KR20120049421A

KR20120049421A - 아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료

Info

Publication number: KR20120049421A
Application number: KR1020100108174A
Authority: KR
Inventors: 유상호; 왕렌; 박천석
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2012-05-17
Also published as: KR101177218B1; CN103270167A; US20120238744A1; WO2012060519A1; EP2559770A4; EP2559770B1; CN103270167B; US8653256B2; EP2559770A1

Abstract

본 발명은 아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수크로즈 단독 또는 프락토즈와 함께 수크로즈를 함유한 용액 상에 아밀로수크라제를 처리한 효소반응을 통해 고순도의 투라노즈를 제조할 수 있는 고순도 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료에 관한 것이다.

Description

아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료{Preparation method of turanose using amylosucrase and sweetner using turanose}

본 발명은 아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료에 관한 것이다.

투라노즈는 자연적으로 벌에서 생기는 환원성 이당류로서 수크로즈 단맛의 약 반에 해당하는 단맛을 나타내며, 수크로즈의 유사체이며 3-O-α-D-글루코피라노실-D-프락토즈의 화학적 구조를 지닌다.

투라노즈는 치아 우식 유발 미생물에 의해 발효되지 않기 때문에 칼로리 없는 감미료로서 사용될 수 있으며, 따라서 음식, 화장품 및 약학 산업계에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.

일본공개특허 제1993-252974호는 녹말성 물질과 프락토즈를 함유한 수용액 상에 사이클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제를 처리하여 투라노즈를 제조하는 효소공정을 개시하는 유일한 문헌으로서, 상기 효소공정은 사이클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제에 의해 녹말성 물질을 프락토즈로 변화시키는 글리코실전이 반응과 글루코아밀라제에 의해 상기 전이산물의 α-1,4-글루칸 사슬의 가수분해 반응을 포함한 2단계의 중요한 공정을 포함한다.

그러나, 아직까지 고순도의 투라노즈를 간편하면서도 높은 수율로 제조할 수 있는 투라노즈 제조공정은 전무한 상태이므로, 식품에 사용되는 칼로리 없는 감미료, 화장품 또는 의약품 등에 사용되는 첨가제 개발을 위하여 이러한 투라노즈의 제조방법을 개발하는 것이 매우 중요하다.

이에, 본 발명자는 고순도 투라노즈를 효율좋게 생산하기 위하여 연구 노력한 결과, 아밀로수크라제를 효소원으로 이용하여 수크로즈 등과 같은 기질에 작용시킴으로써 투라노즈를 효율좋게 생산할 수 있었고, 또한 간단한 정제 공정을 통해 고순도 투라노즈를 효율좋게 생산할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업적 규모로 쉽고 고수율로 고순도 투라노즈를 생산할 수 있는 투라노즈 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아밀로수크라제를 수크로즈 용액에 작용시켜 투라노즈가 생산되도록 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 정제하는 단계를 포함하는 투라노즈의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 아밀로수크라제는 미생물 Neisseria polysaccharea, Deinococcus geothermalis 및 Alteromonas macleodii로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물로부터 유래되며, 특히 Neisseria polysaccharea로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 미생물은 미국특허 제6265635호에 개시된 방법에 따라 분리될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 아밀로수크라제는 2.4 U/ml의 최고 활성을 나타내며, 이때 생산되는 투라노즈의 함량은 2.38 mg/ml이므로, 아밀로수크라제의 비활성(specific activity)은 1.01 U/mg protein인 것으로 확인되었다. 따라서, 투라노즈의 수율 향상을 위하여, 아밀로수크라제는 수크로즈 100g 당 20 내지 500 mg, 바람직하게는 40 내지 150 mg의 양으로 포함될 수 있으며, 만약, 아밀로수크라제의 함량이 상기 범위를 벗어나면 반응 전환 효율이 떨어지거나 부반응 속도의 증가 등의 문제가 야기될 수 있다.

상기 미생물 Neisseria polysaccharea는 미생물이 자라서 효소인 아밀로수크라제를 생산할 수 있는 조건 하에서 배양되며, 일반적으로 약 37℃의 온도 및 pH 7.0 내지 7.2에서 분리되고 배양된다. 배양 시간은 미생물이 충분히 증식할 수 있는 한 제한이 없지만, 예를들어 24 내지 48시간 동안 배양할 수 있다. 미생물 배양이 완료된 후, 보편적인 고액 상분리 방법에 의해 배양물로부터 세포를 모을 수 있다. 예를들어, 4℃에서 원심분리하여 상등액을 제거하여 세포를 수득할 수 있다.

특히, 상기 미생물 Neisseria polysaccharea로부터 유래된 아밀로수크라제 유전자를 숙주세포, 예를들어 대장균, 바실러스, 유산균, 곰팡이류 내에서 재조합 단백질체로 발현시켜 얻을 수 있다.

세포성 효소원은 보편적인 방법을 따라 세포로부터 추출된 조효소를 사용할 수 있다. 예를들어, 초음파 또는 호모게네이션을 이용한 분쇄법으로 세포로부터 효소를 추출하고 상기 추출물을 원심분리 또는 막 여과를 통해 처리함으로써 조효소를 얻을 수 있다. 조효소를 추가적인 처리없이 사용하거나 보편적인 방법으로 정제하여 사용할 수 있다. 예를들어, 조효소 추출물을 여과하여 불용성 물질을 제거하고 상기 여과물을 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼에 통과시켜 재조합 His₆-태그된 아밀로수크라제를 정제하고, 4℃에서 Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices를 이용하여 상기 아밀로수크라제를 용출시켜 전기영동적으로 균질한 효소를 얻을 수 있다.

정제 효소는 직접 이용되거나 또는 보편적인 방법에 의해 담체 물질에 고정화되어 사용될 수 있다. 예를들어, 이온 교환체에 대한 결합법, 수지 및 막에 대한 공유결합 및 흡착법 등의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 고정화를 통해 합성촉매로서 효소를 쉽게 회수할 수 있고 여러번 사용할 수 있다. 효소의 정제공정이 일반적으로 많은 시간과 고비용이 소요되기 때문에 효소의 고정과 재사용은 상당한 비용 절감에 기여할 수 있다.

본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제의 활성은 다음과 같이 측정할 수 있다. 즉, 기질로서 0.1M 수크로즈를 함유한 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0) 900 μl에 효소 용액 100 μl을 첨가하고, 상기 혼합물을 35℃에서 30분 동안 반응시키며, 상기 반응 혼합물을 100℃에서 10분 동안 가열하여 효소 반응을 중단시킨다. 프락토즈를 표준물질로 사용한 디니트로살리실산(DNS) 방법을 이용하여 상기 반응 혼합물 중으로 유리된 프락토즈의 양을 분석한다. 아밀로수크라제 활성 1 unit는 분석 조건에서 분당 1 μmol 프락토즈 생산을 촉진시키는 효소의 양으로서 정의된다.

본 발명에서 사용된 기질은 수크로즈 단독 또는 상기 수크로즈에 프락토즈를 추가적으로 보강하여 사용할 수 있다. 사용된 수크로즈 및 프락토즈의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 예를들어, 기질로서 0.25M 또는 0.75M 프락토즈로 보강된 1.0M 또는 2.5M 수크로즈 용액 상에서 작용될 때에도 상기 효소는 반응하여 투라노즈를 생산할 수 있다. 또한, 상당히 고농도의 기질 또는 용해되지 않은 기질을 지닌 용액을 사용할 수도 있다.

본 발명의 효소반응 시 반응온도는 효소를 불활성화하지 않는 온도이면 어떠한 온도이든 상관없지만, 특히 약 40℃의 온도까지, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도가 바람직하다.

또한, 본 발명의 효소반응 시 반응 pH는 약 6.0 내지 9.0일 수 있지만, 바람직하게는 6.5 내지 7.5일 수 있다.

또한, 본 발명의 효소반응 시 반응시간은 효소반응 조건 하에서 달라질 수 있지만, 100-400 units/L의 정제 아밀로수크라제를 사용할 경우 24 내지 120 시간에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 반응 혼합물인 당조성물 중 투라노즈의 수율은 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상이며, 가장 높은 수율은 73%로 나타났다. 본 발명에 따라 얻어진 당조성물을 여과하여 불순물을 제거하고 활성탄으로 탈색시킨다.

또한, 생산규모 및 반응조건에 따라 생산된 투라노즈의 정제 회수를 위하여, 다양한 고순도 정제방법을 이용할 수 있다. 예를들어, 이온-교환 수지 크로마토크래피, 활성탄을 이용한 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피, 분별결정법 등을 이용하여 고순도 투라노즈를 갖는 산물을 반응 혼합물로부터 쉽게 정제할 수 있으며, 얻어진 산물을 시럽 산물로 농축한다. 필요하다면 시럽 산물을 분말 산물로 건조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 투라노즈를 포함하는 감미료를 제공한다.

투라노즈는 치아 우식 유발 미생물에 의해 발효되지 않기 때문에 칼로리 없는 감미료로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 음식물, 화장품 및 의약품 등 산업계에서 중요한 감미료 또는 첨가제의 역할을 수행할 수 있다.

본 발명에 따르면, 수크로즈 단독 또는 프락토즈와 함께 수크로즈를 함유한 용액 상에 아밀로수크라제를 처리함으로써 수크로즈 등과 같은 기질로부터 고순도 투라노즈를 쉽게 생산하고, 분리하며 고순도로 정제할 수 있기 때문에 음식물, 화장품 및 의약품 등 산업계에서 중요한 칼로리 없는 감미료 또는 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 정제되지 않은 투라노즈 시료의 HPAEC 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 2는 정제된 투라노즈 시료의 HPAEC 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 3은 정제된 투라노즈 시료의 HPLC-MS 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 4는 정제된 투라노즈 시료의 TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
이때, 레인 1 및 7은 G1(글루코즈)-G7(말토헵타오즈) 표준물질; 레인 2는 수크로즈 표준물질; 레인 3은 투라노즈 표준물질; 레인 4는 프락토즈 표준물질; 레인 5는 정제되지 않은 투라노즈 시료; 레인 6은 정제된 투라노즈 시료임.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 효소 준비 및 정제

1. 재조합 E. coli BL21의 스탁 배양물 준비

Neisseria polysaccharea 아밀로수크라제 뉴클레오타이드 서열에 기초한 2개의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 Neisseria polysaccharea ATCC 43768으로부터 NpAS에 대응하는 유전자를 얻었다. 즉, 상기 PCR 반응은 주형인 N. polysaccharea 게놈 DNA와 2개의 올리고뉴클레오타이드 (서열번호 1: NPAS1 5'- GGA TCC GAT GTT GAC CCC CAC GCA GCA A -3'; 및 서열번호 2: NPAS2 5'- GGC AAG CTT CAG GCG ATT TCG AGC CAC AT -3')를 이용하여 수행되었다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 T-easy vector (Promega, Madison, WI, USA)에서 클로닝하고, PCR 반응 시 어떠한 실수 존재 여부를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. BamHI and HindIII를 이용하여 인서트를 자른 후, 얻어진 단편을 동일 효소로 처리된 pRSET-B 벡터로 삽입시켜 NpAS 발현 벡터인 pRSET-NpAS를 얻었다. 효율적인 유전자 발현을 위하여 상기 pRSET-NpAS으로 E. coli BL21을 형질전환시켰다.

2. 효소 준비

1% (w/v) 박토트립톤, 0.5% (w/v) 이스트 추출물, 0.5% (w/v) 염화나트륨, 및 물로 구성된 액체 영양배양 배지를 pH 7.0으로 조정하였다. 500ml의 배양배지를 120℃에서 15분 동안 멸균시킨 1000ml Erlenmeyer 플라스크에 담은 후, 냉각시키고 앞서 준비된 재조합 E. coli BL21의 스탁 배양물로 접종한 후 0.01% (w/v) 암피실린의 존재 하 37℃에서 배양하였다. 세포의 광학밀도가 약 0.6에 도달하였을 때, 0.1M 이소프로필-β-D-치오칼락토피라노사이드 1ml를 배양물에 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 16℃에서 12시간 동안 배양한 후, 4℃에서 20분 동안 5,500×g에서 원심분리하여 세포를 수확하였다.

3. 효소 정제

앞서 준비된 배양물을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 50ml에서 완전하게 재현탁시킨 후, 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator 550,. Fisher Scientific Co.) Model D100을 이용하여 세포를 파괴시켰다. 얻어진 혼합물을 4℃에서 20분 동안 11,000×g에서 원심분리하여 세포성 잔해를 제거하였다. 얻어진 상등액을 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시킨 후, 5ml의 여과액을 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼을 통해 통과시켜 재조합 His₆-태그된 아밀로수크라아제를 정제하였다. His₆-태그된 아밀로수크라제를 용출하기 전에 Ni-NTA 친화성 컬럼을 20ml 세정 완충액(50mM Tris, 300mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸, pH 7.0)으로 먼저 세정한 후, 5ml의 용출 완충액(50mM Tris, 300mM 염화나트륨, 250mM 이미다졸, pH 7.0)을 이용하여 아밀로수크라제 단백질을 용출시킨 후, 4℃에서 Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Millipore Corporation, Billerica, USA)를 이용하여 농축시켰다. 전기영동적으로 단일 단백질 밴드를 갖는 효소 제제를 얻었다.

<실시예 2> 정제되지 않은 투라노즈 제조

1. 수크로즈로부터 얻어진 투라노즈 제조

앞선 실시예에서 얻어진 정제 아밀로수크라아제 400 unit/L를 2.0M 수크로즈를 함유한 용액에 가하였고, 35℃에서 72시간 동안 효소 반응을 수행하였다. 반응 후 10분 동안 끓는 물에서 효소를 가열하여 불활성화 하였다. 얻어진 반응산물을 펄스 전류 검출기(Dionex, USA)를 지닌 DX-300 series HPAEC system (Dionex, USA)을 이용하여 분석하였다. 이때, 상업적으로 판매되는 글루코즈, 프락토즈, 수크로즈, 말토오즈 및 투라노즈를 표준물질로 이용하여 당류를 분석하였다. 그 결과는 하기 표 1 및 도 1과 같다.

당류	HPAEC 체류시간 (min)	당류 조성 (%)
글루코즈	4.00	0.7
프락토즈	4.33	20.7
수크로즈	6.75	4.9
투라노즈	7.75	51.1
다른 당류	-	22.6

2. 반응시간 별 반응산물의 당 조성 분석

앞선 실시예에서 얻어진 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 2.0M 수크로즈를 함유한 용액에 가하였고, 35℃에서 효소 반응을 수행하였다. 시료를 정해진 시간간격으로 모으고, 100℃에서 10분 동안 끓여 남아있는 효소를 불활성화 하였다. 그후, 각 시료의 당 조성을 앞선 실시예와 유사하게 HPAEC을 이용하여 분석한 결과 표 2와 같다.

반응시간 (hour)	당 조성 (%)
반응시간 (hour)	글루코즈	프락토즈	수크로즈	투라노즈	다른 당류
24	0.5	9.6	52.9	25.2	11.8
72	0.7	20.7	4.9	51.1	22.6
120	0.9	20.8	5.0	52.0	21.3

표 2로부터, 본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제는 기질로서 2.0M 수크로즈를 이용하여 35℃에서 최소 72시간 동안 반응할 때 약 50% 투라노즈를 함유한 당류 조성물을 형성하였다. 약 20%의 수득율을 나타내는 본 반응의 또다른 주요 산물은 프락토즈이며, 글루코즈, 소비되지 않은 수크로즈 및 다른 당류에 의해 나머지를 차지하였다.

<실시예 3> 투라노즈 수율에 관한 효소 양의 영향

1.0M 수크로즈 용액에 본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제 100, 200 또는 400 unit/L를 첨가하여 얻어진 혼합물을 35℃에서 효소적으로 반응시켰다. 정해진 시간 간격을 두고 시료를 모아 100℃에서 10분 동안 가열하여 남아있는 효소를 불활성화 하였다. 각 시료의 당류 조성을 HPAEC를 이용하여 분석하였고, 다양한 효소 활성에서 각 시료의 투라노즈 수율과 반응시간은 하기 표 3과 같다.

투라노즈 수율 (%)		효소 양 (units/L)
투라노즈 수율 (%)		100	200	400
반응시간 (hour)	24	8.8 ± 0.3	19.3 ± 0.8	30.7 ± 0.2
	72	27.4 ± 1.0	30.8 ± 0.2	31.7 ± 0.3
	120	31.4 ± 0.5	31.6 ± 0.6	31.8 ± 0.5

상기 표 3으로부터 100 unit/L의 정제 아밀로수크라제는 120시간 반응 후 약 30%의 수율로 투라노즈를 생성하였고, 400 unit/L의 정제 아밀로수크라제는 단지 24시간 반응 후 약 30%의 수율로 투라노즈를 생성하였다.

<실시예 4> 투라노즈 수율에 관한 온도의 영향

본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 1.0, 1.5 또는 2.0M 수크로즈를 함유한 용액에 첨가하였고, 30, 35 및 40℃에서 각각 효소 반응을 수행하였다. 72시간 반응 후, 시료를 100℃에서 10분 동안 가열하여 남아있는 효소를 불활성화 하였고, HPAEC를 이용하여 각 시료의 당류 조성을 분석하였다. 다양한 수크로즈 농도 및 온도에서 각 시료의 투라노즈 수율을 하기 표 4에 나타내었다.

투라노즈 수율 (%)		온도 (℃)
투라노즈 수율 (%)		30	35	40
수크로즈 농도 (M)	1.0	33.9 ± 0.1	31.7 ± 0.3	29.6 ± 0.0
	1.5	38.7 ± 0.4	36.1 ± 0.5	34.7 ± 0.0
	2.0	34.2 ± 0.2	51.1 ± 0.0	38.7 ± 1.1

표 4와 같이, 본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제는 기질로서 2.0M 수크로즈를 이용하여 35℃에서 72시간 동안 반응할 때 약 50% 투라노즈를 생산하였다.

<실시예 5> 투라노즈 수율에 관한 수크로즈 농도의 영향

본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5M 수크로즈를 함유한 용액에 첨가하였고, 35℃에서 각각 효소 반응을 수행하였다. 시료를 정해진 시간 간격으로 모은 후, 시료를 100℃에서 10분 동안 가열하여 남아있는 효소를 불활성화 하였다. 각 시료의 당류 조성은 HPAEC를 이용하여 분석하였고, 다양한 수크로즈 농도 및 반응온도에서 각 시료의 투라노즈 수율을 하기 표 5에 나타내었다.

투라노즈 수율 (%)		수크로즈 농도 (M)
투라노즈 수율 (%)		1.0	1.5	2.0	2.5
반응시간 (hour)	24	30.7 ± 0.2	26.5 ± 0.2	25.1 ± 0.1	17.9 ± 0.0
	72	31.7 ± 0.3	36.1 ± 0.5	51.1 ± 0.0	41.0 ± 0.8
	120	31.8 ± 0.5	37.4 ± 0.3	52.0 ± 0.9	56.2 ± 0.3

표 5와 같이, 수크로즈 농도가 높을수록 최종적으로 더많은 투라노즈가 생산되었다. 120 시간 반응 후, 2.5M 수크로즈 용액을 이용할 경우 효소는 약 55%의 고수율로 투라노즈를 생산하였다.

<실시예 6> 투라노즈 수율에 관한 프락토즈 첨가의 영향

다양한 농도의 수크로즈(1.0, 1.5 또는 2.0M) 및 프락토즈(0.25, 0.50 또는 0.75M)를 지닌 용액을 준비한 후, 본 발명에 따른 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 각 용액에 첨가하였고, 35℃에서 각각 효소 반응을 수행하였다. 96시간 반응 후, 시료를 100℃에서 10분 동안 가열하여 남아있는 효소를 불활성화 하였고, 각 시료의 당류 조성을 HPAEC를 이용하여 분석하였다. 다양한 수크로즈 및 프락토즈의 농도에서 각 시료의 투라노즈 수율을 하기 표 6에 나타내었다.

투라노즈 수율 (%)		프락토즈 (M)
투라노즈 수율 (%)		0	0.25	0.50	0.75
수크로즈 농도 (M)	1.0	30.9 ± 0.8	45.8 ± 0.1	57.2 ± 0.2	62.8 ± 1.1
	1.5	36.5 ± 0.6	49.8 ± 0.1	58.6 ± 0.3	65.4 ± 0.4
	2.0	50.9 ± 0.1	60.0 ± 0.1	67.1 ± 0.4	73.1 ± 0.6

표 6과 같이, 프락토즈 농도가 높을수록 최종적으로 더많은 투라노즈가 생산되었다. 0.75M 프락토즈를 각 반응 배지에 첨가할 경우 효소는 약 60%의 고수율로 투라노즈를 생산하였다.

<실시예 7> 수크로즈로부터 정제 투라노즈 제조

1. 효소 준비 및 정제

재조합 E. coli BL21의 스탁 배양물을 1% (w/v) 박토트립톤, 0.5% (w/v) 이스트 추출물, 0.5% (w/v) 염화나트륨 및 물로 구성된 멸균 액체 영양 배양배지 5L에 접종시키고 0.01% (w/v) 암피실린 존재 하 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그후, 0.1M 이소프로필-β-D-치오칼락토피라노사이드 10ml를 배양물에 첨가하였다. 16℃에서 16시간 동안 배양한 후, 4℃에서 30분 동안 5,500×g에서 원심분리하여 세포를 수확하였다.

얻어진 세포 배양물을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 500ml에서 재현탁시킨 후, 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator 550,. Fisher Scientific Co.) Model D100을 이용하여 세포를 파괴시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 원심분리하여 상등액을 얻은 후, 상기 상등액을 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시키고, 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼을 이용하여 정제하며, Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Millipore Corporation, Billerica, USA)를 이용하여 농축하였다. 약 100ml의 효소 농축액은 최종적으로 약 2.4 unit/ml의 활성을 나타내었다.

2. 수크로즈로부터 정제 투라노즈 제조

최종 농도가 2.5M인 수크로즈를 지닌 용액을 준비하였고, 상기 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 상기 용액에 첨가하였고, 35℃에서 120시간 동안 효소 반응을 수행하였다. 그후, 반응 혼합물을 100℃에서 10분 동안 가열하고, 냉각하며, 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켜 불용성 물질을 제거한 후, 순서대로 JAIGEL W-251 및 W-252 (20 mm × 500 mm)와 같은 2개의 친수성 분취용 컬럼을 구비한 분취용 고속액체크로마토그래피 (model LC-9104; JAI Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 정제하였다. 시료의 용출을 위하여 3mL/min의 유속으로 탈이온수를 사용하였다. 투라노즈 분획을 얻고, 농축하며 동결건조하여 약 96%의 순도와 약 65%의 수율을 갖는 투라노즈를 다량 함유한 당류 분말을 얻었다.

3. 형태 분석

앞서 제조된 투라노즈를 함유한 고순도 당류 분말을 이용하여 다음의 형태분석을 수행하였다.

1) HPAEC

펄스 전류 검출기(Dionex, USA)를 지닌 DX-300 series HPAEC system (Dionex, USA)을 이용하여 앞서 준비된 고순도 당류 분말을 분석하였으며, 이때 상업적으로 판매되는 글루코즈, 프락토즈, 수크로즈, 말토오즈 및 투라노즈를 표준물질로 이용하였다. 그 결과, 도 3과 같이 수크로즈로부터 투라노즈가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

2) HPLC-MS

앞서 정제된 투라노즈의 질량 스펙트럼은 양이온 전기분무 모드를 이용하여 Agilent 1100 series MSD (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 상에서 얻었다. 시료 용액은 0.8 ml/min의 유속으로 전기분무원에 전달되었고, 주입 용량은 10㎕이었다. capillary voltage를 4kV로 유지하는 동안, fragmentor voltage를 150V로 고정하였다. 이러한 전기분무원의 온도는 350℃로 유지하였고, 검출 스캔 범위는 m/z 100 내지 1400으로 하였다.

그 결과, 도 4와 같이 고순도 당류 분말에 대하여 MS m/z 365.3에서 이온(M + Na)⁺를 나타내어 상기 당류가 이당류인 것을 확인하였다.

3) NMR

600 MHz NMR 시스템 (Rheinstetten, Germany)을 이용하여 NMR 분석을 수행하였고, 이때 정제 투라노즈는 순수 D₂O에 용해시켜 사용하였다. 표준 실험법에 따라 HSQC (heteronuclear single quantum correlation), ¹³C 및 ¹H NMR 스펙트럼을 기록하였다. 데이터 처리는 TopSpin^® 2.0 소프트웨어 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany)를 이용하였다.

정제 투라노즈의 ¹³C NMR 스펙트럼 분석 결과, 하기 표 7 및 도 5와 같이, 3-O-α-D-글루코피라노실-α-D-프락토프라노즈, 3-O-α-D-글루코피라노실-β-D-프락토프라노즈 및 3-O-α-D-글루코피라노실-β-D-프락토피라노즈와 같은 투라노즈 호변이체인 것을 확인하였다.

호변이체	Chemical shift (ppm)
	α-D-글루코피라노실 단위						D-프락토즈 단위
	C-1	C-2	C-3	C-4	C-5	C-6	C-1	C-2	C-3	C-4	C-5	C-6
3-O-α-D-글루코피라노실-α-D-프락토프라노즈	97.1	71.5	73.1	69.6	74.8	60.5	61.3	104.5	85.0	72.5	81.8	63.0
3-O-α-D-글루코피라노실-β-D-프락토프라노즈	98.7	71.7	72.9	69.6	74.6	60.5	62.5	101.9	80.8	72.6	81.1	63.1
3-O-α-D-글루코피라노실-β-D-프락토피라노즈	101.2	72.3	73.1	69.6	73.0	60.7	64.3	98.0	76.9	70.5	69.3	63.6

4) TLC

TLC 분석은 Whatman K6 실리카겔 플레이트를 이용하여 수행하였고, 이때 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 1-프로판올 및 물 (85:20:20:15 v/v)을 용매계로 사용하였다. 메탄올에 용해된 0.3% (w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌디아민과 5% (v/v) 황산을 플레이트에 분무하고, 110℃에서 10분 동안 플레이트를 가열하여 착색하였다.

그 결과, 도 6과 같이 상기 당류가 투라노즈인 것을 확인하였다.

<실시예 8> 수크로즈로부터 정제 투라노즈 제조

최종농도가 2.0M인 수크로즈와 최종농도가 0.75M인 프락토즈를 지닌 용액을 준비하였고, 정제 아밀로수크라제 400 unit/L를 상기 용액에 첨가하였고, 35℃에서 96시간 동안 효소 반응을 수행하였다. 그후, 반응 혼합물을 100℃에서 10분 동안 가열하여 남아있는 효소를 불활성화 하였고, 실온으로 냉각시켰다. 얻어진 반응 혼합물은 약 73%의 투라노즈를 함유하였다(도 1 참조). 다른 산물로부터 투라노즈를 분리하기 위하여, 반응 혼합물을 먼저 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켜 불용성 물질을 제거한 후, 순서대로 JAIGEL W-251 및 W-252 (20 mm × 500 mm)와 같은 2개의 친수성 분취용 컬럼을 구비한 분취용 고속액체크로마토그래피 (model LC-9104; JAI Ltd., Tokyo, Japan)에 적용하였다. 시료의 용출을 위하여 3mL/min의 유속으로 탈이온수를 사용하였다. 투라노즈 분획(도 2의 분획 C)을 얻고, 농축하며 동결건조하여 약 96%의 순도와 약 65%의 수율을 갖는 투라노즈를 다량 함유한 당류 분말을 얻었다(도 3).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academia Cooperation Group Of Sejong University <120> Preparation method of turanose using amylosucrase and sweetner using turanose <130> DP-2010-0560 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPAS1 <400> 1 ggatccgatg ttgaccccca cgcagcaa 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPAS2 <400> 2 ggcaagcttc aggcgatttc gagccacat 29

Claims

아밀로수크라제를 수크로즈 용액에 작용시켜 투라노즈가 생산되도록 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 정제하는 단계를 포함하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 아밀로수크라제는 미생물 Neisseria polysaccharea, Deinococcus geothermalis 및 Alteromonas macleodii로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 수크로즈 용액은 프락토즈를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 반응온도는 30 내지 40℃인 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 반응 pH는 6.5 내지 7.5℃인 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 반응시간은 100-400 units/L의 아밀로수크라제를 사용할 경우 24 내지 120시간인 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 정제는 이온-교환 컬럼 크로마토크래피, 활성탄을 이용한 컬럼 크로마토그래피 또는 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 투라노즈의 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 투라노즈를 포함하는 감미료.