WO2018182345A1 - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 - Google Patents

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 Download PDF

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    • C12Y503/01009—Glucose-6-phosphate isomerase (5.3.1.9)
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    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/02—Phosphotransferases (phosphomutases) (5.4.2)
    • C12Y504/02002—Phosphoglucomutase (5.4.2.2)

Definitions

  • the transformed gene may include both the form inserted into the chromosome of the host cell and the form located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the gene may include DNA and RNA as a polynucleotide capable of encoding a polypeptide, and may be used without limitation as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in its own form or in the form of a polynucleotide structure, and may be operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the term "culture” means growing the microorganisms under appropriately controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the culture conditions are not particularly limited, but using a basic compound (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg phosphoric acid or sulfuric acid) to an appropriate pH (eg pH 5 to 9, specifically PH 7 to 9) can be adjusted.
  • a basic compound eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg phosphoric acid or sulfuric acid
  • Another aspect of the present application is to convert fructose-6-phosphate to tagatose-6-phosphate by contacting fructose-6-phosphate with tagatose-diphosphate aldolase, a microorganism expressing it or a culture of the microorganism. It relates to a process for preparing tagatose-6-phosphate, which comprises
  • Thermotoga registered in Genbank maritima ) genes were selected for the gene (SEQ ID NO: 8, hereinafter, t4) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) that is expected to tagatose-6-phosphate dephosphorase enzyme, and the sequence of the selected gene Based on the forward primer (SEQ ID NO: 29) and the reverse primer (Reverse primer, SEQ ID NO: 30) was designed and synthesized.
  • the primers were used to amplify the t4 gene by polymerase chain reaction (PCR) using thermochromic DNA (genomic DNA) of Marimotoma as a template. Each gene was amplified and then inserted into E.

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Abstract

본 출원은 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법
본 출원은 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.
타가토스는 우유, 치즈, 카카오 등의 식품, 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며 GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 여러 제품 적용 시 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 대체 감미료로 이용될 수 있다.
종래 공지된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적(촉매 반응)방법과 생물학적(이성화 효소반응) 방법이 있다(PCT WO 2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격의 불안정성이 존재하여, 타가토스 생산 원료의 안정적 수급에 한계가 있다. 따라서, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 필요하여 연구된 바 상기 문헌들은 포도당과 갈락토스 및 과당으로부터 각각 갈락토스, 사이코스 및 타가토스를 생산하는 방법을 개시하고 있다(대한민국 등록특허 제10-744479호, 제10-1057873호 및 제10-1550796호).
한편, 타가토스-6-인산 키나아제(Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)는 아래 [반응식 1]에서와 같이, ATP 와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP 와 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있으나, 상기 타가토스-6-인산 키나아제가 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2018003749-appb-I000001
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 경제적 원료를 이용하면서도 타가토스로의 전환율을 높일 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 타가토스-6-인산 키나아제(Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)가 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 기능이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
이에 포도당 또는 전분을 원료로 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 순차적으로 제조한 후 본 출원의 타가토스-6-인산 키나아제를 이용하여 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)으로 전환시키고, 비가역 반응경로를 수행하는 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 타가토스를 생산할 수 있으면서, 포도당 또는 전분에서 타가토스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
본 출원의 일 목적은 타가토스-6-인산 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-6-인산 키나아제, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.
본 출원의 다른 일 목적은 타가토스 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-6-인산 키나아제, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물; 및 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.
본 출원의 다른 일 목적은 과당-6-인산에, 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는 타가토스-6-인산의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 상기 타가토스-6-인산을 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스-6-인산 생산용 조성물을 제공한다.
상기 타가토스-6-인산 키나아제는 (Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)는 ATP 와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP 와 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있는 것으로서, 예를 들어 과당-6-인산을 기질로 하여 타가토스-6-인산을 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다.
상기 타가토스-6-인산 키나아제는 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당-6-인산의 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스-6-인산으로 전환시키는 과당-6-인산 C4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-6-인산 C4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 키나아제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 이르러 '타가토스-6-인산 키나아제'가 과당-6-인산의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 과당-6-인산 4-에피머화 활성을 나타냄을 밝혀내었으며 따라서 본원에서는 '타가토스-6-인산 키나아제' 는 '과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate C4 epimerase)'와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 동일성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 타가토스-6-인산 키나아제 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 언에어로리네 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 딕티오글로무스 속(The genus of Dictyoglomus) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 언에어로리네 박테리움(Anaerolineae bacterium), 또는 딕티오글로무스 써모필움(Dictyoglomus thermophilum) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)-6-인산의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스-6-인산으로 전환시키는 특징이 있다. 본원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소로는 타가토스-6-인산 키나아제 (tagatose-6-phosphate kinase) 활성을 가지는 것으로 알려진 효소를 사용할 수 있으며, 타가토스-6-인산 키나아제는 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있었다. 본 출원에 이르러, 상기 타가토스-6-인산 키나아제가 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 새로이 밝혀내었다. 이에, 본 출원의 일 구현예는 과당-6-인산으로부터 타가토스-6-인산을 제조함에 있어서 타가토스-6-인산 키나아제를 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-6-인산 키나아제의 신규 용도에 관한 것이다. 또한, 본 출원의 일 구현예는 타가토스-6-인산 키나아제를 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 사용하여 과당-6-인산으로부터 타가토스-6-인산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 55℃ 내지 65℃, 60℃ 내지 70℃, 55℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.
나아가 이에 제한되는 것은 아니나 상기 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화효소는 각각 순서대로 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2, 4, 또는 6으로 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다. 구체예에서, 이러한 형질전환된 균주로 미생물은 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1, E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E 이며, 상기 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1는 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11996P로 기탁되었고, 상기 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E 는 2017년 9월 13일에 KCCM12110P 로 기탁되었고, 상기 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E는 2017년 8월 11일에 KCCM12093P로 기탁되었다.
본 출원에서 사용되는 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 이를 암호화하는 핵산을 이용하여 제공될 수 있다.
본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 출원의 핵산은 본 출원의 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 예컨데, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 3, 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 암호화하는 각각의 핵산은 이에 상응하는 서열번호 4, 또는 6의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 더불어, 본 출원의 핵산은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소로 번역될 수 있는 핵산을 포함할 수 있고, 서열번호 2, 4, 또는 6의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 역시 포함할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 사용될 수 있는 과당-6-인산-4-에피머화효소를 발현하는 미생물은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기
벡터는 본 출원의 핵산이 작동가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 이용될 수 있는 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 구체예로는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1, E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E 등일 수 있다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소 또는 관련 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-6-인산 키나아제 또는 관련 효소를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25℃ 내지 40 ℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스-6-인산 생산용 조성물은 추가로 과당-6-인산을 포함할 수 있으며, 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화효소에 의해 상기 과당-6-인산은 타가토스-6-인산으로 전환될 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 및 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물에 관한 것이다. 당해 양태에서 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물에 대한 설명은 전술한 양태에서와 동일하다.
본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 타가토스-6-인산의 인산기를 제거하여 타가토스로 전환시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마(Themotoga maritima) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 유전적 상동성 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화효소는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포도당-6-인산 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 효소의 존재하에 포도당-6-인산을 이성화하여 과당-6-인산을 생성할 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 이성화시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 유전적 상동성 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 효소는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키거나, 포도당-6-인산을 포도당-1-인산으로 전환시키는 가역 반응을 촉매한다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 또는 그 역으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 네아폴리타나 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포스포글루코무타아제는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 포스포글루코무타아제는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포도당을 인산화하는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 데이노코커스 sp. 또는 언에어로리네 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 데이노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis), 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포도당을 포도당-6-인산으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 포도당 인산화 효소는 포스페이트 의존형 포도당 인산화 효소일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 포도당 인산화 효소는 서열번호 13 또는 15의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 포도당 인산화 효소는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있고, 본 출원의 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 포도당 인산화 효소는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 포스포릴라아제는, 전분, 말토덱스트린, 또는 수크로오스를 포도당-1-인산으로 전환시킬 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 포스포릴라아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 네아폴리타나 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 포스포릴라아제는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 포스포릴라아제는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 또는 이소아밀라아제(isoamylase); 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 본원에 기재된 타가토스 생산에 사용될 수 있는 2종 이상의 효소들 또는 이의 형질전환체들을 개별적으로 포함하거나, 2종 이상의 효소를 암호화하는 뉴클레오티드들로 형질전환된 형질전환체를 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 4-α-글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase), 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가진 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 써모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 써모토가 마리티마 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지거나 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 유전적 상동성을 갖는 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 4-α-글루카노트랜스퍼라아제는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
상기한 구현예들에서 사용될 수 있는 미생물의 예로는, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2, 및 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4 등을 들 수 있다. 상기 재조합미생물 각각은, 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11990P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1), KCCM11991P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), KCCM11993P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2), KCCM11994P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4) 로 기탁되었다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 상술한 효소들의 각각의 기질에 해당하는 물질, 성분, 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈, 코발트, 알루미늄, 마그네슘(Mg) 및 망간(Mn)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoCl2, CoSO4, MnCl2 및 MnSO4로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 과당-6-인산을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는, 타가토스-6-인산의 제조방법에 관한 것이다.
상기 타가토스-6-인산 생산용 조성물에 관한 사항은 타가토스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 과당-6-인산을, 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 것을 포함하는, 타가토스-6-인산의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 타가토스-6-인산을 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은, 포도당에 본원에 기술된 바와 같은 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 포도당에 본원에 기술된 바와 같은 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로오스로 전환시키는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법에서 각 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 36시간, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 12시간 내지 36시간 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속, 금속 이온 또는 금속염의 존재하에서 수행할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 본원에 기술된 타가토스 생산용 조성물을, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; 및 포스페이트(polyphosphate)와 접촉시키는 것을 포함하는 타가토스의 제조방법에 관한 것이다.
본 출원의 일 구체예에서,
포도당에, 본원에 기술된 바와 같은 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환시키고,
상기 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키고,
상기 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에, 본원에 기재된 과당-6-인산-4-에피머화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키고,
상기 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 타가토스-6-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 것을 포함하는 타가토스의 제조 방법이 제공된다.
상기 각 전환 반응은 순차적으로 실시되거나, 동일 반응계의 in situ 반응으로 실시될 수 있다. 상기 방법에서, 상기 탈인산화효소에 의해 타가토스-6-인산으로부터 유리된 인산이, 포도당 인산화 효소의 기질로 사용되어 포도당-6-인산의 생성에 사용되므로, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있다.
상기 방법에서 포도당은, 일 예에서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 ａ-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환시켜 제조된 것일 수 있다. 이에, 상기 구체예에 따른 방법은 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 구체예에서,
포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키고,
상기 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키고,
상기 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에, 본원에 기재된 과당-6-인산-4-에피머화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키고,
상기 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)에 본원에 기술된 바와 같은 타가토스-6-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 것을 포함하는 타가토스의 제조 방법이 제공된다.
상기 각 전환 반응은 순차적으로 실시되거나, 동일 반응계의 in situ 반응으로 실시될 수 있다.
상기 방법에서 포도당-1-인산은, 일 예에서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 본원에 기술된 바와 같은 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환시켜 제조된 것일 수 있다. 이에, 상기 구체예에 따른 방법은 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 탈인산화효소에 의해 타가토스-6-인산으로부터 유리된 인산이, 포스포릴라아제의 기질로 사용되어 포도당-1-인산의 생성에 사용되므로, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있다.
상기 방법은 추가로 제조된 타가토스를 정제하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 상기 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 타가토스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 타가토스 반응물을 얻을 수 있다.
본 출원에 따른 타가토스 제조 방법은 포도당 또는 전분을 원료로 사용하여 경제적이며, 인산이 축적되지 않아 높은 전환율을 얻을 수 있으며, 비가역 반응경로인 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase) 반응을 포함함으로써 타가토스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 포도당 또는 전분을 원료로 하여 복합 효소 반응을 통하여 타가토스를 생산할 수 있어, 제조 방법이 간단하면서도 경제적이며 수율이 개선된 이점이 있다.
도 1은 전분, 수크로스 또는 포도당으로부터 타가토스 제조의 반응 경로에 사용되는 효소들의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸다. M은 단백질 크기측정 마커(size marker, Bio-RAD, USA)이다.
도 2는 본 출원의 일 실시예의 효소인 CJ_AN1_F6P4E이 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 3는 본 출원의 일 실시예의 효소인 CJ_DT_F6P4E이 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 4는 본 출원의 일 실시예의 효소인 CJ_AB_F6P4E이 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 5는 본 출원의 일 실시예에서 과당-6-인산에 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_DT_F6P4E) 및 CJ_T4_T6PP 처리시 타가토스로 전환됨을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 6은 본 출원의 말토덱스트린으로부터 타가토스 제조 경로에 관여하는 모든 효소를 동시에 첨가한 경우, 복합효소반응에 의하여 타가토스가 생성됨을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과로, 타가토스-6-인산 키나아제로 CJ_AN1_F6P4E을 이용하였다.
도 7은 본 출원의 효소인 T4가 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 각 효소들의 재조합 발현 벡터 및 형질전환체들의 제조
본 출원의 타가토스 제조 경로에 필요한 내열성 효소인 *j글루칸 포스포릴라아제 (α-glucan phosphorylase), 포스포글루코무타아제 (phosphoglucomutase), 포도당-6-인산-이성화효소 (glucose-6-phosphate-isomerase), 4-*j글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase) 를 제공하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 또는 써모토가 마리티마의 Genbank에 등록된 유전자 서열들을 대상으로 상기 효소들로 예상되는 유전자 서열을 선발[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 18(CT1), 서열번호 12(CT2), 서열번호 10(TN1), 서열번호 20(TN2)]하였다.
상기 선발한 유전자의 서열을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 21: CT1-Fp, 서열번호 23: CT2-Fp, 서열번호 25: TN1-Fp, 서열번호 27: TN2-Fp) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 22: CT1-Rp, 서열번호 24: CT2-Rp, 서열번호 26: TN1-Rp, 서열번호 28: TN2-Rp)를 고안하여 합성하고, 이를 이용하여 써모토가 네아폴리타나의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 각 효소의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ및 XhoⅠ 또는 SalI 을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_tn1, pET21a-CJ_tn2이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 발현벡터들은 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2 이라 명명된 형질전환체(형질전환 미생물)를 각각 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11990P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1), KCCM11991P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), 및 KCCM11993P(E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)로 각각 기탁하였다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
실시예 1에서 제조한 각 효소를 발현하는 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2를 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다.
본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 180 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000Хg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000Хg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하고, 이로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 각 효소를 정제하였다. 정제된 재조합 효소액을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 반응에 사용하였다.
정제된 각 효소는 SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 그 결과, CT1(α-글루칸포스포릴레이즈)은 약 96 kDa, CT2(포스포글루코무타아제)는 약 53 kDa, TN1(포도당-6-인산-이성화효소)은 약 51 kDa 인 것을 확인하였다(도 1 참조).
실시예 3: 타가토스-6-인산 키나아제의 과당-6-인산-4- 에피머화 효소 활성 확인
3-1. 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 재조합 미생물의 제조 1
신규 내열성의 과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila)의 Genbank에 등록된 유전자 서열들을 대상으로 상기 효소로 예상되는 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His(바이오니아社)에 삽입하여 각각 pBT7-C-His-an1 이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. 상기 발현벡터들은 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1 이라 명명된 형질전환체(형질전환 미생물)를 각각 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11996P(E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1)로 기탁하였다.
3-2. 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 재조합 미생물의 제조 2
과당-6-인산-4-에피머화효소(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)를 제공하기 위해 호열성 미생물인 언에로리네 박테리움 (Anaerolineae bacterium) SG8_19 또는 딕티오글로무스 투르지둠 (Dictyoglomus turgidum) 유래 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 각각 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, Genbank 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 에 등록된 언에로리네 박테리움 SG8_19 또는 딕티오글로무스 투르지둠 유전자 서열을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하고, 상기 2종 미생물의 아미노산 서열(서열번호 3 및 5)과 염기 서열(서열번호 4 및 6) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E, 및 pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E 를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).
상기 제조된 발현벡터들은 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/ pBT7 -C-His-CJ_AB_F6P4E, 및 E. coli BL21(DE3)/ pBT7 -C-His-CJ_DT_ F6P4E 이라 명명된 형질전환체(재조합 미생물)를 각각 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 순차적으로 기탁기관(한국미생물보존센터: Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM12093P(기탁일자 2017년 8월 11일), 및 KCCM12110P(기탁일자 2017년 9월 13일)를 부여 받았다.
3-3. 재조합 타가토스-6-인산 키나아제 효소의 제조
상기 제조한 재조합 미생물로부터 재조합 효소 CJ_DT_F6P4E, CJ_AB_F6P4E, 및 CJ_AN1_F6P4E를 제조하기 위하여, 각각의 재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 180 rpm 및 37℃ 조건에서 수행하였다. 본 배양한 배양액은 8,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 다음, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였고, 25 mM Tris-HCl(pH 7.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_DT_F6P4E, CJ_AB_F6P4E, 및 CJ_AN1_F6P4E를 확보하였다.
3-4. 재조합 타가토스-6-인산 키나아제 효소의 과당-6-인산-4- 에피머화 효소 활성분석
상기 실시예 3-3에서 확보한 재조합 타가토스-6-인산 키나아제 효소의 과당-6-인산-4-에피머화 활성을 분석하였다. 구체적으로, 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 기질인 1 중량% 과당-6-인산을 현탁하고, 정제된 1 unit/ml CJ_DT_F6P4E, CJ_AB_F6P4E, 및 CJ_AN1_F6P4E을 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 인산 제거를 위하여 1 unit/ml 포스파테이즈(NEB사 Alkaline phosphatase, Calf Intestinal)를 첨가하여 온도 37℃에서 1시간 처리하였다. HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였으며, HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상(물)을 1 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 시차굴절 검출기(Refractive Index Detector)로 결과물을 분석하였다.
그 결과, CJ_DT_F6P4E, CJ_AB_F6P4E, 및 CJ_AN1_F6P4E은 모두 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 활성이 있음을 확인할 수 있다(도 2 내지 도 4).
실시예 4: 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(D- tagatose -6-phosphate phosphatase) 발굴
본 출원의 타가토스 제조 경로 중 과당-6-인산으로부터 타가토스의 생산을 동시 복합 효소반응에 의하여 진행하기 위하여 타가토스-6-인산 키나아제 효소와 동시에 효소반응이 가능한 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발굴하였다.
4-1. 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 재조합 미생물의 제조
Genbank에 등록된 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-6-인산 탈인산화 효소로 예상되는 유전자(서열번호 8, 이하, t4로 기재) 및 아미노산 서열(서열번호 7)을 선발하고, 상기 선발한 유전자의 서열을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 29) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 30)를 고안하여 합성하였다. 상기 프라이머를 이용하여 써모토가 마리티마의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 t4 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ및 XhoⅠ를 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen社)에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하고 pET21a-CJ_t4로 명명하였다. 상기 제조된 발현벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 3월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11994P를 부여 받았다.
4-2. 재조합 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 제조
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4를 5 ml LB 액체배지가 담긴 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지가 담긴 배양 플라스크에 접종하여 본배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반 속도 180 rpm 및 37℃에서 수행하였다. 본 배양한 배양액은 8,000Хg로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000Хg로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하고, 이로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 효소를 정제한 후 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 사용하였으며, 상기 정제된 재조합 효소를 CJ_T4로 명명하였다.
4-3. CJ_T4의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성 분석
CJ_T4의 활성 분석을 위하여 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 타가토스-6-인산을 현탁한 후 정제된 0.1 unit/ml CJ_T4와 10 mM MgCl2를 첨가하여 70℃ 에서 10분 동안 반응시킨 다음, HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 HPX-87H(Bio-Rad사) 컬럼을 사용하여 60℃에서 이동상(물)을 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 시차굴절 검출기로 타가토스와 타가토스-6-인산을 분석하였다.
그 결과, 반응 결과물에서 타가토스가 생성되었으며, 인산 및 타가토스 반응물에 상기 CJ_T4를 첨가한 후 동일 반응을 진행한 결과 타가토스가 형성되지 않았다. 따라서 CJ_T4는 비가역적인 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 활성이 있음을 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 5: 동시 복합 효소반응에 의한 타가토스의 생산
복합 효소에 의한 과당-6-인산으로부터 타가토스의 생산 활성을 분석하기 위하여 1 unit/ml CJ_t4 (기탁번호: KCCM11994P), 1unit/ml CJ_DT_F6P4E, 25 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액이 포함된 반응액에 0.1%(w/v) 과당-6-인산을 첨가하여 온도 60℃에서 1시간 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 1 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 타가토스를 검출하였다.
그 결과, 타가토스 생성을 확인하였는바, 타가토스-6-인산 키나아제와 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 동시 복합 효소반응에 의하여 과당-6-인산으로부터 타가토스 생산이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 5).
실시예 6: 동시 복합 효소반응에 의한 말토덱스트린으로부터 타가토스이 생산
복합 효소에 의한 말토덱스트린으로부터 타가토스의 생산 활성을 분석하기 위하여 1 unit/ml CT1, 1 unit/ml CT2, 1 unit/ml TN1, 1 unit/ml T4, 1 unit/ml CJ_AN1_F6P4E, 20~50 mM의 인산화나트륨(sodium phosphate pH 7.0)이 포함된 반응액에 5%(w/v) 말토덱스트린을 첨가하여 온도 60℃에서 1시간 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP0810(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 타가토스를 검출하였다.
그 결과, 첨가된 CT1, CT2, TN1, T4, 그리고 AN1의 복합 효소 반응을 이용하여 말토덱스트린으로부터 타가토스가 생성됨을 확인할 수 있었다(도 6)
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Claims (20)

  1. 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스-6-인산 산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당-6-인산을 추가로 포함하는, 타가토스-6-인산 생산용조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 타가토스-6-인산 생산용 조성물.
  4. 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및
    타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 과당-6-인산을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은 α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 이소아밀라아제(isoamylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 수크라아제(sucrase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  11. 과당-6-인산을, 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스-6-인산을 제조하는 것을 포함하는, 타가토스의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제조된 타가토스-6-인산을, 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 타가토스를 제조하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스의 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 방법은 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당-1-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 방법은 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스를 포도당으로 전환하는 것을 추가로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  18. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0 조건에서, 40℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 24 시간 동안 수행하는, 타가토스 제조방법.
  19. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, 타가토스 생산용 조성물.
  20. (a) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합;
    (b) (i) 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, (ii) 타가토스-6-인산 키나아제; (iii) 포도당-6-인산-이성화효소, (iv) 포스포글루코무타아제 또는 포도당인산화 효소, (v) 포스포릴라아제 및 (vi) α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 이소아밀라아제(isoamylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 수크라아제(sucrase) 중 하나 이상; 및
    (c) 포스페이트(phosphate)를 접촉시키는 것을 포함하는 타가토스 제조방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021506228A (ja) * 2017-11-02 2021-02-22 中国科学院天津工業生物技術研究所 新規なタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ及びその応用
US11060119B2 (en) 2018-07-03 2021-07-13 Arzeda Corp. Methods and compositions for preparing tagatose from fructose

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6961713B2 (ja) * 2017-03-31 2021-11-05 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションCj Cheiljedang Corporation タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法
KR102329311B1 (ko) * 2018-09-28 2021-11-23 씨제이제일제당 주식회사 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법
KR20210096084A (ko) * 2018-10-19 2021-08-04 보너모스, 인코포레이티드 타가토스의 효소적 생산
MA54090A (fr) * 2018-10-29 2022-02-09 Bonumose Inc Production enzymatique d'hexoses
CA3143852A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Daniel Joseph Wichelecki Immobilized enzyme compositions for the production of hexoses
KR102219195B1 (ko) * 2019-08-14 2021-02-24 씨제이제일제당 주식회사 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법
WO2021086035A1 (ko) * 2019-10-31 2021-05-06 주식회사 삼양사 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도
KR102513451B1 (ko) * 2019-10-31 2023-03-23 주식회사 삼양사 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도
KR102399441B1 (ko) * 2020-01-20 2022-05-18 씨제이제일제당 주식회사 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법
CN112342179B (zh) * 2021-01-05 2021-04-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
WO2022255823A1 (ko) * 2021-06-01 2022-12-08 연세대학교 산학협력단 희귀당 비대사성 균주의 희귀당 자화능 결정 유전자군 제공방법
CN113881731A (zh) * 2021-09-17 2022-01-04 华南师范大学 L-塔格糖的合成方法
CN117512033B (zh) * 2023-12-21 2024-04-19 山东三元生物科技股份有限公司 一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006058092A2 (en) 2004-11-22 2006-06-01 Cargill, Incorporated Monosaccharide production system
KR100744479B1 (ko) 2005-06-01 2007-08-01 씨제이 주식회사 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법
KR100964091B1 (ko) 2008-01-28 2010-06-16 씨제이제일제당 (주) 대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법
KR101057873B1 (ko) 2008-05-30 2011-08-19 주식회사 삼양제넥스 알도헥소오스 에피머라아제 및 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법
KR101368731B1 (ko) 2012-01-19 2014-03-06 씨제이제일제당 (주) 유청 막 투과액 또는 유청 막 투과 분말로부터 타가토스의 제조 원료가 되는 갈락토스를 제조하는 방법
KR20140143109A (ko) * 2013-06-05 2014-12-15 씨제이제일제당 (주) 타가토스의 제조방법
KR101480422B1 (ko) * 2013-07-29 2015-01-13 건국대학교 산학협력단 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물
CN106399427A (zh) * 2016-11-01 2017-02-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 塔格糖的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101663358B1 (ko) 2014-01-07 2016-10-07 건국대학교 산학협력단 다양한 미생물 유래의 과당 1,6-이인산 알돌레이즈 및 이를 이용한 과당 6-인산으로부터 타가토스 6-인산으로의 효소 전환 방법
US9914919B2 (en) * 2013-07-29 2018-03-13 Samyang Corporation Aldolase, aldolase mutant, and method and composition for producing tagatose by using same
MX366260B (es) * 2015-10-02 2019-07-04 Bonumose Llc Sintesis enzimatica de d-tagatosa.
MX2019000082A (es) * 2016-06-30 2019-05-02 Cj Cheiljedang Corp Una novedosa tagatosa-6-fosfato fosfatasa termoestable y un procedimiento para producir tagatosa usando la misma.
JP6961713B2 (ja) * 2017-03-31 2021-11-05 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションCj Cheiljedang Corporation タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法
BR112019020520B1 (pt) 2017-03-31 2023-04-11 Cj Cheiljedang Corporation Método de produção de tagatose

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006058092A2 (en) 2004-11-22 2006-06-01 Cargill, Incorporated Monosaccharide production system
KR100744479B1 (ko) 2005-06-01 2007-08-01 씨제이 주식회사 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법
KR100964091B1 (ko) 2008-01-28 2010-06-16 씨제이제일제당 (주) 대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법
KR101057873B1 (ko) 2008-05-30 2011-08-19 주식회사 삼양제넥스 알도헥소오스 에피머라아제 및 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법
KR101368731B1 (ko) 2012-01-19 2014-03-06 씨제이제일제당 (주) 유청 막 투과액 또는 유청 막 투과 분말로부터 타가토스의 제조 원료가 되는 갈락토스를 제조하는 방법
KR20140143109A (ko) * 2013-06-05 2014-12-15 씨제이제일제당 (주) 타가토스의 제조방법
KR101550796B1 (ko) 2013-06-05 2015-09-07 씨제이제일제당 (주) 타가토스의 제조방법
KR101480422B1 (ko) * 2013-07-29 2015-01-13 건국대학교 산학협력단 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물
CN106399427A (zh) * 2016-11-01 2017-02-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 塔格糖的制备方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN 25 May 2013 (2013-05-25), ANONYMOUS: "tagatose-6-phosphate kinase [Dictyoglomus turgidum]", XP055560026, retrieved from NCBI Database accession no. WP_012582774 *
DATABASE PROTEIN 30 January 2014 (2014-01-30), ANONYMOUS: "Inositol-1-monophosphatase [Thermotoga neapolitana DSM 4359]", XP055451074, retrieved from NCBI Database accession no. ACM23254 *
ITO, SUSUMU: "Catalysis, structures, and applications of carbohydrate epimerases", JOURNAL OF APPLIED GLYCOSCIENCE, vol. 57, 6 January 2010 (2010-01-06), pages 1 - 6, XP055560010 *
IZSVAK ET AL., J. MOI. BIOL., vol. 302, 2000, pages 93 - 102
SAMBROOKRUSSELL, MOLECULAR CLONING, 2001
SCHEIT: "Nucleotide Analogs", 1980, JOHN WILEY
UHLMANPEYMAN, CHEMICAL REVIEWS, vol. 90, 1990, pages 543 - 584
WICHELECKI, D: "ATP-binding cassette (ABC) transport system solute- binding protein-guided identification of novel d-altritol and galactitol catabolic pathways in Agrobacterium tumefaciens C58", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 27 November 2015 (2015-11-27), pages 28963 - 28976, XP055560000, doi:10.1074/jbc.M115.686857 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021506228A (ja) * 2017-11-02 2021-02-22 中国科学院天津工業生物技術研究所 新規なタガトース６−リン酸４−エピメラーゼ及びその応用
EP3733843A4 (en) * 2017-11-02 2021-06-23 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences NEW TAGATOSE-6-PHOSPHATE-4-EPIMERASE AND APPLICATION OF IT
JP7266594B2 (ja) 2017-11-02 2023-04-28 中国科学院天津工業生物技術研究所 新規なタガトース６－リン酸４－エピメラーゼ及びその応用
US11060119B2 (en) 2018-07-03 2021-07-13 Arzeda Corp. Methods and compositions for preparing tagatose from fructose
US20220025413A1 (en) * 2018-07-03 2022-01-27 Arzeda Corp. Methods and compositions for preparing tagatose from fructose
US11866758B2 (en) * 2018-07-03 2024-01-09 Arzeda Corp. Methods and compositions for preparing tagatose from fructose

Also Published As

Publication number Publication date
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US11512301B2 (en) 2022-11-29
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