CN116479068B - 一种利用生物酶制备n1-甲基-假尿苷单磷酸的方法 - Google Patents
一种利用生物酶制备n1-甲基-假尿苷单磷酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用生物酶制备N1‑甲基‑假尿苷单磷酸的方法，包括S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:工程菌株使用真核宿主或者原核表达系统宿主，选用表达宿主分别构建黑腹果蝇源脱氧核糖核苷激酶工程菌株、大肠杆菌SK12菌株的多聚磷酸激酶工程菌株，b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，利用异丙基硫代半乳糖苷或者乳糖进行蛋白诱导表达，本发明使用筛选制备的脱氧核糖核苷激酶蛋白，以N1‑甲基‑假尿苷为底物，利用磷酸供体再生系统减少磷酸供体的用量以及副产物的生成，实现了N1‑甲基‑假尿苷单磷酸生物合成，并研究开发非常简单的分离纯化工艺，获得了高纯度的N1‑甲基‑假尿苷单磷酸产品。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法。
背景技术
采用N1-甲基假尿苷三磷酸（N1-Me-pUTP）取代尿苷三磷酸（UTP），由此可见，利用假尿苷或N1-甲基假尿苷替代的方式来降低mRNA免疫原性，已经成为mRNA疫苗开发的关键技术，N1-Me-pUr作为其中一个重要的修饰核苷，在mRNA疫苗的生产过程中是以N1-Me-pUTP的形式参与整个合成工艺，而目前N1-Me-pUTP原料的合成主要有化学法和生物法，通常以N1-Me-pUr或N1-Me-pUMP为出发底物，经过多步磷酸化反应制备。
N1-Me-pUMP化学法合成需要使用大量的磷试剂，并且工艺中需对核苷相应的化学基团进行反复的保护与脱保护，合成工艺繁琐复杂，条件苛刻，副产物较多，异构体分离纯化困难，产品收率低下，并且工艺往往使用离子交换硅胶层析柱，其填料及匹配的高压纯化系统价格高昂，导致整个产品成本极高，限制其产业化生产，因此，亟需设计一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，以解决现有技术中的上述不足之处。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，包括以下步骤：
S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:工程菌株使用真核宿主或者原核表达系统宿主，选用表达宿主分别构建黑腹果蝇源脱氧核糖核苷激酶工程菌株、大肠杆菌SK12菌株的多聚磷酸激酶工程菌株，
b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，利用异丙基硫代半乳糖苷或者乳糖进行蛋白诱导表达，重组酶蛋白发酵物作为生物催化剂用于N1-甲基-假尿苷单磷酸产品的合成；
S2.生物合成：a.底物原料：底物原料N1-甲基假尿苷的反应终浓度为200~400mM，磷酸供体为多种，多聚磷酸盐选为六偏磷酸钠，终浓度为80~160mM，辅因子Mg2+终浓度为80~160mM ，加入相应体积的纯化水作为反应溶剂，将底物搅拌混匀，加热至25~55℃搅拌至澄清，用饱和NaOH将底物液pH调节至6~10，
b.酶催化反应:向底物液中，按1：1~4的比例加入脱氧核糖
核苷激酶酶液，按1：0.5~4的比例加入多聚磷酸激酶酶液，控制反应温度在25~55℃，开始酶催化反应，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液，HPLC分析产物纯度>80%；
S3.酸沉淀：用浓盐酸将酶催化反应液pH调节至1.0~7.0，缓慢搅拌0.5~2h，进行酸沉淀，沉淀结束后，离心或抽滤除去粗品晶体沉淀1，收集上清液1，HPLC检测分析上清液产品含量，损失率<3%；
S4.反应液脱色：向上清液1中加入0.5‰~3‰的活性炭，在一定温度条件下搅拌进行脱色，最后抽滤收集上清液即为脱色液，HPLC检测分析脱色液产品含量，损失率<1%；
S5.粗品结晶：用饱和氢氧化钠溶液将脱色液的pH调至8.0~12.0，向其中加入2~8倍体积的无水乙醇，一定温度条件下缓慢搅拌一段时长后进行析晶，结晶结束后，将粗品结晶液进行抽滤，除去上清液2，收集粗品晶体即沉淀2，HPLC检测分析上清液2产品含量，损失率<4%；
S6.萃取：a.复溶沉淀：用0.1~2倍反应液体积的纯化水将沉淀2进行复溶，常温搅拌并充分匀浆后，获得沉淀2的复溶液，向沉淀2复溶液中缓慢加入2~8倍体积的甲醇并搅拌，抽滤分离不溶物，获得沉淀3及上清液3，
b.再次复溶沉淀：用0.1~2倍反应液体积的纯化水将沉淀3进行复溶，常温搅拌并充分匀浆后，获得沉淀3的复溶液，向沉淀3的复溶液中，缓慢加入2~8倍体积的甲醇并搅拌，抽滤分离不溶物，获得沉淀4及上清液4，
c.合并得萃取液：将上清液3和上清液4合并即为N1-甲基假尿苷单磷酸产品的萃取液，HPLC检测分析萃取液产品含量，损失率<4%；
S7.浓缩提取：合并后的萃取液，经过真空干燥或真空旋蒸或者冷冻干燥后，获得N1-甲基假尿苷单磷酸产品，HPLC纯度>98%，纯化收率>85%。
进一步地，所述S1中，通过基因工程技术将黑腹果蝇源脱氧核糖核苷激酶基因序列进行分子克隆，构建dNK工程菌株，通过基因工程技术将来自大肠杆菌SK12菌株的多聚磷酸激酶基因序列进行分子克隆，构建PPK工程菌株。
进一步地，所述S1中的TB液体培养基中含有12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH2PO4，16.43g/L的KH2PO4·3H2O，蛋白诱导表达的培养温度为20~40℃，继续培养16~24小时，发酵液OD600>70即可停止发酵，收集发酵液菌体。
进一步地，所述S1中，含有重组酶蛋白的工菌发酵菌体、细胞破碎酶液或者冻干粉的其中一种或三种为重组酶蛋白发酵物，并且重组酶蛋白发酵物中的重组酶蛋白和相应的载体材料结合，成为重组酶蛋白的固定化酶。
进一步地，所述S2中，磷酸供体为三磷酸尿苷、三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷三种，且磷酸供体的终浓度为5~10mM。
进一步地，所述S2中，反应过程中使用饱和NaOH将反应液pH控制在6~10，反应期间，每2h间隔取反应液进行HPLC检测分析，跟踪酶催化反应情况。
进一步地，所述S2中，当反应底物转化率>90%时，且继续反应0.5h转化率无明显变化，即可终止反应，如转化率仍有增加，应延长反应时间，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液。
进一步地，所述S4中，向上清液1中加入0.5‰~3‰的活性炭，在30~60℃条件下搅拌1~4h进行脱色，所述S5中，在4~25℃条件下缓慢搅拌0.5~4h进行析晶。
进一步地，所述S6中，复溶沉淀常温搅拌10~60min，向沉淀2复溶液中缓慢加入2~8倍体积的甲醇并在20~40℃条件下搅拌10~60min，在再次复溶沉淀内，重复上述操作。
在上述技术方案中，本发明提供的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，使用筛选制备的脱氧核糖核苷激酶蛋白，以N1-甲基-假尿苷为底物，利用磷酸供体再生系统减少磷酸供体的用量以及副产物的生成，实现了N1-甲基-假尿苷单磷酸生物合成，并研究开发非常简单的分离纯化工艺，获得了高纯度的N1-甲基-假尿苷单磷酸产品，整个生物合成工艺在水相中完成，反应条件温和，未使用有机有毒试剂，副产物较少，绿色环保；同时下游分离纯化工艺流程简单，产品收率高，无需使用离子交换层析柱设备，极大降低了生产成本，为下游原料开发提供了高性价比原料产品。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的具体反应结构式示意图。
图2为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的工艺流程示意图。
图3为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的酶催化反应前原料液HPLC分析图谱示意图。
图4为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的酶催化反应四小时反应液HPLC分析图谱示意图。
图5为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的酶催化反应八小时反应液HPLC分析图谱示意图。
图6为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的分离纯化最终产品N1-Me-pUMP示意图。
图7为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的制备方法流程示意图一。
图8为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的制备方法流程示意图二。
图9为本发明一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法实施例提供的制备方法流程示意图三。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
实施例
如图1-9所示，本发明实施例提供的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，包括以下步骤：
S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:通过基因工程技术将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）源脱氧核苷激酶（dNK）基因序列进行分子克隆，构建dNK工程菌株，dNK具有有广泛的特异性磷酸化胸苷，2'-脱氧核糖腺苷，2'-脱氧核糖胞苷和2'-脱氧核糖鸟苷底物，嘧啶核苷的特异性较高，选择多聚磷酸激酶（PPK）循环系统实现磷酸供体的再生，通过基因工程技术将来自大肠杆菌SK12菌株（Escherichia coli strain K12）的多聚磷酸激酶（PPK）基因序列进行分子克隆，构建PPK工程菌株，工程菌株使用真核宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，也是原核表达系统，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌宿主，选用优质的大肠杆菌BL21为重组蛋白表达宿主分别构建脱氧核糖核苷激酶工程菌株（BL21/dNK）、多聚磷酸激酶工程菌株（BL21/PPK），
b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，TB液体培养基中含有12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH2PO4，16.43g/L的KH2PO4·3H2O，利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或者乳糖进行蛋白诱导表达，蛋白诱导表达的培养温度为25℃，继续培养16小时，发酵液OD600>70即可停止发酵，收集发酵液菌体，重组酶蛋白可为多种物体，重组酶蛋白为含有重组酶蛋白的工菌发酵菌体，也为含有重组酶蛋白的细胞破碎酶液（简称酶液），或者含有重组酶蛋白的冻干粉，该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为重组酶蛋白的固定化酶，重组酶蛋白发酵物重组酶蛋白酶液作为生物催化剂用于N1-甲基-假尿苷单磷酸产品的合成，其中，酶液的制备选用2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的工程菌菌体重悬，体积为发酵液体积的0.2倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机将菌体进行破碎，离心收集上清液即为含重组酶蛋白的酶液；
S2.生物合成：a.底物原料：底物原料N1-甲基假尿苷的反应终浓度为400mM，磷酸供体为多种，磷酸供体为三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸鸟苷（GTP），终浓度为7mM，选择三磷酸鸟苷（GTP）作为磷酸供体，多聚磷酸盐选为六偏磷酸钠，终浓度为100mM，辅因子Mg2+终浓度为110mM ，加入相应体积的纯化水作为反应溶剂，将底物搅拌混匀，加热至30℃搅拌至澄清，用饱和NaOH将底物液pH调节至7，
b.酶催化反应:向底物液中，按1：2（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例加入dNK酶液，按1：2（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例PPK酶液，控制反应温度在35℃，开始酶催化反应，反应过程中使用饱和NaOH将反应液pH控制在7，反应期间，每2h间隔取反应液进行HPLC检测分析，跟踪酶催化反应情况，当反应底物转化率>90%时，且继续反应0.5h转化率无明显变化，即可终止反应，如转化率仍有增加，应延长反应时间，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液，HPLC分析产物纯度>80%；
S3.酸沉淀：用浓盐酸将酶催化反应液pH调节至5.0，缓慢搅拌1h，进行酸沉淀，沉淀结束后，离心或抽滤除去粗品晶体沉淀1，收集上清液1，HPLC检测分析上清液产品含量，损失率<3%；
S4.反应液脱色：向上清液1中加入1.5‰的活性炭，在40℃条件下搅拌2h进行脱色，最后抽滤收集上清液即为脱色液，HPLC检测分析脱色液产品含量，损失率<1%；
S5.粗品结晶：用饱和氢氧化钠溶液将脱色液的pH调至9.0，向其中加入4倍体积的无水乙醇，在12℃条件下缓慢搅拌2.5h进行析晶，结晶结束后，将粗品结晶液进行抽滤，除去上清液2，收集粗品晶体即沉淀2，HPLC检测分析上清液2产品含量，损失率<4%；
S6.萃取：a.复溶沉淀：用0.8倍反应液体积的纯化水将沉淀2进行复溶，复溶沉淀常温搅拌20min，充分匀浆后，获得沉淀2的复溶液，向沉淀2复溶液中缓慢加入4倍体积的甲醇并在25℃条件下搅拌30min，抽滤分离不溶物，获得沉淀3及上清液3，
b.再次复溶沉淀：用1倍反应液体积的纯化水将沉淀3进行复溶，在再次复溶沉淀内，常温搅拌36min并充分匀浆，获得沉淀3的复溶液，向沉淀3的复溶液中，缓慢加入4倍体积的甲醇并在36℃条件下搅拌40min，抽滤分离不溶物，获得沉淀4及上清液4，
c.合并得萃取液：将上清液3和上清液4合并即为N1-甲基假尿苷单磷酸产品的萃取液，HPLC检测分析萃取液产品含量，损失率<4%；
S7.浓缩提取：合并后的萃取液，经过真空干燥或真空旋蒸或者冷冻干燥后，获得N1-甲基假尿苷单磷酸产品，HPLC纯度>98%，纯化收率>85%。
实施例
一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，包括以下步骤：
S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:通过基因工程技术将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）源脱氧核苷激酶（dNK）基因序列进行分子克隆，构建dNK工程菌株，dNK具有有广泛的特异性磷酸化胸苷，2'-脱氧核糖腺苷，2'-脱氧核糖胞苷和2'-脱氧核糖鸟苷底物，嘧啶核苷的特异性较高，选择多聚磷酸激酶（PPK）循环系统实现磷酸供体的再生，通过基因工程技术将来自大肠杆菌SK12菌株（Escherichia coli strain K12）的多聚磷酸激酶（PPK）基因序列进行分子克隆，构建PPK工程菌株，工程菌株使用真核宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，也是原核表达系统，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌宿主，选用优质的枯草芽孢杆菌为重组蛋白表达宿主分别构建脱氧核糖核苷激酶工程菌株（BL21/dNK）、多聚磷酸激酶工程菌株（BL21/PPK），
b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，TB液体培养基中含有12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH2PO4，16.43g/L的KH2PO4·3H2O，利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或者乳糖进行蛋白诱导表达，蛋白诱导表达的培养温度为38℃，继续培养22小时，发酵液OD600>70即可停止发酵，收集发酵液菌体，重组酶蛋白可为多种物体，重组酶蛋白为含有重组酶蛋白的工菌发酵菌体，也为含有重组酶蛋白的细胞破碎酶液（简称酶液），或者含有重组酶蛋白的冻干粉，该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为重组酶蛋白的固定化酶，重组酶蛋白发酵物重组酶蛋白酶液作为生物催化剂用于N1-甲基-假尿苷单磷酸产品的合成，其中，酶液的制备选用2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的工程菌菌体重悬，体积为发酵液体积的0.3倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机将菌体进行破碎，离心收集上清液即为含重组酶蛋白的酶液；
S2.生物合成：a.底物原料：底物原料N1-甲基假尿苷的反应终浓度为200mM，磷酸供体为多种，磷酸供体为三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸鸟苷（GTP），终浓度为10mM，选择三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体，终浓度为6mM，多聚磷酸盐选为六偏磷酸钠，终浓度为160mM，辅因子Mg2+终浓度为90mM ，加入相应体积的纯化水作为反应溶剂，将底物搅拌混匀，加热至45℃搅拌至澄清，用饱和NaOH将底物液pH调节至9，
b.酶催化反应:向底物液中，按1：4（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例加入dNK酶液，按1：3（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例PPK酶液，控制反应温度在45℃，开始酶催化反应，反应过程中使用饱和NaOH将反应液pH控制在9，反应期间，每2h间隔取反应液进行HPLC检测分析，跟踪酶催化反应情况，当反应底物转化率>90%时，且继续反应0.5h转化率无明显变化，即可终止反应，如转化率仍有增加，应延长反应时间，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液，HPLC分析产物纯度>80%；
S3.酸沉淀：用浓盐酸将酶催化反应液pH调节至4.0，缓慢搅拌2h，进行酸沉淀，沉淀结束后，离心或抽滤除去粗品晶体沉淀1，收集上清液1，HPLC检测分析上清液产品含量，损失率<3%；
S4.反应液脱色：向上清液1中加入2‰的活性炭，在55℃条件下搅拌3h进行脱色，最后抽滤收集上清液即为脱色液，HPLC检测分析脱色液产品含量，损失率<1%；
S5.粗品结晶：用饱和氢氧化钠溶液将脱色液的pH调至8.0，向其中加入7倍体积的无水乙醇，在25℃条件下缓慢搅拌2.5h进行析晶，结晶结束后，将粗品结晶液进行抽滤，除去上清液2，收集粗品晶体即沉淀2，HPLC检测分析上清液2产品含量，损失率<4%；
S6.萃取：a.复溶沉淀：用2倍反应液体积的纯化水将沉淀2进行复溶，复溶沉淀常温搅拌38min，充分匀浆后，获得沉淀2的复溶液，向沉淀2复溶液中缓慢加入6倍体积的甲醇并在40℃条件下搅拌60min，抽滤分离不溶物，获得沉淀3及上清液3，
b.再次复溶沉淀：用2倍反应液体积的纯化水将沉淀3进行复溶，在再次复溶沉淀内，常温搅拌55min并充分匀浆，获得沉淀3的复溶液，向沉淀3的复溶液中，缓慢加入7倍体积的甲醇并在38℃条件下搅拌60min，抽滤分离不溶物，获得沉淀4及上清液4，
c.合并得萃取液：将上清液3和上清液4合并即为N1-甲基假尿苷单磷酸产品的萃取液，HPLC检测分析萃取液产品含量，损失率<4%；
S7.浓缩提取：合并后的萃取液，经过真空干燥或真空旋蒸或者冷冻干燥后，获得N1-甲基假尿苷单磷酸产品，HPLC纯度>98%，纯化收率>85%。
实施例
一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，包括以下步骤：
S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:通过基因工程技术将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）源脱氧核苷激酶（dNK）基因序列进行分子克隆，构建dNK工程菌株，dNK具有有广泛的特异性磷酸化胸苷，2'-脱氧核糖腺苷，2'-脱氧核糖胞苷和2'-脱氧核糖鸟苷底物，嘧啶核苷的特异性较高，选择多聚磷酸激酶（PPK）循环系统实现磷酸供体的再生，通过基因工程技术将来自大肠杆菌SK12菌株（Escherichia coli strain K12）的多聚磷酸激酶（PPK）基因序列进行分子克隆，构建PPK工程菌株，工程菌株使用真核宿主如酿酒酵母、毕赤酵母，也是原核表达系统，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌宿主，选用优质的大肠杆菌BL21为重组蛋白表达宿主分别构建脱氧核糖核苷激酶工程菌株（BL21/dNK）、多聚磷酸激酶工程菌株（BL21/PPK），
b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，TB液体培养基中含有12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH2PO4，16.43g/L的KH2PO4·3H2O，利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或者乳糖进行蛋白诱导表达，蛋白诱导表达的培养温度为35℃，继续培养18小时，发酵液OD600>70即可停止发酵，收集发酵液菌体，重组酶蛋白可为多种物体，重组酶蛋白为含有重组酶蛋白的工菌发酵菌体，也为含有重组酶蛋白的细胞破碎酶液（简称酶液），或者含有重组酶蛋白的冻干粉，该酶蛋白亦可与相应的载体材料结合，成为重组酶蛋白的固定化酶，重组酶蛋白发酵物重组酶蛋白酶液作为生物催化剂用于N1-甲基-假尿苷单磷酸产品的合成，其中，酶液的制备选用2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的工程菌菌体重悬，体积为发酵液体积的0.5倍，用超声波细胞粉碎机或高压均质机将菌体进行破碎，离心收集上清液即为含重组酶蛋白的酶液；
S2.生物合成：a.底物原料：底物原料N1-甲基假尿苷的反应终浓度为300mM，磷酸供体为多种，磷酸供体为三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸鸟苷（GTP），终浓度为8mM，选择三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体，终浓度为6mM，多聚磷酸盐选为六偏磷酸钠，终浓度为90mM，辅因子Mg2+终浓度为105mM ，加入相应体积的纯化水作为反应溶剂，将底物搅拌混匀，加热至37℃搅拌至澄清，用饱和NaOH将底物液pH调节至8，
b.酶催化反应:向底物液中，按1：2（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例加入dNK酶液，按1：1（底物N1-Me-pUr g/酶液体积 mL）的比例PPK酶液，控制反应温度在37℃，开始酶催化反应，反应过程中使用饱和NaOH将反应液pH控制在8，反应期间，每2h间隔取反应液进行HPLC检测分析，跟踪酶催化反应情况，当反应底物转化率>90%时，且继续反应0.5h转化率无明显变化，即可终止反应，如转化率仍有增加，应延长反应时间，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液，HPLC分析产物纯度>80%；
S3.酸沉淀：用浓盐酸将酶催化反应液pH调节至3.0，缓慢搅拌1h，进行酸沉淀，沉淀结束后，离心或抽滤除去粗品晶体沉淀1，收集上清液1，HPLC检测分析上清液产品含量，损失率<3%；
S4.反应液脱色：向上清液1中加入1‰的活性炭，在45℃条件下搅拌2h进行脱色，最后抽滤收集上清液即为脱色液，HPLC检测分析脱色液产品含量，损失率<1%；
S5.粗品结晶：用饱和氢氧化钠溶液将脱色液的pH调至9.0，向其中加入4倍体积的无水乙醇，在10℃条件下缓慢搅拌2h进行析晶，结晶结束后，将粗品结晶液进行抽滤，除去上清液2，收集粗品晶体即沉淀2，HPLC检测分析上清液2产品含量，损失率<4%；
S6.萃取：a.复溶沉淀：用0.5倍反应液体积的纯化水将沉淀2进行复溶，复溶沉淀常温搅拌20min，充分匀浆后，获得沉淀2的复溶液，向沉淀2复溶液中缓慢加入4倍体积的甲醇并在30℃条件下搅拌30min，抽滤分离不溶物，获得沉淀3及上清液3，
b.再次复溶沉淀：用0.3倍反应液体积的纯化水将沉淀3进行复溶，在再次复溶沉淀内，常温搅拌20min并充分匀浆，获得沉淀3的复溶液，向沉淀3的复溶液中，缓慢加入5倍体积的甲醇并在30℃条件下搅拌30min，抽滤分离不溶物，获得沉淀4及上清液4，
c.合并得萃取液：将上清液3和上清液4合并即为N1-甲基假尿苷单磷酸产品的萃取液，HPLC检测分析萃取液产品含量，损失率<4%；
S7.浓缩提取：合并后的萃取液，经过真空干燥或真空旋蒸或者冷冻干燥后，获得N1-甲基假尿苷单磷酸产品，HPLC纯度>98%，纯化收率>85%。
酶催化反应4h，由反应液HPLC分析图谱可知，底物N1-Me-pUr转化率54.33%；酶催化反应8h，由反应液HPLC分析图谱可知，底物N1-Me-pUr转化率94.91%，产品N1-Me-pUMP纯度为84.59%；分离纯化最终产品N1-Me-pUMP纯度为98.49%，上述三组实施例经过实验与制备所得出，实施例一、实施例二和实施例三中采用制备方法的成分、原料、时间和温度不同，其余参数一致，通过对最终得到的N1-甲基-假尿苷单磷酸进行实验比对，实施例三中效果最佳。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (9)
1.一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.酶蛋白的制备：a.重组酶蛋白工程菌株构建:工程菌株使用真核宿主或者原核表达系统宿主，选用表达宿主分别构建表达黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）源脱氧核糖核苷激酶工程菌株、表达大肠杆菌SK12菌株的多聚磷酸激酶的工程菌株，
b.重组酶蛋白发酵:使用的发酵培养基为TB液体培养基，利用异丙基硫代半乳糖苷或者乳糖进行蛋白诱导表达，重组酶蛋白发酵物作为生物催化剂用于N1-甲基-假尿苷单磷酸产品的合成；
S2.生物合成：a.底物原料：底物原料N1-甲基假尿苷的反应终浓度为200~400mM，磷酸供体为多种，多聚磷酸盐选为六偏磷酸钠，终浓度为80~160mM，辅因子Mg2+终浓度为80~160mM ，加入相应体积的纯化水作为反应溶剂，将底物搅拌混匀，加热至25~55℃搅拌至澄清，用饱和NaOH将底物液pH调节至6~10，
b.酶催化反应:向底物液中，按1：1~4的比例加入脱氧核糖
核苷激酶酶液，按1：0.5~4的比例加入多聚磷酸激酶酶液，控制反应温度在25~55℃，开始酶催化反应，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液，HPLC分析产物纯度>80%；
S3.酸沉淀：用浓盐酸将酶催化反应液pH调节至1.0~7.0，缓慢搅拌0.5~2h，进行酸沉淀，沉淀结束后，离心或抽滤除去粗品晶体沉淀1，收集上清液1，HPLC检测分析上清液产品含量，损失率<3%；
S4.反应液脱色：向上清液1中加入0.5‰~3‰的活性炭，在一定温度条件下搅拌进行脱色，最后抽滤收集上清液即为脱色液，HPLC检测分析脱色液产品含量，损失率<1%；
S5.粗品结晶：用饱和氢氧化钠溶液将脱色液的pH调至8.0~12.0，向其中加入2~8倍体积的无水乙醇，一定温度条件下缓慢搅拌一段时长后进行析晶，结晶结束后，将粗品结晶液进行抽滤，除去上清液2，收集粗品晶体即沉淀2，HPLC检测分析上清液2产品含量，损失率<4%；
S6.萃取：a.复溶沉淀：用0.1~2倍反应液体积的纯化水将沉淀2进行复溶，常温搅拌并充分匀浆后，获得沉淀2的复溶液，向沉淀2复溶液中缓慢加入2~8倍体积的甲醇并搅拌，抽滤分离不溶物，获得沉淀3及上清液3，
b.再次复溶沉淀：用0.1~2倍反应液体积的纯化水将沉淀3进行复溶，常温搅拌并充分匀浆后，获得沉淀3的复溶液，向沉淀3的复溶液中，缓慢加入2~8倍体积的甲醇并搅拌，抽滤分离不溶物，获得沉淀4及上清液4，
c.合并得萃取液：将上清液3和上清液4合并即为N1-甲基假尿苷单磷酸产品的萃取液，HPLC检测分析萃取液产品含量，损失率<4%；
S7.浓缩提取：合并后的萃取液，经过真空干燥或真空旋蒸或者冷冻干燥后，获得N1-甲基假尿苷单磷酸产品，HPLC纯度>98%，纯化收率>85%。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S1中，通过基因工程技术将黑腹果蝇源脱氧核糖核苷激酶基因序列进行分子克隆，构建脱氧核糖核苷激酶工程菌株，通过基因工程技术将来自大肠杆菌SK12菌株的多聚磷酸激酶基因序列进行分子克隆，构建多聚磷酸激酶工程菌株。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S1中的TB液体培养基中含有12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH2PO4，16.43g/L的KH2PO4·3H2O，蛋白诱导表达的培养温度为20~40℃，继续培养16~24小时，发酵液OD600>70即可停止发酵，收集发酵液菌体。
4.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S1中，重组酶蛋白发酵物为含有重组酶蛋白的工程菌发酵菌体，或者含有重组酶蛋白的细胞破碎酶液，或者含有重组酶蛋白的冻干粉，或者该酶蛋白与相应的载体材料结合，得到的重组酶蛋白的固定化酶。
5.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S2中，磷酸供体为三磷酸尿苷、三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷三种，且磷酸供体的终浓度为5~10mM。
6.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S2中，反应过程中使用饱和NaOH将反应液pH控制在6~10，反应期间，每2h间隔取反应液进行HPLC检测分析，跟踪酶催化反应情况。
7.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S2中，当反应底物转化率>90%时，且继续反应0.5h转化率无明显变化，即可终止反应，如转化率仍有增加，应延长反应时间，直至转化率稳定后，酶催化反应结束，获得酶催化反应液。
8.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S4中，向上清液1中加入0.5‰~3‰的活性炭，在30~60℃条件下搅拌1~4h进行脱色，所述S5中，在4~25℃条件下缓慢搅拌0.5~4h进行析晶。
9.根据权利要求1所述的一种利用生物酶制备N1-甲基-假尿苷单磷酸的方法，其特征在于，所述S6中，复溶沉淀常温搅拌10~60min，向沉淀2复溶液中缓慢加入2~8倍体积的甲醇并在20~40℃条件下搅拌10~60min，在再次复溶沉淀内，重复上述操作。
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