000个克隆，得到5个颜色变化明显且数值比PVA-1高的突变子。经摇瓶复筛选，得到1个比PVA-1活力高2倍克隆子，命名为PVA-2，经过测序结果显示PVA-2相对于野生型青霉素V酰化酶，其在第91位点氨基酸发生了改变，由T突变成了A，在第280位点氨基酸发生了改变，由I突变成了F。且该突变体的青霉素V高浓度耐受性显著提升。

实施例4：稳定性提高的PVA突变体的制备

许多研究表明，二硫键的形成对于稳定蛋白质的空间结构和保持其活性功能具有极其重要的影响。因此，我们利用二硫键预测分析软件(DiANNA1.1)对PVA进行全蛋白分析，发现其具有3个C，其中第4和第286位点的2个C形成1对二硫键，另外第116位点的C为游离的，而该游离的C会影响PVA的蛋白结构的稳定性。为了使第116位点的C形成二硫键，我们将第110位点的S定点突变成C，经DiANNA1.1软件分析，这2个C形成稳定的二硫键，其分析结果如下表2所示。

表2

具体实验过程如下：

突变引物：

S110Cf:TATGTGATTTGCCAGGTGCTGGGCAACTGCGTGACCGTG

S110Cr：CAGCACCTGGCAAATCACATACACCGGATTAATGCCGGTG

以PVA-2为模板，S110Cf/S110Cr为突变引物，运用全质粒PCR技术进行全长扩增，将扩增后的全长基因用DpnI酶切消化去除模板后，进行纯化，化转BL21(DE3)中，于37℃过夜培养，测序正确后，即得到将第110位点的Ser定点突变成Cys的突变体，我们将其命名为PVA-3，其中PCR所用的KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶及相应PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs溶液均购买于TOYOBO公司，并参照其说明书进行PCR反应体系的配置及PCR反应条件的设定。

按实施例1中的方法对PVA-3进行摇瓶发酵、纯化及固定化。同时，对不同的PVA在50℃的热稳定性进行了测定分析。

通过测定发现，突变体PVA-1、PVA-2和PVA-3相对于野生型PVA，在50℃的半衰期都有提高，其中PVA-3效果最显著，半衰期提高至原来的8倍，具体结果如表3所示。这是因为PVA-3中引入的S110C突变，其与第116位点的C形成二硫键，该二硫键使酶蛋白结构更稳定，从而显著提高酶的热稳定性。

表3各PVA突变体与野生型PVA在50℃的热稳定性

编号	氨基酸突变点	T<sub>1/2</sub>(min)	编号	氨基酸突变点	T<sub>1/2</sub>(min)
						PVA-WT	野生型	11	PVA-2	T91A/I280F	15.8
PVA-1	T91A	15.6	PVA-3	T91A/I280F/S110C	88.2

实施例5突变体PVA-3固定化酶的性质及其制备6-APA的应用

5-1突变体PVA-3酶学性质

按照实施例1的方法对上述野生型及突变型PVA纯酶及其固定化酶进行活力检测，突变体PVA-3与其他突变子酶学性质比较见表4。

表4野生型及突变型PVA酶学性质比较

酶	突变位点	比活(U/mg)	固定化酶活力(U/g)
				PVA-WT	无	6	92
PVA-1	T91A	11.3	177
				PVA-2	T91A/I280F	23.2	328
PVA-3	T91A/I280F/S110C	55.3	820

由表3可知，突变体PVA相对于野生型PVA，其比活提高了9倍，固定化活力由92U/g提高到820U/g，说明该突变体固定化酶相对于野生型固定化酶具有更好的应用前景。

5-2突变体PVA-3固定化酶底物耐受性实验

将上述野生型及突变型PVA固定化酶，以相同酶量(1000U活力)分别置于5％、10％、15％、20％、25％和30％的青霉素V钾盐底物溶液中，于25℃温育1个小时，后取出固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，以确保固定化酶中不存在缓冲液残留，将处理后的固定化酶测定其残余活力，具体结果如表5所示。

表5野生型及突变型PVA固定化酶底物耐受性比较

根据表5结果可知，PVA-3固定化酶在25％底物浓度条件下还保持约98％的活力，在30％底物浓度条件下还保持约90％的活力，在5％-20％条件下活性基本没有变化，表明该酶在高底物浓度条件下保持稳定。

5-3野生型PVA与PVA-3固定化酶水解青霉素V制备6-APA实验

(1)水解反应

将上述野生型PVA及PVA-3固定化酶，以相同酶量(5000U)分别置于一定浓度(10％、15％、20％、25％和30％)的青霉素V溶液中，于25℃，pH6.0条件下反应，反应过程中不断滴加3mol/L的浓氨水中和反应过程中产生的酸，使pH恒定在6.00，并记录氨水的加量，当反应达到终点后(判定终点的方法是：氨水自动停止补加，pH值维持在3min以上不变)，记录下总反应时间。将上述水解液过滤，固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，备用。

(2)6-APA结晶反应

将上述过滤后的水解液置于温度为0～8℃水浴锅中，按体积的80％加入预冷的无水甲醇于水解溶液中，开启搅拌并缓慢滴加6mol/L的浓HCl；在30～45min内滴加HCl至pH4.20；在0～4℃水浴中继续结晶1.5h；将结晶液过滤，先用预冷去离子水洗涤一次，再用丙酮洗涤3次，用真空抽干后置于干燥器中过夜干燥，称重装袋后，检测6-APA水分、含量以及青霉素V残留并计算青霉素V的转化率，具体实验对比数据见表6。

表6野生型PVA与PVA-3固定化酶转化应用实验对比

5-4突变体PVA-3固定化酶操作稳定性批次实验

由表5可知，PVA-3固定化酶反应的最佳底物浓度为25％，因此，为了更好地反映该突变体的稳定性，本发明人实验过程中将其反应条件设定如下：青霉素V浓度为25％，PVA-6固定化酶(820U/g)总投量为5000U，反应pH为6.0，反应温度为25℃，反应体积为1000ml，具体实验结果如表7所示。

表7突变体PVA-3固定化酶操作稳定性批次实验

批次	反应时间(min)	残余活力(U/g)	批次	反应时间(min)	残余活力(U/g)
						1	60	820	300	70	753
50	60	812	400	75	712
						100	63	798	500	80	668
200	65	775	600	90	603

通过PVA-3固定化酶操作稳定性批次实验可知，本发明制备的PVA-3固定化酶经过连续600批次转化实验，其反应时间没有明显延长，固定化酶活力没有明显下降，显示出本发明制备的PVA-3固定化酶具有良好的操作稳定性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南福来格生物技术有限公司

<120> 一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用

<130> 201809

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> Bacillus sphaericus野生型青霉素V酰化酶氨基酸序列()

<400> 1

atgctgggtt gtagtagcct gagcattcgc acgacggacg ataaaagtct gtttgcccgc 60

acgatggatt tcacgatgga accggatagc aaagtgatta ttgtgccgcg taactatggc 120

attcgcctgc tggaaaaaga aaacgtggtg atcaacaaca gctatgcgtt tgtgggcatg 180

ggcagcaccg atattaccag cccggtgctg tatgatggcg tgaatgaaaa aggcctgatg 240

ggcgcgatgc tgtattatgc gacctttgcg acctatgcgg atgaaccgaa gaaaggcacc 300

accggcatta atccggtgta tgtgattagc caggtgctgg gcaactgcgt gaccgtggat 360

gatgtgattg aaaaactgac cagctatacc ctgctgaacg aagcgaatat tattctgggc 420

tttgcgccgc cgctgcatta tacctttacc gatgcgagcg gcgaaagcat tgtgattgaa 480

ccggataaaa ccggcattac cattcatcgt aaaaccattg gcgtgatgac caacagcccg 540

ggctatgaat ggcatcagac caatctgcgc gcgtatattg gcgtgacccc gaacccgccg 600

caggatatta tgatgggcga tctggatctg accccgtttg gtcagggtgc gggcggcctg 660

ggtctgccgg gtgattttac cccgagcgcc cgttttctgc gtgtggccta ctggaaaaaa 720

tacaccgaaa aagcgaaaaa cgaaaccgaa ggcgtgacca acctgtttca tattctgagc 780

agcgtgaaca ttccgaaagg cgtggtgctg accaatgaag gcaaaaccga ttataccatt 840

tataccagcg cgatgtgcgc gcagagcaaa aactactact tcaaactgta cgataatagc 900

cgtattagcg ccgtgagcct gatggcggaa aacctgaata gccaggatct gattaccttt 960

gaatgggacc gtaaacagga tattaaacaa ctgaaccaag tgaatgtgat gagc 1014

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

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<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Ile Ile Val Pro Arg Asn Tyr Gly Ile Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn

35 40 45

Val Val Ile Asn Asn Ser Tyr Ala Phe Val Gly Met Gly Ser Thr Asp

50 55 60

Ile Thr Ser Pro Val Leu Tyr Asp Gly Val Asn Glu Lys Gly Leu Met

65 70 75 80

Gly Ala Met Leu Tyr Tyr Ala Thr Phe Ala Thr Tyr Ala Asp Glu Pro

85 90 95

Lys Lys Gly Thr Thr Gly Ile Asn Pro Val Tyr Val Ile Ser Gln Val

100 105 110

Leu Gly Asn Cys Val Thr Val Asp Asp Val Ile Glu Lys Leu Thr Ser

115 120 125

Tyr Thr Leu Leu Asn Glu Ala Asn Ile Ile Leu Gly Phe Ala Pro Pro

130 135 140

Leu His Tyr Thr Phe Thr Asp Ala Ser Gly Glu Ser Ile Val Ile Glu

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Pro Asp Lys Thr Gly Ile Thr Ile His Arg Lys Thr Ile Gly Val Met

165 170 175

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180 185 190

Ile Gly Val Thr Pro Asn Pro Pro Gln Asp Ile Met Met Gly Asp Leu

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Asp Leu Thr Pro Phe Gly Gln Gly Ala Gly Gly Leu Gly Leu Pro Gly

210 215 220

Asp Phe Thr Pro Ser Ala Arg Phe Leu Arg Val Ala Tyr Trp Lys Lys

225 230 235 240

Tyr Thr Glu Lys Ala Lys Asn Glu Thr Glu Gly Val Thr Asn Leu Phe

245 250 255

His Ile Leu Ser Ser Val Asn Ile Pro Lys Gly Val Val Leu Thr Asn

260 265 270

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275 280 285

Ser Lys Asn Tyr Tyr Phe Lys Leu Tyr Asp Asn Ser Arg Ile Ser Ala

290 295 300

Val Ser Leu Met Ala Glu Asn Leu Asn Ser Gln Asp Leu Ile Thr Phe

305 310 315 320

Glu Trp Asp Arg Lys Gln Asp Ile Lys Gln Leu Asn Gln Val Asn Val

325 330 335

Met Ser

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<211> 1014

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<213> PVA-1突变体(T91A编码基因)

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<210> 8

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<213> PVA-3突变体(T91A/I280F/S110C氨基酸序列)

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Claims

1.一种青霉素V酰化酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，优选将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的青霉素V酰化酶第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，优选的突变体命名为PVA-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种青霉素V酰化酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，优选将具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，优选的突变体命名为PVA-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种青霉素V酰化酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第110位的丝氨酸突变成半胱氨酸，优选将具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸第91位的苏氨酸突变成丙氨酸，第280位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第110位的丝氨酸突变成半胱氨酸，优选的突变体命名为PVA-3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.一种编码青霉素V酰化酶突变体的基因序列，其特征在于，为编码权利要求1-3任一项所述的青霉素V酰化酶突变体中的任一种的基因序列。

5.含有权利要求4所述编码基因中的一种或几种的的重组表达载体。

6.含有权利要求5所述重组表达载体中的一种或几种的基因工程菌。

7.一种固定化青霉素V酰化酶突变体，其特征在于，利用环氧基载体或氨基载体将权利要求1-3任一项所述的青霉素V酰化酶突变体进行固定化。

8.青霉素V酰化酶突变体的应用，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的青霉素V酰化酶突变体，或者权利要求7所述的固定化青霉素V酰化酶突变体催化水解青霉素V制备6-APA。

9.根据权利要求8所述的青霉素V酰化酶突变体的应用，其特征在于，，所述固定化青霉素V酰化酶突变体水解青霉素V制备6-APA时，其转化条件为：底物青霉素V浓度(W/V)为15％～30％，优选为20％～30％，更优选为25％，转化温度为20～25℃，pH为6.0～6.5。