CN115247193A - 一种尿苷的工业化生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尿苷的工业化生产方法。该生产方法采用含有胞苷的料液或胞苷粗品为底物配置溶液，流经固定化处理的胞苷脱氨酶树脂柱，转化温度25‑35℃，pH：7‑9，转化时间6‑8h。HPLC检测转化液，当转化率大于98%时，停止转化，收集转化液。转化液经脱色，浓缩结晶干燥，精制得到尿苷成品。经实际生产，转化率98%以上，成品尿苷HPLC纯度达到99.8%以上，多批累计收率86%以上。固定化酶树脂柱可连续转化10批以上，转化效率无明显下降。多次转化树脂柱效率降低后，酶重新挂柱处理，树脂可重复利用。本发明利用相对低值的胞苷原料得到高值的尿苷产品，生产效率高，生产成本低，利于工业化连续生产。

Description

一种尿苷的工业化生产方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化酶工业化生产尿苷的方法。
背景技术
尿苷，白色针状结晶或粉末，无气味，味稍甜而微辛，系核苷类的一种，能溶于水，微溶于稀醇，不溶于无水乙醇。尿苷是一种药物，可用于巨型红血球贫血，也可与其他核苷、碱基合用于治疗肝、脑血管、心血管等疾病；也是制造氟尿嘧啶、脱氧核苷、碘苷、溴苷、氟苷等药物的主要原料。
在食品方面，尿苷是5＇-尿苷酸的前体，尿苷酸是构成细胞核糖核酸的4种主要单核苷酸之一，参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸的生物合成；而尿苷酸钠不仅可作为调味品、分子生物学试剂及制药原料，还可作为食品添加剂添加到牛奶中，以生产接近母乳的牛乳，增强婴儿的免疫力，如惠氏等10多个品牌的奶粉中都添加了5＇-核苷酸。
作为目前最有希望成为对抗新冠病毒特效药物之一的Molnupiravir是由默沙东/Ridgeback公司联合研发的小分子药物。在2021年11月4日，该公司宣称该药物已经获得英国药品和保健产品监管局（MHRA）批准上市。目前该药物主要由尿苷作为起始物料合成，其大规模生产商业化潜力巨大。
目前核苷主流的生产方法发酵法包括直接发酵法、添加前提物发酵法和基因重组技术构建生产菌进行发酵生产。
直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及核苷类似物抗突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，达到在发酵过程中积累嘧啶核苷的目的。
添前体发酵法是利用核苷酸生物合成途径的补救途径，通过在核苷生产菌的培养基中添加前体物尿嘧啶，使嘧啶碱基通过补救途径直接合成核苷，增加尿苷的生成量。如CN113929299A公开一种利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶一步转化为尿苷的方法。
基因工程技术改造菌株，如基因克隆、基因敲除等，因其无次级突变、改造目的性强、实验周期短等优势逐渐受到人们重视。如CN108486162A利用分子生物学方法向Bacillus subtilis A219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基中引入突变位点获得工程菌；在发酵罐中对工程菌进行发酵培养获得尿苷发酵液。如CN113755414A对尿苷的降解及利用基因进行了敲除，对尿苷生物合成途径中的关键酶进行了过表达，对嘧啶核苷途径进行了基因改造，解除合成途径的反馈抑制。
胞苷脱氨酶（cyditine deaminase）是嘧啶代谢途径中的一种酶，催化胞苷和脱氧胞苷不可逆水解脱氨形成相应的尿苷和脱氧尿苷，广泛存在于细菌、人和高等植物。
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在胞苷的发酵生产中，要提高胞苷的产量，由枯草芽孢杆菌嘧啶核苷生物合成及其代谢调控可知，可首先通过诱变得到一株胞苷生产菌枯草芽孢杆菌，再通过同源重组的方法敲除胞苷脱氨酶基因，构建出遗传稳定的胞苷脱氨酶缺失株，阻止胞苷通过胞苷脱氨酶代谢为尿苷和尿嘧啶，使胞苷得到积累。反之，利用胞苷脱氨酶，可以使胞苷高效一步地代谢为尿苷。如CN103031295B以含冬虫夏草胞苷脱氨酶菌体发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，以胞苷为底物，经一定条件转化尿苷粗品，分离纯化的到尿苷。但转化率只有81%-86%，且催化剂一次使用后不可回收利用，不利于降低生产成本和工业化大规模连续生产。
固定化酶技术可以很好的解决上述问题，固定化酶（immobilized enzyme）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好。在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高。固定化酶的催化反应过程更易控制。固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作，特别适合工业化大规模连续生产。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种固定化酶生产尿苷的方法，适用于工业化大规模连续生产。本发明利用胞苷发酵液或胞苷粗品为底物配制溶液，循环流经固定化处理的胞苷脱氨酶树脂柱，催化氨解得到尿苷转化液，转化液经精制结晶得到尿苷产品。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种尿苷的工业化生产方法，包括以下步骤：
（1）将含有胞苷的料液或胞苷粗品配置为一定浓度的底物溶液，循环流经固定化处理的胞苷脱氨酶树脂柱。
（2）HPLC检测转化液，当转化率大于98%时，停止转化，收集转化液。
（3）转化液经脱色，浓缩结晶干燥，得到尿苷成品，HPLC检测纯度。
优选的，步骤1将含有胞苷的料液或胞苷粗品配置为0.5mol/L-1.3mol/L的底物溶液，循环流经固定化处理的胞苷脱氨酶树脂柱，固定化酶树脂量：底物量为1:4-1:10，增加固定化酶树脂量比可缩短转化时间。更优选的，固定化酶树脂量：底物量为1:5。
优选的，步骤1转化液流速为30-50VB/h，转化温度控制在适合酶反应的25-35℃。随着酶反应的进行，脱出的氨使转化液pH值升高，影响酶的活性和阻碍反应的平衡，加入酸可促进正反应进行，这里选用二氧化碳气瓶往转化液中通入二氧化碳气体，压力为0.01-0.2MPa。二氧化碳溶解后生成碳酸，控制转化液pH值在7-9。相比其他液酸，二氧化碳可以浓缩后去除，减少带入杂质，有利于后续精制。根据固定化酶树脂和底物的量比，转化时间为6-8小时。
优选的，步骤2HPLC检测转化，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为乙腈：乙酸铵缓冲液=3：97；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。当检测转化率大于98%时，停止转化，收集转化液。
优选的，步骤3转化液加入2%活性炭脱色，精密过滤，真空浓缩至浓度为70-75%粘稠液，缓慢降温至18-24℃结晶，加入适量乙醇出料，甲醇或乙醇的其中一种洗涤晶体，真空干燥得到尿苷产品。
优选的，步骤3HPLC检测纯度，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为甲醇：磷酸二氢钾缓冲液=5：95；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
本发明的有益效果在于：
1、采用固定化酶技术将胞苷脱氨酶固定在树脂上，酶的稳定性提高，既可搅拌也可装柱，酶树脂可反复使用，提高了反应效率，转化率98%以上，成品尿苷HPLC纯度达到99.8%以上，多批累计收率86%以上。
2、固定化酶树脂柱可连续转化10批以上，转化效率无明显下降；多次转化树脂柱效率降低后，酶重新挂柱处理，树脂可重复利用，降低了使用成本。
3、酶树脂易与转化液分离，碳酸调节pH值促进了反应进行，简化了提纯工艺，反应温和，生产条件要求低，生产成本低，环境影响小，利于大规模工业化连续生产。
附图说明
图1：实施例3转化2h后HPLC检测图谱。
图2：实施例3转化4h后HPLC检测图谱。
图3：实施例3转化6h后HPLC检测图谱。
图4：实施例3转化8h后HPLC检测图谱。
具体实施方式
实施例1
往投料罐中泵入浓度14%的胞苷发酵浓缩液5000L，浓度0.5mol/L，搅拌下25℃保温。循环流过175L固定化胞苷脱氨酶树脂柱，固定化酶树脂与底物胞苷的量比为1:4，流速50VB/h。二氧化碳气瓶往投料罐中通入二氧化碳，压力为0.01-0.2MPa，控制转化液pH值稳定在7-9。转化过程中HPLC检测转化液，转化7h转化率大于98%，转化完成，停止转化，收集转化液。用适量水冲洗柱子，转化液泵入脱色罐，投入10kg活性炭，60℃搅拌脱色30min，精密过滤。滤液泵入浓缩罐，真空浓缩至浓度为75%，缓慢搅拌降温至24℃结晶，加入适量乙醇出料，用少量乙醇洗涤晶体，晶体70℃真空干燥得到尿苷产品586kg。母液循环套用，树脂重复使用，4批后累计收率86.3%，HPLC检测纯度99.9%。
HPLC检测转化，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为乙腈：乙酸铵缓冲液=3：97；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
HPLC检测纯度，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为甲醇：磷酸二氢钾缓冲液=5：95；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
实施例2
往投料罐中泵入4000L纯化水，投入1500kg胞苷粗品，浓度1.3mol/L,搅拌下35℃保温。投入150L固定化胞苷脱氨酶树脂搅拌，固定化酶树脂与底物胞苷的量比为1:10，二氧化碳气瓶往投料罐中通入二氧化碳，压力为0.01-0.2MPa，控制转化液pH值稳定在8-9。转化过程中HPLC检测转化液，转化8h转化率大于98%。过滤树脂，用适量水冲洗树脂，转化液泵入脱色罐，投入25kg活性炭，60℃搅拌脱色30min，精密过滤。滤液泵入浓缩罐，真空浓缩至70%，缓慢搅拌降温至18℃结晶，加入适量乙醇出料，用少量乙醇洗涤晶体，晶体70℃真空干燥得到尿苷产品1261kg。母液循环套用，树脂重复使用，5批后累计收率86.5%，HPLC检测纯度99.9%。
HPLC检测转化，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为乙腈：乙酸铵缓冲液=3：97；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
HPLC检测纯度，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为甲醇：磷酸二氢钾缓冲液=5：95；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
实施例3
往投料罐中泵入4500L纯化水，投入1200kg胞苷粗品，浓度0.9mol/L，搅拌下32℃保温。循环流过240L固定化胞苷脱氨酶树脂柱，固定化酶树脂与底物胞苷的量比为1:5，流速36VB/h。二氧化碳气瓶往投料罐中通入二氧化碳，压力为0.01-0.2MPa，控制转化液pH值稳定在7-9。转化过程中HPLC检测转化液，检测图谱如附图1-4所示，结合表1，可得转化2h转化率为32.6%；结合表2，可得转化4h转化率为62.6%；结合表3，可得转化6h转化率为88.7%；结合表4，可得转化8h转化率为98.4%，此时转化完成，停止转化，收集转化液。用适量水冲洗柱子，转化液泵入脱色罐，投入20kg活性炭，60℃搅拌脱色30min，精密过滤。滤液泵入浓缩罐，真空浓缩至浓度73%，缓慢搅拌降温至20℃结晶，加入适量乙醇出料，用少量甲醇洗涤晶体，晶体70℃真空干燥得到尿苷产品1013kg。母液循环套用，树脂重复使用，4批后累计收率87%，HPLC检测纯度100%。
HPLC检测转化，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为乙腈：乙酸铵缓冲液=3：97；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
HPLC检测纯度，条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为甲醇：磷酸二氢钾缓冲液=5：95；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
表1 转化2h后HPLC检测数据
组分名 保留时间（min） 峰高（mv） 峰面积（mv.sec） 面积百分比（%）
胞苷 4.20917 109.13 1184.45 67.3911
尿苷 4.66917 49.80 573.13 32.6089
表2 转化4h后HPLC检测数据
组分名 保留时间（min） 峰高（mv） 峰面积（mv.sec） 面积百分比（%）
胞苷 4.22500 66.01 701.26 37.3347
尿苷 4.69333 104.86 1177.06 62.6653
表3 转化6h后HPLC检测数据
组分名 保留时间（min） 峰高（mv） 峰面积（mv.sec） 面积百分比（%）
胞苷 4.23667 22.12 231.03 11.2888
尿苷 4.71000 162.37 1815.54 88.7112
表3 转化8h后HPLC检测数据
组分名 保留时间（min） 峰高（mv） 峰面积（mv.sec） 面积百分比（%）
胞苷 4.23250 3.49 35.59 1.5802
尿苷 4.70583 197.06 2216.37 98.4198
如上表可见转化8h后转化率最高，转化率为98.4198%。
对比实施例1
现有技术的一种尿苷的制备方法：
往反应器中加入肌苷10kg，尿嘧啶5.5kg，密西根克雷伯氏湿菌体1.8kg，纯化水100L。以200rpm搅拌，55℃保温反应42h。微滤/离心得生物转化合成液。浓缩得到浓缩液，根据浓缩液中尿苷的量加入5倍无水乙醇热溶抽滤得到粗品溶液。粗品溶液加入1%活性炭，过滤降温结晶，离心得到尿苷湿品。湿品干燥后检验得HPLC含量99.9%，成品7.1kg。
对比实施例2
现有技术的一种尿苷的制备方法：
以含冬虫夏草胞苷脱氨酶菌体发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，催化剂干菌体浓度为6.7mg/ml，催化剂体积用量为100mg/g底物。以胞苷为底物，初始浓度为10g/L，于pH为6.5～8.5的缓冲溶液构成的转化体系中，在30℃、150rpm条件下转化反应2～3h，反应结束后，将反应液过滤，取滤液即为含尿苷的粗品，分离纯化获得尿苷，转化率81%-86%。
由以上可知，本发明的一种尿苷的工业化生产方法，所得到的产品收率高于现有技术的制备方法，转化率高，生产效率高，生产成本低，有利于工业化连续生产。
以上所述仅是本发明的示范性实施方式，而非用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由所附的权利要求确定。

Claims (9)

1.一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有胞苷的料液或胞苷粗品配置为一定浓度的底物溶液，循环流经固定化处理的胞苷脱氨酶树脂柱；
（2）HPLC检测转化液，当转化完全时，收集转化液；
（3）转化液经脱色，浓缩结晶干燥，得到尿苷成品，HPLC检测纯度。
2.根据权利要求1所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中底物胞苷料液配置的浓度为0.5mol/L-1.3mol/L。
3.根据权利要求2所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中胞苷脱氨酶树脂柱的固定化酶树脂与底物胞苷的量比为1:4-1:10。
4.根据权利要求3所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中转化条件为：转化流速为30-50VB/h，转化温度为25-35℃，转化pH为7-9，转化时间为6-8h。
5.根据权利要求4所述的一种尿苷的工业化生产方法，控制转化pH值的方法为：往转化液中通入二氧化碳气体，压力为0.01-0.2MPa。
6.根据权利要求1所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（2）中HPLC检测条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为乙腈：乙酸铵缓冲液=3：97；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
7.根据权利要求1所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（3）中结晶条件为：浓缩终点浓度为70-75%，结晶温度为18-24℃，甲醇或乙醇的其中一种洗涤晶体。
8.根据权利要求7所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（3）中HPLC检测条件为：色谱柱为C18柱4.6×150mm；流动相为甲醇：磷酸二氢钾缓冲液=5：95；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；进样量：20µl；运行时间：10分钟。
9.根据权利要求6所述的一种尿苷的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化完全标准是：当转化率大于98%时，停止转化。
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