WO2018230946A1

WO2018230946A1 - 신규 내열성 아밀로수크라제 효소 및 이를 이용한 아밀로스의 효소적 제조방법

Info

Publication number: WO2018230946A1
Application number: PCT/KR2018/006664
Authority: WO
Inventors: 양성재; 이영미; 김성보; 조성준
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2018-12-20
Also published as: KR102080160B1; KR20180135423A

Abstract

본 출원은 신규 내열성 아밀로수크라제 효소 및 이를 이용한 아밀로스의 효소적 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각 효소의 최적 pH, 최적 온도가 확인된 열안정성이 우수한 고온성 및 내열성의 신규 아밀로수크라제 및 이를 이용한 아밀로스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 내열성 아밀로수크라제 효소 및 이를 이용한 아밀로스의 효소적 제조방법

최근 아밀로수크라제가 식품, 화장품 및 제약 등의 산업에서 중요한 효소로 사용되고 있다. 이는 당공여체로 고가의 뉴클레오타이드당(nucleotide sugar)를 사용하는 를루아르 당전이효소(Leloir glycosyltransferases)와는 달리 아밀로수크라제는 저가인 자당을 사용하여 비교적 광범위한 당수용체들에 대해서 우수한 당전이 활성을 보유하고 있기 때문이다. 이에 따라 공정 효율화를 위해 열안정성이 높고 특정 당수용체에 대해 특이성 등이 개선된 아밀로수크라제를 개발하려는 노력이 활발히 수행되고 있다.

특히, 종래에 보고된 아밀로수크라제는 일부 중온성 미생물 속(genus)의 종에서만 제한적으로 분리되어 왔고, 이같은 미생물 유래의 효소들은 생화학적 특성 분석 결과 대부분 열 안정성도 그리 높지 않은 것으로 평가되었다(2014. Appl.Biochem.Biotechnol.173:904-917).

한편, 효소의 안정성(stability)은 특정 화합물의 효소적 제조를 위한 공정적용에 있어 매우 중요한 특성이다. 특히, 고온에서의 효소반응 공정은 자당 및 다양한 수용체들에 대한 용해도를 증가시킬 수 있어 고농도의 기질 사용이 가능하고, 물질 확산 속도 및 반응속도의 증가, 그리고 기질-효소 반응시간의 단축 등으로 인하여 단위 생산성(productivity)을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 고온의 효소반응 공정은 외부 미생물 등으로 인한 공정오염을 최소화시킬 수 있기 때문에 내열성 아밀로수크라제의 개발은 절실히 요구되고 있다. 또한, 내열성 아밀로수크라제의 열안정성을 이용하면 중온성 미생물에서도 대량 발현 후 고온 열처리에 의해 중온성 미생물 유래 단백질을 선택적으로 변성시키고 제거 할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 최근 열 안정성이 우수한 고온성 및 내열성의 신규 아밀로수크라제의 개발이 요구되어 왔다.

본 발명자는 열 안정성이 우수한 고온성 및 내열성의 신규 아밀로수크라제를 동정하고 이를 이용하여 아밀로스를 보다 효율적으로 생산하기 위하여 연구 노력한 결과, 본 출원의 신규 효소가 내열성을 가지면서 아밀로스 등은 높은 효율로 생산함을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은, 알파-아밀라아제의 효소 중 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 1) N-말단쪽으로 143번 위치가 아스팔트산, 140번 위치가 티로신, 100번 위치가 히스티딘, 61번 위치가 프롤린, 36번 위치가 페닐알라닌, 2번 위치가 아르기닌 및 2) C-말단쪽으로 165 번 위치가 아르기닌, 44 번 위치가 이소류신, 42 번 위치가 글루탐산, 14 번 위치가 글루타민, 4 번 위치가 페닐알라닌, 3 번 위치가 알라닌, 1 번 위치가 알라닌인 것을 포함하는 부위가 활성 부위인, 아밀로수크라제를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 이와 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 아밀로수크라제를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은, 상기 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 아밀로스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은, 상기 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물에 자당을 접촉시켜, 상기 자당을 아밀로스로 전환하는 단계를 포함하는, 아밀로스 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 출원은 최적 pH 및 최적 온도가 확인된 열안정성이 우수한 고온성 및 내열성의 신규한 재조합 아밀로수크라제를 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라 이 효소를 이용하여 아밀로스의 안정적인 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 출원에 따라 메이오써머스(Meiothermus) 속의 7종의 호열성 미생물들로부터 아밀로수크라제로 판단되는 유전자 서열(표 1 및 서열목록 8 내지 14)을 선발하고, 합성 프라이머(표2)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭, 재조합 효소 발현용 벡터의 제조, 종균 배양 및 정정된 각 재조합 효소의 아밀로수크라제 활성분석을 통하여 얻은 반응액 시료들의 사진도이다.

도 2는 본 출원에 따라 신규로 합성된 비수용성 화합물이 진정한 아밀로스임을 증명하기 위하여 글루코아밀라제(AMG 300L, Novozyme사)를 이용한 포도당 생성여부를 육안 및 HPLC분석을 통하여 확인한 microtube 사진도와 그래프이다.

도 3은 본 출원에 따라 제조된 신규한 아밀로수크라제 효소에 의해 튜라노스가 생성되었음을 확인하는 그래프이다.

도 4는 본 출원에 따라 제조된 신규한 아밀로수크라제 효소에 의해 과당과 글리세롤 기질로부터 글루코실-글리세롤이 생성됨을 확인한 그래프이다.

도 5a 내지 도5c는 본 출원에 따라 제조된 신규 재조합 아밀로수크라제 효소의 최적 pH를 보인 그래프이다.

도 6은 본 출원 신규한 재조합 아밀로수크라제 효소의 최적 반응온도를 나타낸 그래프이다.

이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 알파-아밀라아제의 효소 중 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 1) N-말단쪽으로 143번 위치가 아스팔트산, 140번 위치가 티로신, 100번 위치가 히스티딘, 61번 위치가 프롤린, 36번 위치가 페닐알라닌, 2번 위치가 아르기닌 및 2) C-말단쪽으로 165 번 위치가 아르기닌, 44 번 위치가 이소류신, 42 번 위치가 글루탐산, 14 번 위치가 글루타민, 4 번 위치가 페닐알라닌, 3 번 위치가 알라닌, 1 번 위치가 알라닌인 것을 포함하는 부위가 활성 부위인 아밀로수크라제를 제공하는 것이다.

또한, 상기 활성 부위는 추가로 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 N-말단쪽으로 240 번 위치 내지 241번 위치가 아르기닌, 236 번 위치 내지 237번 위치가 아르기닌, 111 번 위치 내지 112번 위치가 히스티딘, 112 번 위치 내지 113번 위치가 아스팔트산, 113 번 위치 내지 114번 위치가 아스팔트산인 것을 포함하는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 "아밀라아제 (amylase)"는 대표적인 전분 분해 효소이며, 그 작용 양식에 따라 α-아밀라아제 (α-amylase), β-아밀라아제 (β-amylase) 및 글루코아밀라아제 (glucoamylase)로 분류된다. α-아밀라아제는 타액에 주로 존재하며, α-1,4 결합만을 불규칙하게 가수분해한다. 본 출원의 알파-아밀라아제는 아밀라제의 한 종류로서 셋 이상의 α-1,4연결 포도당 단위를 갖는 다당류에서 α-1,4 글리코사이드 결합을 가수분해시키는 효소이다.

또한, 본 출원의 목적상 열 안정성이 우수한 고온성 및 내열성의 신규 아밀로수크라제를 동정한 결과, 기존에 알파-아밀라아제라고 알려진 효소가 다른 활성 부위를 가짐을 확인하였고, 이들 활성 부위는 아밀로수크라제의 활성 부위와 거의 동일함을 알 수 있었다. 이를 통해, 알파-아밀라아제 효소 중 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 N-말단 또는 C-말단쪽으로 특정 위치의 아미노산을 포함하는 활성 부위를 갖는 효소가 아밀로수크라제의 역할을 함을 알 수 있다.

본 출원에서 용어, "기준 촉매 잔기(catalytic residue)"는 촉매작용을 위하여 기질과 반응할 수 있는 효소 잔기로, 친핵성 촉매(nucleophile) 또는 일반 산-염기 촉매(general acid/base)를 포함할 수 있다. 기준 촉매 잔기는 해당 잔기를 다른 알라닌 등 다른 아미노산으로 치환하여 효소 활성을 유지여부를 확인함으로써 확인할 수 있다.

아밀로수크라제의 경우 기질인 글루코스 또는 프럭토스와 직접적으로 수소결합을 하는 아미노산일 수 있다.

일 예로 메이오써머스 러퍼스 (Meiothermus rufus) 유래의 아밀로수크라제의 경우, 277번 위치의 아스팔트산이 기준 촉매 잔기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추가 촉매 잔기는 상기 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 C-말단쪽으로 42번 위치가 글루탐산인 것으로서, 기질인 프럭토즈와 수소결합을 하거나, 기질인 프럭토즈 또는 글루코스와 O-linkage로 수소결합을 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "활성 부위(active-site)"는 효소의 한 부분으로서 기질이 결합하여 화학반응을 거치는 것을 의미한다. 효소의 활성 부위는 대부분 아미노산 잔기가 기질을 인식하는 부분이며, 직접적으로 촉매반응을 하는 잔기를 활성 자리 잔기라고 한다. 기질은 보통 효소의 활성 부위와 수소결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 힘 등을 통해 결합하게 된다.

일 예로, 본 출원의 아밀로수크라제의 활성 부위는 기질인 자당으로부터 α-1,4-결합의 가수분해를 통해 아밀로스를 생산하거나, 수크로즈로부터 환원성이당류인 튜라노스를 생산하거나, 과당과 글리세롤을 기질로 하여 글루코실-글리세롤을 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 메이오써머스 속 (Meiothermus sp .) 유래의 신규한 내열성 아밀로수크라제를 제공하는 것이다. 또한, 상기 아밀로수크라제는 상기 알파 아밀라아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 아밀로수크라제는 호열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 메이오써머스 속 (Meiothermus sp .) 유래 효소일 수 있다. 더욱 구체적으로는, 메이오써머스 러버(Meiothermus ruber), 메이오써머스 티미더스 (Meiothermus timidus), 메이오써머스 러퍼스 (Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이와넨시스 (Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 실바너스 (Meiothermus silvanus), 메이오써머스 써베레우스 (Meiothermus cerbereus), 또는 메이오써머스 클리아로필러스(Meiothermus chliarophilus) 유래 효소일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 아밀로수크라제는 열안정성이 확보된 효소로, 보다 안정적으로 아밀로스의 대량 생산에 적용할 수 있는 장점이 있다.

본 출원에서 용어, "아밀로수크라제"는 자당을 아밀로스로 전환시키는 활성을 가지는 폴리펩티드, 아밀로스 생산 폴리펩티드, 아밀로스를 생산하는 폴리펩티드, 수크로즈를 투라노스로 전환시키는 활성을 가지는 폴리펩티드, 투라노스 생산 폴리펩티드, 투라노스를 생산하는 폴리펩티드, 과당 및 글리세롤을 글루코실-글리세롤로 전환시키는 활성을 가지는 폴리펩티드, 글루코실-글리세롤 생산 폴리펩티드, 글루코실-글리세롤을 생산하는 폴리펩티드 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한 아밀로수크라제는 효소 번호(EC number)가 EC 2.4.1.4일 수 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는, 서열번호 1 또는 이와 60% 이상의 서열 동일성을 갖는, 아밀로수크라제를 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열은 서열번호 2 내지 7의 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 상기 아밀로수크라제는 서열번호 1 의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 아밀로수크라제는 서열번호 1 내지 7과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아밀로수크라제를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 아밀로수크라제에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 아밀로수크라제라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 "상동성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련성 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.

또한, 상기 "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 일치하는 정도를 의미하며, 경우에 따라서는 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된다.

용어 "상동성" 및 "동일성"은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성 또는 동일성이 있는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 일반적으로 모두 또는 타겟 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 엄격도 또는 높은 엄격도에서 하이브리드할 것이다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 적어도 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(바람직하게는, 버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다.

본 출원의 아밀로수크라제는 내열성을 가질 수 있다.

본 출원에서 사용된 용어 "내열성"은 아밀로수크라제의 열안정성이 증가된 것을 의미한다. 구체적으로 상기 내열성에 의하여 고온에서 효소반응이 가능하며, 고온의 반응 공정에서 기질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 기질 용해도가 증가함에 따라 고농도의 기질 사용이 가능하며, 물질의 확산 속도 또는 반응속도가 증가되어 반응시간이 단축됨으로써 생산성이 향상될 수 있다. 또한, 외부 미생물로 인한 공정오염을 최소화할 수 있다.

또한, GRAS(generally recognized as safety) 미생물들에서 상기 아밀로수크라제를 대량 발현 시킨 후 내열성 특성을 이용하면 사균화 균체로 이용가능하다. 구체적으로, 고온에서 열처리하는 방법으로 효과적으로 재조합 미생물들을 사균화 가능할 뿐만 아니라, 상기 아밀로수크라제를 분리하여 이용하고자 할 경우에도 재조합 미생물 유래의 단백질들을 선택적으로 변성시키고 제거 할 수 있어 아밀로수크라제의 정제공정을 효율화 할 수 있는 장점이 있다.

구체적으로 상기 아밀로수크라제는 50℃ 내지 70℃에서 0.5시간 내지 24시간 열처리 시, 상기 열처리 전의 활성의 75% 이상의 활성을 유지할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 아밀로수크라제는 50℃ 내지 70℃에서 0.5시간 내지 24시간 열처리 시 상기 열처리 전의 활성의 100% 이상의 활성을 유지할 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 본 출원의 아밀로수크라제의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 출원의 아밀로수크라제와 동일한 활성을 가지는 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 아밀로수크라제를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아밀로수크라제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 서열번호 1 내지 7의 아밀로수크라제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 14의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 8 내지 14의 염기서열과 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아밀로수크라제로서, 본 출원의 아밀로수크라제와 동일한 활성을 가지는 아밀로수크라제라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 아밀로수크라제는 각각 서열번호 8 내지 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 것일 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 아밀로수크라제를 포함하거나, 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 아밀로수크라제 및/또는 상기 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 재조합 미생물에 있어서 상기 재조합은 형질 전환에 의해 이루어질 수 있다. 본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(Ca(H₂PO₄)₂, CaHPO₄, 또는 Ca₃(PO₄)₂) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 숙주세포 또는 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하여 자당으로부터 아밀로스를 생산하거나, 수크로즈로부터 투라노스를 생산하거나, 과당 및 글리세롤로부터 글루코실-글리세롤을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 출원의 재조합 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 자당을 아밀로스로, 수크로즈를 투라노스로, 과당 및 글리세롤을 글루코실-글리세롤으로 전환시키는 활성을 가지는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는, 상기 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 아밀로스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 상기 조성물은 투라노스 또는 글루코실-글리세롤을 추가로 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 조성물은 당해 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물에 자당을 접촉시켜, 상기 자당을 아밀로스로 전환하는 단계를 포함하는, 아밀로스 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 상기 방법은 접촉과정에서 기질로 수크로즈를 접촉시키는 경우 수크로즈를 투라노스로 전환하여 투라노스를 제조할 수 있으며, 과당 및 글루코스를 접촉시키는 경우 과당 및 글루코스를 글리코실-글리세롤로 전환하여 글리코실-글리세롤을 제조할 수 있다.

또한, 상기 접촉은 pH 7.0 내지 8.0 조건에서, 50℃ 내지 60℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 24시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0, pH 7.0 내지 pH 9.0, pH 5.0 내지 pH 8.0, pH 6.0 내지 pH 8.0, 또는 pH 7.0 내지 pH 8.0에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 75℃, 45℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 75℃, 55℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 75℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 또는 6시간 내지 24시간 동안 수행할 수 있다.

상기 조성물 또는 상기 방법에 있어서, 상기 미생물의 배양물은 본 출원의 폴리펩티드를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계로부터 제조될 수 있다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 수행될 수 있다. 이러한 배양은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 배양은 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 pH 9, 구체적으로는 pH 6 내지 pH 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 0.5시간 내지 160시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 본 출원의 폴리펩티드는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 제조방법은 제조된 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 투라노스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 자당, 수크로즈, 과당 및 글리세롤을 본 출원의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 아밀로스, 투라노스, 또는 글루코실-글리세롤을 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 수크로스의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

본 출원은 신규 내열성 아밀로수크라제 효소 및 이를 이용한 아밀로스의 효소적 제조방법을 개시한다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.

실시예 1. 내열성 아밀로수크라제를 생산하는 신규 형질전환체 균주의 제조 및 재조합 효소의 정제

실시예 1-1. 내열성 아밀로수크라제를 생산하는 신규 형질전환체 균주의 제조 및 재조합 효소의 정제

먼저, 본 출원의 이화학적 특성을 보유하는 신규 내열성의 아밀로수크라제(amylosucrase, EC 2.4.1.4)를 제공하기 위해 표 1에 명기된 메이오써머스(Meiothermus) 속 7종의 호열성 미생물로부터 아밀로수크라제로 판단되는 유전자 서열(서열목록 8 내지 14)을 선발하였다.

다음에, 합성 프라이머(표 2)를 이용하여 각 메이오써머스(Meiothermus) 속 염색체 DNA(genomic DNA)로부터 해당 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 신장을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 신장반응을 수행하였다.

그 결과, 약 2000bp의 Mrb_AS(1911bp), Mti_AS(1953bp), Mrf_AS(1923bp), Mta_AS(1911bp), Msi_AS(1935bp), Mce_AS(1911bp), Mch_AS(1947bp)를 수득하였다.

아밀로수크라제유전자 공여 미생물명	아미노산 서열번호	염기 서열번호	재조합 효소명	한국 미생물 보존센터 균주기탁 정보
아밀로수크라제유전자 공여 미생물명	아미노산 서열번호	염기 서열번호	재조합 효소명	재조합 균주명	기탁 번호
Meiothermus ruber	1	8	Mrb_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mrb_AS	KCCM11936P
Meiothermus timidus	2	9	Mti_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mti_AS	KCCM11937P
Meiothermus rufus	3	10	Mrf_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mrf_AS	KCCM11938P
Meiothermus taiwanensis	4	11	Mta_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mta_AS	KCCM11939P
Meiothermus silvanus	5	12	Msi_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Msi_AS	KCCM11940P
Meiothermus cerbereus	6	13	Mce_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mce_AS	KCCM11941P
Meiothermus chliarophilus	7	14	Mch_AS	E. coli BL21(DE3)/CJ_ Mch_AS	KCCM11942P

유전자	프라이머	서열	서열번호
Mrb_AS	정방향(F)	GGGCATATG ATGGACGAGGCCCTTTTTTTTG	15
Mrb_AS	역방향(R)	CCGTCAGCTACCGGGCGCTGGGTCAGCC	16
Mti_AS	정방향(F)	GGG CATATGATGTTCTCCACCCCGCTCCCTG	17
Mti_AS	역방향(R)	CCGTCAGCTCGATCACTCTCATCCGT	18
Mrf_AS	정방향(F)	GGGCATATGATGGATGTTGCTGCCTTCCTGAA	19
Mrf_AS	역방향(R)	CCGTCAGCTAGCTTGCCCTCGAGGGGAG	20
Mta_AS	정방향(F)	GGG CATATGATGGACGAGGCCCTTTTTTTTG	21
Mta_AS	역방향(R)	CCGTCAGCTACCGGGTGCTGGGTGAGC	22
Msi_AS	정방향(F)	GGG CATATGATGTTTTCCCGACCCCTTACC	23
Msi_AS	역방향(R)	CCGTCAGCGCCCTCGCCCTGGGTCAGC	24
Mce_AS	정방향(F)	GGGCATATGATGAACGAGCGAGTTTTTTTTG	25
Mce_AS	역방향(R)	CCGTCAGCTACCGGGTGCTGGGTTAG	26
Mch_AS	정방향(F)	GGG CATATGATGTTCTCTACCCCGCTCCCC	27
Mch_AS	역방향(R)	CCGTCAGCCACCTCATCCGTGATCCACAG	28

상기에서 얻은 증폭된 유전자를 제한효소 NdeI 및 SalI을 사용하여 pET21a_SalI6His(pET21a의 제한효소 XhoI 인식부위 CTCGAG를 SalI 인식부위 GTCGAC로 변형한 벡터)에 삽입하여 재조합 효소 발현용 벡터 7종을 제조하였다.

상기 각 재조합 벡터를 열충격(heat shock) 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 7종의 재조합 균주를 제조하였다. 상기 형질전환체들은 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터에 2016년 11월 22일자 기탁하여 기탁번호, KCCM11936P 내지 KCCM11942P를 각각 부여 받았다(표1).

본 발명자들은 재조합 효소(서열번호 1 내지 7)를 제조하기 위해, 상기 각 형질전환된 균주를 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 각각 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 수행하였다. 상기와 같이 배양된 전 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 다시 본 배양을 실시하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 본 배양 공정에서 교반 속도는 200 rpm이며 배양 온도는 37℃를 유지하였다. 상기 본 배양액은 8,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)으로 2회 세척하고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다(도1A). 본 출원에 따라 합성된 각 재조합 효소들은 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.

실시예 1-2. 메이오써머스 ( Meiothermus ) 속 7종 호열성 미생물간의 서열 동일성 분석

표 1에 명기된 메이오써머스(Meiothermus) 속 7종의 호열성 미생물간의 서열 동일성을 분석하기 위하여 단백질(아미노산) 서열간 서열 정렬(sequence alignment)을 위한 도구로서 ClustalW 프로그램을 사용하였고, 두 서열이 부분적으로 어느 정도의 높은 상동성을 가지는가를 나타내기 위해 정렬하는 국부 상동성(local homology)이 아닌 전역 다중 정렬(global multiple alignment)를 사용하였다. 이러한 전역 다중 정렬 방법으로 선택된 효소의 서열들을 정렬한 후, 전체 서열에 대해 서열간 유사성 (Sequence Similarity, %) 및 서열간 동일성 (Sequence Identity, %)을 분석 하였다.

그 결과, 선정된 7종의 효소(MchAS, MtiAS, MsiAS, MceAS, MrbAS, MtaAS, MrfAS)의 아미노산 서열은 서로간에 61% 이상의 동일성을 가짐을 확인하였다(표 3).

	MchAS	MtiAS	MsiAs	MceAs	MrbAs	MtaAs	MrfAs
MchAS		92	76	62	61	61	62
MtiAS			75	62	62	62	61
MsiAs				61	62	61	61
MceAs					89	88	85
MrbAs						96	86
MtaAs							85

실시예 1-3. 메이오써머스 ( Meiothermus ) 속 7종 호열성 미생물의 활성 부위 분석

표 1에 명기된 메이오써머스(Meiothermus) 속 7종의 호열성 미생물의 활성 부위(Active site)를 분석하기 위하여 아밀로수크라제 활성부위 내 촉매 잔기로 알려진 영역과 기준 촉매 잔기(catalytic residue)를 비교하였다.

구체적으로 아밀로수크라제 활성부위 내 촉매 잔기는 FEBS Lett., 2000., 474, 33-37, J. Biol. Chem., 2012, 287, 6642-6654 등에서 기재된 촉매 잔기를 기준으로 하였다.

그 결과, 선정된 7종의 효소(MchAS, MtiAS, MsiAS, MceAS, MrbAS, MtaAS, MrfAS)의 아미노산 서열은 서로간에 기준 촉매 잔기를 기준으로 동일한 거리에 활성부위가 위치하거나 2개 이내의 아미노산 서열 거리 정도의 차이가 있음을 확인하였다(표 4).

	MrbAs	MtiAS	MrfAs	MtaAs	MsiAs	MceAs	MchAS	비고
1	H177	H185	H177	H177	H180	H177	H168
2	Y137	Y145	Y137	Y137	Y140	Y137	Y128
3	D134	D142	D134	D134	D137	D134	D125
4	R518	R525	R518	R518	R520	R518	R508
5	R514	R521	R514	R514	R516	R514	R504
6	H388	H397	H388	H388	H391	H388	H379
7	D389	D398	D389	D389	D392	D389	D380
8	D390	D399	D390	D390	D393	D390	D381
9	R442	R450	R442	R442	R445	R442	R433
10	I321	I329	I321	I321	I324	I321	I312
11	P216	P224	P216	P216	P219	P216	P207
12	Q291	Q299	Q291	Q291	Q294	Q291	Q282
13	A280	A288	A280	A280	A283	A280	A271
14	F281	F289	F281	F281	F284	F281	F272
15	A278	A286	A278	A278	A281	A278	A269
16	D277	D285	D277	D277	D280	D277	D268	기준 촉매 잔기
17	F241	F249	F241	F241	F244	F241	F232
18	R275	R283	R275	R275	R278	R275	R266
19	E319	E327	E319	E319	E322	E319	E310	기준 촉매 잔기

실시예 2. 신규 아밀로수크라제를 이용한 아밀로스, 투라노스 및 글루코실 -글리세롤의 생산

실시에 2-1. 아밀로수크라제에 의한 아밀로스 생산

실시예 1에서 제조된 각 재조합 효소에 대해 아밀로수크라제의 주요 반응인 자당으로부터 α-1,4-결합을 한 선형의 비수용성 글루칸인 아밀로스가 합성되는지 여부에 대한 활성 분석을 수행하였다.

반응 조성물은 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 자당에 2 mg/mL 정제된 효소를 첨가하였다. 음성 대조군 반응으로는 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 2 mg/mL 정제된 효소를 첨가 후 열처리(100℃, 약 10분)하여 효소를 불활성화 하였고, 본 시료액에 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 자당을 첨가하여 반응 조성물을 조제하였다. 각 반응 조성물은 60℃에서 약 5시간까지 반응 시간에 따른 비수용성 아밀로스의 생성여부를 확인하였다.

그 결과, 본 출원에 따라 합성된 재조합 효소들은 모두 침전물 형태의 비수용성 화합물인 아밀로스를 생성함을 확인하였다(도 1B).

또한, 본 출원에 따라 합성된 아밀로스가 진정한 아밀로스임을 증명하기 위하여 말토덱스트린의 α-1,4-결합을 가수분해 할 수 있는 글루코아밀라제(AMG 300L, Novozyme社)를 이용하여 60℃에서 10시간 분해시킨 후 포도당 생성 여부를 확인하였다.

그 결과, 비수용성인 아밀로스는 효소반응후 수용성 물질 즉 포도당으로 분해 됨을 마이크로튜브(microtube)에 넣어 육안 및 HPLC 분석을 통해 확인하였다(도 2).

실시예2-2. 아밀로수크라제에 의한 튜라노스(turanose) 생산

실시예 1에서 제조된 각 재조합 효소 아밀로수크라제가 수크로즈로부터 환원성이당류인 튜라노스가 합성되는지 여부에 대한 활성 분석을 수행하였다.

반응 조성물은 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 자당에 2 mg/mL 정제된 효소를 첨가하였다. 음성 대조군 반응으로는 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 2 mg/mL 정제된 효소를 첨가 후 열처리(100℃, 약 10분)하여 효소를 불활성화 하였고, 본 시료액에 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 수크로즈를 첨가하여 반응 조성물을 조제하였다. 각 반응 조성물은 60℃에서 약 5시간까지 반응 시간에 따른 튜라노스의 생성여부를 확인하였다.

그 결과, 본 출원의 재조합 효소들은 모두 튜라노스를 생성함을 확인하였다(도 3).

실시예2 -3. 아밀로수크라제에 의한 글루코실 -글리세롤( glucosyl -glycerol) 생산

실시예 1에 따라 제조된 각 재조합 효소 아밀로수크라제의 반응에 의해 과당과 글리세롤을 기질로 하여 글루코실-글리세롤이 합성되는지 여부에 대한 활성 분석을 수행하였다.

반응 조성물은 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 0.8M 자당과 다양한 농도의 글리세롤(0.1, 0.4, 0.8, 1.6, 2.4M)을 현탁한 후 2 mg/mL 정제된 각 효소를 첨가하였다. 각 반응 조성물은 55℃에서 약 16시간 동안 반응시킨 후 글루코실-글리세롤의 생성여부를 확인하였다.

그 결과, 본 출원의 재조합 효소들은 모두 글루코실-글리세롤의 생성함을 확인하였다(도 4).

실시예 3. 재조합 효소의 최적 pH 및 온도, 열안정성 분석

실시예 3-1. pH 변화와 효소 활성 검정

먼저, 본 출원에 따른 신규 재조합 효소의 pH 변화와 효소 활성 관계를 분석하고자 하였다.

반응 조성물은 다양한 pH의 50 mM 완충용액(pH 4-7, 시트르산 나트륨; pH 4-7, 아세트산 나트륨; pH 6-8, 인산 칼륨: pH 7-9, Tris-HCl)에 현탁된 45%(w/v) 자당과 0.5 mg/mL 본 출원에 따라 정제된 효소를 첨가하여 조제하였다. 55℃에서 10분 동안 반응된 각 시료는 열처리(100℃, 약 10분)하여 반응을 중지시킨 후 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 SUGAR SP0810(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80℃에서, 이동상으로 물을 0.6 ml/분 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, 시차 굴절률 검출기(Refractive Index Detector)로 자당을 검출하여 자당 분해를 정량 분석하고 본 출원 아밀로수크라제 효소의 최적 pH가 7.5임을 확인하였다(도 5a 내지 도c).

실시예 3-2. 온도 변화와 효소 활성 검정

또한, 상기 재조합 효소의 온도 변화에 따른 효소 활성을 분석하고자 하였다.

반응 조성물은 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 자당과 0.5 mg/mL 본 출원에 따라 정제된 상기 효소를 첨가하여 조제하였다. 40 내지 90℃에서 10분 동안 반응된 각 시료는 열처리(100℃, 약 10분)하여 반응을 중지시킨 후 상기 실험예와 동일한 조건으로 HPLC로 분석하여 최적 온도를 확인하였다.

그 결과, 종래 미생물 유래의 효소들의 각각 30℃~50℃의 최적 온도에 비하여 50℃ 이상 75℃까지도 열안정성이 있는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 3-3. 열안정성 분석

실시예 1에서 정제한 본 출원 효소액(50 mM 인산 칼륨 완충용액 내, pH 7.0)을 공시재료로 50℃에서 70℃까지의 범위에서 24시간 동안 열처리한 후, 50 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁된 45%(w/v) 자당을 첨가하여 잔여 활성을 측정하였다. 반응 후 열처리(100℃, 약 10분)하여 반응을 중지시킨 후 상기 실험예와 동일한 조건으로 HPLC로 분석하여 열안정성을 확인하였다.

그 결과, 최적 pH 및 온도와 열안정성은 하기 표5와 같이 pH 7.5 및 50℃ 이상 60℃ 이하로 확인되었다(표 5).

아밀로수크라제유전자 공여 미생물명	재조합 효소명	최적pH	최적온도(℃)	열안정성^*	참고문헌
Deinococcus geothermalls	Dge_AS		47-50℃	50℃에서26시간 후, 50% 활성 손실됨55℃에서6.8시간 후, 50% 활성 손실됨	2008, FEMS Microbilo. Lett 285:25-322009. Carbohydr. Res. 344:1612-1619
Melothermus ruber	Mrb_AS	7.5	60	60℃에서 24시간 후, 5% 이하 활성 손실됨	본 발명
Melothermus timidus	Mti_AS	7.5	60	60℃에서 24시간 후, 5% 이하 활성 손실됨
Melothermus rufus	Mrf_AS	7.5	60	70℃에서 24시간 후, 5% 이하 활성 손실됨
Melothermus taiwanensis	Mta_AS	8	60	60℃에서 24시간 후, 5% 이하 활성 손실됨
Melothermus Silvanus	Msi_AS	7.5	55	60℃에서 24시간 후, 15% 이하 활성 손실됨
Melothermus cerbereus	Mce_AS	7.5	55	60℃에서 24시간 후, 20% 이하 활성 손실됨
Melothermus chliarophilus	Mch_AS	7.5	50	60℃에서 24시간 후, 20% 이하 활성 손실됨

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

알파-아밀라아제의 효소 중 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 1) N-말단쪽으로 143번 위치가 아스팔트산, 140번 위치가 티로신, 100번 위치가 히스티딘, 61번 위치가 프롤린, 36번 위치가 페닐알라닌, 2번 위치가 아르기닌 및 2) C-말단쪽으로 165 번 위치가 아르기닌, 44 번 위치가 이소류신, 42 번 위치가 글루탐산, 14 번 위치가 글루타민, 4 번 위치가 페닐알라닌, 3 번 위치가 알라닌, 1 번 위치가 알라닌인 것을 포함하는 부위가 활성 부위인, 아밀로수크라제.
제1항에 있어서,

상기 활성 부위는 추가로 기준 촉매 잔기인 아스팔트산으로부터 N-말단쪽으로 240 번 위치 내지 241번 위치가 아르기닌, 236 번 위치 내지 237번 위치가 아르기닌, 111 번 위치 내지 112번 위치가 히스티딘, 112 번 위치 내지 113번 위치가 아스팔트산, 113 번 위치 내지 114번 위치가 아스팔트산인 것을 포함하는 것인, 아밀로수크라제.
제1항에 있어서,

상기 아밀로수크라제는 메이오써머스 속 (Meiothermus sp .) 속 미생물 유래인 것인, 아밀로수크라제.
제 3항에 있어서,

상기 메이오써머스 속 미생물은 메이오써머스 러버(Meiothermus ruber), 메이오써머스 티미더스 (Meiothermus timidus), 메이오써머스 러퍼스 (Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이와넨시스 (Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 실바너스 (Meiothermus silvanus), 메이오써머스 써베레우스 (Meiothermus cerbereus), 및 메이오써머스 클리아로필러스(Meiothermus chliarophilus)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 호열성 미생물인 것인, 아밀로수크라제.
서열번호 1 또는 이와 60% 이상의 서열 동일성을 갖는, 아밀로수크라제.
제5항에 있어서,

상기 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열은 서열번호 2내지 7의 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것인, 아밀로수크라제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아밀로수크라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물.
제8항의 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 아밀로스 생산용 조성물.
제11항에 있어서,

상기 조성물은 투라노스 또는 글루코실-글리세롤을 추가로 생산하는 것인, 아밀로스 생산용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물에 자당을 접촉시켜, 상기 자당을 아밀로스로 전환하는 단계를 포함하는, 아밀로스 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물에 수크로즈를 접촉시켜, 상기 수크로즈를 투라노스로 전환하는 단계를 포함하는, 투라노스 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 아밀로수크라제, 상기 아밀로수크라제를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물에 과당 및 글루코스를 접촉시켜, 상기 과당 및 글루코스를 글리코실-글리세롤로 전환하는 단계를 포함하는, 글리코실-글리세롤 제조 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 접촉은 pH 7.0 내지 pH 8.0, 및 50℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행하는, 제조 방법.