CN109628541A - 一种酶法合成青霉素v盐的方法 - Google Patents
一种酶法合成青霉素v盐的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109628541A CN109628541A CN201910089112.1A CN201910089112A CN109628541A CN 109628541 A CN109628541 A CN 109628541A CN 201910089112 A CN201910089112 A CN 201910089112A CN 109628541 A CN109628541 A CN 109628541A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- penicillin
- salt
- ospen
- solution
- crystal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical class N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005352 clarification Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 20
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 claims abstract description 19
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical class OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 claims description 5
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 claims description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 2
- YAVVGPBYBUYPSR-UHFFFAOYSA-N benzene;oxygen Chemical compound [O].C1=CC=CC=C1 YAVVGPBYBUYPSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- AAEQXEDPVFIFDK-UHFFFAOYSA-N 3-(4-fluorobenzoyl)-2-(2-methylpropanoyl)-n,3-diphenyloxirane-2-carboxamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC(=O)C1(C(=O)C(C)C)OC1(C=1C=CC=CC=1)C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 AAEQXEDPVFIFDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 abstract description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 7
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 abstract description 3
- HCTVWSOKIJULET-LQDWTQKMSA-M phenoxymethylpenicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 HCTVWSOKIJULET-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 3
- IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- HRDXJKGNWSUIBT-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Chemical group [CH2]OC1=CC=CC=C1 HRDXJKGNWSUIBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- -1 phenoxy acetic acid glycol ester Chemical class 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- OPEGYZAATHKDEM-HCWXCVPCSA-N (2r,4s)-2-[(r)-carboxy(formamido)methyl]-5,5-dimethyl-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound CC1(C)S[C@H]([C@H](NC=O)C(O)=O)N[C@H]1C(O)=O OPEGYZAATHKDEM-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000025047 Non-histaminic angioedema Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940127249 oral antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 229940124585 oral penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229940090663 penicillin v potassium Drugs 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- LFBBSWBQNQXKPF-LQDWTQKMSA-M sodium;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenoxyacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 LFBBSWBQNQXKPF-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法是将6‑APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在溶液中进行酶催化反应生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得青霉素V盐，该方法与现有技术相比，生产周期短、操作简单、绿色无污染、生产成本低，制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4‑羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，产品质量远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准，具有良好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种青霉素V盐的合成方法，特别涉及一种6-APA和苯氧乙酸衍生物原料在青霉素酰化酶催化作用下一步反应生成青霉素V的方法，属于医药化工技术领域。
背景技术
青霉素V盐(青霉素V钾、青霉素V钠)是临床上常用的抗生素药物，其中青霉素V钾应用更广泛。青霉素V钾属β-内酰胺酶类抗生素，抗菌谱与青霉素G相似，能够破坏细菌细胞壁，具有杀菌作用，是治疗革兰阳性菌及部分阴性菌感染的首选药物，临床上已广泛应用于治疗脓肿、化脓性脑膜炎，肺炎、淋病等症。青霉素V钾与青霉素G钾/钠相比，其对酸稳定，不易被胃酸破坏，口服吸收好，其口服制剂尤其适合儿童使用。另外，被β-内酰胺酶的破坏比青霉素G钾/钠慢，故对耐药性金葡菌引起的感染比青霉素G钾/钠更有效。
国外青霉素V钾片最早于1952年开始应用于临床，1957年9月获美国FDA批准，美国药典、英国药典、日本药局方等均有收载。目前，美国、加拿大、英国、德国、日本等国家均有生产，是国际上临床使用较广泛的一种口服抗生素。青霉素应用至今发生过敏反应的机率较高，常见的过敏反应包括皮疹、荨麻疹、皮炎、发热、血管神经性水肿、哮喘、过敏性休克等，其中以过敏性休克最为严重，甚至可导致死亡。为了防止过敏反应的发生，特别是严重过敏反应的发生，国内规定青霉素在使用前需要做皮肤敏感试验，皮试阴性的药物可以给病人使用，皮试阳性的则禁止使用，而在国外口服的青霉素类药品均是免皮试的。
近年来口服青霉素V制剂的需求量大大增加，但是国内生产的青霉素V盐原料药产品质量同国外的原料药质量相比还存在相当大的距离。因此，如何生产达到甚至超过国外原料药质量水平的青霉素V盐、得到杂质含量低尤其是聚合物杂质含量低的青霉素V盐，是一个有重大意义的课题。
目前国内能自行生产青霉素V钾原料药的供应商主要是华北制药，利用微生物菌株从发酵工艺生产，所述菌株能在存在侧链前体苯氧乙酸时生产青霉素V，发酵之后，从发酵培养液中回收青霉素V。如中国专利(CN101747341A)提到的青霉素V钾的生产方法包括如下工序：发酵、酸化提取、脱色过滤、碳酸盐溶液抽提、共沸结晶、洗涤、干燥，整个过程需要半个月以上。青霉素V钾原料及制剂中可能会含有其合成前体、工艺副产物以及各种降解产物；另外，青霉素V钾也可能自身聚合，产生高分子聚合物。工艺副产物、降解产物和聚合物杂质最大来源是生产过程，生产过程越长，杂质产生几率越大。β-内酰胺类抗生素所致的过敏反应，经多年来的研究已经证明和药物中存在的高分子聚合物有关。现有的生产青霉素V钾的方法因发酵周期长、生产工序长，故各种工艺副产物、降解产物和聚合物杂质含量高。与发酵法相比，酶法合成法具有生产周期短、工艺简单、反应条件温和、转化率高、副产物少、杂质含量少、产品质量高等优点，近年来受到广泛关注，目前未见酶法合成青霉素V盐的公开文献报道。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明的目的是在于提供一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法生产周期短、操作简单、绿色无污染、生产成本低，制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，产品质量远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法是将6-APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在溶液中进行酶催化反应生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得；所述青霉素酰化酶包括青霉素G酰化酶突变体和/或青霉素V酰化酶突变体。
优选的方案，所述苯氧乙酸衍生物具有式1结构：
其中，R为-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH(CH3)2、-O(CH2)3CH3、-OCH2(CHOH)2CH2OH、-NH2或本发明的苯氧乙酸衍生物中R主要为离去基团，其对反应的影响相对较小，理论上选择范围较广，本发明优选为本领域常见的有机取代基团。
优选的方案，所述青霉素酰化酶以固定化细胞形式和固定化酶形式加入。本发明的青霉素酰化酶采用固定化细胞形式和固定化酶形式加入，主要是使酶更稳定化，更有利于后续的酶与反应液的分离，通过简单的过滤即可实现酶的分离回收，实现再利用。本发明的采用的青霉素G酰化酶及青霉素V酰化酶均来自现有技术，如中国专利(CN105274082A)或(CN105087533A)中报道的青霉素G酰化酶突变体，以及(Enzyme and microbialtechnology，Volume 119，December 2018，Pages 65-70)中报道的青霉素V酰化酶突变体。而本发明技术方案首次发现这两种酶可以催化6-APA和苯氧乙酸衍生物之间的反应一步高选择性合成青霉素V。
优选的方案，6-APA与苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1：1.1～1.5。
优选的方案，6-APA与青霉素酰化酶的重量比为1：2～4。
优选的方案，所述酶催化反应的条件为：在温度为5～40℃，pH为4.0～8.0条件下，反应1～2h。较优选的温度为10～30℃。较优选的pH为5.0～6.0。较优选的反应时间为80～100min。在优选的条件下有利于酶活性的发挥，提高酶催化反应效率。
优选的方案，所述酸化过程为：采用酸液调节溶液pH值至2.5～3.5，养晶10～30分钟。在优选的条件下有利于青霉素V晶体的生成和长大。酸液可以为盐酸、硫酸等常见酸液。
优选的方案，所述盐化过程为：将青霉素V晶体采用碳酸盐溶液调节pH5.5～7.5，再添加带水剂，减压蒸发浓缩至晶体析出。碳酸盐主要是指碳酸钠或碳酸钾。带水剂如正丁醇、甲苯等，带水剂主要是与水形成共沸，带走水分。
本发明的青霉素V盐的制备过程中，由原料到获得产物，整个合成、纯化及结晶全过程不超过24小时。
本发明制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％。
本发明的青霉素V盐合成路线如下：
相对现有技术，本发明技术方案带来的有益效果为：
本发明首次发现最新报道的青霉素G酰化酶突变体和青霉素V酰化酶突变体对6-APA和苯氧乙酸衍生物之间的反应具有很好的催化活性，可以实现青霉素V的高效合成，以进一步获得高纯度青霉素V盐。
本发明的青霉素V盐的生产周期短，青霉素V盐合成、纯化、结晶全过程不超过24小时。
本发明的青霉素V盐的生产过程操作简单，只需一步合成和两步结晶步骤。
本发明的青霉素V盐的合成过程绿色无污染，不需使用醋酸丁酯等进行萃取纯化。
本发明的青霉素V盐合成以6-APA和苯氧乙酸衍生物为原材料，且青霉素酰化酶可以反复利用，成本低。
本发明的青霉素V盐产品质量好，远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准，液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，可改变国内现有的青霉素V药物必须做皮试的现状。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的青霉素V钾结晶粉HPLC检测色谱图。
图2是本发明实施例2中制备青霉素V反应过程中HPLC检测色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步阐明本发明内容，但不以任何形式限制本发明权利要求保护范围。
实施例1
取25.0g 6-APA，加入300mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入30.0g苯氧乙酸乙二醇酯，混合均匀，加入50.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH5.0，温度30℃，反应90分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.8mg/mL，青霉素V浓度为106.9mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至3.0，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至5倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.0，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉38.8g，青霉素V钾摩尔收率86.39％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，青霉素V钾液相纯度99.80％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.010％。
实施例2
取25.0g 6-APA，加入400mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入30.0g苯氧乙酸甘油酯，混合均匀，加入75.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH6.0，温度20℃，反应80分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.3mg/mL，青霉素V浓度为87.5mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至2.8，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至4倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.3，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉39.1g，青霉素V钾摩尔收率87.06％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，青霉素V钾液相纯度99.85％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.011％。
实施例3
取25.0g 6-APA，加入400mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入35.0g苯氧乙酸丁四醇酯，混合均匀，加入50.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH5.0，温度30℃，反应90分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.5mg/mL，青霉素V浓度为89.0mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至2.8，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至4倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.5，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉40.5g，青霉素V钾摩尔收率90.18％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，其中青霉素V钾液相纯度99.77％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.015％。
以上实施例制备的青霉素V钾结晶粉的有关物质检测情况见表1，聚合物检测情况见表2，有关物质和聚合物按照《中国药典》2015版第二部青霉素药典方法检查。
表1不同来源的青霉素V钾结晶粉杂质对比
/代表未检出，杂质D指4-羟基苯氧甲基青霉素对照品，杂质E指苯氧甲基青霉噻唑酸对照品，杂质F指苯氧甲基脱羧青霉噻唑酸对照品。
表2不同来源的青霉素V钾结晶粉聚合物杂质含量对比
Claims (8)
1.一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：将6-APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在溶液中进行酶催化反应生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得；所述青霉素酰化酶包括青霉素G酰化酶突变体和/或青霉素V酰化酶突变体。
2.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述苯氧乙酸衍生物具有式1结构：
其中，R为-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH(CH3)2、-O(CH2)3CH3、-OCH2(CHOH)2CH2OH、-NH2或
3.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述青霉素酰化酶以固定化细胞形式和固定化酶形式加入。
4.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：6-APA与苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1：1.1～1.5；6-APA与青霉素酰化酶的重量比为1：2～4。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：在温度为5～40℃，pH为4.0～8.0条件下，反应1～2h。
6.根据权利要求5所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：在温度为10～30℃，pH为5.0～6.0条件下，反应1～2h。
7.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述酸化过程为：采用酸液调节溶液pH值至2.5～3.5，养晶10～30分钟。
8.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述盐化过程为：将青霉素V晶体采用碳酸盐溶液调节pH 5.5～7.5，再添加带水剂，减压蒸发浓缩至晶体析出。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910089112.1A CN109628541B (zh) | 2019-01-30 | 2019-01-30 | 一种酶法合成青霉素v盐的方法 |
| CN202080011415.2A CN113365973B (zh) | 2019-01-30 | 2020-01-15 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
| PCT/CN2020/072246 WO2020156176A1 (zh) | 2019-01-30 | 2020-01-15 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910089112.1A CN109628541B (zh) | 2019-01-30 | 2019-01-30 | 一种酶法合成青霉素v盐的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109628541A true CN109628541A (zh) | 2019-04-16 |
| CN109628541B CN109628541B (zh) | 2020-03-17 |
Family
ID=66064194
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910089112.1A Active CN109628541B (zh) | 2019-01-30 | 2019-01-30 | 一种酶法合成青霉素v盐的方法 |
| CN202080011415.2A Active CN113365973B (zh) | 2019-01-30 | 2020-01-15 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080011415.2A Active CN113365973B (zh) | 2019-01-30 | 2020-01-15 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN109628541B (zh) |
| WO (1) | WO2020156176A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110923148A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-03-27 | 华北制药股份有限公司 | 青霉素v钾高产菌及其在发酵生产青霉素v钾中的应用 |
| CN111272916A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-12 | 河北华北制药华恒药业有限公司 | 一种青霉素v酸含量的检测方法 |
| WO2020156176A1 (zh) * | 2019-01-30 | 2020-08-06 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132513A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-09 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法 |
| CN109161540A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-01-08 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109628541B (zh) * | 2019-01-30 | 2020-03-17 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种酶法合成青霉素v盐的方法 |
-
2019
- 2019-01-30 CN CN201910089112.1A patent/CN109628541B/zh active Active
-
2020
- 2020-01-15 WO PCT/CN2020/072246 patent/WO2020156176A1/zh active Application Filing
- 2020-01-15 CN CN202080011415.2A patent/CN113365973B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132513A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-09 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法 |
| CN109161540A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-01-08 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种青霉素v酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SENWEN DENG等: "Efficient cascade synthesis of ampicillin from penicillin G potassium salt using wild and mutant penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| 刘振梅: "《中等专业学校教材 药物化学》", 31 January 2006, 中国医药科技出版社 * |
| 刘芳: "青霉素G酰化酶反应机理的说明", 《现代商贸工业》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020156176A1 (zh) * | 2019-01-30 | 2020-08-06 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
| CN113365973A (zh) * | 2019-01-30 | 2021-09-07 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
| CN113365973B (zh) * | 2019-01-30 | 2024-04-19 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 苯氧乙酸衍生物及利用其酶法制备青霉素v盐的方法 |
| CN110923148A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-03-27 | 华北制药股份有限公司 | 青霉素v钾高产菌及其在发酵生产青霉素v钾中的应用 |
| CN111272916A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-12 | 河北华北制药华恒药业有限公司 | 一种青霉素v酸含量的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113365973A (zh) | 2021-09-07 |
| CN113365973B (zh) | 2024-04-19 |
| WO2020156176A1 (zh) | 2020-08-06 |
| CN109628541B (zh) | 2020-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100564382C (zh) | 头孢呋辛钠的合成方法 | |
| CN109628541A (zh) | 一种酶法合成青霉素v盐的方法 | |
| CN110590867B (zh) | 一种d-氨基葡萄糖盐酸盐的合成方法 | |
| CN1896259A (zh) | 一种生产γ－氨基丁酸的方法及其专用反应柱 | |
| CN111039861A (zh) | 一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺 | |
| CN104447800B (zh) | 一种头孢西丁酸的合成技术 | |
| CN102153566B (zh) | 头孢地尼的制备方法 | |
| CA1075627A (en) | Antibiotic lucknomycin from streptomyces diastatochromogenes | |
| CN102559829A (zh) | 头孢曲松钠粗盐的合成方法 | |
| CN112645912A (zh) | 一种高纯度m2晶型麦考酚钠的制备方法 | |
| CN106222230A (zh) | 一种绿色酶法合成头孢克洛的方法 | |
| CN113699209B (zh) | 一种7-adca回收方法 | |
| CN112322688B (zh) | 一种从酶催化合成头孢丙烯生产废液中回收7-apra的方法 | |
| CN115247193A (zh) | 一种尿苷的工业化生产方法 | |
| CN101906052B (zh) | 一种制备d-间羟基苯甘氨酸的方法 | |
| JP2873894B2 (ja) | 環状デプシペプチドおよびその製造法 | |
| CN113072567B (zh) | 一种拉氧头孢钠合成工艺 | |
| JPS5923794B2 (ja) | ジヒドロキシアセトンの製造法 | |
| CN109371095B (zh) | 一种酶法合成阿莫西林的方法 | |
| CN113234092A (zh) | 一种头孢类中间体7-氨基3-去乙酰氧基头孢烷酸及其制备方法 | |
| CN110563750B (zh) | 一种头孢西酮的合成方法 | |
| CN110642922B (zh) | 一类甲硝唑接丝氨酸二肽化合物及其制备与应用 | |
| CN117987487A (zh) | 基于酶法合成异丙叉克林霉素棕榈酸酯的方法 | |
| JP2631867B2 (ja) | （ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル−３−ブテン酸の製造方法 | |
| JPH0740951B2 (ja) | 微生物による含窒素複素環化合物の水酸化物の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method for enzymatic synthesis of penicillin V salt Granted publication date: 20200317 Pledgee: Changsha Bank city branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: HUNAN FLAG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012003 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |