BR112019020338A2

BR112019020338A2 - composição para produção de tagatose, e, método de produção de tagatose.

Info

Publication number: BR112019020338A2
Application number: BR112019020338A
Authority: BR
Inventors: Lee Chan-Hyoung; Jung Choi Eun; Kug Cho Hyun; Hyang Park Il; Bo Kim Seong; Jae Yang Sung; Mi Lee Young
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-04-28
Also published as: EP3604516A1; EP3604516A4; JP6961713B2; CN111133103B; MX2019011730A; TWI704227B; BR112019020338B1; CN111133103A; JP2020511974A; WO2018182355A1; US11408017B2; KR20180111679A; BR112019020338A8; US20200087689A1; TW201842187A; CA3057595A1; KR102076288B1

Abstract

trata-se de uma composição para produção de tagatose, que compreende frutose-4-epimerase, e um método de produção de tagatose que usa a mesma.

Description

COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE TAGATOSE, E, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE TAGATOSE

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente revelação refere-se a uma composição para produção de tagatose, que compreende frutose-4-epimerase, e um método de produção da tagatose que usa a mesma.

2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA [002] A tagatose é um adoçante natural, que está presente em uma pequena quantidade em alimentos, tais como leite, queijo, cacau, etc., e em frutas doces, tais como maçãs e tangerinas, e tem uma propriedade física similar à sacarose. A tagatose tem um valor calórico de 1,5 kcal/g, que é um terço do valor da sacarose, e um índice glicêmico (GI) de 3, que é 5% do valor da sacarose. A tagatose tem um sabor doce similar à sacarose e vários benefícios à saúde. Nesse sentido, a tagatose pode ser usada como um adoçante alternativo capaz de satisfazer tanto ao sabor quanto à saúde quando aplicada a uma ampla variedade de produtos.

[003] Métodos convencionalmente conhecidos de produção da tagatose incluem um método químico (uma reação catalítica) ou um método biológico (uma reação enzimática isomerizante) de uso de galactose como uma matéria-prima principal (vide PCT WO 2006/058092, patentes coreanas números 10-0964091 e 10-1368731). Contudo, o preço da lactose, que é uma matéria-prima básica da galactose nos métodos de produção conhecidos, era instável, dependendo das quantidades produzidas, suprimento e demanda de leite era e lactose em mercados globais, etc. Dessa forma, há uma limitação no suprimento estável da matéria-prima para produção da tagatose. Portanto, um novo método capaz de produzir tagatose a partir de um açúcar comumente usado (sacarose, glicose, frutose, etc.) como uma matéria-prima era necessário e foi estudado, e os documentos supracitados revelam um método

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2/33 de produção de galactose, psicose e tagatose a partir da glicose, galactose e frutose, respectivamente (patentes coreanas números 10-744479, 10-1057873 e 10-1550796).

[004] Enquanto isso, a tagatose-6-fosfato quinase (EC 2.7.1.144) é conhecida por produzir ADP e D-tagatose 1,6-bifosfato a partir de ATP e Dtagatose-6-fosfato como um substrato, como no seguinte [Esquema de Reação 1]. Contudo, não houve estudos sobre se a tagatose-6-fosfato quinase catalisa a conversão de frutose (D-frutose) em tagatose.

ESQUEMA DE REAÇÃO 1

ATP + D-tagatose 6-fosfato <> ADP + D-tagatose 1,6-bifosfato [005] Com base nesse antecedente, os presentes inventores realizaram amplos estudos para desenvolver uma enzima que tem atividade para converter frutose em tagatose e, como resultado, descobriram que a tagatose-6-fosfato quinase (EC 2.7.1.144) tem a capacidade de converter frutose em tagatose, de modo a concluir a presente revelação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Um objeto da presente revelação é fornecer uma composição útil para a produção da tagatose, que compreenda tagatose-6-fosfato quinase, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase, ou uma cultura do micro-organismo.

[007] Outro objeto da presente revelação é fornecer um método de produção da tagatose, que compreende a conversão de frutose em tagatose por meio da colocação de frutose em contato com frutose-4-epimerase da presente revelação, um micro-organismo que expressa a fnitose-4-epimerase, ou uma cultura do micro-organismo.

[008] Doravante, outros objetos e vantagens da presente revelação serão descritos em maiores detalhes com referência à seguinte descrição, junto com as reivindicações e os desenhos que acompanham o presente documento. Visto que os conteúdos que não são descritos no presente

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 8/40 / 33 relatório descritivo podem ser suficientemente reconhecidos e inferidos por aqueles versados na técnica ou técnica similar, uma descrição dos mesmos será omitida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [009] A Figura 1 mostra um resultado de SDS-PAGE para analisar um peso molecular da tagatose-6-fosfato quinase (CJ_ANT_F4E) que foi produzida em um transformante e separada do mesmo, de acordo com uma modalidade da presente revelação;

A Figura 2 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase (CJ_ANT_F4E) preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epi merase;

A Figura 3 é um gráfico que mostra atividade de 4epimerização de frutose da tagatose-6-fosfato quinase (CJ_ANT_F4E) preparada em uma modalidade da presente revelação de acordo com mudanças de temperatura;

A Figura 4 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase CJ_AB_F4E preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epimerase;

A Figura 5 é um gráfico que mostra atividade de 4epimerização de frutose da tagatose-6-fosfato quinase CJ_ABJF4E preparada em uma modalidade da presente revelação de acordo com mudanças de temperatura;

A Figura 6 é um gráfico que mostra atividade de 4epimerização de frutose da tagatose-6-fosfato quinase CJ_ABJF4E preparada em uma modalidade da presente revelação de acordo com adição de metais;

A Figura 7 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase CJ__DT__F4E preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epimerase;

A Figura 8 é um gráfico que mostra atividade de 4

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 9/40 / 33 epimerização de frutose da tagatose-6-fosfato quinase CJJDT_F4E preparada em uma modalidade da presente revelação de acordo com mudanças de temperatura;

A Figura 9 é um gráfico que mostra atividade de 4epimerização de frutose da tagatose-6-fosfato quinase CJJDT_F4E preparada em uma modalidade da presente revelação de acordo com adição de metais;

A Figura 10 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase (CJ_ANTA_F4E) preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epi merase;

A Figura 11 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase (CJ_TH_F4E) preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epimerase;

A Figura 12 é um resultado da cromatografia de HPLC que mostra que a tagatose-6-fosfato quinase (CJ_TAI_F4E) preparada em uma modalidade da presente revelação tem atividade de frutose-4-epimerase. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS [010] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes conforme segue. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada nesta revelação pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. Ademais, todas as combinações de vários elementos revelados nesta revelação se enquadram no escopo da presente revelação. Ademais, o escopo da presente revelação não é limitado pela descrição específica descrita abaixo.

[011] Para conseguir os objetos da presente revelação, um aspecto da presente revelação fornece uma composição para produzir tagatose, que compreende tagatose-6-fosfato quinase.

[012] Especificamente, a composição pode compreender um ou mais de um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 e um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

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1, 3 ou 5. É aparente que um polipeptídeo que tem a homologia e uma sequência de aminoácidos que exibe a eficácia (ou seja, atividade de 4epimerização de frutose para converter em tagatose por epimerização na posição C4 da frutose) que corresponde à proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 também é incluído no escopo da presente revelação, embora tenha uma sequência de aminoácidos, da qual uma sequência parcial é eliminada, modificada, substituída ou adicionada. Ademais, uma sonda que pode ser produzida a partir da sequência de nucleotideos conhecida, por exemplo, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que é hibridizável com uma sequência complementar a toda (ou uma parte de) uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptídeo sob condições estritas também pode ser incluída sem limitação, desde que tenha a atividade de 4-epimerização de frutose.

[013] Conforme usado neste documento, o termo “condições estritas” significa condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é permitida. Essas condições dependem do comprimento do polinucleotídeo e do grau de complementação, e variáveis são bem conhecidas na técnica, e especificamente descritas em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., infra). As condições estritas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais genes que têm alta homologia, homologia de 80% ou superior, homologia de 90% ou superior, homologia de 95% ou superior, homologia de 97% ou superior, homologia de 99% ou superior são hibridizados entre si e genes que têm homologia inferior à homologia acima não são hibridizados entre si, ou condições de lavagem ordinárias de hibridização de Southern, ou seja, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes a uma concentração de sal e uma temperatura correspondentes a 60 °C, 1 x SSC, 0,1% de SDS, especificamente, 60 °C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS e, mais especificamente, 68 °C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. A sonda usada na hibridização pode ser uma parte de uma sequência complementar da

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 11/40 / 33 sequência de nucleotídeos. Tal sonda pode ser produzida pela PCR com uso de oligonucleotídeos produzidos com base na sequência conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA que contém essas sequências de nucleotídeos como um modelo. Ademias, aqueles versados na técnica podem ajustar a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem de acordo com fatores, tais como o comprimento da sonda, caso necessário.

[014] Conforme usado neste instrumento, o termo “homologia” refere-se a uma porcentagem de identidade entre duas porções químicas de polinucleotídeos ou polipeptídeos. A homologia da sequência de uma porção química para outra pode ser determinada por uma técnica conhecida na arte. Por exemplo, a homologia pode ser determinada alinhando-se diretamente a informação de sequência de duas moléculas de polinucleotídeos ou duas moléculas de polipeptídeos, por exemplo, parâmetros tais como pontuação, identidade, similaridade, etc., por meio do uso de um programa de computador que seja prontamente disponível e capaz de alinhar informações de sequência (por exemplo, BLAST 2.0). Além disso, a homologia entre polinucleotídeos pode ser determinada hibridizando-se os polinucleotídeos sob uma condição para formar um filamento duplo estável nas regiões homólogas seguidas pela digestão do filamento hibridizado por uma nucleasse de filamento único específica para determinar o tamanho dos fragmentos digeridos.

[015] Em uma modalidade, a frutose-4-epimerase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um micro-organismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Anaerolinea sp., o gênero de Dictyoglomus ou uma variação do mesmo, especificamente, uma enzima derivada de Dictyoglomus thermophilum, ou uma variação da mesma, especificamente, uma enzima derivada de Anaerolinea thermophila, Anaerolineae bacterium, ou Dictyoglomus thermophilum, ou uma variação da mesma, mas sem se limitar a tanto.

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Ί ! 33 [016] Em uma modalidade, a frutose-4-epimerase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de um micro-organismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Dictyoglomus thermophilum, ou uma variação da mesma, mas sem se limitar a tanto.

[017] A frutose-4-epimerase da presente revelação ou uma variação da mesma é caracterizada por converter D-frutose em D-tagatose pela epimerização de D-frutose na posição C4. Revelou-se que a tagatose-6-fosfato quinase da presente revelação tem atividade de frutose-4-epimerase. Conhecese a tagatose-6-fosfato quinase por produzir D-tagatose 1,6-bifosfato a partir de D-tagatose 6-fosfato como um substrato. Em outras palavras, revelou-se recentemente que a tagatose-6-fosfato quinase tem atividade de frutose-4epimerase. Dessa forma, uma modalidade da presente revelação refere-se ao uso inovador da tagatose-6-fosfato quinase, inclusive com o uso da tagatose6-fosfato quinase como a frutose-4-epimerase na produção de tagatose a partir da frutose. Além disso, outra modalidade da presente revelação refere-se a um método de produção de tagatose a partir da frutose por meio do uso da tagatose-6-fosfato quinase como a frutose-4-epimerase.

[018] Em uma modalidade, a frutose-4-epimerase da presente revelação pode ser uma enzima que tem alta resistência ao calor. Especificamente, a frutose-4-epimerase da presente revelação pode exibir 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, ou 75% a 100% de sua atividade máxima de 50 °C a 70 °C. Mais especificamente, a frutose-4-epimerase da presente revelação pode exibir 80% a 100% ou 85% a 100% de sua atividade máxima de 55 °C a 60 °C, 60 °C a 70 °C, 65 °C, 60 °C ou 70 °C.

[019] Ademais, a frutose-4-epimerase que consiste em SEQ ID NO:

pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2; a frutose-4-epimerase que consiste em SEQ ID NO: 3 pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4; a frutose-4-epimerase que consiste em SEQ ID NO: 5 pode ser codificada por uma sequência de

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 13/40 / 33 nucleotídeos de SEQ ID NO: 6; mas sem se limitar a tanto.

[020] A frutose-4-epimerase da presente revelação ou um variação da mesma pode ser obtida por meio da transformação de um micro-organismo como E.coli com DNA que expressa a enzima da presente revelação ou a variação da mesma, por exemplo, um nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, 4, ou 6, a cultura do micro-organismo para obtenção de uma cultura, interrupção da cultura e então a realização de purificação por meio do uso de uma coluna, etc. O micro-organismo para transformação pode incluir Corynebacterium glutamicum, Aspergillus oryzae, ou Bacillus subtilis, além de Escherichia coli.

[021] Em uma modalidade específica, o micro-organismo transformado pode ser E.coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E (outro nome do mesmo é E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-anl), E.coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E, ou E.coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E, e esses microorganismos foram depositados junto ao Centro de Cultura de Microorganismos Coreano, que é uma Autoridade de Depósito Internacional conforme as Disposições do Tratado de Budapeste, com Números de Acesso KCCM11996P (data de depósito: 20 de março de 2017), KCCM12093P (data de depósito: 11 de agosto de 2017) e KCCM12109P (data de depósito: 13 de setembro de 2017). A frutose-4-epimerase usada na presente revelação pode ser fornecida usando-se um ácido nucleico que codifica a mesma.

[022] Conforme usado neste documento, o termo “ácido nucleico” significa que abrange moléculas de DNA ou RNA, em que nucleotídeos que são unidades constituintes básicas no ácido nucleico podem incluir não apenas nucleotídeos naturais, mas também análogos com modificação de açúcar ou base (vide: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman e Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

[023] O ácido nucleico da presente revelação pode ser um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo que consiste na sequência de

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 14/40 / 33 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 da presente revelação ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a frutose-4-epimerase da presente revelação e que tem a atividade de frutose-4-epimerase. Especificamente, o ácido nucleico que codifica a frutose-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 pode ser um ácido nucleico que tem pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%; de homologia com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Também é aparente que o ácido nucleico da presente revelação pode incluir um ácido nucleico que é traduzido para a ffutose-4-epimerase da presente revelação devido à degeneração de códons ou a um ácido nucleico que hibridiza com um ácido nucleico que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 sob condições estritas e codifica o polipeptídeo que tem a atividade de frutose-4-epimerase da presente revelação.

[024] O micro-organismo que expressa a frutose-4-epimerase que pode ser usada na presente revelação pode ser um micro-organismo, inclusive um vetor recombinante que inclui o ácido nucleico. O vetor pode ser ligado operativamente ao ácido nucleico da presente revelação. Conforme usado neste documento, o termo “ligado operativamente” significa que uma sequência regulatória de expressão de nucleotídeo e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína desejada são ligadas operativamente entre si para realizar as funções gerais, de modo a afetar a expressão da sequência de nucleotídeos de codificação. A ligação operável ao vetor pode ser produzida por meio do uso de uma tecnologia de recombinação genética que usa uma tecnologia de recombinação genética conhecida na técnica, e a divagem de DNA específica do local e a ligação pode ser produzida por meio do uso de enzimas e ligases de restrição conhecidas na técnica.

[025] Conforme usado neste documento, o termo “vetor” refere-se a

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10/33 qualquer mediador para clonagem e/ou transferência de bases em um organismo, tal como uma célula hospedeira. O vetor pode ser um replicon que é capaz de trazer a replicação de fragmentos combinados nos quais diferentes fragmentos de DNA são combinados. Aqui, o termo “replicon” refere-se a qualquer unidade genética (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que funcione como uma autounidade de replicação de DNA in vivo, ou seja, que seja capaz de ser replicada por autorregulação. Conforme usado neste documento, o termo “vetor” pode incluir mediadores virais e não virais para introduzir as bases no organismo, por exemplo, uma célula hospedeira, in vitro, ex vivo ou in vivo, e também pode incluir um DNA minicircular, um transposon, tal como Bela Adormecida (Izsvak et al. J. Mol. Biol. 302:93-102 (2000)), ou um cromossomo artificial. Exemplos do vetor comumente usado podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor de ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, tlO, tll, Charon4A, Charon21A, etc., podem ser usados; e como um vetor de plasmídeo, aqueles usados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc., podem ser usados. Os vetores que podem ser usados na presente revelação não são particularmente limitados, mas qualquer vetor recombinante conhecido pode ser usado.

[026] Ademais, o vetor pode ser um vetor recombinante caracterizado por incluir ainda vários genes de resistência a antibióticos. Conforme usado neste documento, o termo “gene de resistência a antibióticos” refere-se a um gene que tem resistência contra um antibiótico, e uma célula que tem esse gene sobrevive em um ambiente tratado com o antibiótico correspondente. Assim, o gene de resistência a antibióticos é usado como um marcador selecionável durante a produção de uma grande quantidade de plasmídeos em E.coli. O gene de resistência a antibióticos na presente revelação não é um fator que influencie muito a eficiência da

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11/33 expressão de acordo com combinações ideais de vetores, o que é uma tecnologia chave da presente revelação e, portanto, um gene de resistência a antibióticos que seja geralmente usado como um marcador selecionável pode ser usado sem limitação. Exemplos específicos podem incluir um gene de resistência contra ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, estreptomicina ou neomicina.

[027] O micro-organismo que expressa a frutose-4-epimerase que pode ser usada na presente revelação pode ser obtido por um método de introdução do vetor que inclui o ácido nucleico que codifica a enzima em uma célula hospedeira, e um método de transformar o vetor pode ser qualquer método, desde que o mesmo seja capaz de introduzir o ácido nucleico na célula. Uma técnica padrão apropriada conhecida na arte pode ser selecionada e executada. Eletroporação, coprecipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, microinjeção, um método de método DEAE-dextrano, um método de lipossoma catiônico, e um método de choque térmico podem ser incluídos, mas sem se limitar a tanto.

[028] Desde que o gene transformado possa ser expresso na célula hospedeira, o mesmo pode ser integrado ao cromossomo da célula hospedeira e colocado no mesmo, ou pode existir extracromossomicamente. Ademais, o gene inclui DNA e RNA como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e qualquer forma pode ser usada sem limitação, desde que possa ser introduzida na célula hospedeira e expressa na mesma. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de polinucleotídeo que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão inclui um promotor ligado operavelmente ao gene, sinais de terminações transcricionais, locais de aglutinação de ribossomos e sinais de terminação de tradução. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Ademais, o gene, como é ou na forma de

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12/33 um construto de polinucleotídeo, pode ser introduzido na célula hospedeira e operavelmente ligada a sequências necessárias para expressão na célula hospedeira.

[029] O micro-organismo da presente revelação pode incluir um micro-organismo procariótico ou um micro-organismo eucariótico, desde que seja um micro-organismo capaz de produzir a frutose-4-epimerase da presente revelação por meio da inclusão do ácido nucleico da presente revelação ou do vetor recombinante da presente revelação. Por exemplo, o micro-organismo pode incluir cepas de micro-organismos que pertencem ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium, e ao gênero Brevibacterium e, especificamente, pode ser E.coli ou Corynebacterium glutamicum, mas não se limita aos mesmos. Exemplos específicos do micro-organismo podem incluir E.coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E ou E.coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E.

[030] O micro-organismo da presente revelação pode incluir qualquer micro-organismo capaz de expressai' a frutose-4-epimerase da presente revelação de acordo com vários métodos conhecidos, além da introdução do ácido nucleico ou do vetor.

[031] A cultura do micro-organismo da presente revelação pode ser produzida por meio da realização de cultura, em um meio, do microorganismo capaz de expressar a tagatose-6-fosfato quinase da presente revelação.

[032] Conforme usado no presente documento, o termo “realização de cultura” significa que se permite que o micro-organismo cresça sob condições ambientais apropriadamente controladas. O processo de realização de cultura da presente revelação pode ser conduzido de acordo com um meio apropriado e condições de cultura conhecidas na técnica. O processo de

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13/33 realização de cultura pode ser facilmente ajustado por aqueles versados na técnica, de acordo com a cepa a ser selecionada. A etapa de realização de cultura do micro-organismo pode ser conduzida por um processo de lote conhecido, um processo contínuo ou um processo de lote alimentado, embora não se limite particularmente a esses processos. Com relação às condições de cultura, um pH apropriado (por exemplo, pH de 5 a 9, especificamente pH de 6 a 9) pode ser ajustado com o uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), mas não particularmente limitado a isso. Ademais, um agente antiespumante, tal como éster poliglicólico de ácido graxo, pode ser adicionado durante o processo de realização de cultura para impedir a geração de espuma. Ademais, oxigênio ou um gás que contém oxigênio pode ser injetado na cultura a fim de manter um estado aeróbico da cultura; ou nitrogênio, hidrogênio ou gás dióxido de carbono pode ser injetado sem a injeção de um gás a fim de manter um estado de cultura anaeróbico ou microaeróbico. A temperatura da cultura pode ser mantida de 25 °C a 40 °C e, especificamente, de 30 °C a 37 °C, mas não se limita às mesmas. A realização de cultura pode ser continuada até a quantidade desejada de materiais úteis ser obtida e, especificamente, por cerca de 0,5 hora a cerca de 60 horas, não se limita às mesmas. Além disso, o meio de cultura a ser usado pode incluir, como fontes de açúcar, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético). Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não se limitam a tanto. Fontes de nitrogênio podem incluir compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 19/40 / 33 carne, extrato de malte, licor de maceração do milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio). Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não se limitam a tanto. Fontes de fósforo podem incluir fosfato dideutério de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou os sais de sódio correspondentes. Essas fontes de fósforo também podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não se limitam a tanto. O meio de cultura pode incluir estimuladores do crescimento essenciais, tais como sais de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, e vitaminas.

[033] A composição para produção de tagatose da presente revelação pode incluir frutose.

[034] A composição para produção de tagatose da presente revelação pode incluir tagatose-6-fosfato quinase que tem atividade de 4-epimerização de frutose para converter diretamente frutose em tagatose, um microorganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do micro-organismo, a composição caracterizada por não incluir outras enzimas além de frutose como um substrato.

[035] Por exemplo, a composição para produção de tagatose da presente revelação pode ser caracterizada por não incluir, por exemplo, aglucan fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase, a expressão dos mesmos por um micro-organismo ou uma cultura do micro-organismo;

glucoquinase, um micro-organismo que expressa a glucoquinase ou uma cultura do micro-organismo;

tagatose-6-fosfato fosfatase, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do micro-organismo; e/ou

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15/33 α-amilase, pululanase, glucoamilase, sucrase ou isoamilase; um micro-organismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sucrase ou isoamilase; ou uma cultura do micro-organismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sucrase ou isoamilase.

[036] A composição para produção de tagatose da presente revelação pode incluir ainda qualquer excipiente adequado comumente usado na composição correspondente para produção de tagatose. O excipiente pode incluir, por exemplo, um preservativo, um agente umectante, um agente dispersante, um agente de suspensão, um tampão, um agente de estabilização, um agente isotônico, etc., mas não se limita a tanto.

[037] A composição para produção de tagatose da presente revelação pode incluir ainda um metal. Em uma modalidade, o metal da presente revelação pode ser um metal que contém um cátion divalente. Especificamente, o metal da presente revelação pode ser magnésio, níquel ou manganês (Mn). Mais especificamente, o metal da presente revelação pode ser um íon de metal ou um sal de metal, e muito mais especificamente, o sal de metal pode ser MgC12, MgSO4, NiSO4, NÍC12, MnC12, ou MnSO4.

[038] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de tagatose, que compreende a conversão de frutose em tagatose por meio da colocação em contato de frutose (D-frutose com a frutose-4epimerase da presente revelação, sendo que o micro-organismo expressa a frutose-4-epimerase, ou a cultura do micro-organismo.

[039] Em uma modalidade, a colocação em contato da presente revelação pode ser realizada sob condições de pH de 5,0 a pH 9,0 e 30 °C a 80 °C e/ou por 0,5 hora a 48 horas.

[040] Especificamente, a colocação em contato da presente revelação pode ser realizada sob uma condição de pH 6,0 a pH 9,0 ou pH 7,0 a pH 9,0. Além disso, a colocação em contato da presente revelação pode ser realizada sob uma condição de temperatura de 35 °C a 80 °C, 40 °C a 80 °C,

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16/33 °C a 80 °C, 50 °C a 80 °C, 55 °C a 80 °C, 60 °C a 80 °C, 30 °C a 70°C, °C a 70 °C, 40 °C a 70 °C, 45 °C a 70 °C, 50 °C a 70 °C, 55 °C a 70°C, °C a 70 °C, 30 °C a 65 °C, 35 °C a 65 °C, 40 °C a 65 °C, 45 °C a 65°C, °C a 65 °C, 55 °C a 65 °C, 30 °C a 60 °C, 35 °C a 60 °C, 40 °C a 60°C, °C a 60 °C, 50 °C a 60 °C ou 55 °C a 60 °C. Ademais, a colocação em contato da presente revelação pode ser realizada por 0,5 hora a 36 horas, 0,5 hora a 24 horas, 0,5 hora a 12 horas, 0,5 hora a 6 horas, 1 hora a 48 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 12 horas, 1 hora a 6 horas, 3 horas a 48 horas, 3 horas a 36 horas, 3 horas a 24 horas, 3 horas a 12 horas, 3 horas a 6 horas, 6 horas a 48 horas, 6 horas a 36 horas, 6 horas a 24 horas, 6 horas a 12 horas, 9 horas a 48 horas, 9 horas a 36 horas, 9 horas a 24 horas, ou 9 horas a 12 horas,.

[041] Em uma modalidade, a colocação em contato da presente revelação pode ser realizada na presença de um metal.

[042] No método de produção de tagatose da presente revelação, a frutose-4-epimerase da presente revelação, o micro-organismo que expressa a frutose-4-epimerase, a cultura do micro-organismo, o metal, o íon de metal e o sal de metal são os mesmos que aqueles na modalidade descrita acima.

[043] O método de produção da presente revelação pode incluir ainda a separação e/ou purificação da tagatose produzida. A separação e/ou purificação pode ser um método comumente usado na técnica. Exemplos não limitativos podem incluir diálise, precipitação, adsorção, eletroforese, cromatografia de troca de íons, cristalização fracional, etc. O método de purificação pode ser realizado apenas por um único método ou por dois ou mais métodos.

[044] Além disso, o método de produção da presente revelação pode incluir ainda a etapa de realizar descoloração e/ou dessalinização, antes ou após a etapa (ou etapas) de separação e/ou purificação. Ao realizar a descoloração e/ou dessalinização, é possível obter tagatose com maior

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[045] Em ainda outra modalidade, o método de produção da presente revelação pode incluir ainda a etapa de realizar a cristalização da tagatose, após a etapa de conversão em tagatose da presente revelação, realizar a separação e/ou purificação, ou realizar a descoloração e/ou dessalinização. A cristalização pode ser realizada por um método de cristalização comumente usado. Por exemplo, a cristalização pode ser realizada por cristalização de resfriamento.

[046] Em ainda outra modal idade, o método de produção da presente revelação pode incluir ainda a etapa de concentrar tagatose, antes da cristalização. A concentração pode aumentar a eficiência da cristalização.

[047] Em ainda outra modalidade, o método de produção da presente revelação pode incluir ainda a etapa de colocar em contato frutose não reagida com a enzima da presente revelação, o micro-organismo que expressa a enzima, ou a cultura do micro-organismo após a separação e/ou purificação, a etapa de reusar uma solução mãe separada por cristal na separação e/ou purificação após a cristalização da presente revelação, ou uma combinação das mesmas. As etapas adicionais são economicamente vantajosas pelo fato de que tagatose pode ser obtida com maior rendimento e a quantidade de frutose a ser descartada pode ser reduzida.

[048] Doravante, a presente revelação será descrita em maiores detalhes com referência a Exemplos. Contudo, os seguintes Exemplos da presente revelação são meramente um exemplo da presente revelação e o conteúdo da presente revelação não se limita aos mesmos. Será aparente àqueles versados na técnica que esses Exemplos são para fins de ilustração da presente revelação em maiores detalhes e o escopo da presente revelação, conforme descrito nas reivindicações em anexo, não é limitado por esses Exemplos.

EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE E

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AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE

EXEMPLO 1-1: PRODUÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO RECOMBINANTES E TRANSFORMANTES QUE INCLUEM GENE DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE [049] Para fornecer uma frutose-4-epimerase inovadora e resistente ao calor, informações dos genes da tagatose-6-fosfato quinase derivados de dois tipos de Anaerolinea thermophile foram obtidas para preparar vetores que podem ser expressos em E.coli e micro-organismos transformados (transformantes).

[050] Em detalhes, uma sequência de nucleotídeos da tagatose-6fosfato quinase foi selecionada a partir de sequências de nucleotídeos de Anaerolinea thermophile, que estão registradas na KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto), e com base em uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 8) de Anaerolinea thermophile, vetores de expressão recombinantes preparados por meio da inserção em pBT7-C-His, que é um vetor que pode ser expresso em E.coli, foram sintetizados na Bioneer Corp. Para usar o vetor de expressão recombinante, realizou-se PCR por meio do uso de DNA genômico de Anaerolinea thermophile e iniciador 1: ATATACATATGATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTG (SEQ ID NO:

13) e iniciador 2: TGGTGCTCGAGCCCGCACGCCGCAGCGTA ATCTTCCAG (SEQ ID NO: 14) sob condições de desnaturação a 94 °C for 2 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 60 °C por 30 segundos, elongação a 72 °C por 2 minutos, e então elongação a 72 °C por 5 minutos.

[051] Para induzir a expressão de proteína, cada vetor foi transformado em BL21(DE3), que é uma cepa para expressão em E.coli, e designado como E.coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E e E.coli

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BL21 (DE3)/CJ_ANTA_F4E, respectivamente. E.coli

BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E e E.coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E foram depositados conforme as disposições do Tratado de Budapeste com o N® de Acesso KCCM11996P em 20 de março de 2017, e N® de Acesso KCCM12232P em 23 de março de 2018, respectivamente.

EXEMPLO 1-2: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS RECOMBINANTES [052] Para produzir enzimas recombinantes, cada um dentre E.coli

BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E e E.coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E, que são os transformantes produzidos no Exemplo 1-1, foram inoculados em um tubo de cultura que contém 5 ml de um meio líquido de LB com ampicilina, e então a cultura de inoculação foi realizada em uma incubadora de agitação a 37 °C até a absorção a 600 nm ter atingido 2,0. Cada uma das culturas obtidas pela cultura de cultura de inoculação foi inoculada em um frasco de cultura que contém um meio líquido que contém LB (caldo de lisogenia) e lactose, que é um regulador da expressão de proteína, e então a cultura principal foi realizada. Durante a cultura, uma velocidade de agitação foi mantida a 180 rpm e uma temperatura da cultura foi mantida a 37 °C. Cada cultura foi centrifugada a 8.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e ressuspensas em 50 mM de tampão de NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células ressuspensas foram interferidas por meio do uso de um sonicador. Lisados de células foram centrifugados a 13.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para obter apenas sobrenadantes. Cada sobrenadante foi purificado por cromatografia de afinidade de His-tag, e volumes de 10 colunas de 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 20 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram aplicados para remover proteínas não especificamente aglutinadas. A seguir, 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 250 mM de imidazol e 300

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20/33 mM de NaCl foram adicionalmente aplicados para realizar a eluição. A diálise foi realizada por meio do uso de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) para obter dois tipos de enzimas (CJ_ANT_F4E, CJ_ANTA_F4E) para caracterização enzimática. Como resultado, confirmou-se que a frutose-4epimerase recombinante purificada foi submetida a análise de SDS-PAGE, e a CJ_ANT_F4E foi cerca de 47 kDa (Figura 1).

EXEMPLO 1-3: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE PARA CONVERTER FRUTOSE EM TAGATOSE [053] Para medir as atividades das enzimas obtidas no Exemplo 1-2, usou-se 30% em peso de frutose e 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM de CoSO4 e 20 mg/ml de enzima purificada separada no Exemplo 1-2 foram adicionados às mesmas, permitindo-se que os mesmos reagissem a 60 °C por 2 horas. As concentrações da tagatose convertida pela frutose-4-epimerases, CJ_ANT_F4E e CJ_ANTA_F4E, e as taxas de conversão da frutose em tagatose foram examinadas e, como resultado, a CJ_ANT_F4E mostrou uma taxa de conversão de 16,1%, e a CJ__ANTA__F4E mostrou uma taxa de conversão de 21,9%. Essas taxas de conversão foram calculadas pela seguinte equação: taxa de conversão - quantidade de produção da tagatose/concentração de substrato de frutose X 100 [054] Além disso, a frutose restante após a reação e uma tagatose produto foram quantificadas por HPLC. Usou-se Shodex Sugar SP0810 como uma coluna e uma temperatura da coluna foi 80 °C, e água como uma fase móvel foi aplicada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Nas Figuras 2 e 10, um pico que representa a reação da enzima que usa frutose como um substrato foi detectado e quantificado por cromatografia de HPLC.

EXEMPLO 1-4: EFEITO DA TEMPERATURA AOBRE A ATIVIDADE DE 4-EPIMERIZAÇÃO DE FRUTOSE [055] Para examinar um efeito da temperatura sobre as atividades de epimerização das enzimas da presente revelação, cada 1 mg/ml das enzimas

Petição 870190100929, de 08/10/2019, pág. 26/40 / 33 purificadas produzidas no Exemplo 1-2 foi adicionado a 50 mM de tampão Tris HC1 (pH 8,0) que contém frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 50 °C a 80 °C por 3 horas. A tagatose em cada uma das soluções reagidas foi quantificada por HPLC. Como resultado, a enzima CJ_ANT_F4E da presente revelação mostrou suas atividades máximas a 70 °C (Figura 3).

EXEMPLO 2: EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE

EXEMPLO 2-1: PRODUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E TRANSFORMANTE QUE INCLUI GENE DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE [056] Os presentes inventores obtiveram informações de um gene de tagatose-6-fosfato quinase derivado de Anaerolineae bacterium, Taxon ID: 2654588098, e prepararam um vetor recombinante que pode ser expresso em E.coli e um micro-organismo transformado.

[057] Mais especificamente, uma sequência de nucleotídeos da tagatose-6-fosfato quinase foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotídeos de Anaerolineae bacterium, que está registrada na KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto) e no ENA (Arquivo Europeu de Nucleotídeos), e com base em uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 4) da tagatose-6fosfato quinase CJ_AB_F4E derivada de Anaerolineae bacterium, pBT7-CHis-CJ_AB_F4E, que é um vetor de expressão recombinante que contém a sequência de nucleotídeos da enzima e que pode ser expresso em E.coli, foi produzida (Bioneer Corp., Coréia).

[058] O vetor recombinante foi transformado em E.coli BL21(DE3) por transformação de choque de calor (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001), e congelado e armazenado em 50% de glicerol. O transformante foi designado como E.coli BL21(DE3)/CJ__AB_F4E e depositado no Centro de Cultura de Micro-Organismos Coreano (KCCM),

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22/33 que é uma autoridade de depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em 11 de agosto de 2017, com o N» de Acesso KCCM12093P.

EXEMPLO 2-2: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMA RECOMBINANTE [059] Para obter uma enzima recombinante da presente revelação a partir de E.coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E, que é o transformante produzido no Exemplo 2-1, o transformante foi inoculado em um tubo de cultura que contém 5 ml de um meio líquido de LB com antibiótico ampicilina e então realizou-se cultura de inoculação em uma incubadora de agitação a 37 °C até a absorção a 600 mn ter atingido 2,0. A cultura obtida pela cultura de cultura de inoculação foi inoculada em um frasco de cultura que contém um meio líquido que contém LB e lactose, que é um regulador da expressão de proteína, e então a cultura principal foi realizada. A cultura de inoculação e a cultura principal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Então, a cultura foi centrifugada a 8.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com 50 mM de tampão TrisHC1 (pH 8,0) duas vezes e ressuspensas em 50 mM de tampão de NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células ressuspensas foram interferidas por meio do uso de um sonicador. Um lisado de células foi centrifugado a 13.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para tomar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado por cromatografia de afinidade de His-tag e volumes de 10 colunas de 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 20 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram aplicados para remover proteínas não especificamente aglutinadas. A seguir, 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 250 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram adicionalmente aplicados para realizar a eluição. A diálise foi realizada por meio do uso de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) para obter CJ_AB_F4E, que é uma enzima purificada para caracterização enzimática.

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EXEMPLO 2-3: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE PARA CONVERTER FRUTOSE EM TAGATOSE [060] Para medir a atividade de CJ_AB_F4E, que é a enzima recombinante da presente revelação obtida no Exemplo 2-2, 50 mM de TrisHC1 (pH 8,0), 1 mM de NÍSO4, e 20 mg/ml de CJ_AB_F4E foram adicionados a 30% em peso de frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 60 °C por 10 horas.

[061] Além disso, a frutose restante após a reação e uma tagatose produto foram quantificadas por HPLC. Realizou-se HPLC por meio do uso de Shodex Sugar SP0810 como uma coluna, e uma temperatura da coluna foi 80 °C, e água como uma fase móvel foi aplicada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min (Figura 4).

[062] Como resultado, confirmou-se que a taxa de conversão de frutose em tagatose pela enzima da presente revelação era 5,1%.

EXEMPLO 2-4: EXAME DA ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE DE ACORDO COM A MUDANÇA DE TEMPERATURA [063] Para examinar um efeito da temperatura sobre a atividade de

4-epimerização de frutose da enzima recombinante CJ_AB_F4E preparada no Exemplo 2-2, 1 mg/ml de CJ_AB_F4E foi adicionado a 50 mM de tampão Tris HC1 (pH 8,0) que contém 10% em peso de frutose, permitindo-se que o mesmo reagisse em diferentes temperaturas de 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C e 70 °C por 3 horas. A tagatose em cada uma das soluções reagidas foi quantificada por HPLC.

[064] Como resultado, CJ__AB__F4E mostrou sua atividade máxima a °C, e CJ_AB_F4E manteve 50% ou mais de sua atividade máxima de 50 °C a 70 °C (Figura 5).

EXEMPLO 2-5: EXAME DA ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE, DE ACORDO COM A ADIÇÃO DE ION DE METAL

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24/33 [065] Sabe-se que as isomerases conhecidas, por exemplo, glicose isomerase e arabinose isomerase, e epimerases, por exemplo, psicose 3epimerase, exigem íons de metal. Portanto, examinou-se se íons de metal afetam a atividade de 4-epimerização de frutose da enzima recombinante CJ_AB_F4E preparada no Exemplo 2-2.

[066] Mais especificamente, 2 mg/ml de CJ__AB_F4E e cada 1 mM de vários íons de metal, NÍSO4, CaC12, ZnSO4, MgSO4, MnSO4, FeSO4, CuSO4, ou (NH4)2SO4 foram adicionados a 50 mM de tampão Tris HCI (pH 8,0) que contém 10% em peso de frutose para medir a atividade enzimática. O não tratamento dos íons de metal foi determinado como um grupo de controle. A tagatose em cada uma das soluções reagidas foi quantificada por HPLC.

[067] Como resultado, a atividade de CJ_AB_F4E da presente revelação foi aumentada por adição de MnSO4, ou NÍSO4, o que indica que CJ_AB_F4E exige íons de metal, tais como íon de manganês ou íon de níquel. Em particular, CJ_AB_F4E mostrou sua atividade máxima quando se adicionou NÍSO4 (Figura 6).

EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE

EXEMPLO 3-1: PRODUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE E MICROORGANISMO RECOMBINANTE QUE INCLUI GENE DE TAGATOSE6-FOSFATO QUINASE [068] Para identificar uma frutose-4-epimerase inovadora e resistente ao calor, informações do gene de tagatose-6-fosfato quinase derivado de Dictyoglomus thermophilum DSM 3960 foram obtidas para preparar um vetor que pode ser expresso em E.coli e um micro-organismo transformado.

[069] Em detalhes, uma sequência de nucleotídeos da tagatose-6fosfato quinase foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotídeos de Dictyoglomus thermophilum, que é registrado na KEGG (Enciclopédia de

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Genes e Genomas de Kyoto), e com base em uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 6) da tagatose-6-fosfato quinase CJ_DT_F4E derivada de Dictyoglomus thermophilum, pBT7-C-His-CJ_DT_F4E, que é um vetor de expressão recombinante que contém a sequência de nucleotídeos da enzima e pode ser expresso em E.coli foi sintetizada (Bioneer Corp., Coreia).

[070] O vetor recombinante foi transformado em E.coli BL21(DE3) por transformação de choque de calor (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para preparar um micro-organismo recombinante, que foi então congelado e armazenado em 50% de glicerol. O micro-organismo recombinante foi designado como E.coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E, e depositado no Centro de Cultura de Micro-Organismos Coreano (KCCM), que é uma autoridade de depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em 13 de setembro de 2017 com o N® de Acesso KCCM12109P.

EXEMPLO 3-2: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS RECOMBINANTES [071] Para produzir enzima recombinante CJ_DT_F4E a partir de

E.coli BL2i(DE3)/CJ_DT_F4E, que é o micro-organismo recombinante produzido no Exemplo 3-1, o micro-organismo recombinante foi inoculado em um tubo de cultura que contém 5 ml de um meio líquido de LB com antibiótico ampicilina, e então a cultura de inoculação foi realizada em uma incubadora de agitação a 37 °C até a absorção a 600 nm ter atingido 2,0. A cultura obtida pela cultura de cultura de inoculação foi inoculada em um frasco de cultura que contém um meio líquido que contém LB e lactose, que é um regulador da expressão de proteína, e então a cultura principal foi realizada. A cultura de inoculação e a cultura principal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Então, a cultura foi centrifugada a 8.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram

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26/33 lavadas com 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas em 50 mM de tampão de NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células suspensas foram interferidas por meio do uso de um sonicador. Lisados de células foram centrifugados a 13.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para tomar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado por cromatografia de afinidade de His-tag e volumes de 10 colunas de 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 20 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram aplicados para remover proteínas não especificamente aglutinadas. A seguir, 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 250 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram adicionalmente aplicados para realizar a eluição. A diálise foi realizada por meio do uso de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) para obter CJ_DT_F4E, que é uma enzima purificada para caracterização enzimática.

EXEMPLO 3-3: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE PARA CONVERTER FRUTOSE EM TAGATOSE [072] Para medir a atividade de CJ__DT__F4E, que é a enzima recombinante obtida no Exemplo 3-2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM M11SO4, e 5 mg/ml de CJ_DT_F4E foram adicionados a 30% em peso de frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 60°C por 10 horas.

[073] Além disso, a frutose restante após a reação e uma tagatose produto foram quantificadas por HPLC. Realizou-se HPLC por meio do uso de Shodex Sugar SP0810 como uma coluna, e uma temperatura da coluna foi 80 °C, e água como uma fase móvel foi aplicada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min (Figura 7).

[074] Como resultado, confirmou-se que a taxa de conversão da frutose em tagatose pela enzima recombinante CJ_DT_F4E foi 2%.

EXEMPLO 3-4: EXAME DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE DE ACORDO COM A TEMPERATURA [075] Para examinar um efeito da temperatura sobre a atividade de

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4-epimerização de frutose da enzima recombinante CJ_DT_F4E obtida no Exemplo 3-2, 5 mg/ml de CJ_DT_F4E foram adicionados a 50 mM de tampão Tris HCI (pH 8,0) que contém 5% em peso de frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 40 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C e 70 °C por 5 horas. A tagatose em cada uma das soluções reagidas foi quantificada por HPLC.

[076] Como resultado, a CJ_DT_F4E mostrou sua atividade máxima a 60 °C, e mostrou 80% ou mais de sua atividade máxima a 50 °C a 70 °C e 95% ou mais de sua atividade máxima de 55 °C a 70 °C (Tabela 1, Figura 8). [TABELA 1]

ATIVIDADE RELATIVA (%) EM CADA TEMPERATURA

Seção	CJ..DT..F4E
40 °C	44,0
50 °C	80,3
55 °C	98,9
60 °C	100,0
70 °C	98,2

EXEMPLO 3-5: EXAME DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE DE ACORDO COM A ADIÇÃO DE METAL [077] Examinou-se se metais afetam a atividade de 4-epimerização de frutose da enzima recombinante CJJDTJF4E preparada no Exemplo 3-2.

[078] Em detalhes, 5 mg/ml de CJ„DT__F4E e 1 mM de um íon de metal (MgSO4 ou MnSO4) foram adicionados a 50 mM de tampão Tris HCI (pH 8,0) que contém 5% em peso de frutose, e então a atividade enzimática foi medida. O não tratamento dos íons de metal foi determinado como um grupo de controle (w/o). A tagatose em cada uma das soluções reagidas foi quantificada por HPLC.

[079] Como resultado, a atividade de CJ„DT„F4E foi aumentada por adição de MnSO4 ou MnSO4, o que indica que íon de manganês ou íon de magnésio (ou urn sal do mesmo) é capaz de aumentar a atividade de 4epimerização de frutose de CJ_DT„F4E (Figura 9). Em particular, confirmouse que a atividade de CJ_DT„F4E foi aumentada em cerca de 2,5 vezes ou mais por adição de MnSO4, em comparação com o grupo de controle (Figura

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9).

EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE

EXEMPLO 4-1: PRODUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE E MICROORGANISMO RECOMBINANTE QUE INCLUI GENE DE TAGATOSE6-FOSFATO QUINASE [080] Para identificar uma frutose-4-epimerase inovadora e resistente ao calor, informações de um gene de tagatose-6-fosfato quinase derivado de Thermobifida halotolerans foram obtidas para reparar um vetor recombinante que pode ser expresso em E.coli e um micro-organismo recombinante transformado.

[081] Especificamente, uma sequência de nucleotídeos da tagatose6-fosfato quinase foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotídeos de Thermobifida halotolerans, que está registrada na KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto), e com base em uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 10) da tagatose-6-fosfato quinase CJ_DT_F4E derivada de Thermobifida halotolerans, pBT7-C-His-CJ_TH_F4E, que é um vetor de expressão recombinante que contém a sequência de nucleotídeos da enzima e pode ser expresso em E.coli, foi sintetizada (Bioneer Corp., Coréia).

[082] O vetor recombinante foi transformado em E.coli BL21(DE3) por transformação de choque de calor (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para preparar um micro-organismo recombinante, e congelado e armazenado em 50% de glicerol. O micro-organismo recombinante foi designado como E.coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E, e depositado no Centro de Cultura de Micro-Organismos Coreano (KCCM), que é uma autoridade de depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em sexta-feira, 23 de março de 2018 com o de Acesso KCCM12235P.

EXEMPLO 4-2: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMA

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RECOMBINANTE [083] Para preparar uma enzima recombinante CJ_TH_F4E a partir do micro-organismo recombinante E.coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E produzido no Exemplo 4-1, o micro-organismo recombinante foi inoculado em um tubo de cultura que contém 5 ml de um meio líquido de LB com antibiótico ampicilina, e então a cultura de inoculação foi realizada em uma incubadora de agitação a 37 °C até a absorção a 600 nm ter atingido 2,0. A cultura obtida pela cultura de cultura de inoculação foi inoculada em um frasco de cultura que contém um meio líquido que contém LB e lactose, que é um regulador da expressão de proteína, e então a cultura principal foi realizada. A cultura de inoculação e a cultura pri ncipal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Então, a cultura foi centrifugada a 8.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas em 50 mM de tampão de NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células suspensas foram interferidas por meio do uso de um sonicador. Um Usado de células foi centrifugado a 13.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para tomar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado por cromatografia de afinidade de His-tag e volumes de 10 colunas de 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 20 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram aplicados para remover proteínas não especificamente aglutinadas. A seguir, 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 250 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foram adicionalmente aplicados para realizar a eluição. A diálise foi realizada por meio do uso de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) para obter CJ_TH_F4E, que é uma enzima purificada para caracterização enzimática.

EXEMPLO 4-3: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE PARA CONVERTER FRUTOSE EM TAGATOSE [084] Para medir a atividade de CJ_TH_F4E, que é a enzima

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30/33 recombinante obtida no Exemplo 4-2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM MnSO4, e 4 mg/ml de CJ_TH_F4E foram adicionados a 1% em peso de frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 55°C por 4 horas.

[085] A frutose remanescente após a reação e uma tagatose produto foram quantificadas por HPLC. Realizou-se HPLC por meio do uso de Shodex Sugar SP0810 como uma col una, e uma temperatura da coluna foi 80 °C, e água como uma fase móvel foi aplicada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min (Figura 11).

[086] Como resultado, confirmou-se que a taxa de conversão da frutose em tagatose pela enzima recombinante CJ_TH_F4E foi 0,1%.

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE

EXEMPLO 5-1: PRODUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE E MICROORGANISMO RECOMBINANTE QUE INCLUI GENE DE TAGATOSE6-FOSFATO QUINASE [087] Para identificar uma frutose-4-epimerase inovadora e resistente ao calor, informações de um gene de tagatose-6-fosfato quinase derivado de Thermoanaerobacter indiensis foram obtidas para preparar um vetor recombinante que pode ser expresso em E.coli e um micro-organismo recombinante transformado.

[088] Em detalhes, uma sequência de nucleotideos da tagatose-6fosfato quinase foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotideos de Thermoanaerobacter indiensis, que está registrada na KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto), e com base em uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) e uma sequência de nucleotideos (SEQ ID NO: 12) da tagatose-6-fosfato quinase CJJTAIJF4E derivada de Thermoanaerobacter indiensis, pBT7-C-His~CJ_TAI_F4E, que é um vetor de expressão recombinante que contém a sequência de nucleotideos da enzima e pode ser expresso em E.coli, foi sintetizada (Bioneer Corp., Coréia).

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31/33 [089] O vetor recombinante foi transformado em E.coli BL21(DE3) por transformação de choque de calor (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para preparar um micro-organismo recombinante, e congelado e armazenado em 50% de glicerol. O micro-organismo recombinante foi designado como E.coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E, e depositado no Centro de Cultura de Micro-Organismos Coreano (KCCM), que é uma autoridade de depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em sexta-feira, 23 de março de 2018 com ο Νθ de Acesso KCCM12236P.

EXEMPLO 5-2: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMA RECOMBINANTE [090] Para preparar uma enzima recombinante CJ_TAI_F4E a partir do micro-organismo recombinante E.coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4E produzido no Exemplo 5-1, o micro-organismo recombinante foi inoculado em um tubo de cultura que contém 5 ml de um meio líquido de LB com antibiótico ampicilina, e então a cultura de inoculação foi realizada em uma incubadora de agitação a 37 °C até a absorção a 600 nm ter atingido 2,0. A cultura obtida pela cultura de cultura de inoculação foi inoculada em um frasco de cultura que contém um meio líquido que contém LB e lactose, que é um regulador da expressão de proteína, e então a cultura principal foi realizada. A cultura de inoculação e a cultura principal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Então, a cultura foi centrifugada a 8.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas em 50 mM de tampão de NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células suspensas foram interferidas por meio do uso de um sonicador. Um lisado de células foi centrifugado a 13.000 rpm e 4 °C por 20 minutos para tomar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado por cromatografia de afinidade de His-tag e volumes de 10 colunas de 50 mM de tampão NaH2PO4 (pH 8,0) que contém 20 mM de imidazol e

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300 mM de NaCI foram aplicados para remover proteínas não especificamente aglutinadas. A seguir, 50 mM de tampão NaH2PC)4 (pH 8,0) que contém 250 mM de imidazol e 300 mM de NaCI foram adicional mente aplicados para realizar a eluição. A diálise foi realizada por meio do uso de 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) para obter CJ_TAI_F4E, que é uma enzima purificada para caracterização enzimática.

EXEMPLO 5-3: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA RECOMBINANTE PARA CONVERTER FRUTOSE EM TAGATOSE [091] Para medir a atividade de CJ_TAI_F4E, que é a enzima recombinante obtida no Exemplo 5-2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM MnSO4, e 5 mg/ml de CJ_TAI_F4E foram adicionados a 5% em peso de frutose, permitindo-se que os mesmos reagissem a 55°C por 10 horas.

[092] A frutose remanescente após a reação e uma tagatose produto foram quantificadas por HPLC. Realizou-se HPLC por meio do uso de Shodex Sugar SP0810 como uma coluna, e uma temperatura da coluna foi 80 °C, e água como uma fase móvel foi aplicada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min (Figura 12).

[093] Como resultado, confirmou-se que a taxa de conversão da frutose em tagatose pela enzima recombinante CJJTAI__F4E foi 8,7%. EFEITO DA INVENÇÃO [094] A frutose-4-epimerase da presente revelação tem excelente resistência ao calor, produz tagatose em uma escala industrial e converte frutose como um açúcar comum em tagatose com um alto rendimento e, dessa forma, é economicamente viável.

Autoridade de Depósito Internacional Centro de Cultura de MicroOrganismos Coreano (estrangeira) > de Acesso: KCCM11996P

Data de depósito: 20170320

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Organismos Coreano (estrangeira)

Ns de Acesso: KCCM12093P

Data de depósito: 20170811

Autoridade de Depósito Internacional Centro de Cultura de Microorganismos Coreano (estrangeira)

Ns de Acesso: KCCM12109P

Data de depósito: 20170913

Ns de Acesso: KCCM12232P

Data de depósito: 20180323

Ns de Acesso: KCCM12235P

Data de depósito: 20180323

Ns de Acesso: KCCM12236P

Data de depósito: 20180323

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para produção de tagatose, caracterizada pelo fato de que compreende tagatose-6-fosfato quinase, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do micro-organismo.
2. Composição para produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda frutose.
3. Composição para produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma ou mais da tagatose-6-fosfato quinase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11.
4. Composição para produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a tagatose-6-fosfato quinase ser uma enzima derivada de Anaerolineae sp., o gênero de Thermobifida, o gênero de Thermoanaerobacter ou o gênero de Dictyoglomus, ou uma variação dos mesmos.
5. Método de produção de tagatose, caracterizado pelo fato de que compreende a conversão de frutose em tagatose por meio da colocação em contato da frutose com tagatose-6-fosfato quinase, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do microorganismo.
6. Método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a colocação em contato ser realizada sob condições de pH 5,0 a pH 9,0 e 30 °C a 80 °C por 0,5 hora a 48 horas.