KR100964091B1 - 대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대두 유래의 올리고당 또는 이를 함유한 수용성 당액을 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 대두 유래의 올리고당을 알파-갈락토시다아제를 이용하여 선택적으로 가수분해하고, 이 가수분해물로부터 얻어지는 갈락토스를 효소적 이성화 반응을 통하여 연속적으로 타가토스를 생산하며, 이를 크로마토그래피법으로 분리하여 수득하고 미반응물은 재순환시키는 타가토스의 제조 방법에 관한 것이다.
대두 올리고당, 알파-갈락토시다아제, 갈락토스, 타가토스, 크로마토그래피, 선택적 가수분해

Description

대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법{PROCESS FOR MANUFACTURING TAGATOSE USING SOY OLIGOSACCHARIDES}
본 발명은 대두에 존재하는 대두 올리고당(soy oligosaccharide) 또는 이를 함유한 수용성 당액을 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것으로, 대두 내에 수용성으로 존재하는 올리고당 내에 구성 성분으로 존재하는 갈락토스(galactose)를 선택적 가수분해를 통하여 선택적으로 회수하고, 이를 이용하여 타가토스(tagatose)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
타가토스는 수크로오스와 거의 구별할 수 없는 천연의 단맛을 가지고 있으며, 물리적 성질 또한 수크로오스와 비슷하다. 그러나 섭취한 타가토스는 소장에서 잘 흡수되지 않기 때문에 혈당치에 영향을 주지 않으며, 칼로리는 수크로오스의 약 30%인 저칼로리 감미료이다. 또한 타가토스는 장내 미생물에 의하여 발효되어 유익한 유산균의 증식을 촉진시키는 전생물적 효과 (prebiotic effect)를 가지고 있다.
그러나 이러한 타가토스는 자연계에 흔하게 존재하는 것이 아니라 유제품 또는 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당이므로, 저칼로리의 기능성 감미료로 사용되기 위해서는 저렴한 원료로부터 대량 생산할 수 있는 기술이 개발되어야 한다.
미국 특허 제 5002612호 및 제 5078796호는 락타아제를 사용하여 락토오스 또는 락토오스 함유물질을 갈락토스와 글루코스의 혼합물로 가수분해하고, 임의로 글루코스를 제거하고, 이어서 갈락토스를 타가토스로 화학적 이성질화시키는 D-타가토스의 제조방법을 제공한다.
또한 미국 특허 제 6057135호는 치즈 훼이 (cheese whey) 또는 밀크를 가수분해하여 갈락토스 및 글루코스를 수득하는 단계, 수득된 갈락토스를 L-아라비노스 이소머라제로 이성질화시키는 단계, 및 생성물 및 비전환 화합물을 크로마토그래피에 의해 분리하여 비전환 화합물을 공정으로 재순환시키는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
지금까지 타가토스의 생산을 위해 사용되고 있는 핵심원료는 유당 또는 유당을 함유하고 있는 물질과 같은 유가공 부산물이다. 이러한 유당 또는 유당을 함유하고 있는 물질을 출발원료로 하는 생물전환공정에 있어서 타가토스의 생산 방법은 기본적으로 이단계 반응 (유당 → 갈락토스 → 타가토스)으로 수행되어야 한다.
이에 본 발명자들은 이러한 사실에 근거하여, 유당 이외에 자연계에서 저가로 공급받을 수 있는 목재 및 공정 부산물 중 갈락토스를 다량 함유하고 있는 원료에 대한 연구를 수행하였으며, 대두 분리 단백 제조 부산물이 다른 물질에 비하여 높은 갈락토스 함유량을 가지고 있음을 확인하고 크로마토그래피 법을 경제적으로 이용할 수 있는 원료를 선정하였으며, 그 결과 대두 분리 단백 유청으로부터 수득 한 대두 올리고당이 실제적으로 산업화 가능한 원료임을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 주요한 목적은 대두 올리고당 또는 이를 함유하고 있는 수용성 당액을 선택적으로 가수분해하여 갈락토스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 상기 가수분해된 당액에서 갈락토스를 효소 이성화 반응을 통하여 이성질화시켜 이성화 산출물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 법을 이용하여 타가토스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 대두 유래의 올리고당 또는 이를 주 원료로 함유하고 있는 수용성 당액을 알파-갈락토시다아제로 선택적 가수분해하여 갈락토오스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
1) 대두 유래의 올리고당 또는 이를 주 원료로 함유하고 있는 수용성 당액을 알파-갈락토시다아제로 선택적 가수분해하는 단계;
2) 상기 가수분해된 당액에서 갈락토스를 아라비노스 이성화효소로 이성질화시키는 단계; 및
3) 이렇게 얻어진 이성화 산출물을 크로마토그래피를 이용하여 연속적으로 분리하여 타가토스를 얻고, 갈락토스를 재순환시키는 단계;
를 포함하는 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 1)과 3)의 반응이 하나의 반응기에서 동시에 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 각 단위 공정별 물질의 균형 및 설비 투자를 고려한 효율적 타가토스 생산 방법을 개발하였으며, 특히 크로마토그래피 분리를 용이하게 하기 위하여 선택적 가수분해를 하는 방법 등을 적용한 새로운 경제적 공법을 개발하였다. 따라서, 본 발명은 종래의 유당이 아닌 식물성 원료인 대두 유래 올리고당 및 이를 주 원료로 함유하고 있는 수용성 당액을 선택적으로 가수분해시켜 갈락토오스를 수득하고, 그대로 수득된 갈락토오스를 이성질화시켜 얻은 수크로오스, 갈락토오스 및 타가토스의 3개 이상의 당이 혼재되어 있는 당액을 단일 크로마토그래피를 이용함으로써 타가토스를 경제적으로 생산할 수 있다.
본 발명은
1) 대두 유래의 올리고당 또는 이를 주 원료로 함유하고 있는 수용성 당액을 알파-갈락토시다아제로 선택적 가수분해하는 단계;
2) 상기 가수분해된 당액에서 갈락토스를 아라비노스 이성화효소로 이성질화시키는 단계; 및
3) 이렇게 얻어진 반응물을 크로마토그래피를 이용하여 연속적으로 분리하고, 갈락토스는 재순환시키는 단계;
를 포함하는 타가토스 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 출발 물질은 대두 분리 단백 부산물인 대두 유청(soy bean whey) 및 그로부터 유래된 대두 올리고당 또는 이를 주 원료로 함유하고 있는 수용성 당액일 수 있으며, 바람직하게는 대두 올리고당일 수 있다.
상기 대두 유청에 함유되어 있는 당은 대부분 수크로오스(Sucrose), 라피노오스(raffinose) 및 스타키오스(Stachyose)를 주 구성 성분으로 하고 있으며, 라피노오스 및 스타키오스는 수크로오스와 갈락토스가 알파-1, 4(alpha-1,4)로 결합된 중합체로 구성되어 있다. 상기 당들의 탄수화물 성분을 나열하면 다음 표 1과 같으며, 대두 유청 혹은 대두 올리고당에 함유되어 있는 단위 구성 성분은 수크로오스와 갈락토오스로 구분할 수 있고, 이를 좀더 세분화할 경우에는 글루코오스, 프룩토오스 및 갈락토오스의 혼합 단당으로 해석할 수 있다.
탄수화물명 당원수 갈락토스 함량 구성단위의 당 함량 몰비
라피노오스 3당 33.3 Suc : D-Gal = 1:1
스타키오스 4당 50 Suc : D-Gal = 1:2
수크로오스 2당 0 -
이와 같이, 본 발명에서 사용되는 대두 유청과 같이 대부분의 자연계에 존재하는 식물성 원료에는 대부분의 갈락토스가 글루코오스 또는 프룩토오스와 함께 탄수화물 내지는 올리고당의 형태로 존재하고 있기 때문에, 가수분해를 통하여 얻어진 당액 또한 이러한 3개 이상의 당이 혼재되어 있는 혼합 단당으로 구성된다.
종래와 같이 우유로부터 유래한 부산물은 대부분의 당이 유당(Lactose)만으로 구성되어 있기 때문에, 이들 원료를 가수분해하였을 경우 글루코오스와 갈락토스의 혼합 단당을 일차적으로 손쉽게 얻을 수 있으며, 이는 발달된 크로마토그래피를 통하여 경제적으로 분리할 수 있다.
그러나, 본 발명에서와 같이 3개 이상의 당을 함유하는 당액을 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 것은 선택적인 조건을 충족시키지 않는 한 경제적으로 수행하기가 상당히 어려우며, 이러한 이유에서 유당을 제외한 다른 원료를 이용하여 갈락토스 내지는 타가토스를 경제적으로 생산하기는 상당히 어려운 상황이다.
일반적으로, 크로마토그래피법에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행되고 있으며, 특히 식품 용도로 사용할 수 있는 크로마토그래피 분리법에 사용할 수 있는 금속 이온 잔기는 K, Na, Ca, Mg 등으로 한정되어 있는 실정이다.
글루코오스 및 갈락토스는 알도스(aldose) 체로 구성된 물리적으로 상당히 유사한 구조를 가지는 당이며, 프룩토오스는 케토오스(ketose) 체로 구성된 당이다. 일반적으로 알도스체와 케토오스체로 구성된 혼합당의 분리는 양이온 잔기를 가진 수지를 이용한 크로마토그래피법으로 경제적으로 분리가 가능하며, 이는 전분당 공정에서 실제로 널리 사용되고 있다. 그러나 같은 알도스체인 글루코오스와 갈락토스는 그 물리적 형태가 유사함에 따라 K, Na 와 같은 잔기를 가진 별도의 수지를 사용하여야만 경제적 분리가 가능하다. 이는 기본적으로 두 개의 개별적인 크로마토그래피 설비를 순차적으로 결합하였을 때에만 갈락토스를 순수 분리할 수 있음을 나타낸다. 이는 도 1에서 설명하였다. 또한, 일반적으로 혼합당의 크로마토그래피 분리는 많은 양의 물을 사용하기에 공정에서의 농축 비용이 상승될 뿐 아니라, 고가의 설비 투자를 요구한다.
본 발명의 가수분해에 사용되는 효소는 알파-갈락토시다아제(α-galactosidase)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인버타아제(invertase)를 포함하지 않는 알파-갈락토시다아제일 수 있다.
상기 알파-갈락토시다아제는 자연계에 존재하는 당 분해 효소로서 라피노오스 또는 스타키노오스를 구성하고 있는 수크로오스와 갈락토스 사이의 알파-1,4 결합을 선택적으로 절단하여, 대두 유청 또는 대두 올리고당으로부터 수크로오스 및 갈락토스를 주성분으로 한 당액을 조제할 수 있다.
그러나, 일반적으로 산업적으로 사용할 수 있는 효소의 생산시에는 그 효소를 생산하는 미생물 또는 균사체를 배양하여 상등액을 효소 제조 원료로서 사용하므로, 이들 대부분은 대표적인 당 가수분해 효소인 인버타아제를 같이 포함하고 있다. 본 발명에서는 크로마토그래피의 용이성을 위하여 수크로오스와 갈락토오스로의 선택적 가수분해가 필수적이므로, 인버타아제를 포함하지 않는 알파-갈락토시다아제를 사용하는 것이 크로마토그래피를 이용한 분리를 더욱 용이하게 한다.
상기 알파-갈락토시다아제는 인버타아제 유전자를 그 안에 가지고 있지 아니한 균주로부터 유래된 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 알파-갈락토시다아제는 모티에렐라 비나세애 라피노세우틸라이저 ATCC 20034(Mortierella vinaceae var. 라피노오스utilizer ATCC 20034) 또는 앱시디아 그리세올라 ATCC 20431(Absidia griseola ATCC 20431)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명은 대두 올리고당을 알파-갈락토시다아제로 가수분해하여 수득된 수크로오스 및 갈락토스를 함유한 당액을 선택적으로 수크로오스 결정화 전처리를 더 하여 수크로오스 함량이 감소된 당액을 수득하였다. 대두 올리고당은 과량의 수크로오스를 함유하고 있기 때문에, 크로마토그래피 분리시 당액 부피의 증가, 설비 규모의 증가, 소모 정제수의 증가등의 바람직하지 않은 영향을 미치므로, 상기 수크로오스 결정화 전처리는 공정의 유틸리티를 감소시킨다.
본 발명은 상기와 같이 알파-갈락토시다아제를 사용하여 선택적으로 가수분해된 당액을 이용하여 갈락토스 내지는 타가토스를 경제적으로 생산하는 기술을 완성하였으며, 본 발명에서 수득된 갈락토스를 타가토스로 전환시키기 위하여 아라비노스 이성화효소를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 썰포로버스 속 (Sulfurobus sp.), 써모토가 속 (Thermotoga sp.) 또는 지오바실러스 속 (Geobacillus sp.) 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소를 사용할 수 있다. 더욱 바람직 하게는 써모토가 네아폴리타나 DMS2068 (Thermotoga neapolitana DSM5068) 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 가수분해 및 이성질화를 통하여 수득된 수크로오스, 갈락토스 및 타가토스를 함유하는 혼합당으로 구성된 당액을 크로마토그래피 분리법을 이용하여 분리한다. 더욱 바람직하게는, 크로마토그래피 3상 분리법을 이용한다.
이성화 반응과 같은 가역 반응은 일반적으로 경제적인 조업 조건에서 이론적으로 상 평형 상태가 존재하며, 이론적으로 모든 기질이 산출물로 전환되기는 불가능하다. 따라서 이러한 류의 당 공정에는 크로마토그래피법 등을 이용한 미반응물의 경제적 분리 및 재순환이 필요하며, 이 생산 기술의 또다른 핵심은 크로마토그래피법의 경제적 수행 가능성에 있다.
상기 크로마토그래피 분리에서 당액 분리용 수지는 Ca 잔기를 가진 수지를 이용할 수 있다.
크로마토그래피 분리 단계에서 미반응물의 재순환은 당액의 종류에 따라 다음과 같이 당업자들이 필요에 따라 임의적으로 선택하는 것이 가능하다.
타가토스를 주성분(90% 이상)으로 함유한 당액의 경우에는, 타가토스를 농축한 후 필요에 따라 결정화하는 단계로 이루어질 수 있다.
갈락토스를 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 당액 내의 성분 함량비에 따라 선택적으로 이성화 반응 앞 단계 또는 결정화 반응 앞 단계로 재순환시킬 수 있다.
수크로오스를 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 농축 또는 결정화를 거쳐 가공처리함으로써 설탕액으로 사용하거나 다른 생산 원료로서 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 크로마토그래피 분리를 통한 갈락토스 내지는 타가토스의 수득이 경제적으로 가능한 원료를 확보하기 위하여 산업 부산물 내 당 성분 분석 및 평가를 수행하였다. 그렇게 하여 선정된 대두 유청 또는 대두 올리고당의 알파-갈락토시다아제를 이용한 선택적 가수분해를 통하여 가수분해 당화액을 조제 하였으며, 이 가수분해 당화액으로부터 갈락토스 내지는 타가토스를 순수 분리할 수 있는 경제적 생산 기술을 개발하였다. 특히 본 발명에는 연속 재순환 방식을 공정에 도입함으로 한 단계 발전된 고수율의 경제적 생산 기술을 완성하였다.
이에 본 연구에서는 소재 가공 공정의 부산물로 쉽게 수득할 수 있으며, 그 주성분이 탄수화물로 구성되어 있는 원료를 경제적 타가토스 생산 원료로서 일차 선정하고, 이들에 포함되어 있는 탄수화물 성분, 특히 수용액 상태에 함유되어 있는 수용성 당 성분 (단당, 이당, 올리고당류 포함)의 성분 및 함량을 상세 분석하였으며, 이로부터 효소 등을 이용한 선택적 가수분해를 통하여 크로마토그래피 분리가 용이한 조성물의 형태로의 이용 가능성을 판단하였다.
이러한 연구의 결과를 통하여, 대두 분리 단백 부산물인 대두 유청 및 그로부터 유래된 수용성 당액 내지는 대두 올리고당이 다른 원료에 비하여 경제적으로 갈락토스 내지는 타가토스를 경제적으로 순수 분리하는데 우수한 조성을 가지고 있음을 알았으며, 이를 원료로 한 타가토스 생산 공법의 완성을 본 발명을 통하여 기술적으로 완성하였다.
실시예 1. 산업 부산물 내 당 조성 분석
현재 시판되고 있는 대두 올리고당을 중국 시장에서 수집하여 표본 샘플로 사용하였다. 이렇게 얻어진 대두 올리고당 내의 탄수화물 성분 분석을 위하여 HPLC를 수행하였다. 컬럼은 수펠코-PB 분리 컬럼(Supelco-PB sugar separation column; SUPELCO)를 사용하였으며, 분석 조건은 0.5 ml/min으로 정제수를 이동상으로 하여 수행하였다. 표준 용액은 각각 HPLC 등급 시약(HPLC grade reagent; Sigma) 을 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.
대두 올리고당 조성
당 체류시간 [분] 조성물 [건조 고형 베이스, 중량 %]
스타키오스 12.549 51.7
라피노오스 13.441 21.8
수크로오스 14.384 11.9
글루코스 16.919 3.7
갈락토스 19.783 6.3
프룩토오스 23.206 4.6
대두 올리고당 내 탄수화물의 조성의 경우, 라피노오스 및 스타키오스의 함량비는 전체 탄수화물의 73.5%를 구성하고 있었으며, 수크로오스와 프룩토오스가 기타 잔당으로 26.5% 정도를 차지하고 있었다. 도 2는 이때의 HPLC 분석 크로마토그램이다.
실시예 2. 대두 올리고당 당 함량 분석 및 효소 가수분해 반응 후 분석
실시예 1에서의 대두 올리고당을 알파-갈락토시다아제 효소로 처리하여 갈락토스 공급원으로 사용하고자 하였다. 사용된 효소는 발리다아제(Validase AGS; Valley Research, US)였으며, 기질인 대두 올리고당 제품 대비 효소의 사용량은 각각 0.15% (w/w)였으며, 온도 50℃에서 150rpm으로 교반시켜 가수분해시켰다. 시간에 따라 알파-갈락토시다아제의 가수분해에 따른 갈락토스 생성 및 당 성분 변화를 도 3에 나타내었다.
발리다아제의 경우, 대두 올리고당인 스타키오스를 분해하여 라피노오스와 갈락토스를 생성하였으며, 생성된 라피노오스를 다시 수크로오스와 갈락토스로 분해하는 경향을 보였다. 발리다아제는 주성분이 알파-갈락토시다아제로서, 사료 내에 첨가하여 대두 올리고당을 분해시켜 대두 올리고당의 섭취로 인해 유발되는 설사, 복통 등의 부작용을 줄이는데 사용되는 제품이다.
도 3에서와 같이, 제품 내 알파-갈락토시다아제 효소는 대두 올리고당 내의 갈락토스-갈락토스 결합 및 갈락토스-수크로오스 결합을 선택적으로 가수분해하는 작용을 하나, 수크로오스를 분해하여 글루코스, 프룩토오스를 생성하는 인버타아제의 작용도 확인되었다.
수크로오스가 24시간 이후에는 잔존하지 않으나 글루코스와 프룩토오스는 계속 생성되는 특이한 현상을 보였으며, 이는 스타키오스, 라피노오스의 분해로 생성된 수크로오스가 발리다아제 내의 인버타아제의 작용으로 인해 분해되어 계속 글루코스와 프룩토오스가 생성되는 결과에서 유추할 수 있었다. 가수분해 반응이 시작된 후, 50시간 이후에는 갈락토스, 프룩토오스 및 글루코스가 더 이상 생성되지 않는 현상을 보였으며, 이 때의 당 조성을 표 3에 나타내었다.
발리다아제에 의한 대두 올리고당 액의 조성
당 조성물 [건조 고형 베이스, %]
스타키오스 0
라피노오스 3.8
수크로오스 0
글루코스 28.4
갈락토스 45
프룩토오스 22.8
실시예 3. 인버타아제를 함유하지 않는 알파- 갈락토시다아제
앞서 기술된 바와 같이, 크로마토그래피의 용이성을 위하여 효소를 사용하여 수크로오스와 갈락토스로의 선택적 가수분해가 경제적 타가토스 생산에 있어 필수적이므로, 알파-갈락토시다아제를 사용하여 라피노오스 내지는 스타키오스를 구성하고 있는 수크로오스와 갈락토스 사이의 알파-1,4 결합을 선택적으로 절단하는 기술이 필요하다.
그러나, 일반적으로 산업적으로 사용할 수 있는 수준의 효소 생산은 대부분 원하는 효소를 과량으로 세포 외 분비할 수 있는 미생물 혹은 균사체를 선별하고, 이를 액체 혹은 고체에서 배양하여 그 상등액을 효소 조제의 원료로서 사용하여 생산된다. 알파-갈락토시다아제도 마찬가지로 산업적 용도로 판매, 유통되고 있는 효소류는 대부분 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ) 등의 균사체 배양 상등액을 그 효소 조제의 원료로서 사용하고 있으며, 이들 대부분은 인버타아제를 그 효소액에 같이 포함하고 있다.
인버타아제는 자연계에 존재하는 대부분의 생물들이 가지고 있는 대표적인 당 가수분해 효소로서, 수크로오스 등을 쉽게 가수분해하는 효소적 특징을 가지고 있다. 그리하여 효소액에 포함되어 있는 인버타아제는 당액 내에 존재하는 수크로오스를 글루코스와 프룩토오스로 빠르게 가수분해하는 특성을 부여하며, 이는 타가토스의 경제적 생산을 방해하는 중요한 요인으로서 작용한다.
따라서, 본 발명자들은 자연계에 존재하는 미생물 또는 균사체 중, 알파-갈락토시다아제를 생산하는 균체들의 인버타아제 생산 유무를 자세히 조사하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
인버타아제 생산 유무
알파-갈락토시다아제 인버타아제
Aspergillus niger O O
Aspergillus oryzae O
Aspergillus oryzae d- Aspergillusniger O
Mortierelialla vinaceavar. Raffinose utilizer O
Absidia griseola O
Saccharomyces carlsbergensis O O
Saccharomyces cerevisiae d- Guar seed O O
Bacillus subtilis O
Kluyveromyces fragilis O
본 연구에서는 인버타아제를 생산하지 않고, 알파-갈락토시다아제만을 생산하는 모티에렐라 비나세애 라피노세우틸라이저 또는 앱시디아 그리세올라의 배양 균사체를 가수분해 효소로서 사용하였다.
본 연구에 사용된 인버타아제를 포함하지 않는 알파-갈락토시다아제는 유전자은행(ATCC)에서 분양받은 곰팡이인 모티에렐라 비나세애 라피노세우틸라이저 (Mortierella vinaceae var. raffinose utilizer ) ATCC20034, 앱시디아 그리세올라(Absidia griseola ) ATCC20431을 사용하였다.
이들 균주의 배양 배지 조성은 0.1M 인산 버퍼(pH6.0), 유당 10g/l, 펩톤 3 g/l, 효모 추출물 3g/l, 염화칼륨 0.5 g/l, 황산마그네슘 0.5 g/l, 황산제1철 약간 이다. 30℃에서 3일간 배양한 후 배양액을 여과시스템 (CORNING, BOTTLE and BOTTLE TOP FILTERS)을 이용하여 각각의 균만을 모았다. 수집된 균을 얼음에 박아 10분간 호모게나이저를 이용하여 파쇄하고, 10000 rpm 속도로 10분간 원심분리기를 이용하여 상등액을 취하여 최종 효소액을 얻었다.
대두 올리고당 당을 상기 수득된 효소액을 이용하여 효소 가수분해를 실시하였다. 가수분해 반응 조건은 40℃에서 7시간 진행하였다. 당 함량 알아보기 위해 HPLC 분석(SUPELCO, SUPELCOGEL Pb HPLC Column)을 하였다. 그 결과 각각의 인버타아제를 포함하지 않은 알파-갈락토시다아제를 이용한 선택적 가수분해에 의하여 대두 올리고당이 선택적으로 가수분해되어 수크로오스와 갈락토스로 분해되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이를 도 4에 나타내었다.
실시예 4. L- 아라비노스 이성화효소를 이용한 갈락토스의 타가토스로의 이성화 전환 반응
본 발명의 갈락토스로부터 타가토스로의 이성화 반응은 본 연구팀이 기 확보하고 있는 초고온균 유래의 아라비노스 이성화 효소를 코리네박테리움 숙주 내에 발현한 균주인 고도호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소 (arabinose isomerase)를 사용하여 달성하였다.
상기 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pCJ-1 및 pCJ-7(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0068505)에 각각 삽입하여 최종적으로 숙주인 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032 (Corynebacterium glutamicum KCTC 13032)을 얻었다. 상기 내열성 효소를 발현시킨 균주를 20 % (w/v) 농도로 2.0 % 의 소디움 알지네이트(sodium alginate) 용액에 혼합 후 교반하여 현탁용액을 조제하였으며, 이를 자연 낙하 방식으로 0.1 M CaCl2 용액에 떨어뜨려 경화 반응을 유도하였다. 이렇게 하여 조제된 균체 포집 알지네이트 경화 비드를 고정화 반응에 사용하였다. 기질로서는 반응 결과물로 얻어진 당액에 20 mM Tris-HCl pH 7.5 버퍼를 첨가하여 pH 를 조절한 후 반응 기질 용액으로 사용하였다.
상기로부터 얻어진 아라비노스 이성화효소를 이성화 반응에 사용하여 이성화 산출물을 얻었다.
실시예 5. 가수분해된 혼합 단당의 크로마토그래피 분리 패턴 분석
상기 실시예에 의하여 수득된 이성화 산출물(혼합 단당)을 이용한 갈락토스의 크로마토그래피 분리법을 설계하기 위하여, 혼합 당의 크로마토그래피 분리 패턴 분석을 수행하였다.
혼합 단당의 크로마토그래피 분리를 위하여, 다음과 같은 물질 및 설비를 사용하여 실험을 수행하였다. 당 분리용 수지는 FINEX MFG220 Ca++ (FINEX)를 사용하였으며, 이동상으로는 정제된 3차 수를 사용하여 60℃ 온도 하에서 11 ml/min 유속으로 조업하였다. 컬럼은 XK50/100 컬럼 (Ammersham Bioscience, USA)을 2개 직렬 연결하여 사용하였으며, 각 컬럼내 수지를 1900 ml으로 충진하여 사용하였다. 분리를 위하여 투여되는 혼합당은 50 Bx 농도의 당액을 일회당 160 ml 사용하였다. 사용한 혼합 단당의 구성은 일차적으로 수크로오스 : 갈락토스를 80 : 20의 혼합 당액을 사용하였으며, 이차로 갈락토스 : 타가토스를 50 : 50 으로 임의 조정하여 시험 샘플로 사용하여 그 분해 패턴을 분석하였다. 실험의 결과, 수크로오스와 갈락토스, 그리고 타가토스는 서로 일정한 간격을 두고 쉽게 분리될 수 있음을 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
실시예 6. 타가토스 결정화
실시예 5의 크로마토그래피 분리로 회수된 용액을 사용하여 타가토스의 결정화를 시도하였다. 타가토스 최종 함량이 90%인 분획 부분을 회수하였으며, 결정기에서 당농도가 70 Bx로 되도록 진공, 가열 농축하였다. 온도를 50℃까지 냉각하고, 시간당 2℃ 씩 서서히 냉각하였으며, 40℃에서 타가토스 시드(seed)를 첨가하여 육정시켰다.
타가토스의 결정화가 진행됨에 따라 상대적으로 상등액 내의 당 농도가 희석되는 현상이 관찰되었으며, 희석되는 상등액의 농도를 일정하게 유지하기 위하여, 진공 농축을 결정화 반응 중에 지속 수행하였다. 결정화 반응 중 반응 상등액의 농도가 65 Bx 이상으로 일정하게 유지하여 결정의 생성, 육정을 유지하였다.
결정은 20시간 이후 중단하였으며, 원심분리기를 이용하여 상등액과 결정을 분리하였다. 초기 결정액 중 타가토스는 71%를 회수하였으며, 순도는 90%에서 98% 이상 정제되어 생산되었다. 원심분리에 의해 분리된 타가토스는 다시 진공건조기를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 건조하였다. 이 때 생성된 타가토스 결정을 현미경으로 관찰한 사진이 도 6 이며, 시판 중인 수크로오스와 비교하여 그 모양과 크기를 비교하였다.
실시예 7. 크로마토그래피 분리 기술을 이용한 대두 유청 가수분해물로부터 타가토스의 연속 재순환 생산 공정 설계
상기 실시예 등을 통하여 확인된 대두 유청 부산물 혹은 대두 올리고당을 원료로 한 타가토스의 생산 공정을 아래와 같이 설계하였으며, 이를 도 7에 간략한 도식으로 설명하였다. 아래 단계 중, 탈색, 탈염등의 제품 품질 향상을 위한 단위 공정은 별도로 삽입하지 않았으며, 이는 공정 중의 품질 변화에 따라 선택적으로 삽입/배제할 수 있다.
1. 대두 유청 부산물로부터 한외여과, 정밀여과 등을 통하여 전처리 후 대두 올리고당을 분리하는 단계
2. 대두 올리고당액 (농도 10 ~ 50 %) 을 높거나 낮은 온도에서 (고온균 유래의 혹은 곰팡이 유래의 효소 사용시) 가수 분해하는 단계
3. 가수분해된 수크로오스와 갈락토스를 크로마토그래피 분리하는 단계. 공정 중의 당 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제할 수 있다.
4. 갈락토스를 주성분 (50% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액을 L-아라비노스 이성화효소(혹은 L-갈락토스 아이소머라아제) 반응기를 통과하여 타가토스를 생산하는 단계
5. 갈락토스와 타가토스, 그리고 소량의 혼합당으로 구성된 이성화 산출물을 크로마토그래피 분리하는 단계. 공정 중의 당 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제할 수 있다.
6. 타가토스를 주성분 (70% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액을 농축하고 (필요시) 결정화하는 단계
7. 갈락토스를 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액을 이성화 반응기 앞으로 재순환시키는 단계
8. 타가토스의 결정화 단계에서 수득되는 비결정 모액을 당액 내 조성분에 따라 결정화 전단계 혹은 이성화 전단계로 재순환시키는 단계
실시예 8. 혼합 단당의 3상 분리
전체 공정의 물질 균형에 포함되는 모든 당을 혼합 형태로 1 패스 테스트(1 pass test)를 수행하였으며, 이 결과는 크로마토그래피 분리 기술을 이용한 연속 재순환 생산 공정 설계 시뮬레이션에 활용하였다.
1 패스 테스트가 혼합 당을 사용하여 수행되었으며, 이 결과로부터 기초 매개 변수를 계산하였다. 새로운 시뮬레이티드 무빙-베드 시스템(New Simulated Moving-bed System; Organo, Japan) 방법을 사용하여 컴퓨터로 각 성분의 농도 프로파일을 모의 실험하고, 성분의 순도 및 각 분획에 대한 회복 속도(recovery rate)를 계산하였다. 유출액(effluent liquid)은 각각의 분획으로 분리되었다. 각 분획을 HPLC로 분석하고, 분석 결과로부터 각 성분의 용출 곡선을 만들었다. 각 용출 패턴을 실험하고, 각 성분의 기초 매개변수(parameters)를 계산하였다. 1 패스 테스트 조건을 표 5에 나타내었다. 분획의 분석 방법은 표 6에 나타내었다. HPLC 분석 조건은 표 7에 나타내었다.
1 패스 테스트 조건
샘플 혼합 단당 샘플
수크로오스: 73.93 %, 기타-2: 0.51 %
갈락토스 : 12.62 %, 기타-3: 0.39 %
타가토스 : 12.56 %
공급하는 시럽의 농도 Bx. 60 %
흡착제 앰버라이트
(Amberlite CR-1310; Ca-type, New resin)
컬럼 사이즈 20 mm x 1000 mm (314 ml)
탈착제 H2O
공급 부피 15 ml
유속 26 ml/min (LV5m/h)
온도 60 ℃
분석 방법
Brix: 농도
(g/100g)		 굴절계: RA-50 (Kyoto Electronics)
단당류 조성물 HPLC: VP 시리즈(Shimadzu Corp.)
HPLC 분석 조건
컬럼 TSK-GEL SCX-Ca (6.0 x L150 x 5 cloumn)
탈착제 H2O
유속 0.8 ml/min
공급 부피 10 μl
온도 70 ℃
농도 측정 기기 서로 다른 굴절 인덱스 미터(Index meter)
1 패스 테스트로부터 얻은 용출 곡선을 도 8에 나타내었다.
기초 매개변수를 용출 곡선의 결과로부터 계산하고, 분리 성능(separation performance)를 계산하기 위하여 컴퓨터 시뮬레이션을 실행하였다. 시뮬레이션의 조건을 표 8에 나타내었다. 최적 분리 성능값을 얻기 위하여, 상기 실험자는 당액 샘플과 이동상인 물의 비율 (탈착제/공급 부피율)을 변화시키며 그에 따른 통액 내 당 성분 분석을 실시하고, 이를 통하여 회수되는 구획 내 당의 성분별 회수율, 순도를 계산하였다. 시뮬레이션 결과의 요약은 표 9에 나타내었다. 표 9에서 케이스 6, 7, 8, 9는 시뮬레이션의 결과로부터 얻은 대차 대조표(mass balance sheets)이다. 각 시뮬레이션에서 타가토스는 목표로 하는 90%의 바람직한 순도를 달성하였다. 대표도로서 케이스 9의 시뮬레이션 결과의 상세도를 도 9에 표시하였다.
시뮬레이션 조건
조건 3상 분리
공급 시럽의 농도 Bx 60
목표 순도 타가토스 순도: 90 % 이상
결과 케이스 6 케이스 7 케이스 8 케이스 9
시뮬레이션 결과의 요약
조건 케이스 6 케이스 7 케이스 8 케이스 9
유속(L/L-R/hr) 0.0464 0.0469 0.0469 0.0446
탈착제/공급 부피율 4.93 4.91 5.31 5.13
타가토스 순도 (%) 95.2 93.6 96.0 97.2
타가토스 회수율(%) 87.8 91.1 81.7 93.0
갈락토스 순도 (%) 74.3 76.3 63.7 77.8
갈락토스 회수율(%) 88.5 86.0 98.3 92.7
이 실시예에서 언급된 성능은 오가노 컴퓨터 시뮬레이션에서의 계산 결과이다.
실시예 9. 혼합 단당에서의 L- 아라비노스 이성화효소의 반응 안정성
본 특허에서 제안되는 3상 크로마토그래피를 이용한 경제적 타가토스의 생산 공정은 지금까지 수행되었던 갈락토스로부터 타가토스로의 이성화 반응과는 달리, 그 기질 용액 조성의 많은 부분을 갈락토스 이외의 당 (글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스)이 차지하고 있다. 따라서, 이렇게 포함되어 있는 다른 당들이 효소를 이용한 이성화 반응을 저해하는지의 여부가 본 기술 도입의 중요한 전제 조건으로 작용된다. 본 실시예에서는 본 연구팀이 사용하고 있는 이성화 효소를 사용함에 있어서 혼합 단당 조성액에서의 갈락토스 이성화 반응의 기질 특이성을 밝히고자 하였다.
각각의 기질 용액은 100 g/L 농도의 갈락토스 용액에 수크로오스, 글루코오스, 프룩토오스를 일정 비례로 첨가하여 조제하였으며, 그 당 성분별 조성비는 (a) Suc : Glu : Gal : Fru = 0 : 0 : 1 : 0, (b) Suc : Glu : Gal : Fru = 3 : 1 : 1 : 1, (c) Suc : Glu : Gal : Fru = 0 : 3 : 1 : 2 와 같다. 각각의 당 성분비는 (a) 대조군으로서 갈락토스만을 함유하고 있는 경우, (b) 올리고당내 갈락토스간 1,4-결합의 선택적 가수분해 수행한 경우, (c) 완전 가수분해로 단당으로 전부 분해된 경우의 당 성분 결과비와 유사 수준으로 임의 조제하여 사용하였다.
갈락토스 이성화 반응은 발현 배지에서 생육한 기탁균주 (CJ-1-TNAI, 수탁번호 KCCM10786P) 팰렛을 10 % (w/v) 농도로 기질 혼합액에 첨가하고, 70℃에서 1시간 반응하여 수행하였다. 반응이 끝난 혼합액은 4℃에서 15분간 냉각한 후, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후, 상등액 만을 취하였다. 이렇게 하여 얻어진 상등액은 정제수로 5배 희석한 후, 0.45 μm 주사기 필터(Millipore, USA)를 거친 후 HPLC 분석하였다.
혼합 단당 조성액에서의 이성화 반응 결과물 내의 당 농도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과는 도 10에 나타난 바와 같았으며, 이를 각 당의 표준 용액으로 정량화한 결과는 표 10에 나타난 바와 같다.
분류 당 조성물
수크로오스 글루코스 갈락토스 프룩토오스 타가토스
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
(a) 대조군 0 0 13.4 0 5.9
(b) 조건 1 54.7 21.3 13.5 0 6.0
(c) 조건 2 0 60.4 13.7 37.2 6.0
이 결과에 따르면, 상당량의 수크로오스, 글루코스, 프룩토오스가 혼합되어 있는 혼합 당액 내에서도 갈락토스 이성화 반응은 그 반응속도에 영향을 받지 않고, 동일 수준 (본 실험에서 동등 수준인 30.8 % 도달하였음)의 전환률을 얻었음을 알 수 있다. 따라서 적어도 대두 올리고당 유래의 원료 가수분해물로부터 얻어지는 글루코스, 프룩토오스, 수크로오스는 효소를 이용한 갈락토스 이성화 반응 수행에 있어 반응 저해 요인으로 작용하지 않음을 알 수 있었다.
실시예 10. 3상 분리 기술을 이용한 대두 유청 가수분해물로부터 타가토스의 연속 재순환 생산 공정 설계
상기 실시예 6에서 설계된 타가토스의 생산 공정은 두 번의 크로마토그래피를 사용하며, 이는 많은 양의 정제수와 농축을 필요로 하는 공정이다. 본 연구에서는 이를 효율적으로 극복하기 위하여 진보된 크로마토그래피 설계를 통하여 한 번의 크로마토그래피를 사용하여 타가토스를 생산할 수 있는 방법을 설계하였으며, 이는 상기 실시예에서 구체적으로 실증하였다.
단일 크로마토그래피를 사용한 타가토스의 생산 공정을 아래와 같이 설계하였으며, 이를 도 11에서 간략한 도식으로 설명하였다. 아래 단계 중, 탈색, 탈염등의 제품 품질 향상을 위한 단위 공정은 별도로 삽입하지 않았으며, 이는 공정 중의 품질 변화에 따라 선택적으로 삽입/배제할 수 있다.
1. 대두 유청 부산물로부터 한외여과, 정밀여과 등을 통하여 전처리 후 대두 올리고당을 분리하는 단계
2.대두 올리고당액 (농도 10 ~ 50 %) 을 높거나 낮은 온도에서 (고온균 유래의 혹은 곰팡이 유래의 효소 사용시) 가수 분해하는 단계
3. 수크로오스와 갈락토스를 주성분 (합계 90 % 이상) 으로 함유한 가수분해된 당액을 L-아라비노스 이성화효소(혹은 L-갈락토스 이성화효소) 반응기를 통과하여 갈락토스를 타가토스로 이성화하는 단계
4. 수크로오스와 갈락토스, 그리고 타가토스를 그 주성분으로 하는 (3개 요소가 전체의 90% 이상) 혼합당으로 구성된 이성화 반응액을 크로마토그래피로 3상으로 분리하는 단계. 공정 중의 당 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제할 수 있다. 이로부터 유래된 크로마토그래피 당 분리액은 3종류로,
A. 타가토스를 주성분 (90% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액으로, 농축하고 (필요시) 결정화하는 단계로 이어질 수 있다.
B. 갈락토스를 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액으로, 당내 성분의 함량비에 따라 선택적으로 이성화 반응기 앞 혹은 결정화 앞단계로 재순환시킬 수 있다.
C. 수크로오스를 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액으로, 이는 수크로오스액으로의 사용을 위한 농축, 결정화 등의 후처리 단계를 거쳐 가공처리 하거나, 혹은 더 진보된 다른 생산 원료로서 사용할 수 있다.
5. 타가토스의 결정화 단계에서 수득되는 비결정 모액을 당액 내 조성분에 따라 결정화 전단계 혹은 이성화 전단계로 재순환시키는 단계
실시예 11. 수크로오스 결정화 전처리를 이용한 대두 유청 가수분해물로부터 타가토스의 연속 재순환 생산 공정 설계
상기 설계된 한 번의 크로마토그래피를 사용하여 타가토스를 생산할 수 있는 방법에 진일보하여, 수크로오스 결정화 공정을 통하여 당액 내 수크로오스량을 절감하여 공정 유틸리티를 감소시키는 설계를 하였다.
대두올리고당은 특히 그 구성 성분으로 과량의 수크로오스를 함유하고 있으며, 이는 크로마토그래피 분리시의 당액 부피의 증가, 설비 규모의 증가, 소모 정제수의 증가 등 바람직하지 않은 영향을 미친다.
이에 수크로오스 결정화 단계를 전처리 단계로 포함하는 단일 크로마토그래피를 사용한 타가토스의 생산 공정을 아래와 같이 설계하였으며, 이는 도 12에서 간략한 도식으로 설명하였다. 아래 단계 중, 탈색, 탈염등의 제품 품질 향상을 위한 단위 공정은 별도로 삽입하지 않았으며, 이는 공정 중의 품질 변화에 따라 선택적으로 삽입/배제할 수 있다.
1. 대두 유청 부산물로부터 한외여과, 정밀여과 등을 통하여 전처리 후 대두 올리고당을 분리하는 단계
2. 대두 올리고당액 (농도 10 ~ 50 %) 을 높거나 낮은 온도에서 (고온균 유래의 혹은 곰팡이 유래의 효소 사용시) 가수 분해하는 단계
3. 가수분해된 올리고당액 내 수크로오스를 결정화를 통하여 더욱 증가된 함량비의 갈락토스를 포함하는 당액을 수득하는 단계
4. 수크로오스와 갈락토스를 주성분 (합계 90 % 이상) 으로 함유한 가수분해된 당액을 L-아라비노스 이성화효소(혹은 L-갈락토스 이성화효소) 반응기를 통과하여 갈락토스를 타가토스로 이성화하는 단계
5. 수크로오스와 갈락토스, 그리고 타가토스를 그 주성분으로 하는 (3개 요소가 전체의 90% 이상) 혼합당으로 구성된 이성화 반응액을 크로마토그래피로 3상으로 분리하는 단계. 공정 중의 당 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제할 수 있다. 이로부터 유래된 크로마토그래피 당 분리액은 3종류로,
A. 타가토스를 주성분 (90% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액으로, 농축하고 (필요시) 결정화하는 단계로 이어질 수 있다.
B. 갈락토스를 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액으로, 당내 성분의 함량비에 따라 선택적으로 이성화 반응기 앞 혹은 결정화 앞단계로 재순환시킬 수 있다.
C. 수크로오스를 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액으로, 이는 수크로오스액으로의 사용을 위한 농축, 결정화 등의 후처리 단계를 거쳐 가공처리 하거나, 혹은 더 진보된 다른 생산 원료로서 사용할 수 있다.
6. 타가토스의 결정화 단계에서 수득되는 비결정 모액을 당액 내 조성분에 따라 결정화 전단계 혹은 이성화 전단계로 재순환시키는 단계.
도 1은 혼합 단당액의 순수 크로마토그래피 분리 방법 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 대두 올리고당 내 당 함량 분석 HPLC 분석 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 3은 대두 올리고당의 성분 분석 및 가수분해 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인버타아제를 포함하지 않은 알파-갈락토시다아제 처리 대두 올리고당의 당 성분 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 가수분해된 혼합 단당의 크로마토그래피 분리 패턴 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 생성된 타가토스 결정을 현미경으로 관찰하여 시판 중인 수크로오스와 그 모양과 크기를 비교한 것이다. (a : 수크로오스 , b : 타가토스)
도 7은 대두 유청 부산물 혹은 대두 올리고당을 원료로 한 타가토스의 생산 공정을 나타낸 것이다.
도 8은 1 패스 테스트로부터 얻은 용출 곡선을 나타낸 것이다.
도 9는 케이스 9(3상 분리)의 시뮬레이션 결과의 상세도를 나타낸 것이다.
도 10은 혼합 단당 조성액에서의 이성화 반응 결과물 내의 당 농도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 단일 크로마토그래피를 사용한 타가토스의 생산 공정을 간략한 도식으로 나타낸 것이다.
도 12는 수크로오스 결정화 단계를 전처리 단계로 포함하는 단일 크로마토그래피를 사용한 타가토스의 생산 공정을 간략한 도식으로 나타낸 것이다.

Claims (17)

  1. a. 대두 유청 부산물로부터 대두 올리고당을 분리하는 단계;
    b. 상기 대두 올리고당을 인버타아제를 포함하지 않는 알파-갈락토시다아제(inveratase free α-galactosidase)로 가수분해하는 단계;
    c. 상기 가수분해된 당액을 아라비노스 이성화효소로 이성질화시켜 수크로오스, 갈락토스 및 타가토스를 주성분으로 하는 혼합당으로 구성된 이성화 산출물을 수득하는 단계; 및
    d. 상기 이성화 반응액을 단일 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 타가토스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계 후 가수분해된 대두 올리고당으로부터 수크로오스 결정화 공정을 통해 수크로오스량이 감소된 당액을 수득하는 단계를 더 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 d) 단계 후 미반응 갈락토오스를 공정 중에서 재순환시키는 단계를 더 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미반응 갈락토오스는 크로마토그래피에 의해 분리되어 단계 b) 또는 단계 c)로 재순환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 대두 유청 부산물은 한외여과(ultrafiltraion) 또는 정밀여과(microfiltration)로 전처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 대두 올리고당은 농도 10 ~ 50%인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가수분해는 40℃ ~ 80℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 알파-갈락토시다아제는 모티에렐라 비나세애 라피노세우틸라이저 ATCC 20034(Mortierella vinaceae var . rafinoseutilizer ATCC 20034) 또는 앱시디아 그리세올라 ATCC 20431(Absidia griseola ATCC 20431)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 알파-갈락토시다아제는 수크로오스와 갈락토오스 사이의 알파-1,4 결합을 선택적으로 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    단계 b)의 가수분해에 의해 수크로오스 및 갈락토오스가 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 아라비노스 이성화효소는 호열성 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 이성화 반응액은 수크로오스, 갈락토오스 및 타가토스가 전체의 90% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서,
    단계 d)의 단일 크로마토그래피는 Ca 잔기를 가진 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    단계 b) 내지 c)의 반응이 하나의 반응기에서 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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