KR20180111679A - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 과당-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 {A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same}

본 출원은 과당-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

타가토스는 우유, 치즈, 카카오 등의 식품, 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며 GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 여러 제품 적용 시 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 대체 감미료로 이용될 수 있다.

종래 공지된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적(촉매 반응)방법과 생물학적(이성화 효소반응) 방법이 있다(PCT WO 2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격의 불안정성이 존재하여, 타가토스 생산 원료의 안정적 수급에 한계가 있다. 따라서, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 필요하여 연구된 바 상기 문헌들은 포도당과 갈락토스 및 과당으로부터 각각 갈락토스, 사이코스 및 타가토스를 생산하는 방법을 개시하고 있다(대한민국 등록특허 제10-744479호, 제10-1057873호 및 제10-1550796호).

한편, 타가토스-6-인산 키나아제(Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)는 아래 [반응식 1]에서와 같이, ATP 와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP 와 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있으나, 상기 타가토스-6-인산 키나아제가 과당(D-fructose)을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는지에 대한 보고는 전무하다.

[반응식 1]

ATP + D-타가토스 6-포스페이트

ADP + D-타가토스 1,6-바이포스페이트

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과 타가토스-6-인산 키나아제(Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)가 과당을 타가토스로 전환시키는 활성이 있음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

PCT WO 2006/058092 A2 대한민국 등록특허 제10-0964091호 (2010.06.08. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1368731 (2014.2.24. 등록) 대한민국 등록특허 제10-744479 (2007.7.25. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1057873 (2011.8.11. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1550796호 (2015.09.01. 등록)

Kim et al., Novel Activity of UDP-Galactose-4-Epimerase for Free Monosaccharide and Activity Improvement by Active Site-Saturation Mutagenesis, 2011, Appl Biochem Biotechnol, 163:444-451

본 출원의 일 목적은 타가토스 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-6-인산 키나아제, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.

본 출원의 다른 목적은 본원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 타가토스-6-인산 키나아제는 (Tagatose-6-phosphate kinase, EC 2.7.1.144)는 ATP 와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP와 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있는 것으로서, 예를 들어 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율(%)=타가토스 중량/초기 과당 중량 x100)이 0.01% 이상, 구체적으로 1% 이상, 더욱 구체적으로 1.5% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 1% 내지 30%의 범위, 1.5% 내지 25%의 범위, 또는 1.5% 내지 23%의 범위일 수 있다.

구체적으로 상기 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 하나 이상 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.

본원에 이르러 '타가토스-6-인산 키나아제'가 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 나타냄을 밝혀내었으며 따라서 본원에서는'과당-4-에피머화 효소'와 호환적으로 사용될 수 있다.

본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

일 구현예로 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 언에어로리네 sp. 유래 효소, 써모비피다 속(The genus of Thermobifida), 써모언에로박터 속(The genus of Thermoanaerobacter) 또는 그 변이체, 딕티오글로무스 속(The genus of Dictyoglomus) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있고, 구체적으로는, 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila), 언에어로리네 박테리움(Anaerolineae bacterium), 언에어로리네 써모리모사 (Anaerolinea thermolimosa), 써모비피다 할로톨레란스(Thermobifida halotolerans), 써모언에로박터 인디엔시스(Thermoanaerobacter indiensis) 또는 딕티오글로무스 써모필움(Dictyoglomus thermophilum) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있는 것으로 본원에서 타가토스-6-인산 키나아제(Tagatose-6-phosphate kinase)가 과당-4-에피머화 효소로서의 활성을 가짐을 밝혀내었다. 타가토스-6-인산 키나아제는 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 D-타가토스 1,6-바이포스페이트(D-tagatose 1,6-biphosphate)를 생산하는 것으로 알려져 있었다. 즉, 타가토스-6-인산 키나아제가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 새로이 밝혀냄으로써 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 타가토스-6-인산 키나아제를 과당-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-6-인산 키나아제의 신규 용도에 관한 것이다. 또한, 본 출원의 일 구현예는 타가토스-6-인산 키나아제를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 55℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 65℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.

나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 서열번호 1로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 3로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 5로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 7로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 9로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 11로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의해 각각 암호화되는 것일 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12의 뉴클레오티드로 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.

구체예에서, 이러한 형질전환된 균주로. E. coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E(이의 다른 이름은 E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1이다), E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E 이며, 이들은 각각 순서대로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11996P(기탁일: 2017년 3월 20일), KCCM12093P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12109P(기탁일: 2017년 9월 13일), KCCM12232P (기탁일: 2018년 3월 23일), KCCM12235P (기탁일: 2018년 3월 23일), KCCM12236P (기탁일: 2018년 3월 23일)로 기탁하였다. 본 출원에서 사용되는 과당-4-에피머화 효소는 이를 암호화하는 핵산을 이용하여 제공될 수 있다.

본 출원에서 용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).

본 출원의 핵산은 본 출원의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 과당-4-에피머화 효소와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 과당-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 염기서열과 각각 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 더불어, 본 출원의 핵산은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소로 번역될 수 있는 핵산을 포함할 수 있고, 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 역시 포함할 수 있음은 자명하다.

본 출원에서 사용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 핵산이 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 출원에서 이용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 예로는 E. coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E. E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E 가 있다.

본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-6-인산 키나아제를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 ℃ 내지 40 ℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 기질인 과당 이외에 다른 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

예를 들어 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;

포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;

타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물; 및/또는

α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 또는 이소아밀라아제(isoamylase); 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 마그네슘, 니켈, 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 MgCl₂, MgSO₄, NiSO₄, NiCl₂, MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원은 다른 양태로서, 과당(D-fructose)을 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

본 출원의 일 구현예로, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0, 온도는 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 9시간 내지 48시간 동안, 9시간 내지 36시간 동안, 9시간 내지 24시간 동안, 9시간 내지 12시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다.

본 출원의 타가토스 제조방법에 있어서, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물, 금속, 금속이온 및 금속염은 다른 양태에서 전술한 바와 같다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계의 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 타가토스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 과당의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성이 우수하며 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 높을 수율로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1은 본 출원의 일 실시예에 따른 형질전환체에서 생성되고 분리된 타가토스-6-인산 키나아제(CJ_ANT_F4E)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_ANT_F4E)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_ANT_F4E)의 과당-4-에피머화 활성에 있어서 온도 변화에 따른 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_AB_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 5는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_AB_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_AB_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_DT_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 나타냄을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 8은 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_DT_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 효소 CJ_DT_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_ANTA_F4E)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 11는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_TH_F4E)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 12는 본 출원의 일 실시예에서 제조된 타가토스-6-인산 키나아제 (CJ_TAI_F4E)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 기술함으로써 본 출원을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하며, 본 출원의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1 : 타가토스-6-인산 키나아제의 제조 및 그 활성 평가

실시예 1-1: 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 제공하기 위해 2종의 아네로리네아 써모필리아 (Anaerolinea thermophile)에서 유래한 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물(형질전환체)을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 아네로리네아 써모필리아 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하였고, 아네로리네아 써모필리아의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 염기 서열 (서열번호 2) 및 아미노산 서열 (서열번호 7)과 염기 서열 (서열번호 8)을 바탕으로 대장균 발현 가능 벡터인 pBT7-C-His에 삽입하여 제작된 재조합 발현벡터를 바이오니아에 합성 의뢰하였다. 재조합 발현벡터를 사용하기 위해, 아네로리네아 써모필리아의 Genomic DNA를 이용하여, 프라이머 1: ATATACATATGATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTG(서열번호 13) 과 프라이머 2: TGGTGCTCGAGCCCGCACGCCGCAGCGTAATCTTCCAG(서열번호 14)를 이용하여, PCR 조건은 94 ℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 신장을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 신장반응을 수행하였다.

단백질 발현을 유도하고자 대장균 발현용 균주인 BL21(DE3)에 형질 전환하였고, E. coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E 로 명명하였다. 부다페스트 조약 하에. E. coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E는 2017년 3월 20일에 기탁번호 KCCM11996P로 기탁되었고, E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E는 2018년 3월 23일에 기탁번호 KCCM12232P로 기탁되었다.

실시예 1-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

재조합 효소를 제조하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조된 형질전환체인 E.coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E 를 앰피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 액체배지 5ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB(Lysogeny broth)와 단백질발현조절인자인 락토스가 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 배양 과정 중의 교반속도는 180rpm이며, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 10mM 이미다졸(imidazole)과 300mM NaCl이 포함되어 있는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하였으며, 세포 파쇄물은 13,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액은 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고, 20mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 최종 250mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 흘려주어 용출 정제하였으며, 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석 후 효소 특성 분석을 위한 효소 2종(CJ_ANT_F4E, CJ_ANTA_F4E)을 확보하였다. 그 결과, 정제된 재조합 과당-4-에피머화 효소는 SDS-PAGE분석을 통하여 CJ_ANT_F4E가 약 47kDa인 것을 확인하였다(도 1).

실시예 1-3 : 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 1-2에서 얻어진 효소들의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당을 사용하였고, 여기에 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM CoSO₄, 상기 실시예 1-2에서 분리된 20mg/ml 정제효소를 첨가하여 온도 60℃에서 2시간 반응하였다. 과당-4-에피머화 효소 CJ_ANT_F4E, CJ_ANTA_F4E 에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 확인한 결과, CJ_ANT_F4E의 전환율은 16.1 %, CJ_ANTA_F4E의 전환율은 21.9%였다. 상기 전환율은 다음 식으로 산출되었다: 전환율=타가토스 생성량/과당 기질 농도 X 100

또한, 반응 후 잔존하는 과당과 생성물인 타가토스의 경우 HPLC를 이용하여 정량하였다. 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이고, 컬럼 온도를 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1ml/분으로 흘려주었다. 도 2 및 도 10 에 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 과당을 기질로 하는 상기 효소의 반응을 나타내는 피크를 검출 정량하였다.

실시예 1-4 : 과당-4- 에피머화 활성에 대한 온도의 영향

본 출원의 효소의 에피머화 활성에 대한 온도 영향성을 조사하기 위하여 과당을 포함하는 50mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 상기 실시예 1-2에서 제조된 1mg/ml 정제효소를 첨가하여 50℃ 내지 80℃에서 3시간 반응하였고, 반응 완료액은 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다. 그 결과, 본 출원의 CJ_ANT_F4E 효소는 70℃에서 최대활성을 나타내었다(도 3).

실시예 2 : 타가토스-6-인산 키나아제의 제조 및 그 활성 평가

실시예 2-1: 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

본 발명자들은 언에로리네 박테리움(Anaerolineae bacterium) Taxon ID : 2654588098 유래 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

더욱 구체적으로는, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 ENA(European Nucleotide Archive)에 등록된 언에로리네 박테리움 유전자 서열을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하여, 언에로리네 박테리움 유래 타가토스-6-인산 키나아제 CJ_AB_F4E의 아미노산 서열(서열번호 3) 및 염기 서열(서열번호 4) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_AB_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 각각의 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12093P를 부여받았다.

실시예 2-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 2-1에 따라 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 유래의 CJ_AB_F4E로부터 본 출원 재조합 효소를 수득하기 위하여, 상기 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이어서, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 다음, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였고 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_AB_F4E를 확보하였다.

실시예 2-3 : 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 2-2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_AB_F4E의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO_{4 ,} 및 각 20 mg/mL의 CJ_AB_F4E를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 4).

실험 결과, 상기 효소에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 5.1%임을 확인하였다.

실시예 2-4 : 재조합 효소의 온도 변화에 따른 활성 확인

상기 실시예 2-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_AB_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에 1mg/mL CJ_AB_F4E를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_AB_F4E 효소는 65℃에서 최대활성을 나타내었으며, CJ_AB_F4E는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 이상을 유지함을 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 2- 5 : 금속이온 첨가에 따른 재조합 효소의 활성 확인

종래 공지된 이성화 효소, 예컨대 포도당 이성화 효소 및 아라비노스 이성화 효소 및 에피머효소, 예컨대 사이코스 3-에피머화 효소는 금속이온을 요구하는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 실시예 2-2에서 수득한 본 출원 재조합 효소 CJ_AB_F4E도 금속이온이 과당-4-에피머화 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

더욱 구체적으로, 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에, 2 mg/mL의 CJ_AB_F4E를 첨가하고, 다양한 금속이온 NiSO₄, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, MnSO₄, FeSO₄, CuSO₄, 또는 (NH₄)₂SO₄ 을 각 1 mM씩 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 설정하였다. 상기 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_AB_F4E 효소는 MnSO₄, 또는 NiSO₄ 의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간이온이나 니켈이온 등 금속이온의 요구성이 있음을 알 수 있었다. 특히, NiSO₄를 첨가한 경우 최대 활성을 보임을 확인하였다(도 6).

실시예 3 : 타가토스-6-인산 키나아제의 제조 및 그 활성 평가

실시예 3-1: 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 딕티오글로무스 써모필움(Dictyoglomus thermophilum) DSM 3960 유래 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환된 재조합 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 딕티오글로무스 써모필움 유전자 서열을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하여, 딕티오글로무스 써모필움 유래 타가토스-6-인산 키나아제 CJ_DT_F4E 의 아미노산 서열(서열번호 5) 및 염기서열(서열번호 6) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_DT_F4E 를 합성하였다(㈜바이오니아,대한민국).

상기 각 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 E. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 9월 13일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12109P 를 부여받았다.

실시예 3-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 3-1에서 제조한 재조합 미생물 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E로부터 재조합 효소 CJ_DT_F4E 를 제조하기 위하여, 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_DT_F4E 를 확보하였다.

실시예 3- 3 :재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 3-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_DT_F4E 의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 5 mg/mL의 CJ_DT_F4E 를 첨가하여 60℃에서 10시간 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 7).

그 결과, 재조합 효소 CJ_DT_F4E에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 2%임을 확인하였다.

실시예 3-4 : 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 3-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_DT_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도 영향력을 조사하기 위하여 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에, 5mg/mL의 CJ_DT_F4E를 첨가하여 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 완료액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

그 결과, CJ_DT_F4E 는 60℃ 에서 최대활성을 나타내었으며, 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 80% 이상, 55℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 95% 이상의 활성을 유지함을 확인하였다(표 1 및 도 8).

온도별 상대활성(%)

구분	CJ_DT_F4E
40℃	44.0
50℃	80.3
55℃	98.9
60℃	100.0
70℃	98.2

실시예 3-5 : 금속 첨가에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 3-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_DT_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 금속이 영향을 미치는지 확인하였다.

구체적으로, 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에, 5 mg/mL의 CJ_DT_F4E 를 첨가하고, 금속이온 MgSO₄, MnSO₄ 를 1 mM씩 첨가하여 효소 활성을 측정하였다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군(w/o)으로 설정하였다. 상기 반응 완료액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

그 결과, CJ_DT_F4E 는 MnSO₄ 및 MgSO₄의 첨가에 의하여 활성이 증가하여 망간 또는 마그네슘 이온(또는, 이의 염)이 CJ_DT_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다 (도 9). 특히, CJ_DT_F4E는 MnSO₄를 첨가한 결과 대조군에 비하여 2.5배 이상의 활성 증가를 확인하였다(도 9).

실시예 4 : 타가토스-6-인산 키나아제의 제조 및 그 활성 평가

실시예 4-1: 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 써모비피다 할로톨레란스(Thermobifida halotolerans) 유래 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환된 재조합 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 써모비피다 할로톨레란스 유전자 서열을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하여, 써모비피다 할로톨레란스 유래 타가토스-6-인산 키나아제 CJ_DT_F4E 의 아미노산 서열(서열번호 9) 및 염기서열(서열번호 10) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_TH_F4E 를 합성하였다(㈜바이오니아,대한민국).

상기 각 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 E. coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12235P 를 부여받았다.

실시예 4-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 4-1에서 제조한 재조합 미생물 균주 E. coli BL21(DE3)/ CJ_TH_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_TH_F4E 를 제조하기 위하여, 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_TH_F4E 를 확보하였다.

실시예 4- 3 :재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 4-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_TH_F4E 의 활성을 측정하기 위하여, 1 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 4 mg/mL의 CJ_TH_F4E 를 첨가하여 55℃에서 4시간 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 11).

그 결과, 재조합 효소 CJ_TH_F4E에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 0.1%임을 확인하였다.

실시예 5 : 타가토스-6-인산 키나아제의 제조 및 그 활성 평가

실시예 5-1: 타가토스-6-인산 키나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 써모언에로박터 인디엔시스(Thermoanaerobacter indiensis) 유래 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환된 재조합 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 써모언에로박터 인디엔시스 유전자 서열을 대상으로 타가토스-6-인산 키나아제 유전자 서열을 선발하여, 써모언에로박터 인디엔시스 유래 타가토스-6-인산 키나아제 CJ_TAI_F4E 의 아미노산 서열(서열번호 11) 및 염기서열(서열번호 12) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_TAI_F4E 를 합성하였다(㈜바이오니아,대한민국).

상기 각 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 E. coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12236P 를 부여받았다.

실시예 5-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 5-1에서 제조한 재조합 미생물 균주 E. coli BL21(DE3)/ CJ_TAI_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_TAI_F4E 를 제조하기 위하여, 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_TAI_F4E 를 확보하였다.

실시예 5- 3 :재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 5-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_TAI_F4E 의 활성을 측정하기 위하여, 5중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 5 mg/mL의 CJ_TAI_F4E 를 첨가하여 55℃에서 10시간 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 12).

그 결과, 재조합 효소 CJ_TAI_F4E 에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 8.7%임을 확인하였다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11996P

수탁일자 : 20170320

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12093P

수탁일자 : 20170811

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12109P

수탁일자 : 20170913

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12232P

수탁일자 : 20180323

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12235P

수탁일자 : 20180323

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12236P

수탁일자 : 20180323

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same <130> P18-0071 <150> KR 17/0042166 <151> 2017-03-31 <150> KR 17/0111494 <151> 2017-08-31 <150> KR 17/0158766 <151> 2017-11-24 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-6-phophate kinase, CJ_ANT_F4E derived from Anaerolinea thermophila <400> 1 Met Thr Ala Ile Leu Glu Asn Leu Ala Ala Ala Arg Arg Ala Gly Lys 1 5 10 15 Pro Ala Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Val Val Leu Arg 20 25 30 Ala Ala Ile Arg Arg Ala Ala Ala Ser Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn His Leu Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Arg Asp Phe Val Ala Phe Val Asn Ser Ile Ala Ala Glu Glu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ile Phe Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn 85 90 95 Pro Trp Arg Arg Glu Lys Ala Glu Asp Ala Leu Thr Lys Ala Ala Ala 100 105 110 Met Val Asp Ala Tyr Val Thr Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Ala Ser Met Gly Cys Ala Gly Glu Pro Ala Ala Leu Asp Asp Val Thr 130 135 140 Ile Ala His Arg Ala Ala Lys Leu Thr Ala Val Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Thr Glu Ala Gly Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Ile Leu Gly Thr Glu Val 165 170 175 Pro Val Pro Gly Gly Ala Asp His Val Leu Glu Thr Val Ala Pro Thr 180 185 190 Glu Pro Gln Ala Ala Arg Asn Thr Ile Asp Leu His Arg Glu Ile Phe 195 200 205 Ala Gln His Gly Leu Ser Asp Ala Phe Glu Arg Val Ile Ala Phe Val 210 215 220 Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Ser Asp Asn Val Val Ala Tyr Asp 225 230 235 240 Pro Gln Ala Ala Gln Ser Leu Ser Ala Val Leu Asp Gly Glu Pro Arg 245 250 255 Leu Val Phe Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Glu Pro Ala Leu 260 265 270 Ala Ala Leu Val Arg Asp Gly Tyr Pro Ile Leu Lys Val Gly Pro Gly 275 280 285 Leu Thr Phe Ala Tyr Arg Glu Ala Leu Tyr Ala Leu Asp Met Ile Ala 290 295 300 Ser Glu Met Val Gly Thr Tyr Gly Asp Arg Pro Leu Ala Arg Thr Met 305 310 315 320 Glu Lys Leu Met Leu Ser Ala Pro Gly Asp Trp Gln Gly His Tyr His 325 330 335 Gly Asp Asp Ile Thr Leu Arg Leu Gln Arg His Tyr Ser Tyr Ser Asp 340 345 350 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Ala Leu Ala Ala Val Ser 355 360 365 Thr Leu His Lys Ala Leu Asp Gly Lys Thr Ile Pro Glu Thr Leu Leu 370 375 380 Arg Gln Tyr Leu Gly Glu Leu Pro Leu Ala Ala Val Ala Gly Lys Glu 385 390 395 400 Pro Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Val Asp Gln Val Leu Ala Thr Tyr 405 410 415 His Ala Ala Thr Gly Glu Gly Arg His 420 425 <210> 2 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-6-phophate kinase, CJ_ANT_F4E derived from Anaerolinea thermophila <400> 2 atgaccgcca ttttggaaaa tctcgccgcc gcgcgccgcg ccggcaaacc tgcgggcatc 60 acttcggtct gctcggccca ccccgttgtc ctgcgcgccg caatccgccg cgccgccgcc 120 agtcaaacgg ccgtactgat cgaggccacc tgcaatcagg tcaatcatct cggtggttat 180 accggcatga caccgcgtga cttcgttgcc ttcgtcaaca gcatcgccgc ggaagaagga 240 ctgcccgccg aactgctgat ctttggcggc gatcatctcg gccccaatcc ctggcgcagg 300 gagaaggccg aggacgcgct gacaaaagcc gccgccatgg tcgacgccta tgtcacagct 360 ggttttcgca agatccacct tgatgcatcg atgggctgcg ccggtgagcc ggcagccctg 420 gatgacgtca ccatcgccca ccgcgccgcg aaactcacag ccgttgccga aaaggcagcc 480 actgaggctg gcctgccaaa accgctttat attctgggca ccgaagtgcc ggtgcccggc 540 ggtgccgacc atgtgcttga gaccgtcgca ccgaccgaac cgcaggcggc gcgcaacacc 600 atcgatcttc atcgcgaaat ctttgcgcag cacggtcttt ccgatgcgtt cgaacgggtc 660 atcgcctttg tcgtgcagcc gggtgtggaa ttcggcagcg acaatgtcgt cgcttatgat 720 ccgcaggcag cgcagagcct gagcgccgtg ctggatggcg aaccgcgact ggtcttcgaa 780 gcccattcga ccgattacca gaccgagcct gcccttgcgg cactggtacg cgacggatat 840 ccgatcctca aagttggacc gggcctcacc ttcgcttacc gggaagcgct ttatgcactc 900 gacatgatcg cctccgaaat ggtcggcacc tatggcgacc gaccgctggc gcggactatg 960 gaaaaattga tgttaagcgc gccgggcgac tggcagggcc attaccatgg cgacgacatc 1020 acgctccgat tgcaacgcca ttacagctac agcgaccgca tccgttacta ctggacgcga 1080 ccggaagcgc tcgcggccgt ttccaccttg cataaggcac tggatgggaa gacaattccc 1140 gaaaccctgc tgcgccaata tctcggcgaa ttgccgctcg cggcggttgc gggaaaggaa 1200 ccggaggagg ttctggtcgc ggcggtggat caggtgctgg cgacctatca cgcggcgacg 1260 ggcgaaggcc gccactga 1278 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acids sequences of Tagatose-6-phophate kinase, CJ_AB_F4E derived from Anaerolineae bacterium <400> 3 Met Thr Arg Asn Ser Pro Leu Ser Glu Val Ile Ala Ala Gln Lys Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ser Arg Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Ala Asn Pro Trp Val 20 25 30 Ile Glu Ala Met Leu Gln Gln Ala Arg Ala Thr Gly Glu Pro Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ser Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly 50 55 60 Trp Thr Pro Asp Gln Phe Met Ala Tyr Leu Arg Asp Leu Ala Pro Arg 65 70 75 80 Gln Glu Phe Pro Phe Asp His Ile Ile Val Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Ser Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Met Asp Lys Ala 100 105 110 Lys Ile Leu Ile Arg Asp Cys Val Arg Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His 115 120 125 Leu Asp Ala Ser Met Lys Cys Ala Asp Asp Asp Pro His Arg Pro Leu 130 135 140 Asp Thr Arg Ile Ser Ala Ala Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala 145 150 155 160 Glu Lys Ala Phe Ser Glu His Pro Pro Gly Gly Ala Pro Pro Tyr Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Glu Val Pro Leu Pro Gly Gly Val Gln Glu Gln Glu 180 185 190 Glu Gly Leu Ser Val Thr Ser Ile Gly Asp Val Ala Gly Thr Ile Glu 195 200 205 Ser Thr Lys Glu Ala Phe Phe Ala Arg Gly Leu Glu Arg Ala Trp Glu 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Tyr Gly Asp Ala 225 230 235 240 Thr Leu Phe Glu Tyr Asp Arg Ala Arg Ala Ala Asp Leu Ala Arg Phe 245 250 255 Ile Glu Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg Gln Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ser Phe Arg Glu Gly Val Phe 290 295 300 Ala Leu Ala Ala Ile Glu Glu Glu Leu Leu Ala Gly Arg Gln Asp Val 305 310 315 320 Glu Pro Ser Arg Val Arg Glu Val Leu Asp Lys Thr Met Leu Ala Asn 325 330 335 Pro Ile Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Gln Gly Asp Asp Gln Ala Val His 340 345 350 Leu Lys Arg Lys Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ser Arg Tyr Tyr Trp Pro 355 360 365 Val Pro Glu Val Gln Phe Ser Leu Ser Arg Leu Ile Gln Asn Leu Gly 370 375 380 Glu Gln Pro Leu Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Val Gln 385 390 395 400 Tyr Ala Arg Ile Arg Gly Gly Glu Ile Ala Asn Val Pro Arg Ala Ile 405 410 415 Leu Leu Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Ser Asp Tyr Ser Tyr Ala Cys 420 425 430 Gly Tyr Leu Thr Gly Pro Ala Arg Arg Asn Arg 435 440 <210> 4 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequences of Tagatose-6-phophate kinase, CJ_AB_F4E derived from Anaerolineae bacterium <400> 4 atgactcgga actcgccctt atcagaggtg atcgctgccc agaaacgcgg cgagagcaga 60 gggatcgctt ccatatgctc ggccaatccc tgggtcatcg aggccatgct gcaacaggcc 120 cgcgcgaccg gcgaacctgt cctgatcgag tcgacctgca accaggtcaa tcaattcggc 180 ggctacaccg gttggacgcc ggatcaattc atggcctatc ttcgagattt ggcgccccgg 240 caagaatttc cctttgacca catcatcgtc ggcggcgatc atctcgggcc tagcccctgg 300 caagacgagc cggccgcgat agcgatggat aaggccaaga tcctgatccg ggattgcgtc 360 cgggcaggtt acaccaagat tcacctggac gccagcatga agtgcgccga cgacgatccc 420 catcggccgc tagataccag gatatctgcg gcccgggcgg ccgagctggc ccaggtggcc 480 gaaaaagcat tctccgagca cccaccaggc ggtgcgccgc cttattatgt gatcggcacc 540 gaggtgccct tgcccggtgg ggttcaggaa caggaggagg gattgagtgt taccagtata 600 ggcgacgtgg ccggaaccat tgaatcgacc aaagaagcct tttttgcacg aggcttagaa 660 agggcttggg aacgggtcat agccgtcgtg gtgcaacccg gcgtggagta tggtgatgcc 720 acgttatttg aatatgatcg ggctcgggcg gccgatctgg cccgatttat cgaaggttat 780 gatggcttga tatacgaagc gcattccact gattatcagt tagctgaggc actccggcag 840 ttggtagaag atcatttcgc catcttgaag gtggggccag cgctaacatt ttcatttcgg 900 gagggggttt ttgccctggc tgccatagaa gaggagctgt tggccgggcg acaggatgtc 960 gaaccgtcac gggtgcgcga agttctggat aagaccatgt tggctaatcc aatctactgg 1020 cagaagtatt atcagggaga tgaccaggcc gtacatttga aaaggaaata tagttttagt 1080 gaccgttccc gatactattg gccggttccc gaggtgcaat tttctttgtc ccgactaatt 1140 caaaatttgg gagagcagcc gctgcctcta acgctcttaa gccaatacct gccggtccaa 1200 tacgcccgaa tcagaggtgg cgaaatagcc aatgttcccc gggcgatcct cttggataag 1260 gtcagaagcg tactctctga ttactcatat gcatgcggtt atctgaccgg ccctgctaga 1320 agaaaccgct ga 1332 <210> 5 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_DT_F4E derived from Dictyoglomus thermophilum <400> 5 Met Trp Leu Ser Lys Asp Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Val Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asn Pro Tyr Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Phe Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Asn Asp Tyr Ile Leu Ile Glu Ala Thr Pro His Gln Ile Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Asp Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Val Met Gly Ile Ile Lys Glu Lys Gly Ile Glu Glu Asp Arg Val Ile 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ser 85 90 95 Ser Ser Ala Met Lys Lys Ala Lys Asp Leu Ile Arg Ala Phe Val Glu 100 105 110 Ser Gly Tyr Lys Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Ser Leu Ser Asp 115 120 125 Asp Pro Val Val Leu Ser Pro Glu Lys Ile Ala Glu Arg Glu Arg Glu 130 135 140 Leu Leu Glu Val Ala Glu Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Asn Phe Gln Pro 145 150 155 160 Val Tyr Val Val Gly Thr Asp Val Pro Val Ala Gly Gly Gly Glu Glu 165 170 175 Glu Gly Ile Thr Ser Val Glu Asp Phe Arg Val Ala Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Val Pro Arg Ile Trp Asp Arg Ile Ile Gly 195 200 205 Phe Val Ile Met Leu Gly Ile Gly Phe Asn Tyr Glu Lys Val Phe Glu 210 215 220 Tyr Asp Arg Ile Lys Val Arg Lys Ile Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu 225 230 235 240 Asn Leu Phe Val Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Lys Arg Ala 245 250 255 Leu Arg Asp Met Val Glu Asp Gly Val Arg Ile Leu Lys Val Gly Pro 260 265 270 Ala Leu Thr Ala Ser Phe Arg Arg Gly Val Phe Leu Leu Ser Ser Ile 275 280 285 Glu Asp Glu Leu Ile Ser Glu Asp Lys Arg Ser Asn Ile Lys Lys Val 290 295 300 Val Leu Glu Thr Met Leu Lys Asp Asp Lys Tyr Trp Arg Lys Tyr Tyr 305 310 315 320 Lys Asp Ser Glu Arg Leu Glu Leu Asp Ile Trp Tyr Asn Leu Leu Asp 325 330 335 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Glu Tyr Lys Glu Ile Lys Ile 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gaaagtacaa ttttcagcct 480 gtgtatgtgg tgggaactga tgtaccggta gctggaggag gcgaagagga aggtattacc 540 tcagtggagg attttagagt agcaatctcc tctttaaaaa aatattttga ggatgttcca 600 aggatatggg ataggataat tggttttgta ataatgcttg gtataggttt taattatgaa 660 aaagtgtttg agtatgacag gattaaggtg agaaaaattt tagaggaggt aaagaaagag 720 aatctttttg ttgaaggtca ctctactgac tatcagacaa aacgtgcatt gagagatatg 780 gtagaggatg gagtaagaat tcttaaggtt ggtcctgctt taacagcaag ttttagaagg 840 ggagtatttt tattaagtag cattgaggat gagcttatat cggaagataa aaggtctaat 900 attaagaaag ttgtgcttga gactatgtta aaagatgata aatattggag aaagtattat 960 aaggattcag aaagattaga attagatatt tggtacaact tacttgatag gattagatat 1020 tattgggaat ataaagagat aaaaatagct ttaaataggc tttttgaaaa tttttcggaa 1080 ggggttgata ttagatacat ctatcaatat ttttatgatt cgtattttaa agtaagagaa 1140 ggaaaaataa gaaatgatcc aagggagcta ataaagaatg aaataaagaa ggtcttggag 1200 gactatcact atgctgtaaa cttataa 1227 <210> 7 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_ANTA_F4E derived from Anaerolinea thermophila <400> 7 Met Met Phe Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Asp Met Val Thr Ala Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Met Ala Arg Gly Ile Pro Ser Ile Cys Ser Ala His Pro 20 25 30 Val Val Leu Ser Ala Ala Cys His Leu Ala Arg Arg Ser Gly Ala Pro 35 40 45 Leu Leu Ile Glu Thr Thr Cys Asn Gln Val Asn His Gln Gly Gly Tyr 50 55 60 Ser Gly Met Thr Pro Ala Asp Phe Val Arg Phe Leu Arg Glu Ile Leu 65 70 75 80 Glu Arg Glu Gly Ile Pro Pro Gln Gln Val Ile Leu Gly Gly Asp His 85 90 95 Leu Gly Pro Tyr Pro Trp Arg Lys Glu Pro Ala Glu Thr Ala Ile Ala 100 105 110 Gln Ala Leu Glu Met Val Arg Ala Tyr Val Gln Ala Gly Tyr Thr Lys 115 120 125 Ile His Leu Asp Ala Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Asp Pro Glu Arg 130 135 140 Pro Leu Pro Leu Glu Arg Ile Ala Arg Arg Ala Ala Gln Leu Cys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Val Gln Pro Val Tyr Val Ile Gly 165 170 175 Ser Glu Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Gly Gln Glu Ala Arg Leu 180 185 190 His Val Thr 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Glu Ile Ser Ser His Pro Gln Asp Leu Ile Arg Ala His 405 410 415 Ile Gln His Thr Leu Glu Asp Tyr Ala Ala Ala Cys Gly 420 425 <210> 8 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_ANTA_F4E derived from Anaerolinea thermophila <400> 8 atgatgttcg gctcgcctgc tcccctgctg gatatggtca ccgcgcagaa acagggcatg 60 gcgcggggta tcccatccat ttgttcggca catccggtgg tgctgagtgc cgcctgccat 120 cttgcccgcc ggagcggcgc gcccctgctc atcgaaacca cctgcaatca ggtcaaccac 180 caaggtgggt acagcggcat gacccccgcc gattttgtcc gctttctgcg cgaaattctg 240 gaacgggaag gtattccccc gcaacaggtc atcctgggcg gggatcacct gggtccttac 300 ccctggcgga aagagcctgc cgaaaccgcc atagcacaag cgctggaaat ggtgcgggca 360 tacgtgcagg caggctacac caaaattcat ctggacgctt ccatgccctg cgccgatgac 420 gaccccgagc gtcccctgcc gctggagcgc atagcccgac gggcggcgca gttgtgcgcc 480 gccgccgaag ccgccgcggg agcggttcag ccggtgtacg taattggcag tgaggtgccc 540 ccgcccggcg gcgcgcaggg tcaggaggca agacttcacg tcaccactcc gcaggaagcc 600 caagccgcgc tggatgcctt tcgggaagcc tttctgcagg caggcttgac tcccgtttgg 660 gagcgggtca ttgcgctggt agtccagccg ggggtggagt ttggcgtgga cagcattcac 720 gcctatcagc gcgaagccgc ccgcccgctg aagaccttca tcgagggcgt gcccggcatg 780 gtgtatgaag cccactcgac cgattaccag acccgtgcct ccctgcgtgc gctggtggaa 840 gaccactttt ccattctcaa ggttggtccg gcactaacct ttgcctaccg cgaagccgtg 900 ttcgccctgg aacacatcga acgggaaata ttgggcaggc aggatatgcc tctctcccgc 960 ctgagtgaag tcctcgacga ggtgatgctg aacgatccac gccactggca gggatacttt 1020 gccggcgctc ccgccgaaca ggcgctggcg cgccgctaca gtttcagcga ccgcattcgc 1080 tattactggc accatcccgc cgcgcaggaa gccgtgcgga gactgctcgc caacctgatc 1140 gaaaccccgc cgccgctgag tttgctcagc cagtacctgc cgcgcgagta tgagatggtg 1200 cgcgcggggg aaatctccag ccacccgcag gacctgattc gggcacatat ccagcacacg 1260 ctggaagatt acgctgcggc gtgcgggtaa 1290 <210> 9 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_TH_F4E derived from Thermobifida halotolerans <400> 9 Met Ser Val Ile Pro Lys Glu Thr Gly Val Ser Pro Ser Arg Leu Asn 1 5 10 15 Val Pro Ser Arg Leu Gly Val Gly Pro Met Ser Lys Asn Ala Val Asp 20 25 30 Ala Ala Ile Ser Val Ala Ala Arg Ala Asp Gln Pro Leu Met Leu Ile 35 40 45 Pro Ser Arg Arg Gln Val Glu Ala Ala Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Val 50 55 60 Glu Gln Trp Asp Thr Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Val Arg Arg Asn Asp 65 70 75 80 Leu Val Gly Arg Ile Leu Leu Cys Arg Asp His Gly Gly Pro Tyr Gln 85 90 95 Ser Pro Arg Glu Arg Glu Gln Arg Leu Pro Leu Asp Ala Ala Met Ala 100 105 110 Ser Ala Leu Glu Ser Tyr Lys Glu Asp Ile Arg Cys Gly Phe Asp Leu 115 120 125 Leu His Ile Asp Thr Ser Met Asp Leu Asp Gly Val Ala Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Ala Ile Asp Arg Ala Leu Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Val Glu Phe 145 150 155 160 Ala Arg Ser Gln Gly Arg Glu Val Met Phe Glu Ile Gly Phe Glu Asp 165 170 175 Gln Gly Arg Asp Thr Asn Asp Pro Phe Glu Phe Gln Glu Leu Leu Asp 180 185 190 Glu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Lys Ala Asp Leu Pro Ala Pro Thr Phe 195 200 205 Val Val Ala Gln Thr Gly Thr Lys Val Val Glu Thr Gly Asn Thr Gly 210 215 220 Gly Ile Gly Val Ala Pro Ser Ala Val Gly Val Ala Val Arg Ala Leu 225 230 235 240 Ala Asp Val Val Glu Arg Asn Gly Ile Ala Leu Lys Ala His Asn Cys 245 250 255 Asp Tyr Leu Asp Glu Ser Thr Val Gly Tyr Leu Ala Ala Ser Gly Val 260 265 270 His Ala Leu Asn Val Ala Pro Glu Phe Gly Val Val Glu Thr Arg Ala 275 280 285 Phe Ile Gly Val Leu Gln Glu Leu Gly Leu Gly Val Gln Arg Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser Trp Lys Lys Trp Met Ala 305 310 315 320 Gln Asn Thr Thr Ala Thr Asp Tyr Asp Arg Ala Val Ile Ala Gly His 325 330 335 Tyr Val Tyr Gly Thr Asp Glu Phe Lys Glu Ile Lys Thr Ala Ala Gln 340 345 350 Gln Ile Ala Gln Ser Arg Gly Ile Asp Val Asp Thr Arg Leu Arg Glu 355 360 365 Ala Val Ala Ala Ser Ile Glu Asn Tyr Ala Arg Pro Leu Arg Glu Val 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ala Ala 385 390 <210> 10 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_TH_F4E derived from Thermobifida halotolerans <400> 10 atgtccgtta tcccgaaaga gaccggtgtt tccccgagcc gactgaatgt tccctcacgg 60 ctgggggtgg gaccgatgtc gaagaacgcg gtggacgcgg cgatcagcgt ggcggcccgc 120 gccgaccagc cgctgatgct catccccagc cggcgccagg tcgaggcggc gtctcagggc 180 ggcggctacg tcgagcagtg ggacaccgcg gcgttcgccg actacgtgcg ccgcaacgac 240 cttgtgggac ggatcctgct gtgcagggac cacggaggcc cctaccagtc cccgcgggag 300 cgggagcagc ggctccccct cgacgcggcg atggcctccg cgctggagtc ctacaaggag 360 gacatccgct gcggtttcga cctgctgcac atcgacacct ccatggacct cgacggagtc 420 gccgacgagt cggcggcgat cgaccgggcg ctggagctct acgggcagtg cgtcgagttc 480 gcccgttccc aggggcggga ggtgatgttc gagatcggct tcgaggacca gggaagggac 540 accaacgacc cgttcgagtt ccaggagctc ctcgacgagg cgctggaggg gctgcgcaag 600 gcggacctgc ccgccccgac cttcgtcgtc gcgcagacgg ggaccaaggt cgtcgagacc 660 ggcaacaccg gcgggatcgg ggtcgcgccc agcgcggtcg gtgtcgccgt gcgcgcgctg 720 gccgacgtcg tggagcggaa cggcatcgcc ctcaaggcgc acaactgcga ctacctggac 780 gagagcacgg tcgggtacct ggccgcctcc ggtgtgcacg cgctgaacgt cgctccggag 840 ttcggcgtgg tcgagacgcg ggcgttcatc ggcgtactgc aggagctggg cctgggcgtg 900 cagcgggagc gcttcctcgc cctggcctac gagtccggct cgtggaagaa gtggatggcc 960 cagaacacca cggccaccga ctacgaccgc gccgtgatcg ccggccacta cgtctacggc 1020 acggacgagt tcaaggagat caagaccgcg gcccagcaga tcgcgcagtc ccggggcatc 1080 gacgtcgaca cccggctgcg tgaggccgtc gccgcgtcga tcgagaacta cgcgcgaccg 1140 ctgcgcgaag tcgccgcggc ggcttccgcc cccgcggcgg cgtga 1185 <210> 11 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_TAI_F4E derived from Thermoanaerobacter indiensis <400> 11 Met Asn Thr Glu His Pro Leu Lys Asn Val Val Lys Leu Gln Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ile Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser Ala Asn Glu Ile Val 20 25 30 Ile Gln Val Ala Met Glu Lys Ala Leu Ser Met Asp Ser Tyr Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ala Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn 50 55 60 Met Lys Pro Ile Asp Phe Arg Asp Phe Val Tyr Ser Ile Ala Lys Arg 65 70 75 80 Ile Asn Phe Pro Glu Asn Arg Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Pro Trp Lys Asn Gln Gln Ala Lys Lys Ala Met Glu Glu Ala 100 105 110 Lys Glu Leu Val Lys Gln Phe Val Met Ala Gly Phe Thr Lys Ile His 115 120 125 Val Asp Thr Ser Met Phe Leu Gly Asp Asp Asn Ile Asn Ile Lys Leu 130 135 140 Asp Thr Glu Thr Ile Ala Glu Arg Gly Ala Ile Leu Val Ser Val Ala 145 150 155 160 Glu Arg Ala Phe Glu Glu Leu Lys Lys Ser Asn Pro Tyr Ala Leu His 165 170 175 Pro Val Tyr Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Val Pro Gly Gly Ser Gln 180 185 190 Lys Glu Asn Asn Asn Glu Ile Gln Val Thr Lys Pro Ala Asp Phe Glu 195 200 205 Glu Thr Val Glu Val Tyr Lys Ser Thr Phe Tyr Lys Tyr Gly Leu Gly 210 215 220 Asn Ala Trp Glu Asp Val Val Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Glu Asn Ile His Glu Tyr Asp His Gln Gln Ala Glu Asn 245 250 255 Leu Val Ser Ala Leu Lys Lys Tyr Pro Asn Leu Val Phe Glu Ala His 260 265 270 Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Met Val Arg Asp 275 280 285 Gly Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Glu Leu Thr Phe Ala Leu Arg 290 295 300 Glu Gly Leu Phe Ala Leu Asn Ile Ile Glu Lys Glu Leu Phe Lys Asp 305 310 315 320 Asn His Asp Ile Glu Met Ser Asn Phe Ile Asp Ile Leu Asp Thr Ala 325 330 335 Met Leu Asn Asn Pro Lys Tyr Trp Glu Gln Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp 340 345 350 Asn Lys Ile Arg Ile Ala Arg Lys Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Cys Arg 355 360 365 Tyr Tyr Leu Ile Glu Asn Glu Val Arg Ala Ser Met Ser Arg Leu Phe 370 375 380 Lys Asn Leu Thr Asn Val Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Tyr 385 390 395 400 Met Pro Ile Gln Tyr Glu Lys Ile Arg Met Gly Leu Leu Lys Asn Asp 405 410 415 Pro Glu Asn Leu Val Lys Asp Lys Ile Gly Asn Cys Ile Asp Lys Tyr 420 425 430 Leu Tyr Ala Thr Asn Pro Thr Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ile 435 440 445 <210> 12 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of tagatose-6-phosphate kinase, CJ_TAI_F4E derived from Thermoanaerobacter indiensis <400> 12 atgaatacag aacatccttt gaaaaacgtt gttaaactac aaaaaaaggg aattccaata 60 ggtatttatt cagtttgtag tgcaaatgaa atagttattc aagttgcaat ggagaaggca 120 ttgagtatgg atagttatgt tttaattgaa gcaacggcta atcaagtaaa tcaatatggt 180 ggctatacga atatgaaacc tattgatttt agagattttg tgtattctat agccaaaagg 240 ataaacttcc cagaaaatag aataatcctt ggcggggacc acttaggacc tttgccatgg 300 aaaaatcaac aagcgaaaaa agcaatggaa gaagcaaaag aacttgttaa acaatttgtg 360 atggctggct ttacgaaaat tcatgtagat acaagtatgt ttcttggaga tgataacata 420 aatatcaaac tagatactga aactattgcg gagagaggag cgatacttgt atcagtagca 480 gaaagagctt ttgaggagtt aaaaaagtct aatccttatg ctcttcatcc agtttatgta 540 ataggtagtg aagttcctgt tccaggaggt tctcaaaaag aaaataataa tgaaatacaa 600 gtaacaaagc cggcggattt tgaagaaact gtggaagtgt ataaaagcac tttctataaa 660 tatggtttag gaaacgcatg ggaagatgtt gtagcagtgg ttgtgcagcc tggggtggaa 720 tttggagttg aaaatattca tgaatatgat caccaacagg ctgaaaattt agtaagtgct 780 ttaaaaaagt atcctaattt agtatttgaa gcccactcta cggattatca acctgcaaaa 840 ctactaaaag aaatggtgag agatggattt gctatactta aagttggacc tgaattgact 900 tttgcattaa gggaaggatt gtttgctctg aatattatag aaaaagaatt atttaaagat 960 aatcatgata ttgagatgtc aaattttatt gatatccttg atacagcaat gttaaataat 1020 ccgaagtatt gggaacagta ttattacggt gatgataata aaattagaat tgctagaaaa 1080 tacagctatt ctgatagatg taggtattat ctaatcgaaa atgaagttag agcatctatg 1140 tctaggttgt ttaaaaattt aacaaatgtt gagataccat taaccttaat aagtcagtat 1200 atgcctattc aatatgaaaa aattagaatg ggactattaa aaaatgatcc tgagaattta 1260 gtaaaagata aaattggaaa ttgcattgat aagtatttgt atgctactaa tccgacaagt 1320 ggagaattta aactaatata a 1341 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DNA sequence of CJ_ANT_F4E or CJ_ANTA_F4E <400> 13 atatacatat gatgttcggc tcgcctgctc ccctgctg 38 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DNA sequence of CJ_ANT_F4E or CJ_ANTA_F4E <400> 14 tggtgctcga gcccgcacgc cgcagcgtaa tcttccag 38

Claims (6)

1. 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 키나아제를 하나 이상 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 언에어로리네 속(Anaerolineae sp.), 써모비피다 속(The genus of Thermobifida), 써모언에로박터 속(The genus of Thermoanaerobacter), 딕티오글로무스 속(The genus of Dictyoglomus) 유래 효소, 또는 그 변이체인, 타가토스 생산용 조성물.
5. 과당을, 타가토스-6-인산 키나아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행하는, 타가토스 제조방법.
   

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