TW201839139A - 用於生產塔格糖的組成物與利用其生產塔格糖的方法 - Google Patents

Abstract

本申請案是有關於一種包括果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

Description

製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法

本申請案是有關於一種包括果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

先前塔格糖的製備方法有以半乳糖為主原料的化學方法（觸媒反應）及生物學方法（異構化酶反應）（參照韓國註冊專利第10-0964091號）。然而，於先前製備方法中，作為主原料的半乳糖的基礎原料的乳糖因國際市場中的生乳（raw milk）及乳糖的生產量、供需量等而價格不穩定，從而穩定供需存在極限。為了克服先前的塔格糖製備方法的此種問題，已報告有藉由使用己糖醛酸4-差向異構酶（hexuronate C4-epimerase），自作為供需穩定型低價原料的果糖（D-fructose）製備塔格糖的方法（2011. 應用生物化學與生物技術（Appl Biochem Biotechnol.）163: 444-451，韓國註冊專利第10-1550796號），但其存在上述異構化酶反應的轉化率（conversion ratio）較低的侷限。

已知塔格糖-二磷酸醛縮酶（tagatose-bisphosphate aldolase，酶學委員會（Enzyme Commission，EC）4.1.2.40）如下述[反應式1]般以D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-bisphosphate）為基質而生產磷酸甘油酮（glycerone phosphate）與D-甘油醛3-二磷酸（D-glyceraldehyde 3-diphosphate），且參與半乳糖代謝，但並無針對上述塔格糖-二磷酸醛縮酶是否具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性的研究。

[反應式1] D-塔格糖1,6-二磷酸＜＝＞磷酸甘油酮＋D-甘油醛3-二磷酸

於此種背景下，本發明者等人為了開發可用於製備塔格糖的酶而進行銳意研究，結果確認到塔格糖-二磷酸醛縮酶（tagatose-bisphosphate aldolase，EC 4.1.2.40）具有將葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）轉化成塔格糖-6-磷酸的作用，藉此完成本申請案。

藉此，可於以葡萄糖或澱粉為原料依次製備葡萄糖-1-磷酸及葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）後，利用本申請案的塔格糖-二磷酸醛縮酶將葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）轉化成塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate），利用執行不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶（塔格糖-6-磷酸磷酸酶）製備塔格糖，並且可明顯提高自葡萄糖或澱粉向塔格糖的轉化率。

[發明欲解決的課題]

本申請案的一目的在於提供一種有效製備塔格糖-6-磷酸的組成物，上述組成物包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種有效製備塔格糖的組成物，上述組成物包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物、塔格糖-6-磷酸磷酸酶及表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟，上述方法可更包括使上述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的其他目的及優點藉由隨附的發明申請專利、圖式及下述詳細說明而變得更加明確。本說明書中未記載的內容可由在本申請案的技術領域或相似領域中具有常識者充分地認知、推導，所以省略其說明。

[解決課題的手段]

以下，具體地對本申請案的內容進行說明。另一方面，本申請案中揭示的一實施方式的說明及實施形態中的共通事項亦可應用於其他實施方式的說明及實施形態。另外，本申請案中所揭示的各種要素的所有組合均屬於本申請案的範疇。而且，本申請案的範疇並不限制於以下具體的記述。

為了達成本申請案的一目的，本申請案的一實施方式提供一種包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物。

已知塔格糖-二磷酸醛縮酶（tagatose-bisphosphate aldolase，EC 4.1.2.40）以D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-bisphosphate）為基質而生產磷酸甘油酮（glycerone phosphate）與D-甘油醛3-二磷酸（D-glyceraldehyde 3-diphosphate），且參與半乳糖代謝，例如可無限制地包括其他能夠以果糖-6-磷酸為基質而製備塔格糖-6-磷酸的物質。

具體而言，上述塔格糖-二磷酸醛縮酶可包括由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的多肽、或與序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性的多肽。另外，只要為具有上述同源性且具有表現出與由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的蛋白質相應的功效（即，將果糖-6-磷酸中的果糖的4-碳位置進行差向異構化而轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性）的胺基酸序列的多肽，則即便具有一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加的胺基酸序列，亦當然包括於本申請案的範圍內。而且，作為由可根據公知的基因序列製備的探針、例如於嚴格的條件下與編碼上述多肽的鹼基序列的全部或一部分的互補序列雜交（hybridization）的聚核苷酸編碼的多肽，亦可無限制地包括具有果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性的多肽。因此，上述用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物可更包括果糖-6-磷酸。另外，上述組成物可包括由1、3、5、7或9的胺基酸序列構成的塔格糖-二磷酸醛縮酶中的一種以上。

於本申請案中，揭示了“塔格糖-二磷酸醛縮酶”表現出將果糖-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸-4-差向異構化活性，因此於本申請案中“塔格糖-二磷酸醛縮酶”可與“果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate C4 epimerase）”互換使用。

於本申請案中，用語“嚴格的條件”是指可實現聚核苷酸間的特異性雜交的條件。此種條件依存於聚核苷酸的長度及互補性程度，這些參數為本技術領域所熟知，諸如具體記載在文獻（例如，J. Sambrook等人，同源）中。例如，可列舉如下條件：同源性較高的基因彼此雜交、具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性的基因彼此雜交、同源性低於上述的基因彼此不雜交的條件；或於通常的南方雜交清洗條件，即於60℃、1×鹽水檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate，SSC）、0.1%十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）、具體而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、更具體而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS對應的鹽濃度及溫度下清洗1次、具體而言2次至3次的條件。上述雜交中所使用的探針可為鹼基序列的互補序列的一部分。此種探針能夠以根據公知序列製成的寡核苷酸為引子而藉由以包括此種鹼基序列的基因片段為模板的聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）製作。另外，業者可視需要而根據如探針長度的要素調節溫度及清洗溶液的鹽濃度。

於本申請案中，用語“同源性”是指兩個多肽部分（moiety）間的一致性的百分比。自一個部分至另一部分為止的序列間一致性可藉由公知的相應技術而確定。例如，可藉由如下方式確定同源性：對序列資訊進行整列，利用可容易地獲得的電腦程式直接對兩個多肽分子間的序列資訊（例如分值（score）、一致性（identity）及相似度（similarity）等參數（parameter））進行整列（例如，基礎局部比對檢索工具（Basic Local Alig nment Search Tool，BLAST）2.0）。另外，聚核苷酸間同源性可藉由如下方式確定：於在構成同源區域間的穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交後，分解成單鏈特異性核酸酶而確定所分解的片段的尺寸。

於一實施例中，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可為來自嗜熱微生物的酶或其變異體，例如可為來自Thermenaerothrix屬的酶或其變異體、來自Kosmotoga屬的酶或其變異體、來自紅嗜熱鹽菌屬的酶或其變異體、來自Limnochorda屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自Thermenaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia、海洋紅嗜熱鹽菌（Rhodothermus marinus）、Rhodothermus profundi或Limnochorda pilosa的酶，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體具有將D-果糖（fructose）-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而轉化成D-塔格糖-6-磷酸的特徵。作為本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶，可使用已知具有塔格糖-二磷酸醛縮酶（tagatose-bisphosphate aldolase）活性的酶，塔格糖-二磷酸醛縮酶以D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-bisphosphate）為基質而製備磷酸甘油酮（glycerone phosphate）與D-甘油醛3-二磷酸（D-glyceraldehyde 3-diphosphate），且參與半乳糖代謝。於本申請案中，首次揭示上述塔格糖-二磷酸醛縮酶具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性。因此，本申請案的一實施例是有關於一種包括於自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸時將塔格糖-二磷酸醛縮酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的塔格糖-二磷酸醛縮酶的新的用途。另外，本申請案的一實施例是有關於一種將塔格糖-二磷酸醛縮酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶而自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸的方法。

於一實施例中，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可為耐熱性較高的酶。具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於50℃至70℃溫度下表現出最大活性的50%至100%、60%至100%、70%至100%或75%至100%的活性。更具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於55℃至65℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表現出最大活性的80%至100%或85 %至100%的活性。

進而，由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可依次由序列號2、序列號4、序列號6、序列號8或序列號10的核苷酸序列編碼，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體可為藉由如下方式獲得者：於以表現本申請案的上述酶或其變異體的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）（例如序列號2、序列號4、序列號6、序列號8或序列號10的核苷酸）轉形至大腸桿菌（E.coli）等菌株後，對其進行培養而獲得培養物，對上述培養物進行粉碎而藉由管柱等進行精製。除大腸桿菌（Escherichia coli）以外，上述轉形用菌株還可為麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterum glutamicum）、米麴菌（Aspergillus oryzae）或枯草桿菌（Bacillus subtilis）等。於具體例中，作為此種轉形的菌株，微生物可為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_KO_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RM_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RP_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_LP_F6P4E或大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_td1。該等微生物分別依次以寄存編號KCCM11999P（大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_KO_F6P4E）（寄存日期：2017年3月24日）、KCCM12096P（大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RM_F6P4E）（寄存日期：2017年8月11日）、KCCM12097P（大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RP_F6P4E）（寄存日期：2017年8月11日）、KCCM12095P（大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_LP_F6P4E）（寄存日期：2017年8月11日）、及KCCM11995P（大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_td1）（寄存日期：2017年3月20日）寄存於作為布達佩斯條約下的國際保存中心的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

本申請案中使用的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可利用編碼上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸提供。

於本申請案中，用語“核酸”具有總括DNA分子或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）分子的含義，作為核酸的基本構成單元的核苷酸不僅包括天然核苷酸，而且亦可包括糖或鹼基位點經修飾的類似物（參照文獻：Scheit，核苷酸類似物（Nucleotide Analogs），John Wiley，New York (1980)；Uhlman及Peyman，化學綜述（Chemical Reviews），90: 543-584 (1990)）。

本申請案的核酸可為編碼本申請案的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的多肽的核酸、或編碼與本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶具有至少80%、90%、95%、97%或99%的遺傳同源性且具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽的核酸。例如，編碼由序列號1的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸可為與序列號2的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。另外，編碼由序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的各核酸可為與其相應的序列號4、序列號6、序列號8或序列號10的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。而且，本申請案的核酸可包括可藉由密碼簡並性（codon degeneracy）而轉譯成本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸，當然亦可包括如下核酸：於嚴格的條件下與由相對於序列號2、序列號4、序列號6、序列號8或序列號10的鹼基序列為互補性鹼基序列構成的核酸雜交，且編碼具有本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽。

可使用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可為包括包含上述核酸的重組載體的微生物。上述載體可為以可使本申請案的核酸發揮作用的方式連接的形態。於本申請案中，用語“以可發揮作用的方式連接”通常是為了執行功能而鹼基表現調節序列與編碼靶蛋白的鹼基序列以可發揮作用的方式連接，從而可對編碼的鹼基序列的表現產生影響。可利用業界公知的基因重組技術以可發揮作用的方式與載體連接，可使用業界的剪切及連接酶等實現位點特異性DNA剪切及連接。

於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至有機體（例如宿主細胞）的任意的介質。載體可為不同的DNA片段結合而可導入所結合的片段的複製的複製單元（replicon）。此處，“複製單元”是指於生物體內作為DNA自複製單元發揮功能、即可藉由自調節而實現複製的任意的遺傳單位（例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒）。本申請案的用語“載體”可包括用以於試管內、生物體外或生物體內將鹼基導入至有機體（例如宿主細胞）的病毒介質及非病毒介質，可包括微環DNA、如睡美人（Sleeping Beauty）的轉位子（Izsvak等人，分子生物學雜誌（J. MoI. Biol.）302:93-102 (2000)）、或人工染色體。作為通常使用的載體的示例，可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體。可使用於本申請案的載體並無特別限制，可使用公知的表現載體。另外，上述載體可為以更包括各種抗生素抗性基因為特徵的重組載體。於本申請案中，用語“抗生素抗性基因”是對抗生素具有抗性的基因，具有該基因的細胞可存活於以相應的抗生素進行處理過的環境中，因此於在大腸桿菌中獲得大量質體的過程中有效地用作篩選標誌。於本申請案中，抗生素抗性基因並非為對本申請案的核心技術（即由載體的最佳組合實現的表現效率）產生較大影響的要素，因此可無限制地使用通常使用的抗生素抗性基因作為篩選標誌。作為具體的示例，可使用針對胺苄青黴素（ampicilin）、四環素（tetracyclin）、康黴素（kanamycin）、氯黴素（chloroamphenicol）、鏈黴素（streptomycin）或新黴素（neomycin）的抗性基因等。

可利用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可利用將包括編碼上述酶的核酸的載體導入至宿主細胞內的方法，使上述載體轉形的方法可包括將核酸導入至細胞內的任一方法，可選擇如於本技術領域內公知的適當的標準技術而執行。可包括電致孔（electroporation）、磷酸鈣共沉澱（calcium phosphate co-precipitation）、反轉錄病毒感染（retroviral infection）、顯微注射法（microinjection）、二乙胺乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）-葡聚糖（DEAE-dextran）、陽離子脂質體（cationic liposome）法及熱衝擊法等，但並不限制於此。

轉形的基因只要可於宿主細胞內表現即可，因此可包括所有插入於宿主細胞的染色體內的形態及位於染色體外的形式。另外，上述基因只要為包括DNA及RNA作為可編碼多肽的聚核苷酸且可導入至宿主細胞內而表現者即可，因此可無限制地使用具有上述特徵者。例如，上述基因能夠以作為包括自表現所需的所有要素的聚核苷酸結構體的表現盒（expression cassette）形態導入至宿主細胞。上述表現盒通常可包括以可發揮作用的方式連接於上述基因的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖體結合位點和轉譯終止訊號。上述表現盒可呈可實現自複製的表現載體形態。另外，上述基因亦可為如下者：以其本身的形態或聚核苷酸結構體的形態導入至宿主細胞而於宿主細胞內以可發揮作用的方式與表現所需的序列連接。

本申請案的微生物只要為包括本申請案的核酸或本申請案的重組載體而可生產本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物即可，因此可為原核微生物及真核微生物中的任一種。例如，可包括屬於埃希氏菌（Escherichia）屬、歐文氏菌（Erwinia）屬、沙雷氏菌（Serratia）屬、普羅威登菌（Providencia）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬及短桿菌（Brevibacterium）屬的微生物菌株，具體而言，可為大腸桿菌（E.coli）或麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），但並不限制於此。作為此種微生物的具體例，有大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_KO_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RM_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RP_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_LP_F6P4E或大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_td1等。

本申請案的微生物可包括除上述核酸導入或載體導入以外可藉由各種公知方法表現本申請案的果糖-4-差向異構酶的所有微生物。

本申請案的微生物的培養物可為於培養基中培養表現本申請案的塔格糖-二磷酸醛縮酶或相關酶的微生物而製備者。

於本申請案中，用語“培養”是指使上述微生物於適當地調節的環境條件下生長。本申請案的培養過程可利用業界熟知的適當的培養基與培養條件實現。此種培養過程可根據選擇的菌株而由業者容易地調整來使用。培養微生物的上述步驟並無特別限制，可藉由公知的批式培養方法、連續式培養方法、流加式培養方法等而執行。此時，培養條件並無特別限制，可使用鹼性化合物（例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨）或酸性化合物（例如，磷酸或硫酸）調節最適pH值（例如，pH5至pH9，具體而言為pH7至pH9）。另外，可於培養中使用如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡劑來抑制氣泡的產生，另外，為了保持培養物的好氧狀態而可向培養物中注入氧氣或含氧氣體，或為了保持厭氧狀態或微好氧狀態而可不注入氣體或注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體。培養溫度可保持為25℃至40℃、具體而言為30℃至37℃，但並不限制於此。培養時間可持續至獲得所期望的有用物質的生產量為止，具體而言，可培養約0.5小時至60小時，但並不限制於此。而且，使用的培養用培養基作為碳供給源可單獨或混合糖及碳水化合物（例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素）、油脂及脂肪（例如，豆油、葵花籽油、花生油及椰子油）、脂肪酸（例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸）、醇（例如，甘油及乙醇）與有機酸（例如，乙酸）等而使用，但並不限制於此。作為氮供給源，可單獨或混合含氮的有機化合物（例如，蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米漿、大豆粕粉及尿素）或無機化合物（例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨）等而使用，但並不限制於此。作為磷供給源，可單獨或混合磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉的鹽等而使用，但並不限制於此。另外，於培養基中可包括如金屬鹽（例如，硫酸鎂或硫酸亞鐵）、胺基酸及維生素的其他必需生長促進物質。

本申請案的另一實施方式提供一種包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物、及塔格糖-6-磷酸磷酸酶（塔格糖-6-磷酸磷酸酶）、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖的組成物。

與上述用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物相關的事項可相同地適用於用於生產塔格糖的組成物。本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶只要為具有去除塔格糖-6-磷酸的磷酸基而轉化成塔格糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）的酶或其變異體。

根據本申請案的一實施例，本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為如下蛋白質：由序列號11的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號11的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號11的胺基酸序列構成的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可由序列號12的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶（glucose-6-phosphate isomerase）、表現上述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或上述微生物的培養物，可於存在上述酶的條件下將葡萄糖-6-磷酸異構化而生成果糖-6-磷酸。本申請案的葡萄糖-6-磷酸異構酶只要為具有將葡萄糖-6-磷酸異構化成果糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為如下蛋白質：由序列號13的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號13的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號13的胺基酸序列構成的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可由序列號14的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物，上述酶促進將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸、或將葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖-1-磷酸的可逆反應。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）只要為可將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸、或將葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖-1-磷酸的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為如下蛋白質：由序列號15的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號15的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號15的胺基酸序列構成的葡萄糖磷酸變位酶可由序列號16的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖激酶（glucokinase）、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有可將葡萄糖磷酸化的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖激酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自異常球菌屬或厭氧繩菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自異常球菌屬中度嗜熱菌（Deinococcus geothermalis）、嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）的酶或其變異體。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有可將葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。具體而言，本申請案的葡萄糖激酶可為磷酸依存型葡萄糖激酶。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖激酶可為如下蛋白質：由序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號17或序列號19的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號17的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號18的核苷酸序列編碼，本申請案的由序列號19的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號20的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase）、澱粉磷酸化酶（starch phosphorylase）、麥芽糊精磷酸化酶（maltodextrin phosphorylase）或蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase）、表現上述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或上述微生物的培養物。上述磷酸化酶只要為具有可將澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的活性的蛋白質，則可無限制地包括。磷酸化酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。本申請案的磷酸化酶可為如下蛋白質：由序列號21的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號21的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號21的胺基酸序列構成的磷酸化酶可由序列號22的核苷酸序列編碼。

本申請案用於生產塔格糖的組成物可更包括：α-澱粉酶（α-amylase）、支鏈澱粉酶（pullulanase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、蔗糖酶（sucrase）或異澱粉酶（isoamylase）；表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物；或表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可單獨包括可用於生產本申請案中所記載的塔格糖的兩種以上的酶或其轉形體，或包括藉由編碼兩種以上的酶的核苷酸而轉形的轉形體。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括4-α-葡聚糖轉移酶（4-α-glucanotransferase）、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶只要為具有將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為如下蛋白質：由序列號23的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號23的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號23的胺基酸序列構成的4-α-葡聚糖轉移酶可由序列號24的核苷酸序列編碼。

作為可使用於上述實施例的微生物的示例，可列舉大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2及大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4等。上述重組微生物分別於2017年3月20日以寄存編號KCCM11990P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1）、KCCM11991P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2）、KCCM11992P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1）、KCCM11993P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2）、KCCM11994P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4）寄存至韓國微生物寄存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括與上述酶的各基質對應的物質、成分或組成物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括通常使用於上述用於生產塔格糖的組成物的任意適當的賦形劑。作為此種賦形劑，例如可為保存劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但並不限制於此。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括金屬。於一實施例中，本申請案的金屬可為包括2價陽離子的金屬。具體而言，本申請案的金屬可為鎳、鈷、鋁、鎂（Mg）或錳（Mn）。更具體而言，本申請案的金屬可為金屬離子或金屬鹽，更進一步具體而言，上述金屬鹽可為NiSO₄ 、MgSO₄ 、MgCl₂ 、NiCl₂ 、CoCl₂ 、CoSO₄ 、MnCl₂ 或MnSO₄ 。

本申請案的另一實施方式提供一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。

與上述用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物相關的事項可相同地適用於用於生產塔格糖的組成物。

另外，本申請案的又一實施方式提供一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。上述塔格糖的製備方法可更包括使塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）與如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate）與如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使葡萄糖與如本申請案所述的葡萄糖激酶、表現上述葡萄糖激酶的微生物物或表現上述葡萄糖激酶的微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合與如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合與α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖或異澱粉酶、表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖或異澱粉酶的微生物或表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖或異澱粉酶的微生物的培養物接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使葡萄糖與如本申請案所述的4-α-葡聚糖轉移酶、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物接觸而將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的步驟。

於本申請案的方法中，能夠以pH5.0至pH9.0的條件、30件至80℃的溫度條件及/或0.5小時至48小時的條件執行各接觸。具體而言，本申請案的接觸可於pH6.0至pH9.0的條件或pH7.0至pH9.0的條件下執行。另外，本申請案的接觸可於35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的溫度條件下執行。而且，本申請案的接觸可執行0.5小時至36小時、0.5小時至24小時、0.5小時至12小時、0.5小時至6小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、3小時至36小時、3小時至24小時、3小時至12小時、3小時至6小時、12小時至36小時或18小時至30小時。

於一實施例中，本申請案的接觸可於存在金屬、金屬離子或金屬鹽的條件下執行。

本申請案的又一實施方式是有關於一種塔格糖的製備方法，其包括使本申請案所述的用於生產塔格糖的組成物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合及聚磷酸鹽（polyphosphate）接觸的步驟。

於本申請案的一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括： 使葡萄糖與如本申請案所述的葡萄糖激酶、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟； 使上述葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）與如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟； 使上述果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate）與如本申請案所述的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟； 使上述塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate）與如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位（in situ）反應實施。於上述方法中，藉由上述磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作葡萄糖激酶的基質而用於生成葡萄糖-6-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

於上述方法的一例中，葡萄糖可藉由如下方式製備：使澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合與如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

於本申請案的另一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括： 使葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate）與如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟； 使上述葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）與如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟； 使上述果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate）與如本申請案所述的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟； 使上述塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate）與如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位反應實施。

於上述方法的一例中，葡萄糖-1-磷酸可藉由如下方式製備：使澱粉、麥芽糊精、蔗糖及其組合與如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。此時，藉由上述磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作磷酸化酶的基質而用於生成葡萄糖-1-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

上述方法可更包括對所製備的塔格糖進行精製的步驟。上述精製並無特別限制，可使用於本申請案的技術領域中通常使用的方法。作為非限制性的示例，可列舉層析法、分步結晶及離子精製等。上述精製方法可僅實施一種方法，亦可一併實施兩種以上的方法。例如，可藉由層析法對塔格糖生成反應物進行精製，可利用欲分離的糖與附著於離子樹脂的金屬離子之間的弱結合力的差異執行藉由上述層析法進行的糖的分離。

另外，本申請案可更包括於本申請案的精製步驟前或精製步驟後實施脫色、脫鹽、或既實施脫色又實施脫鹽的步驟。藉由實施上述脫色及/或脫鹽，可無雜質地獲得更純淨的塔格糖反應物。

[發明之效果]

本申請案的塔格糖的製備方法因將葡萄糖或澱粉用作原料而較為經濟，因磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率，且因包括不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶（塔格糖-6-磷酸磷酸酶）反應而可明顯地提高向塔格糖的轉化率。

另外，能夠以葡萄糖或澱粉為原料而藉由複合酶反應生產塔格糖，從而具有製備方法簡單、經濟且改善產率的優點。

以下，列舉實施例而詳細地對本申請案進行說明，但上述實施例僅為有助於理解本申請案者，本申請案並不限定於此。

實施例 1 ：各酶的重組表現載體及轉形體的製備

為了提供本申請案的作為塔格糖製備路徑中所需的耐熱性酶的α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase）、葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）、葡萄糖-6-磷酸-異構酶（glucose-6-phosphate-isomerase）及4-α-葡聚糖轉移酶（4-α-glucanotransferase），以作為嗜熱微生物的新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）或海棲熱袍菌的註冊於基因庫（Genbank）的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列[按照上述酶的記載順序分別為序列號22（CT1）、序列號16（CT2）、序列號14（TN1）、序列號24（TN2）]。

基於所選擇的上述基因序列製作正向引子（forward primer，序列號21：CT1-Fp、序列號27：CT2-Fp、序列號29：TN1-Fp、序列號31：TN2-Fp）與反向引子（reverse primer，序列號26：CT1-Rp、序列號28：CT2-Rp、序列號30：TN1-Rp、序列號32：TN2-Rp）而進行合成，利用其而以新阿波羅棲熱袍菌的染色體DNA（基因組（genomic）DNA）為模板來藉由聚合酶鏈反應（PCR）擴增各酶的基因。使用限制酶NdeI及XhoI或SalI將擴增的各酶的基因插入至大腸桿菌表現用質體載體pET21a（Novagen）而製備分別命名為pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_tn1及pET21a-CJ_tn2的重組表現載體。

利用通常的轉形方法[參照：Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備分別命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2的轉形體（轉形微生物），並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體分別以寄存編號為KCCM11990P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1）、KCCM11991P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2）、KCCM11992P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1）及KCCM11993P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2）寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

實施例 2 ：重組酶的製備

將於實施例1中製備的表現各酶的大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2接種至裝有5 ml的溶菌酶肉湯（Lysozyme Broth，LB）液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。

將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）而誘導重組酶表現。上述培養過程中的攪拌速度為180 rpm，且使培養溫度保持為37℃。於在4℃下以8,000×g對培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，使用多聚組胺酸標籤（His-Tag）親和層析法自上述上清液精製各酶。於利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液對精製的重組酶液進行透析後用於反應。

藉由SDS-PAGE分析確認精製的各酶的分子量，根據結果，確認到CT1（α-葡聚糖磷酸化酶）為約96 kDa、CT2（葡萄糖磷酸變位酶）為約53 kDa、TN1（葡萄糖-6-磷酸-異構酶）為約51 kDa。

實施例 3 ：塔格糖 - 二磷酸醛縮酶的果糖 -6- 磷酸 -4- 差向異構酶活性的確認

3-1. 包括塔格糖 - 二磷酸醛縮酶基因的重組表現載體及重組微生物的製備

為了發掘新的耐熱性的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate-4-epimerase），獲得來自作為嗜熱微生物Kosmotoga olearia、海洋紅嗜熱鹽菌（Rhodothermus marinus）、Rhodothermus profundi及Limnochorda pilosa的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及重組微生物。

具體而言，以註冊於基因庫及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的Kosmotoga olearia或海洋紅嗜熱鹽菌ATCC 43812、Rhodothermus profundi DSM 22212及Limnochorda pilosa DSM 28787基因序列為對象而選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，基於上述4種微生物的胺基酸序列（序列號1、序列號3、序列號5及序列號7）及鹼基序列（序列號2、序列號4、序列號6及序列號8）資訊而製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_KO_F6P4E、pBT7-C-His-CJ_RM_F6P4E、pBT7-C-His-CJ_RP_F6P4E及pBT7-C-His-CJ_LP_F6P4E（bioneer（股份有限公司），韓國）。

所製備的上述表現載體於藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖（Molecular cloning），2001）轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備重組微生物後，冷凍保管至50%甘油而使用。將上述重組微生物分別命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_KO_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RM_F6P4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_RP_F6P4E及大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_LP_F6P4E，寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而分別被賦予寄存編號KCCM11999P（寄存日期2017年3月24日）、KCCM12096P（寄存日期2017年8月11日）、KCCM12097P（寄存日期2017年8月11日）及KCCM12095P（寄存日期2017年8月11日）。

為了另外發掘新的耐熱形的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate-4-epimerase），以作為嗜熱微生物的Thermenaerothrix daxensis的註冊於基因庫的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列，基於上述微生物的胺基酸序列（序列號9）與鹼基序列（序列號10）資訊插入至包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His（bioneer公司）而製備命名為pBT7-C-His-CJ_td1的重組表現載體。利用通常的轉形方法[參照：Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_td1的轉形體（轉化微生物），並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體以寄存編號KCCM11995P（大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_td1）寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

3-2. 重組塔格糖 - 二磷酸醛縮酶的製備

為了自所製備的上述重組微生物製備重組酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E及CJ_TD1_F6P4E，將各重組微生物接種至裝有包括胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 ml的LB液體培養基培養管，於37℃的振盪培養器進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的IPTG（異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）而誘導重組酶表現。於180 rpm及37℃的條件下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH₂ PO₄ （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。其次，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH₂ PO₄ （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製後，使用25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E及CJ_TD1_F6P4E。

3-3. 重組塔格糖 - 二磷酸醛縮酶的果糖 -6- 磷酸 -4- 差向異構酶活性分析

對在上述實施例3-2中獲得的重組塔格糖-二磷酸醛縮酶的果糖-6-磷酸-4-差向異構化活性進行分析。具體而言，將1重量%的作為基質的果糖-6-磷酸懸浮至25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液，添加精製的1 unit/ml的CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E及CJ_TD1_F6P4E而於60℃下反應1小時，之後為了去除磷酸，添加1 unit/ml的磷酸酶（NEB公司，鹼性磷酸酶（Alkaline phosphatase）、小牛腸（Calf Intestinal））而於37℃下處理1小時。利用HPLC對反應產物進行分析，以使用SP0810（Shodex）管柱於80℃下以1 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器（Refractive Index Detector）對產物進行分析。

其結果，可確認到CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E及CJ_LP_F6P4E均具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性（圖1a至圖1d）。

另外，可確認到CJ_TD1_F6P4E具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性（圖5）。

實施例 4 ：塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶（ D- 塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶）的發掘

為了於本申請案的塔格糖製備路徑中藉由同步複合酶反應自果糖-6-磷酸生產塔格糖而發掘可與塔格糖-二磷酸醛縮酶同時進行酶反應的塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

4-1. 包括塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶基因的重組表現載體及重組微生物的製備

以註冊於基因庫的海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）基因序列為對象而選擇推測為塔格糖-6-磷酸磷酸酶的基因（序列號12，以下記載為t4）及胺基酸序列（序列號11），基於所選擇的上述基因序列製作正向引子（forward primer，序列號33）及反向引子（reverse primer，序列號34）而進行合成。利用上述引子以海棲熱袍菌的染色體DNA（基因組DNA）為模板而藉由聚合酶鏈反應（PCR）擴增t4基因。使用限制酶NdeI及XhoI將擴增的各酶基因插入至大腸桿菌表現用質體載體pET21a（Novagen公司）而製備重組表現載體，並命名為pET21a-CJ_t4。所製備的上述表現載體於藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001）轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4，於2017年3月20日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM11994P。

4-2. 重組塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶的製備

將大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4接種至裝有5 ml的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的IPTG而誘導重組酶表現。於180 rpm的攪拌速度及37℃下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，使用多聚組胺酸標籤親和層析法自上述上清液精製酶，之後利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而使用，將精製的上述重組酶命名為CJ_T4。

4-3.CJ_T4 的塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶活性的分析

為了分析CJ_T4的活性，於將塔格糖-6-磷酸懸浮至50 mM的Tris-HCl（pH值為7.5）緩衝溶液後，添加精製的0.1 unit/ml的CJ_T4與10 mM的MgCl₂ 而於70℃下反應10分鐘，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用HPX-87H（Bio-Rad公司）管柱於60℃下以0.6 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器對塔格糖與塔格糖-6-磷酸進行分析。

結果顯示，於反應產物中生成塔格糖，於在磷酸及塔格糖反應物中添加上述CJ_T4後進行相同的反應，結果未形成塔格糖。因此，可確認到CJ_T4具有不可逆的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性（圖3）。

實施例 5 ：藉由同步複合酶反應進行的塔格糖生產

於1 unit/ml的CJ_KO_F6P4E或CJ_RP_F6P4E與1 unit/ml的CJ_t4（寄存編號：KCCM11994P）的混合酶液中添加懸浮於25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液的1%（w/v）果糖-6-磷酸而於60℃下反應1小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810（Shodex公司）管柱於80℃下以1 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

結果顯示，確認到生成塔格糖，且可確認到藉由塔格糖-二磷酸醛縮酶與塔格糖-6-磷酸磷酸酶的同步複合酶反應而可自果糖-6-磷酸生產塔格糖（圖2a及圖2b）。

實施例 6 ：藉由同步複合酶反應而自麥芽糊精生產塔格糖

為了對藉由複合酶而自麥芽糊精生產塔格糖的活性進行分析，將5%（w/v）麥芽糊精添加至包括1 unit/ml的CT1、1 unit/ml的CT2、1 unit/ml的TN1、1 unit/ml的T4、1 unit/ml的TD1、20 mM至50 mM的磷酸鈉（sodium phosphate，pH值為7.0）的反應液而於60℃下反應1小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810（Shodex公司）管柱於80℃下以0.6 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

其結果，可確認到藉由所添加的CT1、CT2、TN1、T4與TD1的複合酶反應而自麥芽糊精生成塔格糖（圖6）。

無

圖1a至圖1d是表示本申請案的一實施例的塔格糖-二磷酸醛縮酶（CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E及CJ_LP_F6P4E）具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的層析結果。 圖2a及圖2b是表示於本申請案的一實施例中利用塔格糖-二磷酸醛縮酶（CJ_KO_F6P4E及CJ_RP_F6P4E）及塔格糖-6-磷酸磷酸酶（CJ_T4）對果糖-6-磷酸進行處理時轉化成塔格糖的HPLC層析結果。 圖3是表示作為本申請案的一實施例的酶的T4具有塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性的HPLC層析結果。 圖4是表示於本申請案的一實施例中藉由蛋白質電泳（十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE））對使用於自澱粉、蔗糖或葡萄糖製備塔格糖的反應路徑的酶的分子量進行分析的結果。M為蛋白質大小測定標記（size marker，Bio-RAD，USA）。 圖5是表示作為本申請案的一實施例的酶的TD1（CJ_TD1_F6P4E）具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果。 圖6是表示於同時添加本申請案的參與自麥芽糊精製備塔格糖的路徑的所有酶的情形時藉由複合酶反應生成塔格糖的HPLC層析結果，其中將TD1（CJ_TD1_F6P4E）用作塔格糖-二磷酸醛縮酶。

[國外寄存資訊] 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11990P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11991P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11992P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11993P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11994P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11995P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11999P 寄存日期：2017年3月24日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12095P 寄存日期：2017年8月11日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12096P 寄存日期：2017年8月11日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12097P 寄存日期：2017年8月11日

＜110＞ CJ 第一製糖 ＜120＞ 製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法 ＜130＞ P18-6041 ＜150＞ KR 17/0042165 ＜151＞ 2017-03-31 ＜160＞ 34 ＜170＞ KoPatentIn 3.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 435 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_KO_F6P4E的胺基酸序列 ＜400＞ 1 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile 100 105 110 Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu 115 120 125 Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro 130 135 140 Leu Asn Pro Glu Val Ile Ala Glu Arg Thr Ala Leu Leu Cys Leu Glu 145 150 155 160 Ala Glu Arg Ala Phe Lys Glu Ser Ala Gly Ser Leu Arg Pro Val Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Asn Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Ile His Val Thr Ser Val Gln Asp Phe Glu Arg Thr Val Glu 195 200 205 Leu Thr Lys Lys Ala Phe Phe Asp His Gly Leu Tyr Glu Ala Trp Gly 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Glu 225 230 235 240 His Ile Phe Glu Tyr Asp Arg Asn Arg Ala Arg Glu Leu Thr Glu Ala 245 250 255 Ile Lys Lys His Pro Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Ala Lys Ala Leu Lys Glu Met Val Glu Asp Gly Val Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Phe Phe 290 295 300 Ala Leu Ser Ser Ile Glu Lys Glu Leu Phe Tyr Asp Thr Pro Gly Leu 305 310 315 320 Cys Ser Asn Phe Val Glu Val Val Glu Arg Ala Met Leu Asp Asn Pro 325 330 335 Lys His Trp Glu Lys Tyr Tyr Gln Gly Glu Glu Arg Glu Asn Arg Leu 340 345 350 Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Trp Asn Leu 355 360 365 Pro Glu Val Arg Thr Ala Val Asn Lys Leu Ile Thr Asn Leu Glu Thr 370 375 380 Lys Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Met Gln Tyr 385 390 395 400 Gln Lys Ile Arg Asn Gly Leu Leu Arg Lys Asp Pro Ile Ser Leu Ile 405 410 415 Lys Asp Arg Ile Thr Leu Val Leu Asp Asp Tyr Tyr Phe Ala Thr His 420 425 430 Pro Glu Cys 435 ＜210＞ 2 ＜211＞ 1308 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_KO_F6P4E的核酸序列 ＜400＞ 2 atgaaaaaac atcctcttca ggacattgtt tcattgcaaa aacagggaat acccaaaggg 60 gttttctctg tatgtagtgc caatagattt gttattgaaa ccactctgga atatgcgaag 120 atgaaaggga caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180 tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240 ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300 ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360 gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420 gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480 gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540 gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600 caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660 gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720 catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780 ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840 atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900 gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960 tgttcaaact ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa 1020 aaatattacc agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat 1080 cgcttgaggt attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc 1140 aaccttgaaa caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac 1200 caaaaaatca gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt 1260 acccttgttc ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1308 ＜210＞ 3 ＜211＞ 420 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_RM_F6P4E的胺基酸序列 ＜400＞ 3 Met Gln Ala Gln Ala Leu Leu Thr Val Pro Phe Asp Arg Val Ala Thr 1 5 10 15 His Ala Arg Gly Phe Val Gly Trp Val Ala Glu Leu Leu Gln Gly Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Gln His Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Glu Ala 35 40 45 Val Thr Arg Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asn Ala Pro Leu 50 55 60 Leu Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Leu Asp Gly Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Trp Thr Pro Ala Thr Leu Ala Arg Phe Val Ala Asp Glu Leu Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Leu His Ile Pro Val Val Leu Gly Leu Asp His Gly Gly 100 105 110 Pro Trp Lys Lys Asp Leu His Ala Arg Asn Arg Leu Ser Phe Glu Glu 115 120 125 Thr Phe Gln Ala Val Leu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu His Leu Asp Pro Thr Val Asp Leu Glu Leu Ser Pro 145 150 155 160 Gly Thr Pro Val Pro Ile Pro Arg Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Leu 165 170 175 Leu Arg His Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Arg Arg Asn Leu Pro Pro Val 180 185 190 Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val Gly Gly Gly Leu Gln Ala Glu 195 200 205 Ala Arg Met Ala Glu Phe Leu Asp Arg Leu Trp Thr Ala Leu Asp Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Pro His Pro Val Phe Val Val Gly Asp Ile Gly Thr Arg 225 230 235 240 Leu Asp Thr Arg Thr Phe Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Ala 245 250 255 Leu Val Arg Arg Tyr Gly Ala Leu Ile Lys Gly His Tyr Thr Asp Asp 260 265 270 Val Asp Arg Leu Asp Leu Tyr Pro Lys Ala Gly Ile Gly Gly Ala Asn 275 280 285 Val Gly Pro Gly Leu Ala Ala Ile Glu Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu 290 295 300 Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Gly Leu Ser Val Thr Phe Asp Gln Ala 305 310 315 320 Ile Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Gly Arg Trp Thr Lys Trp Leu Gln 325 330 335 Pro Glu Glu Lys Gly Gln Pro Phe Asp Ala Leu Asp Pro Glu Arg Gln 340 345 350 Arg Trp Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Tyr Val Trp Thr His Pro Ala 355 360 365 Val Leu Gln Ala Arg Arg Glu Leu Tyr Glu Ala Leu Ala Pro Trp Leu 370 375 380 Asp Ala Asp Ala Phe Val Arg Thr Arg Ile Lys Ala Arg Leu Met Asp 385 390 395 400 Tyr Phe Arg Ala Phe Asn Leu Ile His Phe Asn Glu Arg Leu Gln Ala 405 410 415 Phe Leu Pro Glu 420 ＜210＞ 4 ＜211＞ 1263 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_RM_F6P4E的核酸序列 ＜400＞ 4 atgcaggcgc aggccctgct gaccgttcca tttgatcggg tggcgaccca cgcacgcggg 60 tttgtgggct gggtggccga actgctgcag gggcccctgg cctatcagca tacgctgctg 120 gctgtctgtc ccaattcgga agcggtaaca cgggccgcgc tggaggccgc cgccgaggcc 180 aacgccccgc tgctttttgc cgccacgctg aaccaggtgg acctcgacgg cggctacacc 240 ggctggacgc ccgccacgct ggcccggttc gtggcggacg aactggcccg cctggacctg 300 cacatccccg tcgtgctcgg cctggaccac ggcggcccct ggaaaaagga tctgcacgcc 360 cgcaaccgat tgtcctttga ggaaaccttc caggccgtgc tgcgggccat cgaggcctgt 420 ctggatgccg gctacggcct gctgcacctg gatccgacgg tcgatctgga gctatcgccc 480 ggcacgccgg tgcccatccc gcgcattgtc gaacgctcgg tagcgctttt gcgtcatgcc 540 gaaacctatc gacttcgacg taacctgccg ccggtcgcct acgaggtggg caccgaagaa 600 gtcggcggcg gcctgcaggc cgaagcgcgc atggcggagt ttctggatcg cctctggacc 660 gcactggacc gggaaggcct gccccatcca gtcttcgtgg tgggcgacat cggcacccgg 720 ctcgacacgc gcacgttcga cttcgagcgg gcccgacggc tggacgcgct ggtgcgccgc 780 tacggtgccc tcatcaaagg gcactacacc gacgacgtgg atcgcctcga tctgtacccg 840 aaggcgggca tcggcggggc caacgtgggc ccgggcctgg ccgccatcga gtttgaagcg 900 ctggaggcgc tggtggagga agcccgtcgc cgcggtcttt cggtgacgtt cgatcaggcc 960 atccgccggg ccgtcgtcga aagcggacgc tggacgaagt ggctccaacc ggaagagaaa 1020 ggccagccgt tcgatgcgct ggatcccgag cggcaacgct ggctggtggc caccggcagc 1080 cgctacgtgt ggacgcatcc ggccgtcctg caggcccgcc gcgaactcta cgaggcgctc 1140 gccccctggc tcgatgccga cgctttcgtg cgcacgcgca tcaaagcacg cctgatggac 1200 tactttcgtg ccttcaacct gatccatttc aacgagcggc tgcaggcctt tctccccgaa 1260 tga 1263 ＜210＞ 5 ＜211＞ 420 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_RP_F6P4E的胺基酸序列 ＜400＞ 5 Met Gln Ala His Val Leu Leu Ala Pro Ser Phe Glu Gln Leu Ala Asp 1 5 10 15 His Arg His Gly Phe Val Gly Trp Leu Val Asp Leu Leu Arg Gly Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Arg His Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Glu Ala 35 40 45 Val Thr Arg Ala Ala Leu Glu Ala Ala Arg Glu Ala Asn Ala Pro Leu 50 55 60 Phe Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Leu Asp Gly Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Trp Thr Pro Ala Thr Leu Ala Arg Phe Val Ala Asp Glu Arg Ile 85 90 95 Arg Leu Gly Leu Arg Ala Pro Val Val Leu Gly Leu Asp His Gly Gly 100 105 110 Pro Trp Lys Lys Asp Trp His Val Arg Asn Arg Leu Pro Tyr Glu Ala 115 120 125 Thr Leu Gln Ala Val Leu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu His Leu Asp Pro Thr Val Asp Leu Glu Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gly Thr Pro Val Pro Ile Pro Arg Ile Val Glu Arg Thr Val Ala Leu 165 170 175 Leu Gln His Ala Glu Thr Tyr Arg Gln Gln Arg Arg Leu Pro Pro Val 180 185 190 Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val Gly Gly Gly Leu Gln Ala Glu 195 200 205 Ala Arg Met Ala Glu Phe Leu Asp Arg Leu Trp Thr Val Leu Asp Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Pro Arg Pro Val Phe Val Val Gly Asp Ile Gly Thr Arg 225 230 235 240 Leu Asp Thr His Thr Phe Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Ala 245 250 255 Leu Val Arg Arg Tyr Gly Ala Leu Ile Lys Gly His Tyr Thr Asp Gly 260 265 270 Val Asp Arg Leu Asp Leu Tyr Pro Gln Ala Gly Ile Gly Gly Ala Asn 275 280 285 Val Gly Pro Gly Leu Ala Ala Ile Glu Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu 290 295 300 Val Ala Glu Ala His Arg Arg Lys Leu Pro Val Thr Phe Asp Arg Thr 305 310 315 320 Ile Arg Gln Ala Val Ile Glu Ser Gly Arg Trp Gln Lys Trp Leu Arg 325 330 335 Pro Glu Glu Lys Gly Arg Pro Phe Glu Ala Leu Pro Pro Glu Arg Gln 340 345 350 Arg Trp Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Tyr Val Trp Thr His Pro Ala 355 360 365 Val Arg Gln Ala Arg His Gln Leu Tyr Gln Val Leu Ala Pro Trp Leu 370 375 380 Asp Ala Asp Ala Phe Val Arg Ala Arg Ile Lys Ala Arg Leu Met Asp 385 390 395 400 Tyr Phe Arg Ala Phe Asn Leu Ile Gly Phe Asn Glu Arg Leu Gln Ala 405 410 415 Phe Leu Pro Asn 420 ＜210＞ 6 ＜211＞ 1263 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_RP_F6P4E的核酸序列 ＜400＞ 6 atgcaggcgc acgtcctgct tgccccttcg ttcgagcagc tagcagacca caggcacgga 60 tttgttggct ggttggtcga tttgctgcgc ggaccgctgg cttaccggca cacgctgctg 120 gccgtatgtc ccaattccga agccgtaacg cgcgccgccc tggaagctgc gcgcgaagcc 180 aacgccccgc tattttttgc ggctaccctg aaccaggtcg acctggatgg cggatatacc 240 ggctggaccc cggccacgct ggctcgtttt gttgccgacg 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tcaggtgctc 1140 gctccctggc tcgatgccga tgcttttgtg cgcgcgcgca tcaaggcccg cctgatggac 1200 tacttccgcg ctttcaacct gataggcttc aatgaacggc tgcaggcctt tttacctaat 1260 tga 1263 ＜210＞ 7 ＜211＞ 448 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_LP_F6P4E的胺基酸序列 ＜400＞ 7 Met Gln Thr Ser Thr Ala Tyr Val Arg Gln Val Ile Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15 Thr Arg Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Ser Val Cys Thr Ala Asp Pro Leu 20 25 30 Val Leu Arg Ala Ala Leu Lys Gln Ala Val Glu Asp Gly Ser Pro Ala 35 40 45 Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr 50 55 60 Gly Met Glu Pro Pro Ala Phe Val Glu Phe Val Leu Gly Leu Ala Arg 65 70 75 80 Glu Met Gly Leu Pro Pro Glu Arg Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu 85 90 95 Gly Pro Asn Pro Trp Gln Arg Leu Ala Ala Glu Glu Ala Met Arg His 100 105 110 Ala Cys Asp Leu Val Glu Ala Phe Val Ala Cys Gly Phe Thr Lys Ile 115 120 125 His Leu Asp Ala Ser Met Pro Leu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Gly Ala 130 135 140 Leu Ser Lys Arg Val Val Ala Glu Arg Thr Ala Gln Leu Cys Glu Ala 145 150 155 160 Ala 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ctgcgaggcg 480 gccgaggcgg ccttcaggaa gcggtcccag gcggaggggg cgtcggcgcc tccgctctac 540 gtcatcggct ccgacgtgcc tccgcccggc ggcgagacct ccgggagcca ggggcccaag 600 gtgaccacgc cggaggagtt cgaggagacg gtcgcgctga cgcgggcgac ctttcacgat 660 cggggcctgg acgacgcctg gggacgggtg atcgccgtgg tggtccagcc gggggtggac 720 ttcggcgagt ggcaggttca cccctacgat cgggccgccg cggcgagcct tacccgagcc 780 ttgacgcagc atccggggct ggccttcgaa gggcactcca ccgactacca gacgccgggg 840 cggcttcgcc agatggcgga agacggcatc gccatcctga aggtggggcc ggccctcacc 900 ttcgccaagc gggaagcgct cttcgccctg aacgccctgg agtccgaagt gctggggacg 960 gacggccgag cacggcgctc caacgtcgaa gccgccctcg aagaggcgat gctcgccgat 1020 ccccgtcact ggagcgccta ctacagcggg gacgagcacg agctccgtct caagcggaag 1080 tacggcctct ccgaccggtg tcgctactac tggcccgtcc cttcggtgca ggaggccgtc 1140 cagcgcctcc ttggcaacct gcgcgaggcg gggatcccct tgcccctgct gagccagttc 1200 ctgccgcgcc agtacgagcg ggtgcgggag ggcgtcctgc gcaacgaccc ggaggagctg 1260 gtcctggacc ggattcgtga cgtgttgcgg ggatatgcgg cggccgtggg gacgggcgct 1320 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gagcggcttt tttcaagcga ggtttagagt ctgcctggga acgtgtagtg 660 gcgttagtag tgcaacccgg tgttgaattc ggagatcatc agattcatgt ttaccgccgt 720 gaggaagcgc aggctctttc ccgcttcatt gaaagccagc ccggcttagt ctatgaggct 780 cactccaccg actatcagcc ccgtgatgcg ctgcgggctt tggttgagga tcatttcgca 840 atcctgaagg tgggtccggc gctaaccttt gcttttcgtg aggcagtttt tgccctggcc 900 agtatcgagg attgggtatg cgattcaccc agtcgcatcc tggaagtttt ggaaacaacc 960 atgctggcca acccggtcta ctggcaaaag tattacttgg gcgatgagcg agcgcgtcgg 1020 attgccagag ggtatagttt cagcgatcgc attcgttatt attggagtgc accagcggtt 1080 gaacaggcct ttgaacgctt gcgggcaaat ctgaatcgtg tttcgatccc ccttgtcctt 1140 ctcagtcagt atttgccgga tcaatatcgc aaagtgcggg atggacggct gcctaaccag 1200 tttgatgctt tgattctgga taaaatccaa gccgtactgg aagactacaa tgtggcgtgt 1260 ggtgtgagga taggggagtg a 1281 ＜210＞ 11 ＜211＞ 263 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T4),來自Thermotoga maritima ＜400＞ 11 Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu 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ggcgggagga 660 acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720 aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780 gaggggaagt ga 792 ＜210＞ 13 ＜211＞ 451 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 葡萄糖-6-磷酸異構酶(TN1),來自Thermotoga maritima ＜400＞ 13 Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu Asp Leu Glu Ser Thr Lys Glu 20 25 30 Lys Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Phe Thr Glu Asn Thr Pro Asp Phe 35 40 45 Ala Arg Leu Asp Arg Lys Trp Ile Asp Ser Val Lys Glu Leu Glu Glu 50 55 60 Trp Val Val Asn Phe Asp Thr Val Val Val Leu Gly Ile Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu His Tyr Ser Leu Arg Pro Leu Asn Trp 85 90 95 Asn Glu Met Ser Arg Glu Glu Arg Asn Gly Tyr Ala Arg Val Phe Val 100 105 110 Val Asp Asn Val Asp Pro Asp Leu Met Ala Ser Val Leu Asp Arg Ile 115 120 125 Asp Leu Lys Thr Thr Leu Phe Asn Val Ile Ser Lys Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Ala Glu Val Met Ala Asn Tyr Ser Ile Ala Arg Gly Ile Leu 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gatctcaaaa 420 tctggatcca cggctgaggt tatggcgaat tactcgatcg caaggggaat cctggaggct 480 aatggtctgg acccgaaaga acacatcctc atcacaacag atccagagaa gggctttttg 540 agaaaagtag tgaaagaaga gggcttcaga agtcttgagg tccctcccgg cgttggagga 600 aggttcagcg tgctgacgcc cgttggcctc ttctctgcca tggcggaggg tatcgacata 660 gaagaactcc acgacggtgc ccgggatgcg ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720 gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780 atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840 ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900 cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960 gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020 ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080 cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140 atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200 gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260 gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320 ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356 ＜210＞ 15 ＜211＞ 471 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 葡萄糖磷酸變位酶(CT2),來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 15 Met Ile Leu Phe Gly Thr Gly Gly Ile Arg Gly Val Met Arg Lys Gly 1 5 10 15 Glu Phe Asp Glu Asp Thr Val Lys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ala Phe 20 25 30 Trp Met Lys Gln Arg Lys Leu Lys Ser Val Val Ile Ala Tyr Asp Thr 35 40 45 Arg Lys Asn Ser Arg Glu Phe Ala Glu Leu Ala Gly Arg Val Phe Ala 50 55 60 Gly Glu Gly Ile Glu Ala Tyr Val Phe Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro 65 70 75 80 Val Leu Ser Phe Ala Val Arg His Met Lys Ala Gly Ala Gly Val Val 85 90 95 Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr 100 105 110 Thr Trp Asp Gly Val Gln Ala Ile Pro Glu Tyr Thr Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Lys Val Asp Ile Ser Gly Val Arg Glu Gly Gly Phe 130 135 140 Lys His Val Pro Ser Glu Val Lys Glu Ser Tyr Ile Glu Lys Val Val 145 150 155 160 Glu Ile Val Ser Asn Leu Pro Arg 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cggacgagat caccgaaata tacaaaaagg tcgatatctc cggagtgagg 420 gagggaggtt tcaaacacgt accttccgag gtgaaggaga gttacataga gaaagtggtt 480 gagatagtct cgaaccttcc aagaagaacg gaccttgacg ttgcctactc tccactccat 540 ggaacgggag caaactatgt tccggaggtt ttgagaagac tcggtttcaa agtgagacct 600 gtggaagaac agatgaaacc cgatccaaac ttctccacag tcccaactcc aaatcccgaa 660 gaagatgaag cgctcgtttt gctgaacaaa aaggaagcga cccttggact tgcaaccgac 720 ccggactgcg acagggtggg agtggtgtac agaggaagaa ggctcacagg aaaccaggtt 780 ggagtgctcc ttacggactt tctcctcgaa cacgtgaagg tagaaaaccc tctcgtgata 840 aaaacgatcg tcaccacgga catggtgagg cccatctgtg aggaaagggg tgcctatctc 900 gaagaaacac caacaggttt caaattcatc ggtcatttga tagaagaaca cacaaagaaa 960 ggtgacagaa acttcgtctt tggtttcgag gaaagctgtg gatacctcgc aggagaccac 1020 gcaagggaca aagatggtgt tgtgggaagt gtcctctctg cgatagcctt cagcaactac 1080 gacccgtacg aaaaactcga agaactctac agaaagtacg gttactacat ggaaaaactc 1140 atcaacttca agttcgaaga cgtcagcaaa gcgatagaaa tatacaactc cctgaaagag 1200 tacgatggaa taatcgatta ctccagaggt tacaaaggaa taattccaaa cgaaaccata 1260 gccttcgtgt tcgaaaaatc cagaatcttc gtcagaccat ctggaacaga accgaagctc 1320 aaggtgtaca tccacgtgag aggggacaca agggaagagt cagagaatct gatgaaggaa 1380 agtgaaagaa agatcaggga gatcctgaaa ctgtga 1416 ＜210＞ 17 ＜211＞ 270 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ dg ppgk ＜400＞ 17 Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu 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ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300 aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360 accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420 ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480 tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540 cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600 tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660 tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720 acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780 atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813 ＜210＞ 19 ＜211＞ 253 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ at ppgk ＜400＞ 19 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly 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20 atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60 gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120 gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180 tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240 gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300 tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360 tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420 gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480 attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540 acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600 tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660 tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720 ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762 ＜210＞ 21 ＜211＞ 823 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ α-葡聚糖磷酸化酶(CT1),來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 21 Met 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gcgttctctt ccctcgaaag gataaagaac 840 tacatggaag aaggatattc cttcacagag gcccttgaga tcgtgagaca gacgagtgtg 900 tttacaaccc acacacccgt tcccgctgga cacgacagat ttccctttga cctcgtggaa 960 aagaaacttt cgaaattctt cgaaggattc gaaaagagaa atcttctcat ggatcttggg 1020 aaagatgaaa caggcagttt caacatgacg tatcttgccc tgagaacgtc ctctttcata 1080 aacggcgtga gcaaactgca tgcggaagtt tccagaagga tgttcaaaaa cgtgtggcag 1140 ggtgttcccg tggaggaaat accgatcgaa gggataacga acggcgttca catgggaacc 1200 tggatcaacc gtgagatgag aaaactgtac gacagatatc tcggaagggt atggagagat 1260 cacaccgacc ttgagggtat ctggtacggt gttgacagga ttccagatga agaactctgg 1320 caggctcacc tgagggcaaa gaagagattc atcgagtaca taaaagaatc ggtaagaaga 1380 agaaacgaga gactgggaat cgacgaagat gtgccgaaca tcgatgaaaa ttcgctcatc 1440 ataggttttg caagaaggtt tgccacttac aagagggcag ttctcctgct cagcgatctg 1500 gagagactca agaagatcct caacgatcca gaaagacccg tttacgtggt ctatgcgggg 1560 aaggcccatc caagggacga tgcggggaag gaatttttga aacgcatcta cgaagtctcg 1620 cagatgcctg agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680 cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740 agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800 ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860 cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920 aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980 agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040 aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100 aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160 atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220 gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280 tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340 gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400 ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460 gttctcgggt ga 2472 ＜210＞ 23 ＜211＞ 441 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Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 ＜210＞ 24 ＜211＞ 1326 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 4-α-葡聚糖轉移酶(TN2)的DNA序列,來自Thermotoga maritima ＜400＞ 24 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 ＜210＞ 25 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CT1的正向引子DNA序列 ＜400＞ 25 aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34 ＜210＞ 26 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CT1的反向引子DNA序列 ＜400＞ 26 agccccctcg agcccgagaa c 21 ＜210＞ 27 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CT2的正向引子DNA序列 ＜400＞ 27 aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26 ＜210＞ 28 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CT2的反向引子DNA序列 ＜400＞ 28 ataccagtct cgagcagttt caggatc 27 ＜210＞ 29 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ TN1的正向引子DNA序列 ＜400＞ 29 ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34 ＜210＞ 30 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ TN1的反向引子DNA序列 ＜400＞ 30 aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30 ＜210＞ 31 ＜211＞ 31 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ TN2的正向引子DNA序列 ＜400＞ 31 atagagggca tatgataggc taccagatct a 31 ＜210＞ 32 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ TN2的反向引子DNA序列 ＜400＞ 32 atcttcatct cgagaaccac ctcc 24 ＜210＞ 33 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ T4的正向引子DNA序列 ＜400＞ 33 ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28 ＜210＞ 34 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ T4的反向引子DNA序列 ＜400＞ 34 catactcgag cttcccctct cctatct 27

Claims (20)

1. 一種用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其包括一種以上的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成的塔格糖-二磷酸醛縮酶。
4. 一種用於生產塔格糖的組成物，其包括： 塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物；及 塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
6. 如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或所述微生物的培養物。
7. 如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物。
8. 如申請專利範圍第7項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物。
9. 如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖激酶、表現所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培養物。
10. 如申請專利範圍第9項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶的微生物或所述微生物的培養物。
11. 一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖-6-磷酸的步驟。
12. 如申請專利範圍第11項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使所製備的所述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖的步驟。
13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖-6-磷酸與葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而將所述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟。
14. 如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖-1-磷酸與葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而將所述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
15. 如申請專利範圍第14項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合與α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶的微生物或表現所述微生物的培養物接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。
16. 如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖與葡萄糖激酶、表現所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而將所述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
17. 如申請專利範圍第16項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合與α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖或異澱粉酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖或異澱粉酶的微生物或表現所述微生物的培養物接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。
18. 如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中以pH5.0至pH9.0的條件、40℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至24小時的條件執行所述接觸。
19. 如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中所述塔格糖-二磷酸醛縮酶由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7或序列號9的胺基酸序列構成，所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶由序列號11的胺基酸序列構成。
20. 一種塔格糖的製備方法，其包括： 使以下進行接觸的步驟： （a）澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合； （b）（i）塔格糖-6-磷酸磷酸酶、（ii）塔格糖-二磷酸醛縮酶、（iii）葡萄糖-6-磷酸-異構酶、（iv）葡萄糖磷酸變位酶或葡萄糖激酶、（v）磷酸化酶及（vi）α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶中的一種以上；及 （c）聚磷酸鹽（phosphate）。