BR112019020229B1 - Composições compreendendo tagatose-bifosfato aldolase e métodos para produzir tagatose - Google Patents
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Abstract
composição para produzir tagatose e método para produzir tagatose com o uso da mesma. a presente revelação se refere a uma composição para produzir tagatose, que compreende frutose-6-fosfato-4- epimerase, e um método para produzir tagatose com o uso da mesma.
Description
[001] A presente revelação refere-se a uma composição para produzir tagatose-6-fosfato, que compreende frutose-6-fosfato 4-epimerase, e um método para produzir tagatose com o uso da mesma.
[002] Os métodos convencionais de produção de tagatose incluem um método químico (uma reação catalítica) e um método biológico (uma reação de enzima de isomerização) do uso da galactose como matéria-prima principal (ver Patente Coreana Número 10-0964091). No entanto, o preço da lactose, que é uma matéria-prima básica da galactose usada como principal matéria-prima nos métodos de produção conhecidos, é instável, dependendo das quantidades produzidas, oferta e demanda de leite cru e lactose nos mercados globais, etc. Assim, há uma limitação no fornecimento estável do mesmo. Para superar o problema dos métodos convencionais de produção de tagatose, foram relatados métodos de produção de tagatose a partir de D-frutose com preço baixo e fornecimento constante, fazendo uso de hexuronato C4-epimerase (2011. Appl Biochem Biotechnol. 163: 444-451; Patente Coreana 10-1550796). No entanto, há uma limitação em que a isomerização tem uma baixa taxa de conversão.
[003] A tagatose-bifosfato aldolase (EC 4.1.2.40) é conhecida por produzir fosfato de glicerona e gliceraldeído-3-fosfato a partir de 1,6-bifosfato de D-tagatose como substrato, como mostrado a seguir [Esquema de reação 1], e participar de um metabolismo da galactose. No entanto, não existem estudos sobre se a tagatose- bifosfato aldolase tem atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6- fosfato. REAÇÃO DO ESQUEMA 1 1,6-bifosfato de D-tagatose <=> fosfato de glicerona + Gliceraldeído-3- fosfato
[004] Sob estes antecedentes, os presentes inventores realizaram extensos estudos para desenvolver um uma enzima que pode ser usada na produção de tagatose e, como resultado, descobriram que a tagatose-bifosfato aldolase (EC 4.1.2.40) tem a capacidade de converter glicose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato completando, assim, a presente revelação.
[005] Consequentemente, glicose ou amido podem ser usados como matéria- prima para produzir sequencialmente glicose-1-fosfato e glicose-6-fosfato e, em seguida, a tagatose-bifosfato aldolase da presente revelação pode ser usada para converter glicose-6 -fosfato em tagatose-6-fosfato e tagatose-6-fosfato fosfatase, que executa uma via de reação irreversível, podem ser usados para produzir tagatose enquanto aumentam notavelmente uma taxa de conversão de glicose ou amido em tagatose.
[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma composição útil para a produção de tagatose-6-fosfato, que compreenda tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase ou uma cultura do microrganismo.
[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição útil para a produção de tagatose, que compreenda tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase ou uma cultura do microrganismo; e tagatose-6-fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[008] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método de produção de tagatose, que compreenda a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato e com tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase, ou uma cultura do microrganismo, onde o método pode, ainda, compreender ainda a conversão de tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato e com tagatose-6-fosfato fosfatase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[009] Outros objetos e vantagens da presente revelação serão descritos em mais detalhes com referência à descrição a seguir, juntamente com as reivindicações e desenhos anexos. Uma vez que o conteúdo que não é descrito na presente especificação pode ser suficientemente reconhecido e inferido por aqueles versados na técnica ou em técnica similar, uma descrição do mesmo será omitida. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As Figuras 1A a 1D são resultados da cromatografia por HPLC, que mostram que a tagatose-bifosfato aldolase (CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E e CJ_LP_F6P4E) de uma modalidade da presente revelação têm atividade frutose-6- fosfato; As Figuras 2A e 2B são resultados da cromatografia por HPLC, que mostra que o tratamento de frutose-6-fosfato com tagatose-bifosfato aldolase (CJ_KO_F6P4E e CJ_RP_F6P4E) e tagatose-6-fosfato fosfatase (CJ_T4) converte frutose-6-fosfato em tagatose-um-fosfato em tagatose presente revelação; A Figura 3 é um resultado da cromatografia por HPLC, que mostra que T4 que é uma enzima de uma modalidade da presente revelação, tem atividade de tagatose- 6-fosfato fosfatase; A Figura 4 é um resultado da eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) para analisar pesos moleculares de enzimas usadas nas vias de produção de tagatose a partir de amido, sacarose ou glicose em uma modalidade da presente revelação, em que M representa uma escada de tamanho de proteína (marcador de tamanho, Bio- RAD, EUA); A Figura 5 é um resultado da cromatografia por HPLC que mostra que TD1(CJ_TD1_F6P4E), que é uma enzima de uma modalidade da presente revelação, tem atividade de frutose-6-fosfato 4-epimerase; A Figura 6 é um resultado da cromatografia por HPLC que mostra que quando todas as enzimas envolvidas na via de produção de tagatose a partir de maltodextrina foram adicionadas ao mesmo tempo, a tagatose foi produzida por reações enzimáticas complexas, em que TD1(CJ_TD1_F6P4E) foi usado como tagatose-bifosfato aldolase.
[010] Doravante, a revelação presente será descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, cada descrição e modalidade divulgada nesta revelação pode ser aplicada a outras descrições e modalidades de coisas comuns. Além disso, todas as combinações de vários elementos divulgados nesta revelação se enquadram no escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[011] Para alcançar um objetivo da presente revelação, um aspecto da presente revelação fornece uma composição para a produção de tagatose-6-fosfato, que compreende tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase ou uma cultura do microrganismo.
[012] A tagatose-bifosfato aldolase (EC 4.1.2.40) é conhecida por produzir fosfato de glicerona e Gliceraldeído-3-fosfato a partir de 1,6-bifosfato de D-tagatose como substrato e participa no metabolismo da galactose. Por exemplo, a tagatose- bifosfato aldolase pode ser qualquer uma sem limitação, desde que seja capaz de produzir tagatose-6-fosfato a partir de frutose-6-fosfato como substrato.
[013] Especificamente, a tagatose-bifosfato aldolase pode ser um polipeptídio que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9, ou compreende um polipeptídio com pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, ou 99% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9. É também aparente que um polipeptídio com a homologia e uma sequência de aminoácidos que exiba a eficácia (isto é, epimerização por frutose-6-fosfato C4 atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato por epimerização de frutose-6-fosfato na posição C4 da frutose) correspondente à proteína que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9, também é incluído no escopo da presente revelação, embora tenha uma sequência de aminoácidos, da qual uma sequência parcial é excluída, modificada, substituída ou adicionada. Além disso, uma sonda, que pode ser produzida a partir da sequência conhecida de nucleotídeos, por exemplo, um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo que é hibridável com uma sequência complementar a toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio em condições rigorosas também pode ser incluída sem limitação, desde que possua a atividade de epimerização da frutose-6-fosfato C4. Portanto, a composição para a produção de tagatose-6-fosfato pode ainda compreender frutose- 6-fosfato. Além disso, a composição pode compreender uma ou mais da tagatose- bifosfato aldolase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9.
[014] A presente revelação revelou que a 'tagatose-bifosfato aldolase' exibe a atividade de epimerização da frutose-6-fosfato 4 para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato pela epimerização da frutose-6-fosfato em C4 posição. Na presente revelação, portanto, a 'tagatose-bifosfato aldolase' pode ser usada de forma intercambiável com a 'frutose-6-fosfato C4 epimerase'.
[015] Como usado no presente documento, o termo "condições rígidas" significa condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos. Essas condições dependem do comprimento do polinucleotídeo e do grau de complementação, e as variáveis são bem conhecidas na técnica e especificamente descritas em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook e outros, Infra). As condições rígidas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais os genes com alta homologia, homologia de 80% ou superior, homologia de 90% ou superior, homologia de 95% ou superior, homologia de 95% ou superior, homologia de 97% ou superior, homologia ou 99% ou superior são hibridados com cada outro e genes com homologia menor que a homologia acima não são hibridizados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern, ou seja, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1*SSC, 0,1% SDS, especificamente, 60 °C, 0,1xSSC, 0,1% SDS, e mais especificamente 68 °C, 0,1*SSC, 0,1% SDS. A sonda utilizada na hibridação pode fazer parte de uma sequência complementar da sequência de nucleotídeos. Tal sonda pode ser produzida por PCR ao usar oligonucleotídeos produzidos com base na sequência conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA que contém essas sequências de nucleotídeos como um molde. Além disso, aqueles versados na técnica podem ajustar a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem de acordo com fatores como o comprimento da sonda, se necessário.
[016] Como usado no presente documento, o termo "homologia" refere-se a uma porcentagem de identidade entre duas porções polipeptídicas. A correspondência de sequência de uma porção para outra pode ser determinada por uma técnica conhecida. Por exemplo, a homologia pode ser determinada alinhando diretamente as informações de sequência de duas moléculas polipeptídicas, por exemplo, parâmetros como pontuação, identidade e semelhança, etc., com uso de um programa de computador que está prontamente disponível e capaz de alinhar informações de sequência (por exemplo, BLAST 2.0). Além disso, a homologia entre polinucleotídeos pode ser determinada por hibridização dos polinucleotídeos sob uma condição para formar uma fita dupla estável nas regiões homólogas, seguida pela digestão da fita hibridada por uma nuclease específica de fita única para determinar o tamanho dos fragmentos digeridos.
[017] Em uma modalidade específica, a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo termofílico ou uma variante do mesmo, por exemplo, uma enzima derivada de Thermanaerothrix sp. ou uma variante sua, uma enzima derivada de Kosmotoga sp. ou uma variante sua, uma enzima derivada de Rhodothermus sp. ou uma variante sua , uma enzima derivada de Limnochorda sp. ou uma variante sua, e especificamente, uma enzima derivada de Thermanaerothrix daxensis, Kosmotoga olearia, Rhodothermus marinus, Rhodothermus profundi ou Limnochorda pilosa, mas não se limita a elas.
[018] A frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente revelação, ou uma variante da mesma, é caracterizada pela conversão de D-frutose-6-fosfato em D-tagatose-6- fosfato pela epimerização de D-frutose-6-fosfato na posição C4. A frutose-6-fosfato-4- epimerase da presente revelação pode ser uma enzima que é conhecida por ter atividade de tagatose-bifosfato aldolase e a tagatose-bifosfato aldolase produz fosfato de glicerona e Gliceraldeído-3-fosfato a partir de D-tagatose 1, 6-bifosfato como substrato e participa do metabolismo da galactose. A presente revelação revelou recentemente que a tagatose-bifosfato aldolase tem a atividade de frutose-6-fosfato- 4-epimerase. Por conseguinte, uma modalidade da presente revelação refere-se ao novo uso da tagatose-bifosfato aldolase, que inclui o uso da tagatose-bifosfato aldolase como frutose-6-fosfato-4-epimerase na produção de tagatose-6-fosfato a partir da frutose-6- fosfato. Além disso, outra modalidade da presente revelação refere-se a um método de produção de tagatose-6-fosfato a partir de frutose-6-fosfato usando a tagatose-bifosfato aldolase como a frutose-6-fosfato-4-epimerase.
[019] Em uma modalidade, a frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente revelação pode ser uma enzima com alta resistência ao calor. Especificamente, a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação pode exibir 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100% ou 75% a 100% de sua atividade máxima a 50 °C a 70 °C. Mais especificamente, a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação pode exibir 80% a 100% ou 85% a 100% de sua atividade máxima de 55 °C a 65 °C, 60 °C a 70 °C, 55 °C, 60 °C ou 70 °C.
[020] Além disso, a frutose-6-fosfato-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 pode ser, mas sem limitação, codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10, respectivamente.
[021] A frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente revelação ou uma variante da mesma, pode ser obtida pela transformação de um microrganismo, tal como Escherichia coli com DNA que expressa a enzima da presente revelação ou a sua variante, por exemplo, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10, cultivando o microrganismo para obter uma cultura, interrompendo a cultura e, em seguida, realizando a purificação usando uma coluna, etc. O microrganismo para transformação pode incluir Corynebacterium glutamicum, Aspergillus oryzae, ou Bacillus subtilis, além da Escherichia coli. Em uma modalidade específica, a transformação do microrganismo pode ser Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E, Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_LPia/CJ_LPia-C-His-CJ_td1. Esses microrganismos foram depositados no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, que é uma Autoridade Depositária Internacional, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste com o número de acesso KCCM11999P (Escherichia coli BL21(DE3)/ CJ_KO_F6P4E) (data do depósito: 24 de março de 2017) , KCCM12096P (Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E) (data do depósito: 11 de agosto de 2017), KCCM12097P (Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E) (data do depósito: 11 de agosto de 2017), KCCM12095P (Escherichia coli BL21(DE3) / CJ_LP_F6P4E) (data do depósito: 11 de agosto de 2017) e KCCM11995P (Escherichia coli BL21(DE3)/pBT7-C-His- CJ_td1) (data do depósito: 20 de março de 2017), respectivamente.
[022] A frutose-6-fosfato-4-epimerase usada na presente revelação pode ser fornecida usando um ácido nucleico que codifica o mesmo.
[023] Como usado no presente documento, o termo "ácido nucleico" significa que ele abrange moléculas de DNA ou RNA, em que os nucleotídeos que são unidades constituintes básicas no ácido nucleico podem incluir não apenas nucleotídeos naturais, mas também análogos com modificação de açúcar ou base (ver: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
[024] O ácido nucleico da presente revelação pode ser um ácido nucleico que codifica o polipeptídio que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ou 9 da presente revelação ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídio com pelo menos 80 %, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a frutose-6-fosfato- 4-epimerase da presente revelação e que tem a atividade da frutose-6-fosfato-4- epimerase. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica a frutose-6-fosfato-4- epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser um ácido nucleico que possui pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 99 % ou 100% de homologia com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2. Além disso, o ácido nucleico que codifica a frutose-6-fosfato-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 5 pode ser um nucleico ácido possuindo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4 ou 6 correspondente a ela, respectivamente. Também é aparente que o ácido nucleico da presente revelação pode incluir um ácido nucleico que é traduzido na frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação devido à degeneração do códon ou um ácido nucleico que hibrida com um ácido nucleico que consiste de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 sob condições rígidas e codifica o polipeptídio que possui a atividade frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação.
[025] O microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase que pode ser usada na presente revelação pode ser um microrganismo que compreende um vetor recombinante que compreende o ácido nucleico.
[026] O vetor pode estar operacionalmente ligado ao ácido nucleico da presente revelação. Como usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" significa que uma sequência reguladora da expressão de nucleotídeos e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína alvo estão operacionalmente ligadas uma à outra para executar as funções gerais, o que afeta, assim, a expressão da sequência de nucleotídeos codificadora. A ligação operável ao vetor pode ser produzida usando uma tecnologia de recombinação genética conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas do local podem ser produzidas com uso de enzimas de restrição e ligases conhecidas na técnica.
[027] Como usado no presente documento, o termo "vetor" refere-se a qualquer mediador para clonagem e/ou transferência de bases para um organismo, como uma célula hospedeira. O vetor pode ser um replicon que é capaz de trazer a replicação de fragmentos combinados nos quais diferentes fragmentos de DNA são combinados. No presente documento, o termo "replicon" refere-se a qualquer unidade genética (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que funciona como uma autounidade de replicação de DNA in vivo, ou seja, que pode ser replicada por autorregulação. Como usado no presente documento, o termo "vetor" pode compreender mediadores virais e não virais para introduzir as bases no organismo, por exemplo, uma célula hospedeira, in vitro, ex vivo, ou in vivo, e pode também incluir um DNA minicircular, um transposon tal como a Bela Adormecida (Izsvak e outros J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), ou um cromossomo artificial. Exemplos do vetor comumente usado podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor fágico ou vetor cosmídeo, podem ser utilizados pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, APII, t10, t11, Charon4A e Charon21A, etc.; e como vetor plasmídico, podem ser utilizados aqueles baseados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL e pET, etc. Os vetores que podem ser utilizados na presente revelação não são particularmente limitados, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, o vetor pode ser um vetor recombinante caracterizado por compreender ainda vários genes de resistência a antibióticos. Como usado no presente documento, o termo "gene de resistência a antibióticos" refere-se a um gene com resistência a um antibiótico, e uma célula com esse gene sobrevive em um ambiente tratado com o antibiótico correspondente. Portanto, o gene de resistência a antibióticos é usado como um marcador selecionável durante a produção de uma grande quantidade de plasmídeos em Escherichia coli. O gene de resistência a antibióticos na presente revelação não é um fator que influencia bastante a eficiência da expressão de acordo com combinações ótimas de vetores, que é uma tecnologia-chave da presente revelação e, portanto, um gene de resistência a antibióticos que geralmente é usado como marcador selecionável pode ser usado sem limitação. Exemplos específicos podem incluir um gene de resistência contra ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, estreptomicina ou neomicina, etc.
[028] O microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase que pode ser usada na presente revelação, pode ser obtido por um método de introdução do vetor que compreende o ácido nucleico que codifica a enzima em uma célula hospedeira e um método de transformar o vetor pode ser qualquer método, desde que seja capaz de introduzir o ácido nucleico dento da célula. Uma técnica padrão apropriada, conhecida por aqueles versados técnica, pode ser selecionada e realizada. Eletroporação, coprecipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, micro injeção, um método DEAE-dextrano, um método lipossômico catiônico e um método de choque térmico podem ser incluídos, mas não estão limitados a isso.
[029] Desde que o gene transformado possa ser expresso na célula hospedeira, ele pode ser inserido no cromossomo da célula hospedeira ou pode existir de forma extra cromossômica. Além disso, o gene compreende DNA e RNA como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio, e qualquer forma pode ser usada sem limitação, desde que possa ser introduzida na célula hospedeira e expressa nela. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção polinucleotídica que compreende todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão pode compreender um promotor operacionalmente ligado ao gene, sinais de terminação transcricional, locais de ligação ao ribossomo e sinais de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto replicável. Além disso, o gene tal como é ou na forma de uma construção polinucleotídica pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente ligado às sequências necessárias para a expressão na célula hospedeira.
[030] O microrganismo da presente revelação pode incluir tanto um microrganismo procariótico quanto um microrganismo eucariótico, desde que seja um microrganismo capaz de produzir a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação porque compreende o ácido nucleico da presente revelação ou o vetor recombinante da presente revelação. Por exemplo, o microrganismo pode incluir cepas de microrganismos pertencentes ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium, e ao gênero Brevibacterium, e, especificamente, pode ser Escherichia.coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, Escherichia.coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, Escherichia.coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E, Escherichia.coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E, Escherichia.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1, etc.
[031] O microrganismo da presente revelação pode incluir qualquer microrganismo capaz de expressar a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação, ou enzimas relacionadas de acordo com vários métodos conhecidos, além da introdução do ácido nucleico ou do vetor.
[032] A cultura do microrganismo da presente revelação pode ser produzida por cultivo, em um meio, do microrganismo é capaz de expressar a tagatose-bifosfato aldolase da presente revelação ou enzimas relacionadas.
[033] Como usado no presente documento, o termo “cultura” significa que o microrganismo pode crescer sob condições ambientais controladas adequadamente. O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado de acordo com um meio e condições de cultura apropriados conhecidos na técnica. O processo de cultura pode ser facilmente ajustado por aqueles versados na técnica, de acordo com a cepa a ser selecionada. A etapa de cultivar o microrganismo pode ser realizada por um processo em lote, um processo contínuo ou um processo em lote alimentado etc, mas não está particularmente limitada a isso. Em relação às condições da cultura, um pH adequado (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 7 a 9) pode ser ajustado com uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), mas não é particularmente limitado a estes. Além disso, um agente antiespuma, tal como o éster de poliglicol de ácidos graxos, pode ser adicionado durante o processo de cultura para impedir a geração de espuma. Além disso, oxigênio ou um gás contendo oxigênio pode ser injetado na cultura, a fim de manter um estado de aerobiose da cultura; ou gás nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono pode ser injetado sem a injeção de um gás, a fim de manter um estado de anaerobiose ou microarobiose, da cultura. A temperatura da cultura pode ser mantida de 25 °C a 40 °C e, especificamente, de 30 °C a 37 °C, mas não está limitada a ela. A cultura pode ser continuada até que a quantidade desejada de materiais úteis seja obtida e, especificamente, por cerca de 0,5 horas a cerca de 60 horas, mas não se limita a isso. Além disso, o meio de cultura a ser usado pode compreender, como fontes de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol , óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) etc. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não estão limitados a isso. As fontes de nitrogênio podem incluir compostos orgânicos que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, álcool de milho, farelo de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) etc. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não estão limitadas a elas. As fontes de fósforo podem incluir di-hidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato de dipotássio ou os sais correspondentes que contêm sódio, etc. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não estão limitadas a elas. O meio de cultura pode compreender estimuladores de crescimento essenciais, como sais de metais (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[034] Outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para a produção de tagatose, que compreende tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase, ou uma cultura do microrganismo; e tagatose-6-fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[035] A descrição da composição para a produção de tagatose-6-fosfato também pode ser aplicada à composição para a produção de tagatose. A tagatose-6- fosfato fosfatase da presente revelação pode ser qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter tagatose-6-fosfato em tagatose, pela eliminação de um grupo fosfato da tagatose-6-fosfato. A tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga maritima ou uma variante sua.
[036] De acordo com uma modalidade da presente revelação, a tagatose-6- fosfato fosfatase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma homologia genética dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 12.
[037] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender, ainda, glicose-6-fosfato isomerase, um microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato isomerase, ou uma cultura do microrganismo. Na presença da enzima, a glicose-6-fosfato pode ser isomerizada para produzir frutose-6-fosfato. A glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para isomerizar glicose-6-fosfato em frutose-6- fosfato. A glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga maritima ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma homologia dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a glicose-6-fosfato-isomerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14.
[038] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender ainda fosfoglucomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou uma cultura do microrganismo. A enzima catalisa uma reação reversível da conversão da glicose-1-fosfato em glicose-6- fosfato ou conversão de glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. A fosfoglucomutase da presente revelação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato ou converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. A fosfoglucomutase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga neapolitana ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a fosfoglucomutase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a fosfoglucomutase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16.
[039] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender ainda glucoquinase, um microrganismo que expressa a glucoquinase ou uma cultura do microrganismo. A glucoquinase da presente revelação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para fosforilar a glicose. A glucoquinase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Deinococcus sp. ou Anaerolinea sp., ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Deinococcus geothermalis ou Anaerolinea thermophila, ou uma variante das mesmas. A glicocinase da presente revelação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose em glicose- 6-fosfato. Especificamente, a glucoquinase da presente revelação pode ser uma glucoquinase dependente de fosfato. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a glucoquinase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 ou 19, uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma homologia genética dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a glucoquinase consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 18, e a glucoquinase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 da presente revelação, pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 20.
[040] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode ainda compreender α-glucana fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa o mesmo ou uma cultura do microrganismo. A fosforilase pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-1-fosfato. A fosforilase pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga neapolitana ou uma variante sua. A fosforilase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 97%, 99% ou 100%, ou uma homologia genética dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a fosforilase consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 22.
[041] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender ainda α-amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; um microrganismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; ou uma cultura do microrganismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase.
[042] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender duas ou mais enzimas das enzimas acima descritas, que podem ser usadas na produção de tagatose ou de seus transformantes individualmente ou de um transformante transformado com nucleotídeos que codificam as duas enzimas ou mais.
[043] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender ainda 4-α-glucanotransferase, um microrganismo que expressa a 4-α- glucanotransferase, ou uma cultura do microrganismo que expressa a 4-α- glucanotransferase. A 4-α-glucanotransferase da presente revelação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose em amido, maltodextrina ou sacarose. A 4-α-glucanotransferase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga maritima ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a 4-α-glucanotransferase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma homologia genética dentro da faixa determinada por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente revelação, a 4-α-glucanotransferase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 da presente revelação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 24.
[044] Exemplos dos microrganismos que podem ser utilizados nas modalidades descritas acima podem incluir Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_ct1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2, e Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4, etc. Os microrganismos recombinantes foram depositados no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos em 20 de março de 2017 com adesão números KCCM11990P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_ct1), KCCM11991P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), KCCM11993P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2), KCCM11994P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_t4), respectivamente.
[045] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode ainda compreender uma substância, um componente ou uma composição que corresponde a um substrato de cada uma das enzimas descritas acima.
[046] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender ainda qualquer excipiente adequado, comumente usado na composição correspondente para a produção de tagatose. O excipiente pode incluir, por exemplo, um conservante, um agente umectante, um agente dispersante, um agente de suspensão, um tampão, um agente estabilizante ou um agente isotônico, etc., mas não está limitado a esses.
[047] A composição para a produção de tagatose da presente revelação pode compreender, ainda, um metal. Em uma modalidade, o metal da presente revelação pode ser um metal que contém um cátion divalente. Especificamente, o metal da presente revelação pode ser em níquel, cobalto, alumínio, magnésio (Mg) ou manganês (Mn). Mais especificamente, o metal da presente revelação pode ser um íon metálico ou um sal metálico, e muito mais especificamente, o sal metálico pode ser NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoCl2, CoSO4, MnCl2 ou MnSO4.
[048] Outro aspecto da presente revelação refere-se a um método de produção de tagatose-6-fosfato, que compreende a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato e com tagatose- bifosfato aldolase, o microrganismo expressa a tagatose-bifosfato aldolase, ou a cultura do microrganismo.
[049] A descrição da composição para a produção de tagatose-6-fosfato também pode ser aplicada à composição para a produção de tagatose.
[050] Outro aspecto da presente revelação refere-se a um método de produção de tagatose, que compreende a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato, ao entrar em contato com frutose-6-fosfato e com tagatose- bifosfato aldolase, o microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase, ou a cultura do microrganismo. O método de produção da tagatose pode compreender ainda a conversão de tagatose-6-fosfato em tagatose, ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato e com tagatose-6-fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou a cultura do microrganismo.
[051] O método da presente revelação pode compreender, ainda, a conversão de glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-6-fosfato e com glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase.
[052] O método da presente revelação pode compreender, ainda, a conversão de glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-1-fosfato com fosfoglucomutase da presente revelação, o microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou a cultura do microrganismo que expressa a fosfoglucomutase.
[053] O método da presente revelação pode compreender, ainda, a conversão de glicose em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose com a glucoquinase da presente revelação, o microrganismo que expressa a glucoquinase, ou a cultura do microrganismo que expressa a glucoquinase.
[054] O método de presente revelação pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-1-fosfato, ao entrar em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos, com a α-glucana fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase da presente revelação, ou microrganismo que mostra uma fosforilase ou uma cultura de microrganismo que expressa uma fosforilase.
[055] O método de presente revelação pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose ao entrar em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos com α-amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; o microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; ou uma cultura de microrganismo que expressa uma α-amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase.
[056] O método da presente revelação pode compreender, ainda, a conversão de glicose em amido, maltodextrina ou sacarose, ao entrar em contato com glicose com a 4-α-glucanotransferase da presente revelação, o microrganismo que expressa a 4-α-glucanotransferase, ou a cultura do microrganismo que expressa a 4-α- glucanotransferase.
[057] Cada contato no método da presente revelação pode ser realizado em condições de pH 5,0 a pH 9,0, 30 °C a 80 °C e/ou 0,5 horas a 48 horas. Especificamente, o contato da presente revelação pode ser realizado sob uma condição de pH 6,0 a pH 9,0 ou pH 7,0 a pH 9,0. Além disso, o contato da presente revelação pode ser realizado sob uma condição de temperatura de 35 °C a 80 °C, 40 °C a 80 °C, 45 °C a 80 °C, 50 °C a 80 °C, 55 °C a 80 °C, 60 °C a 80 °C, 30 °C a 70 °C, 35 °C a 70 °C, 40 °C a 70 °C, 45 °C a 70 °C, 50 °C a 70 °C, 55 °C a 70 °C, 60 °C a 70 °C, 30 °C a 65 °C, 35 °C a 65 °C, 40 °C a 65 °C, 45 °C a 65 °C, 50 °C a 65 °C, 55 °C a 65 °C, 30 °C a 60 °C, 35 °C a 60 °C, 40 °C a 60 °C, 45 °C a 60 °C, 50 °C a 60 °C ou 55 °C a 60 °C. Além disso, o contato da presente revelação pode ser realizado por 0,5 horas a 36 horas, 0,5 horas a 24 horas, 0,5 horas a 12 horas, 0,5 horas a 6 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 12 horas, 1 hora a 6 horas, 3 horas a 36 horas, 3 horas a 24 horas, 3 horas a 12 horas, 3 horas a 6 horas, 12 horas a 36 horas ou 18 horas a 30 horas.
[058] Em uma modalidade, o contato da presente revelação pode ser realizado na presença de um metal, um íon metálico ou um sal metálico.
[059] Outro aspecto da presente revelação refere-se a um método de produção de tagatose, que compreende entrar em contato com a composição para produzir a tagatose descrita no presente documento com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos; e fosfato.
[060] Em uma modalidade específica da presente revelação, é fornecido um método de produção de tagatose, que compreende: converter glicose em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose com a glucoquinase da presente revelação, o microrganismo que expressa a glucoquinase, ou a cultura do microrganismo, converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-6-fosfato com a glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo, converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato com a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação, o microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase, ou a cultura do microrganismo, e converter tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose- 6-fosfato com a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase, ou a cultura do microrganismo.
[061] As reações de conversão podem ser realizadas sequencialmente ou in situ no mesmo sistema de reação. No método, o fosfato liberado da tagatose-6-fosfato pela fosfatase pode ser usado como um substrato da glucoquinase para produzir glicose-6-fosfato. Portanto, o fosfato não é acumulado e, como resultado, uma alta taxa de conversão pode ser obtida.
[062] No método, a glicose pode ser, por exemplo, produzida pela conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose, ao entrar em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos com α-glucana fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase da presente revelação, ou microrganismo que expressa uma fosforilase, ou uma cultura do microrganismo que expressa uma fosforilase. Portanto, o método de acordo com uma modalidade específica pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose.
[063] Em outra modalidade específica da presente revelação, é fornecido um método de produção de tagatose, que compreende: converter glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-1-fosfato com a fosfoglucomutase da presente revelação, o microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou a cultura do microrganismo, converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-6-fosfato com a glicose-6-fosfato-isomerase da presente revelação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo, converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato com a frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação, o microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase, ou a cultura do microrganismo, e converter tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose- 6-fosfato com a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase, ou a cultura do microrganismo.
[064] As reações de conversão podem ser realizadas sequencialmente ou in situ, no mesmo sistema de reação.
[065] No método, a glicose-1-fosfato pode ser, por exemplo, produzida pela conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-1-fosfato, ao entrar em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos, com α-glucana fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase da presente revelação, ou microrganismo que expressa a fosforilase ou uma cultura de microrganismo que expressa a fosforilase. Portanto, o método de acordo com uma modalidade específica pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-1-fosfato. A este respeito, o fosfato libertado da tagatose-6-fosfato pela fosfatase pode ser utilizado como um substrato da fosforilase para produzir glicose-1-fosfato. Portanto, o fosfato não é acumulado e, como resultado, uma alta taxa de conversão pode ser obtida.
[066] O método pode ainda compreender a purificação da tagatose produzida. A purificação no método não é particularmente limitada e um método comumente usado na técnica a que a presente revelação se refere, pode ser usado. Exemplos não limitativos podem incluir cromatografia, cristalização fracionária e purificação de íons, etc. O método de purificação pode ser realizado apenas por um único método, por dois ou mais métodos. Por exemplo, o produto tagatose pode ser purificado por cromatografia, e a separação do açúcar pela cromatografia pode ser realizada com o uso de uma diferença de força de ligação fraca entre o açúcar a ser separado e um íon metálico ligado a uma resina de íons.
[067] Além disso, a presente revelação pode ainda compreender realizações de descoloração, dessalinização ou ambas descoloração e dessalinização antes ou após a etapa de purificação da presente revelação. Ao realizar a descoloração e/ou dessalinização, é possível obter um produto de tagatose mais puro, sem impurezas.
[068] Doravante, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são fornecidos para melhor entendimento, e a revelação não se destina a ser limitada por esses Exemplos.
[069] Para fornecer α-glucana fosforilase, fosfoglucomutase, glicose-6-fosfato- isomerase, 4-α-glucanotransferase, que são enzimas resistentes ao calor necessárias no caminho de produção da tagatose da presente revelação, sequências de nucleotídeos esperadas como enzimas [as enzimas acima são representadas por SEQ ID NO: 22(CT1), SEQ ID NO: 16(CT2), SEQ ID NO: 14(TN1) e SEQ ID NO: 24(TN2), respectivamente] foram selecionadas a partir de uma sequência de nucleotídeos de um microrganismo, Thermotoga neapolitana ou Thermotoga maritima, que está registrado no GenBank.
[070] Com base nas sequências de nucleotídeos selecionadas, iniciadores diretos (SEQ ID NO: 21: CT1-Fp, SEQ ID NO: 27: CT2-Fp, SEQ ID NO: 29: TN1-Fp, SEQ ID NO: 31: TN2-Fp) e iniciadores reversos (SEQ ID NO: 26: CT1-Rp, SEQ ID NO: 28: CT2-Rp, SEQ ID NO: 30: TN1-Rp, SEQ ID NO: 32: TN2-Rp) foram projetados e sintetizado, e o gene de cada enzima foi amplificado por PCR, com uso dos iniciadores acima e um DNA genômico da Thermotoga neapolitana como molde. Cada gene amplificado das enzimas foi inserido no pET21a (Novagen que é um vetor de plasmídeo para expressão em Escherichia coli com uso das enzimas de restrição, NdeI e XhoI ou SalI, assim produzindo vetores de expressão recombinantes, designados como pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_tn1, pET21a-CJ_tn2, respectivamente.
[071] Cada um dos vetores de expressão foi transformado em Escherichia coli BL21(DE3) de acordo com um método comum de transformação [ver Sambrook e outros 1989], produzindo assim transformantes (microrganismos transformados) designados como Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2, respectivamente. Esses transformantes foram depositados no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, em 20 de março de 2017 com os números de acesso KCCM11990P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1), KCCM11991P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2), KCCM11992P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1), e KCCM11993P (Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_tn2), respectivamente.
[072] Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1, Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2 que expressam cada uma das enzimas produzidas no Exemplo 1, foram semeadas em um tubo de cultura contendo 5 ml de meio líquido LB e, em seguida, a cultura semeada foi realizada em uma incubadora com agitação a 37 °C até que a absorvância a 600 nm atingisse 2,0.
[073] Cada uma das culturas obtidas pela cultura semeada foi semeada em um balão de cultura contendo um meio líquido LB e, em seguida, a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de IPTG para induzir a expressão e produção das enzimas recombinantes. Durante a cultura, uma velocidade de agitação foi mantida a 180 rpm e uma temperatura de cultura foi mantida a 37 °C. Cada cultura foi centrifugada a 8.000 μg e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguidas de rompimento celular, com a utilização de um sonicador. Os lisados celulares foram centrifugados a 13.000 μg e 4 °C por 20 minutos para obter apenas os sobrenadantes. Cada enzima foi purificada pelo uso de cromatografia de afinidade His-tag. A solução purificada enzimática recombinante foi dialisada contra tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) e utilizada para a reação.
[074] Um peso molecular de cada enzima purificada foi examinado ao SDS- PAGE e, como resultado, foi confirmado que CT1 (α-glucana fosforilase) tem um peso molecular de cerca de 96 kDa, CT2 (fosfoglucomutase) tem um peso molecular de cerca de 53 kDa, TN1 (glicose-6-fosfato-isomerase) tem um peso molecular de cerca de 51 kDa.
[075] Para identificar uma nova frutose-6-fosfato-4-epimerase resistente ao calor, foram obtidas informações genéticas da tagatose-bifosfato aldolase derivada de Kosmotoga olearia, Rhodothermus marinus, Rhodothermus marinus, Rhodothermus profundi e Limnochorda pilosa, que são microrganismos termofílicos, que foram adquiridos para produzir recombinantes vetores expressáveis em Escherichia coli e microrganismos recombinantes
[076] Em detalhes, uma sequência de nucleotídeos de tagatose-bifosfato aldolase foi selecionada a partir de sequências de nucleotídeos de Kosmotoga olearia ou Rhodothermus marinus ATCC 43812, Rhodothermus profundi DSM 22212 e Limnochorda pilosa DSM 28787, registradas no GenBank e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), e com base nas informações das sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 7) e sequências de nucleotídeos (SEQ ID NOS: 2, 4, 6 e 8) dos quatro microrganismos pBT7-C-His-CJ_KO_F6P4E, pBT7-C- His-CJ_RM_F6P4E, pBT7-C-His-CJ_RP_F6P4E e pBT7-C-His-CJ_LP_F6P4E que são vetores recombinantes que compreendem a sequência de nucleotídeos da enzima e eram expressos em Escherichia coli, foram produzidos (Bioneer Corp., Coreia).
[077] Cada um dos vetores de expressão produzidos foi transformado em Escherichia coli BL21(DE3) por transformação de choque térmico (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para produzir microrganismos recombinantes e usado após ser congelado e armazenado em glicerol a 50%. Os microrganismos recombinantes foram designados como Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E, Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E, Escherichia coli BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E, e Escherichia coli BL21(DE3)/ CJ_LP_F6P4E respectivamente e depositados no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia (KCCM), que é uma Autoridade Depositária Internacional, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste com os números de acesso KCCM11999P (data do depósito: 24 de março de 2017), KCCM12096P (data do depósito: 11 de agosto de 2017), KCCM12097P (data do depósito: 11 de agosto de 2017), e KCCM12095P (data do depósito: 11 de agosto de 2017), respectivamente.
[078] Para identificar uma nova frutose-6-fosfato-4-epimerase adicional resistente ao calor, uma sequência de nucleotídeos esperada como enzima foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotídeos de uma Thermanaerothrix daxensis termofílica, que está registrada no GenBank, e com base em informações de uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 10) do microrganismo, o gene foi inserido no pBT7-C-His (Bioneer Corp.), que é um vetor recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos da enzima e é expressável em Escherichia coli para produzir um vetor de expressão recombinante designado como pBT7-C-His-CJ_td1. O vetor de expressão foi transformado em uma cepa de E. coli BL21 (DE3) por um método comum de transformação [ver Sambrook e outros 1989] para produzir um transformante (microrganismo transformado) designado como Escherichia coli BL21(DE3)/pBT7-C- His-CJ_td1, e esse transformante foi depositado no Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (KCCM) sob as disposições do Tratado de Budapeste em 20 de março de 2017 com o número de acesso KCCM11995P (Escherichia coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1).
[079] Para produzir enzimas recombinantes, CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E e TD1(CJ_TD1_F6P4E) a partir dos microrganismos recombinantes produzidos, cada um dos microrganismos recombinantes foi semeado em um tubo de cultura contendo 5 ml de um meio líquido LB com o antibiótico ampicilina e, então, foi realizada uma incubadora com agitação a 37 °C até a absorvância a 600 nm atingir 2,0. Cada uma das culturas obtidas pela cultura semeada, foi semeada em um balão de cultura contendo um meio líquido LB, e então a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiran0sido) para induzir a expressão e produção da enzima recombinante. A cultura semeada e a cultura principal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Cada cultura da cultura principal foi centrifugada a 8.000 μg e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguido de ruptura celular usando um sonicador. Cada lisado celular foi centrifugado a 13.000 μg e 4 °C por 20 minutos para levar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado utilizando cromatografia de afinidade com His-tag e foram aplicados 10 volumes de coluna de tampão 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0) contendo imidazol 20 mM e NaCl 300 mM para remover proteínas ligadas não especificamente. Em seguida, 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0) contendo imidazol 250 mM e NaCl 300 mM foi ainda aplicado, para realizar a eluição e a purificação. A diálise foi realizada usando tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0) para obter CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, CJ_LP_F6P4E, e CJ_TD1_F6P4E, que são enzimas purificadas, para análise da caracterização enzimática.
[080] As atividades de frutose-6-fosfato-4-epimerase das enzimas recombinantes tagatose-bifosfato aldolase obtidas no Exemplo 3-2 foram analisadas. Em detalhes, 1% em peso de frutose-6-fosfato como substrato foi suspenso em tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0), e cada 1 unidade/ml dos purificados CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, CJ_LP_F6P4E, e CJ_TD1_F6P4E foi adicionado a ele, e permitido reagir a 60 °C por 1 hora. Para remover o fosfato, 1 unidade/ml de fosfatase (fosfatase alcalina de NEB, Calf Intestinal) foi adicionada e deixada reagir a 37 °C por 1 hora. Os produtos da reação foram analisados por HPLC, e a análise por HPLC foi realizada sob condições de utilização de uma coluna SP0810 (Shodex) e aplicação de uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 1 ml/minuto, e os resultantes foram analisados com uso de um detector de índice de refração.
[081] Como resultado, foi confirmado que todos os CJ_KO_F6P4E, CJ_RM_F6P4E, CJ_RP_F6P4E, e CJ_LP_F6P4E têm a atividade de converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato (Figuras 1A a 1D).
[082] Também foi confirmado que CJ_TD1_F6P4E tem atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato (Figura 5).
[083] Para realizar a produção de tagatose a partir da frutose-6-fosfato por reações enzimáticas complexas simultâneas na via de produção da tagatose da presente revelação, a tagatose-6-fosfato fosfatase, que é capaz de exercer a reação enzimática simultânea com a tagatose-bifosfato aldolase, foi identificada.
[084] Uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 12, doravante, denominada t4) e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) esperada como tagatose-6-fosfato fosfatase, foram selecionadas a partir de uma sequência de nucleotídeos de Thermotoga maritima, que está registrada no GenBank, e com base na sequência de nucleotídeos selecionada, um iniciador direto (SEQ ID NO: 33) e um iniciador reverso (SEQ ID NO: 34) foram projetados e sintetizados. A reação de polimerase em cadeia (PCR) foi realizada com o uso dos iniciadores e o DNA genômico de Thermotoga maritima como molde para amplificar o gene t4. O gene amplificado foi inserido no pET21a (Novagen), que é um vetor plasmídeo para expressão em Escherichia coli com uso das enzimas de restrição NdeI e XhoI, produzindo assim um vetor de expressão recombinante que foi então designado como pET21a-CJ_t4. O vetor de expressão produzido foi transformado em Escherichia coli BL21(DE3) por transformação por choque térmico (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para produzir um microrganismo recombinante, o qual foi então usado após ser congelado e armazenado em glicerol 50%. O microrganismo recombinante foi designado como Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4, e depositado no Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (KCCM), que é uma Autoridade Depositária Internacional, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, em 20 de março de 2017 com o número de acesso KCCM11994P.
[085] Escherichia coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4 foi semeada em um tubo de cultura contendo 5 ml de meio líquido LB e, em seguida, foi realizada a cultura semeada, em uma incubadora com agitação a 37 °C até a absorbância a 600 nm atingir 2,0. A cultura obtida pela cultura semeada foi semeada em um balão de cultura contendo um meio líquido LB, e então a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de IPTG para induzir a expressão e produção das enzimas recombinantes. A cultura semeada e a cultura principal foram realizadas a uma velocidade de agitação de 180 rpm e 37 °C. A cultura obtida pela cultura principal foi centrifugada a 8.000 μg e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 50 mM Tris- HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguidas de rompimento celular com uso de um sonicador. Um lisado celular foi centrifugado a 13.000 μg e 4 °C por 20 minutos para obter apenas um sobrenadante. A enzima foi purificada com a utilização de cromatografia de afinidade His-tag. A enzima purificada foi usada após diálise tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) e a enzima recombinante purificada foi designada como CJ_T4.
[086] Para analisar a atividade de CJ_T4, a tagatose-6-fosfato foi suspensa em tampão 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), e 0,1 unidade/ml de CJ_T4 purificado e MgCl2 10 mM foram adicionados a ela e deixados reagir a 70 °C por 10 minutos. Em seguida, o produto da reação foi analisado por HPLC. A análise por HPLC foi realizada sob condições de uso de uma coluna HPX-87H (Bio-Rad) e aplicação de uma fase móvel (água) a 60 °C e uma taxa de fluxo de 0,6 ml/minuto, e foram analisadas a tagatose e tagatose-6-fosfato com uso de um detector de índice de refração.
[087] Como resultado, tagatose foi produzida no produto da reação. Como resultado da realização da mesma reação após a adição de CJ_T4 aos reagentes fosfato e tagatose, não foi produzida tagatose, o que indica que CJ_T4 possui atividade irreversível de tagatose-6-fosfato fosfatase (Figura 3).
[088] 1% (p / v) de frutose-6-fosfato suspensa em tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0) foi adicionada a uma solução enzimática mista de 1 unidade/ml de CJ_KO_F6P4E ou CJ_RP_F6P4E e 1 unidade/ml de CJ_t4 (número de acesso KCCM11994P) e deixou-se reagir a 60 °C por 1 hora e, em seguida, foi realizada HPLC para analisar o produto da reação. A análise por HPLC foi realizada sob condições para usar uma coluna SP0810 (Shodex) e aplicar uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 1 ml/minuto, e a tagatose foi detectada com uso de um detector de índice de refração.
[089] Como um resultado, a produção de tagatose foi observada, o que indica que a tagatose pode ser produzida a partir de frutose-6-fosfato por reações enzimáticas complexas simultâneas de tagatose-bifosfato aldolase e tagatose-6- fosfato fosfatase (Figuras 2A e 2B).
[090] Para analisar a atividade de produzir tagatose a partir de maltodextrina por enzimas complexas, foi adicionada maltodextrina a 5% (p/v) a uma solução de reação contendo 1 unidade/ml de CT1, 1 unidade/ml de CT2, 1 unidade/ml de TN1, 1 unidade/ml de T4, 1 unidade/ml de TD1 e 20 mM a 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e permitiu-se reagir a 60 °C por 1 hora, e então a HPLC foi realizada para analisar a produto de reação. A análise por HPLC foi realizada sob condições de utilização de uma coluna SP0810 (Shodex) e aplicação de uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 0,6 ml/minuto, e a tagatose foi detectada com uso de um detector de índice de refração.
[091] Como resultado, foi confirmado que a tagatose pôde ser produzida a partir de maltodextrina pelas reações enzimáticas complexas dos CT1, CT2, TN1, T4 e TD1 adicionados (Figura 6).
[092] Um método de produção de tagatose de acordo com a presente revelação é econômico por usar glicose ou amido como matéria-prima, não acumula fosfato para obter uma alta taxa de conversão e compreende uma reação de tagatose- 6-fosfato fosfatase que é uma reação irreversível, o que aumenta notavelmente a taxa de conversão em tagatose.
[093] Além disso, a tagatose pode ser produzida a partir de glicose ou amido como matéria-prima por reações enzimáticas complexas e, portanto, há vantagens de que o método seja simples e econômico, e um rendimento seja melhorado. Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11990P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11991P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11992P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11993P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11994P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11995P Data do depósito: 20 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM11999P Data do depósito: 24 de março de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM12096P Data do depósito: 11 de agosto de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM12097P Data do depósito: 11 de agosto de 2017 Autoridade Depositária Internacional: Centro de Cultura de Microrganismos da Coreia (estrangeira) Número de acesso: KCCM12095P Data do depósito: 11 de agosto de 2017
Claims (18)
1. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: i) tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose- bifosfato aldolase, ou uma cultura do microrganismo; e ii) frutose-6-fosfato; e em que a composição compreende uma ou mais de tagatose-bifosfato aldolase consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.
2. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: i) tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose- bifosfato aldolase, ou uma cultura do microrganismo; ii) frutose-6-fosfato; iii) tagatose-6-fosfato fosfatase, um microrganismo que expressa a tagatose- 6-fosfato fosfatase, ou uma cultura do microrganismo, e em que a composição compreende uma ou mais de tagatose-bifosfato aldolase consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda glicose-6-fosfato isomerase, um microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato isomerase, ou uma cultura do microrganismo.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase, ou uma cultura do microrganismo.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda α-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a α-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, ou uma cultura do microrganismo.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda glicoquinase, um microrganismo que expressa a glicoquinase, ou uma cultura do microrganismo.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase, ou sacarase, um microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase, ou sacarase, ou uma cultura do microrganismo.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a tagatose-6-fosfato fosfatase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
9. Método para produzir tagatose CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) produzir tagatose-6-fosfato ao colocar em contato frutose-6-fosfato com tagatose-bifosfato aldolase, um microrganismo que expressa a tagatose-bifosfato aldolase, ou uma cultura do microrganismo; e b) produzir tagatose convertendo tagatose-6-fosfato produzido na Etapa a) em tagatose, em que a tagatose-bifosfato aldolase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que produz tagatose na Etapa b) ao colocar em contato a tagatose-6-fosfato produzida na Etapa a) com tagatose-6-fosfato fosfatase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase, ou uma cultura do microrganismo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a tagatose-6-fosfato fosfatase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao colocar em contato glicose-6-fosfato com glicose-6-fosfato-isomerase, um microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou uma cultura do microrganismo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda converter glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato ao colocar em contato glicose-1-fosfato com fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase, ou uma cultura do microrganismo.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda converter amido, maltodextrina, ou sacarose em glicose-1- fosfato ao colocar em contato amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação das mesmas com α-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a α-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, ou uma cultura do microrganismo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda converter glicose em glicose-6-fosfato ao colocar em contato glicose com glicoquinase, um microrganismo que expressa a glicoquinase, ou uma cultura do microrganismo.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda converter amido, maltodextrina ou sacarose em glicose ao colocar em contato amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação das mesmas com α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase, ou isoamilase, um microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase, ou isoamilase, ou uma cultura do microrganismo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o contato é realizado em pH 5,0 a 9,0, 40 °C a 80 °C, e/ou por 0,5 horas a 24 horas.
18. Método para produzir tagatose CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar em contato (a) amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos; com (b) (i) tagatose-6-fosfato fosfatase, (ii) tagatose-bifosfato aldolase, (iii) glicose- 6-fosfato-isomerase, (iv) fosfoglicomutase ou glicoquinase, (v) fosforilase, e (vi) α- amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase ou sacarase; e (c) fosfato, em que a tagatose-bifosfato aldolase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.
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