BR112020001762B1 - Variante de atp fosforribosiltransferase, polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium e método para produzir histidina com o uso do mesmo - Google Patents

Abstract

A presente revelação refere-se a uma proteína ATP fosforribosiltransferase (HisG) e um método para produzir histidina com o uso da mesma.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de ATP fosforribosiltransferase e um método para produzir histidina com o uso da mesma.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] L-Histidina é uma dentre os 20 aminoácidos padrão, em que a maioria desses, de um ponto de vista nutricional, não são necessários para adultos, porém, a mesma é classificada como um aminoácido essencial para crianças em crescimento. Adicionalmente, L-histidina está envolvida em importantes processos fisiológicos, tais como antioxidação, regulação imunológica, etc., e assim é usada na indústria médica (isto é, um agente para tratar úlcera gástrica, uma matéria-prima para um agente cardiovascular, sap de aminoácido, etc.).

[003] Histidina é principalmente encontrada na hemoglobina, e é produzida, principalmente, através de um método de extração de hidrólise de proteína que usa refeição de sangue como uma matéria-prima. No entanto, o mesmo tem desvantagens, tais como baixa eficiência, poluição ambiental, etc. Por outro lado, L- histidina pode ser produzida através de fermentação microbiana, porém, a industrialização em larga escala ainda não foi alcançada. Isso ocorre, pois, a biossíntese de L-histidina compete com o precursor de síntese de nucleotídeo, isto é, PRPP, e tem um processo biossíntese complicado e mecanismo regulador que exige grande quantidade de energia.

[004] A produtividade de L-histidina de um microrganismo usado em um método de fermentação aumentou através de um método de seleção mutagênica e mutante e um método de regulação do metabolismo de uma cepa através da modificação genética. Recentemente, sabe-se que a produção de histidina com o uso de microrganismos é alcançada através da biossíntese a partir de PRPP por meio de diversas etapas. No entanto, uma ATP fosforribosiltransferase, que é a primeira enzima envolvida na biossíntese de histidina, tem inibição de retroalimentação pelo produto final, isto é, histidina, ou um derivado da mesma, e isso é um problema na produção industrial de massa de L-histidina (Publicação de Patente Internacional n° WO2014-029376).

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[005] Os presentes inventores fizeram esforços intensos para melhorar uma ATP fosforribosiltransferase inibida por L-histidina, e como resultado, constataram que um microrganismo no qual a variante de ATP fosforribosiltransferase recentemente desenvolvida é introduzida pode produzir L-histidina com um alto rendimento, desse modo, se completa a presente revelação.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de ATP fosforribosiltransferase que tem substituição de uma asparagina na posição 215 por arginina, substituição de glicina na posição 233 por histidina, e substituição de uma treonina na posição 235 por glutamina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um microrganismo transformado para compreender a variante de ATP fosforribosiltransferase e a proteína.

[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir histidina que compreende: cultivar um microrganismo em um meio; e recuperar histidina do meio de microrganismo cultivado ou cultura.

EFEITOS VANTAJOSOS

[011] A presente revelação fornece um método para produzir de maneira eficiente histidina com o uso de uma proteína ATP fosforribosiltransferase (HisG).

MELHOR MODO

[012] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Isto é, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[013] De modo a alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de ATP fosforribosiltransferase que tem substituição de uma asparagina na posição 215 por arginina, substituição de glicina na posição 233 por histidina, e substituição de uma treonina na posição 235 por glutamina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

[014] Conforme usado no presente documento, o termo “ATP fosforribosiltransferase (HisG)” se refere a uma enzima da família glicosiltransferase que catalisa uma reação química e pertence, particularmente, à família de enzima pentosiltransferase. O nome genérico para essa enzima é 1-(5-fosfo-D-ribosil)- ATP:difosfato fosfo-alfa-D-ribosil transferase. A enzima catalisa a seguinte reação: 1- (5-fosfo-D-ribosil)-ATP + difosfato ATP + 5-fosfo-alfa-D-ribose 1-difosfato. A enzima catalisa a primeira etapa na biossíntese de histidina.

[015] Na presente revelação, ATP fosforribosiltransferase pode ser usada intercambiavelmente com “HisG” ou “proteína HisG”. Uma sequência da fosforribosiltransferase pode ser obtida a partir de um banco de dados conhecido, isto é, GenBank de NCBI. Por exemplo, a ATP fosforribosiltransferase pode ser ATP fosforribosiltransferase derivada de Corynebacterium sp., porém, não se limita à mesma. Por exemplo, a ATP fosforribosiltransferase pode ter uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, porém, não se limita à mesma. Por exemplo, a ATP fosforribosiltransferase pode ter uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de aminoácidos que tem homologia ou identidade com a sequência da SEQ ID NO: 13 de 80% ou mais, porém, não se limita à mesma. Especificamente, a ATP fosforribosiltransferase pode incluir um polipeptídeo que tem uma homologia ou identidade com as SEQ ID NOS: 13 e 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Adicionalmente, é óbvio que uma proteína auxiliar que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode ser usada como a ATP fosforribosiltransferase da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade descrita acima e tenha um efeito que corresponde àquele da proteína.

[016] Especificamente, a variante de ATP fosforribosiltransferase da presente revelação pode ser uma na qual, em uma ATP fosforribosiltransferase derivada de Corynebacterium que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, um resíduo de aminoácido glicina na posição 233, um resíduo de aminoácido treonina na posição 235 ou um resíduo de aminoácido asparagina na posição 215 a partir do terminal N é substituído por outros aminoácidos. Por exemplo, o resíduo de aminoácido glicina na posição 233 pode ser substituído por histidina; o resíduo de aminoácido treonina na posição 235 pode ser substituído por glutamina; ou o resíduo de aminoácido asparagina na posição 215 pode ser substituído por arginina.

[017] Especificamente, a variante de ATP fosforribosiltransferase pode consistir em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Na presente revelação, a variante de ATP fosforribosiltransferase pode incluir uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 de 80% ou mais, porém, não se limita à mesma. Especificamente, a variante de ATP fosforribosiltransferase da presente revelação pode incluir um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que tem uma homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Adicionalmente, é óbvio que uma proteína auxiliar que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode estar incluída no escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade descrita acima e tenha um efeito que corresponde àquele da proteína.

[018] Adicionalmente, com base em degeneração de códon, é óbvio que proteínas que consistem na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ou polinucleotídeos que podem ser traduzidas em proteínas que têm uma homologia ou identidade com as proteínas acima, também podem estar incluídos no escopo da presente revelação. Adicionalmente, qualquer sequência que codifica uma proteína que tem a atividade de uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 que pode ser determinada hibridizando-se sob condições estringentes com a sonda (ou sondas) que pode ser preparada a partir de sequências genéticas conhecidas, por exemplo, sequência (ou sequências) complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica acima, também pode ser incluída sem limitação no escopo da presente revelação. O termo “condições estringentes” se refere às condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é possível. Tais condições são especificamente descritas nas referências (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Por exemplo, as condições podem incluir realizar hibridização entre genes que têm uma alta homologia, uma homologia ou identidade de 80% ou mais, especificamente 85% ou mais, mais especificamente 90% ou mais, ainda mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, e com máxima especificidade 99% ou mais, enquanto não se realiza hibridização entre genes que têm uma homologia ou identidade menores que as homologias ou identidades acima; ou se realiza hibridização uma vez, especificamente duas ou três vezes, sob condições de lavagem convencional para hibridização southern de 60 °C, 1x SSC, e 0,1% de SDS, especificamente em uma concentração salina e temperatura que corresponde a 60 °C, 0,1x SSC e 0,1% de SDS, e mais especificamente 68 °C, 0,1x SSC e 0,1% de SDS.

[019] Isto é, embora descrita como “uma proteína ou polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular” na presente revelação, a proteína ou polipeptídeo pode ter uma atividade que é idêntica ou correspondente àquela de um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Em tal caso, é óbvio que quaisquer proteínas que têm uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, substituição conservadora ou adição em parte da sequência também podem ser usadas na presente revelação. Por exemplo, no caso de ter a atividade que é igual ou correspondente àquela do polipeptídeo modificado, não se exclui uma adição de uma sequência a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos, que não altera a função da proteína, uma mutação que pode ocorrer naturalmente, uma mutação silenciosa da mesma, ou uma constituição conservadora, e mesmo quando a adição ou mutação de sequência está presente, a mesma pertence, obviamente, ao escopo da presente revelação.

[020] O termo “substituição conservadora” se refere à substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares. Tal substituição de aminoácido pode ser feita, geralmente, com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

[021] Portanto, na presente revelação, a “variante” pode incluir substituição e/ou modificação conservadora de um ou mais aminoácidos adicionalmente a “uma proteína ou polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular”. Por exemplo, algumas variantes podem incluir variantes nas quais uma ou mais porções foram removidas, tais como a sequência líder de terminal N ou um domínio transmembranar. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma porção foi removida do terminal N e/ou C. Adicionalmente, as variantes podem incluir outras modificações, que incluem deleção ou adição de aminoácidos que têm impacto mínimo sobre as propriedades e estrutura secundária de um polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado em uma sequência de sinal (ou líder) de um terminal N de proteína que está envolvido na transferência de proteínas cotranslacionalmente ou pós-translacionalmente. Adicionalmente, o polipeptídeo também pode ser conjugado em outra sequência ou um ligante para identificar, purificar ou sintetizar o polipeptídeo. Conforme usado no presente documento, o termo “variante” pode se referir a uma variante, modificação, proteína modificada, polipeptídeo modificado, mutante, muteína, divergente, etc., e não se limita desde que o termo se refira à modificação.

[022] Hibridização exige que dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar, embora inadequações entre as bases possam ser possíveis dependendo da estringência da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo mutuamente hibridizáveis. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementa à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares à sequência inteira, assim como sequências de ácido nucleico substancialmente similares.

[023] Especificamente, polinucleotídeos que têm uma homologia ou identidade podem ser detectados em um valor de Tm de 55 °C com o uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização e com o uso das condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, porém, não se limita ao mesmo e pode ser apropriadamente ajustado por uma pessoa comum versada na técnica de acordo com o propósito desejado.

[024] A estringência adequada para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento e complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis relacionadas são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50 a 9.51, 11.7 a 11.8).

[025] A homologia ou identidade se refere a um grau de adequação com uma dada sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica, e pode ser expressa como uma porcentagem.

[026] Os termos “homologia” e “identidade” podem ser frequentemente usados de modo intercambiável entre si.

[027] A homologia ou identidade de sequência de sequências conservadas de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com uma penalidade por lacuna predefinida estabelecida pelo programa a ser usado. Espera-se, geralmente, que sequências substancialmente homólogas ou idênticas hibridizem sob estringência moderada ou alta, ao longo do comprimento inteiro ou de pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, ou cerca de 90% do comprimento inteiro das sequências. Polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons nos polipeptídeos de hibridização também são considerados.

[028] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos terem uma homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de um algoritmo de computador conhecido, tal como o programa “FASTA” (Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 85]: 2444: using default parameters in 2444). Alternativamente, pode ser determinada com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é realizado no programa Needleman do pacote EMBOSS ((EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (NCBI - National Center for Biotechnology Information).

[029] A homologia, similaridade ou identidade de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP (por exemplo., Needleman et al., (1970), J Mol Biol.48 : 443) conforme publicado (por exemplo., Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). Em suma, o programa GAP define a homologia, similaridade ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos similarmente alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na sequência mais curta dentre as duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6.745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, edições, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas de extremidade. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se à relevância entre sequências.

[030] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase, ou um vetor que compreende o polinucleotídeo.

[031] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” refere-se a um polímero de nucleotídeo composto por monômeros de nucleotídeo covalentemente ligados em uma cadeia, e exemplos dos mesmos são fitas de DNA ou RNA que têm um comprimento predeterminado ou mais longo. Especificamente, o polinucleotídeo refere-se a um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificado.

[032] Na presente revelação, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da ATP fosforribosiltransferase é um gene de hisG, que pode ser especificamente derivado de Corynebacterium glutamicum. Com base em degeneração de código genético, as sequências de nucleotídeos que codificam a mesma sequência de aminoácidos e variantes da mesma pertencem ao escopo da presente revelação e, especificamente, podem ser representadas pela SEQ ID NO: 2, porém, não se limitam à mesma.

[033] Adicionalmente, com relação ao polipeptídeo modificado, sequências de nucleotídeos que codificam o mesmo aminoácido e variantes do mesmo também pertencem ao escopo da presente revelação com base em degeneração de código genético.

[034] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase, e um microrganismo transformado com um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase. Especificamente, a introdução pode ser conduzida através de transformação, porém, não se limita à mesma.

[035] Especificamente, nos microrganismos que compreendem a variante de ATP fosforribosiltransferase da presente revelação, a habilidade de produção de histidina é melhorada sem inibir o crescimento de uma célula hospedeira em comparação com um microrganismo que compreende uma ATP fosforribosiltransferase de tipo selvagem. Portanto, histidina pode ser obtida em alto rendimento a partir desses microrganismos.

[036] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA que inclui a sequência nucleotídica do polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo é operavelmente ligada a uma sequência de controle adequada de modo que a mesma possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle inclui um promotor que tem capacidade para iniciar transcrição, qualquer sequência de operadores para o controle da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que controla o terminal de transcrição e tradução. O vetor, após ser transformado com uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma hospedeiro.

[037] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que tenha capacidade para se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo, cosmídeo, vírus e bacteriófago natural ou recombinante. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, e Charon21A podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo; e o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET podem ser usados como um vetor de plasmídeo. Um vetor útil na presente revelação não é particularmente limitado e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Especificamente, o vetor pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, ou pCC1BAC pode ser usado.

[038] Em uma modalidade, um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo modificado através de um vetor para inserção cromossômica. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga), porém, o método não se limita ao mesmo.

[039] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere a um processo de introdução em uma célula hospedeira de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo, desse modo, se permite a expressão da proteína codifica pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o polinucleotídeo transformado é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e está localizado dentro da mesma ou localizado fora do cromossomo, desde que possa ser expresso na célula hospedeira, e ambos os casos estão incluídos. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma desde que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de gene que inclui todos os elementos essenciais necessários para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor operavelmente ligado ao polinucleotídeo, um sinal de terminação de transcrição, um domínio de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de translação. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão que tem capacidade para autorreplicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira como está e pode ser ligado operavelmente a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, porém, o polinucleotídeo não se limita a isso.

[040] Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “ligado operavelmente” se refere a uma ligação funcional entre uma sequência de promotores que inicia e media a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína- alvo da presente revelação e a sequência de genes acima.

[041] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo de produção de histidina” ou “microrganismo que tem produtividade de histidina” se refere a um microrganismo que tem naturalmente uma habilidade de produção de histidina ou um microrganismo no qual uma habilidade de produção de histidina é fornecida em sua cepa parente que não tem habilidade de produção de histidina.

[042] O microrganismo de produção de histidina pode ser uma célula ou microrganismo que inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado ou que tem capacidade para expressar um polipeptídeo modificado transformando-se em um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado. Para os objetivos da presente revelação, a célula hospedeira ou microrganismo pode ser qualquer microrganismo que tem capacidade para produzir L-histidina, que inclui a variante de ATP fosforribosiltransferase. Por exemplo, o microrganismo pode ser uma cepa microbiana, tal como Escherichia sp., Serratia sp., Erwinia sp., Enterobacteria sp., Salmonella sp., Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., ou Corynebacterium sp., especificamente pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium, e mais especificamente pode ser Corynebacterium glutamicum, porém, o microrganismo não se limita aos mesmos.

[043] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo de produção de histidina do gênero Corynebacterium que produz histidina” se refere a um microrganismo do gênero Corynebacterium, que tem uma habilidade de produção de histidina naturalmente ou através de modificação. Já se sabe que a histidina é incluída em uma cultura de um microrganismo do gênero Corynebacterium. Entretanto, sua capacidade de produção de histidina é notavelmente baixa, e genes ou mecanismos envolvidos na produção ainda não foram revelados. Portanto, o “microrganismo do gênero Corynebacterium que tem habilidade de produção de histidina”, na presente revelação, se refere a um próprio microrganismo nativo ou um microrganismo do gênero Corynebacterium no qual um gene estranho envolvido no mecanismo de produção de histidina está inserido ou a atividade de um gene endógeno é reforçada ou inativada de modo a ter uma habilidade de produção de histidina melhorada.

[044] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., porém, não se limita aos mesmos. Mais especificamente, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum, em que o crescimento e a sobrevivência da célula são dificilmente afetados mesmo quando exposta a uma alta concentração de histidina.

[045] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir histidina que compreende: cultivar o microrganismo descrito na presente revelação; e recuperar histidina a parti do microrganismo cultivado ou meio cultivado.

[046] No método, a etapa de cultivar o microrganismo pode ser realizada através de cultura em batelada, cultura contínua e cultura em batelada alimentada conhecidas na técnica, porém, sem se limitar particularmente às mesmas. No presente documento, as condições de cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente, pH 6 a 8 e, com a máxima especificidade, pH 6,8) pode ser mantido com o uso de um produto químico básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um produto químico ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Além disso, uma condição aeróbica pode ser mantida adicionando-se oxigênio ou uma mistura de gases que contém oxigênio a uma cultura celular. A temperatura de cultura pode ser mantida a 20 °C a 45 °C e, especificamente, a 25 °C a 40 °C, e o cultivo pode ser realizado por cerca de 10 horas a 160 horas, porém, as condições não se limitam a essas. A histidina produzida pela cultura pode ser secretada em um meio ou pode permanecer nas células.

[047] Adicionalmente, um meio a ser usado para cultura pode incluir açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação como uma fonte de carbono; um composto orgânico contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, solução de milho, farelo de soja em pó e ureia) ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) individualmente ou em combinação como uma fonte de nitrogênio; e fosfato di-hidrogênio de potássio, fosfato dipotássico ou um sal contendo sódio que corresponde ao mesmo individualmente ou em combinação como uma fonte de fósforo; porém, esses não se limitam aos mesmos. Adicionalmente, o meio pode conter materiais essenciais promotores de crescimento, tais como outros sais de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.

[048] O método para recuperar a histidina produzida na etapa de cultura da presente revelação pode ser conduzido para coletar um aminoácido-alvo do meio cultivado com o uso de um método adequado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização e HPLC podem ser usadas, e a histidina-alvo pode ser recuperada do meio ou microrganismo com o uso de um método adequado conhecido na técnica.

MODO PARA A INVENÇÃO

[049] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes com as modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes ao escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: PROJETO DE VARIANTE DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASE (HISG)

[050] Em uma ATP fosforribosiltransferase (HisG) de um microrganismo do gênero Corynebacterium, quando as concentrações de histidina, nucleotídeo do tipo purina, etc., são aumentadas, ATP, que é um substrato, se liga competitiva ou não competitivamente a um domínio regulador da ATP fosforribosiltransferase e, desse modo, sua atividade é enfraquecida. Com base nisso, uma variante que aprimora estruturalmente sua atividade enquanto evita a ligação de histidina à ATP fosforribosiltransferase foi projetada.

[051] Especificamente, uma variante de ATP fosforribosiltransferase (N215R/G233H/T235Q, SEQ ID NO: 1) foi projetada, em que, a partir do terminal N de uma ATP fosforribosiltransferase de Corynebacterium glutamicum, um resíduo de aminoácido glicina na posição 233 é substituído por histidina, um resíduo de aminoácido treonina na posição 235 é substituído por glutamina e um resíduo de aminoácido asparagina na posição 215 é substituído por arginina. A sequência nucleotídica que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase da SEQ ID NO: 1 é SEQ ID NO: 2.

EXEMPLO 2: CLONAGEM DE GENE DE HISG, E CONSTRUTO DE VETOR PARA INSERÇÃO CROMOSSÔMICA PARA PREPARAR CEPAS DE MARKERLESS EXEMPLO 2-1: CLONAGEM DE GENE DE HISG NO QUAL A VARIAÇÃO DE N215R E A VARIAÇÃO DE G233H E T235Q SÃO INTRODUZIDAS, E CONSTRUTO DE VETOR PARA INSERÇÃO CROMOSSÔMICA

[052] Genes cromossômicos de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de tipo selvagem foram isolados e, então, fragmentos de gene de hisG foram obtidos através de reação em cadeia de polimerase com o uso de pares iniciadores das SEQ ID NOS: 3 e 4 (Tabela 1). No presente documento, após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi executada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 30 segundos, hibridização a 56 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 90 minutos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, polinucleotídeos (cerca de 850 bp) foram obtidos. Os fragmentos de gene de hisG obtidos assim foram ligados a um vetor TOPO, e o vetor construído foi nomeado pTOPO-hisG. TABELA 1

[053] PCR foi conduzida com os iniciadores descritos nas Tabelas 1 e 2 com o uso do vetor pTOPO-hisG preparado como um modelo, como a seguir. Centrada sobre uma região a ser modificada para a introdução de uma variação nos genes de hisG, a PCR primária foi conduzida para os terminais 5‘ e 3‘, respectivamente e, então, a PCR secundária foi conduzida para combinar os dois fragmentos de PCR.

[054] Especificamente, o terminal 5‘ do modelo foi amplificado através de PCR com o uso de iniciadores de Xba1-Cgl-hisG-F (SEQ ID NO: 3) e Cgl-hisG- G233H/T235Q-R (SEQ ID NO: 8). O terminal 3‘ do modelo foi amplificado através de PCR com o uso de iniciadores de Cgl-hisG-G233H/T235Q-F (SEQ ID NO: 7) e Xba1- Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4). PCR secundária foi conduzida com os iniciadores de Xba1-Cgl-hisG-F (SEQ ID NO: 3) e Xba1-Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4) com o uso dos dois fragmentos de PCR obtidos através de PCR como um modelo para a PCR secundária. Os fragmentos dos genes de hisG_G233H/T235Q obtidos através da PCR secundária foram clivados por uma enzima de restrição XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA). Um vetor recombinante foi construído ligando-se os fragmentos de gene clivados a um vetor linear, em que o vetor pDC para inserção cromossômica foi digerido com uma enzima de restrição XbaI, com o uso de T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA). O vetor construído foi nomeado pDC-hisG_G233H/T235Q.

[055] De modo a introduzir adicionalmente a variação de N215R, PCR secundária foi conduzida mais uma vez. Especificamente, com o uso de pDC- hisG_G233H/T235Q como um modelo, o terminal 5’ foi amplificado através de PCR com iniciadores de Cgl13032 hisG N215R-F (SEQ ID NO: 5) e Cgl-hisG- G233H/T235Q-R (SEQ ID NO: 8); e o terminal 3‘ foi amplificado através de PCR com iniciadores de Cgl-hisG-G233H/T235Q-F (SEQ ID NO: 7) e Cgl13032 hisG N215R-R (SEQ ID NO: 6). PCR secundária foi conduzida com os iniciadores de Xba1-Cgl-hisG- F (SEQ ID NO: 3) e Xba1-Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4) com o uso dos dois fragmentos de PCR amplificados como um modelo para a PCR secundária. Os fragmentos de gene obtidos através da PCR secundária foram clivados por uma enzima de restrição XbaI, e os fragmentos de gene clivados foram ligados a um vetor linear no qual o vetor pDC para inserção cromossômica foi digerido com uma enzima de restrição XbaI. Depois disso, os resultados foram, então, inseridos no vetor pDC. O vetor construído foi nomeado pDC-hisG_N215R/G233H/T235Q. A possibilidade de a variação de hisG ser introduzida no vetor construído assim foi confirmada por análise de sequência.

EXEMPLO 2-2: CLONAGEM DE GENE NO QUAL HISG CONHECIDA É INTRODUZIDA E CONSTRUTO DE VETOR PARA INSERÇÃO CROMOSSÔMICA

[056] De modo a comparar a habilidade de produção de histidina de um microrganismo, no qual um gene de HisG modificada conhecido (N215K/L231F/T235A) é introduzido, com aquela de um microrganismo, no qual a variação da presente revelação é introduzida, um vetor de um gene modificado conhecido foi construído (Biochimie. março de 2012; 94(3):829 a 38).

[057] De modo a construir um vetor no qual um gene de HisG modificada (N215K/L231F/T235A) é introduzido, da mesma maneira que no Exemplo 2-1, amplificação por PCR foi conduzida com cada um dos iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 12 e das SEQ ID NOS: 10 e 11 com o uso do vetor de modelo pTOPO como um modelo (Tabela 2). Com o uso dos dois fragmentos de PCR amplificados como um modelo para PCR secundária, a PCR secundária foi conduzida com os iniciadores de Xba1-Cgl-hisG-F (SEQ ID NO: 3) e Xba1-Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4). Os fragmentos de gene obtidos a partir da PCR secundária foram clivados por uma enzima de restrição XbaI, e os fragmentos de gene clivados foram ligados a um vetor linear no qual o vetor pDC para inserção cromossômica foi digerido com uma enzima de restrição XbaI. Depois disso, os resultados foram, então, inseridos no vetor PDC. O vetor construído assim foi nomeado pDC-hisG_N215K/L231F/T235A. TABELA 2

EXEMPLO 3: SELEÇÃO DE CEPA INSERIDA COM GENE DE HISG MODIFICADA EXEMPLO 3-1: SELEÇÃO DE CEPA DE TIPO SELVAGEM INSERIDA COM GENE DE HISG MODIFICADA

[058] O vetor hisG_N215R/G233H/T235Q que contém o gene de HisG modificada, que foi construído no Exemplo 2, foi transformado com Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo selvagem através de eletroporação. Depois disso, cepas que exibem resistência foram selecionadas dentre um meio seletivo que contém canamicina (25 mg/l). Um processo recombinante secundário (cruzamento) foi conduzido de modo a selecionar as cepas nas quais o gene modificado é inserido no cromossomo. PCR foi conduzida com o uso dos iniciadores de Xba1-Cgl-hisG-F (SEQ ID NO: 3) e Xba1-Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4). A cepa, na qual o gene de hisG modificada é inserido pelo fragmento de DNA hisG_N215R/G233H/T235Q inserido no genoma, foi confirmada pela análise de sequência dos produtos de PCR, e foi nomeada ATCC13032-161.

EXEMPLO 3-2: SELEÇÃO DE CEPA QUE TEM HABILIDADE DE PRODUÇÃO DE L-HISTIDINA, NA QUAL O VETOR QUE INCLUI GENE DE HISG MODIFICADA É INSERIDO

[059] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 não pode produzir histidina. Portanto, de modo a medir a atividade da enzima e confirmar a habilidade de produção de L-histidina, HCJ-86 (KCCM11795P), que é uma cepa que tem habilidade de produção de L-histidina, foi usada como uma célula hospedeira.

[060] A HCJ-86 foi obtida como a seguir. Após cultura e inativação por 16 horas em um meio de ativação de Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem, a cepa ativada foi inoculada em um meio de semente esterilizado a 121 °C por 15 minutos e, então, cultivada por 14 horas. Depois disso, o meio de cultura (5 ml) foi recuperado. O meio de cultura recuperado foi lavado com um tampão de ácido cítrico (100 mM), N-metil-N‘-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) foi adicionada a uma concentração final de 200 mg/l e, então, os resultantes foram tratados por 20 minutos. Depois disso, os resultantes foram lavados com um tampão de fosfato (100 mM). A taxa de mortalidade foi calculada manchando-se a cepa tratada com NTG em um meio mínimo e constatou-se que a taxa de mortalidade foi de 85%.

[061] Uma variante, que tem resistência à 1,2,4-triazol-3-alanina, por exemplo, um derivado de L-histidina, e que tem uma habilidade de produção de L-histidina, foi selecionada. A variante foi nomeada HCJ-86. A variante HCJ-86 foi depositada no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, que é uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 22 de dezembro de 2015, e que recebe o no de Acesso KCCM11795P. A análise de sequência do gene de hisG de HCJ-86 revelou que a sequência era idêntica àquela de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo selvagem. Portanto, foi confirmado que não houve variação no gene de hisG.

[062] Os vetores pDC-hisG_G233H/T235Q, pDC- hisG_N215R/G233H/T235Q, e pDC-hisG_N215K/L231F/T235A que contêm o gene de HisG modificada, que foi construído no Exemplo 2, foram transformados com HCJ- 86 de Corynebacterium glutamicum através de eletroporação. Depois disso, cepas que exibem resistência foram selecionadas dentre um meio seletivo que contém canamicina (25 mg/l). Um processo recombinante secundário (cruzamento) foi conduzido de modo a selecionar as cepas nas quais o gene modificado é inserido no cromossomo. PCR foi conduzida com o uso dos iniciadores de Xba1-Cgl-hisG-F (SEQ ID NO: 3) e Xba1-Cgl-hisG-R (SEQ ID NO: 4). As cepas, em que o gene de hisG é modificado pelos fragmentos de DNA hisG_G233H/T235Q, hisG_N215R/G233H/T235Q e hisG_N215K/L231F/T235A inseridos no genoma, foram obtidas e foram confirmadas pela análise de sequência dos produtos de PCR. Essas foram nomeadas HCJ-96, HCJ-161 e HCJ-162, respectivamente.

[063] Dentre essas, a HCJ-161 foi depositada no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, que é uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 27 de fevereiro de 2017, e que recebe o no de Acesso KCCM11982P.

[064] Adicionalmente, as sequências das cepas que passaram pelo processo recombinante secundário (cruzamento) foram analisadas para selecionar uma cepa que tem apenas um fragmento de DNA hisG_N215R, e esse foi nomeado HCJ-163.

[065] De modo a construir uma cepa que tem a modificação de hisG_N215R/L231F/T235A, a cepa HCJ-161 foi transformada com o vetor pDC- hisG_N215K/L231F/T235A através de eletroporação. Depois disso, cepas que mostram resistência foram principalmente selecionadas dentre um meio seletivo que contém canamicina (25 mg/l). As sequências das cepas que passaram pelo processo recombinante secundário (cruzamento) foram analisadas, e uma cepa que contém a modificação de hisG_N215R/L231F/T235A foi selecionada em segundo lugar dentre as cepas nas quais a recombinação ocorreu no gene de hisG. A cepa selecionada foi nomeada HCJ-164.

[066] De modo a preparar uma cepa que tem a modificação de hisG_N215K/G233H/T235Q, a cepa HCJ-162 foi transformada com o vetor pDC- hisG_G233H/T235Q através de eletroporação. Depois disso, cepas que mostram resistência foram principalmente selecionadas dentre um meio seletivo que contém canamicina (25 mg/l). As sequências das cepas que passaram pelo processo recombinante secundário (cruzamento) foram analisadas, e uma cepa que contém a modificação de hisG_N215K/G233H/T235Q foi selecionada em segundo lugar dentre as cepas nas quais a recombinação ocorreu no gene de hisG. A cepa selecionada foi nomeada HCJ-165. Cada cepa e os traços de modificação de ATP fosforribosiltransferase (HisG) são mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3

EXEMPLO 4: MEDIÇÃO DE ATIVIDADES DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASES EXEMPLO 4-1: OBTENÇÃO DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASE

[067] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e as cepas HCJ-96, HCJ- 161, HCJ-162, HCJ-163, HCJ-164 e HCJ-165 selecionadas no Exemplo 3 foram, cada uma, inoculadas em um frasco com reentrância nos cantos (250 ml) que contém um meio de semente (25 ml), e foram cultivadas a 30 °C por 20 horas com agitação a 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. Depois disso, a solução de cultura de semente (1 ml) foi inoculada em um frasco com reentrância nos cantos (250 ml) que contém um meio de produção (24 ml), e foi cultivado a 30 °C por 45 horas a 200 rpm. Após a cultura, as células obtidas foram sonicadas e centrifugadas, e o sobrenadante obtido a partir das mesmas foi usado para avaliação da atividade de ATP fosforribosiltransferase. Enquanto isso, as composições dos meios usados no Exemplo 4-1 são mostradas na Tabela 4 abaixo. TABELA 4

EXEMPLO 4-2: MEDIÇÃO DE ATIVIDADES DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASES

[068] As atividades das variantes de ATP fosforribosiltransferase obtidas no Exemplo 4-1 e aquelas de uma variante de ATP fosforribosiltransferase de tipo selvagem foram medidas. A avaliação das atividades dessas enzimas foi realizada com referência às condições descritas em um relatório de literatura existente (Biochimie. março de 2012; 94(3):829 a 38).

[069] Para a avaliação das atividades das enzimas, o sobrenadante foi quantificado para gerar a mesma concentração. Essas enzimas foram usadas como enzimas de amostra, e as condições de reação foram como a seguir: as composições de reação foram misturadas na proteína quantificada (0,05 mg) para gerar uma quantidade total de 500 μl e, então, medidas a 30 °C em um comprimento de onda UV de 290 nm por 90 segundos. Com relação à ATP fosforribosiltransferase de tipo selvagem que tem baixa atividade, a proteína sobrenadante (0,3 mg) foi usada e medida em um comprimento de onda UV de 290 nm por 30 minutos para a avaliação de atividade. A composição da solução de reação para medir as atividades das enzimas é como a seguir: TABELA5

[070] Como resultado da medição, confirmou-se que as variantes de ATP fosforribosiltransferase tiveram atividades que são aprimoradas em comparação com aquelas da ATP fosforribosiltransferase de tipo selvagem. Em particular, a variante de ATP fosforribosiltransferase que tem a variação de N215R/G233H/T235Q exibiu uma atividade cerca de 160 vezes maior que aquela da enzima de tipo selvagem (Tabela 6). TABELA 6 Atividade de ATP fosforribosiltransferase (HisG)

EXEMPLO 4-3: MEDIÇÃO DE GRAU DE INIBIÇÃO POR HISTIDINA SOBRE ATIVIDADES DE VARIANTES DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASE

[071] O grau de inibição por L-histidina nas atividades de ATP fosforribosiltransferase e das variantes de ATP fosforribosiltransferase obtidas no Exemplo 4-1 foi medido. Especificamente, as atividades dessas enzimas foram medidas na solução de composição de reação do Exemplo 4-2, que conteve L- histidina (0 mM, 50 mM, ou 100 mM), com o uso do método descrito no Exemplo 4-2. Como resultado da medição, confirmou-se que a atividade da enzima de tipo selvagem foi completamente inibida em concentrações de L-histidina de 50 mM e 100 mM. No entanto, as atividades das variantes de ATP fosforribosiltransferase foram menos inibidas por L-histidina. Em particular, a variante de ATP fosforribosiltransferase que tem a variação de N215R/G233H/T235Q mostrou a maior atividade mesmo na solução de composição que contém L-histidina (100 mM) (Tabela 7). TABELA 7

EXEMPLO 5: MEDIÇÃO DE HABILIDADE DE PRODUÇÃO DE L-HISTIDINA DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L-HISTIDINA NA QUAL A VARIANTE DE ATP FOSFORRIBOSILTRANSFERASE É INTRODUZIDA

[072] Habilidades de produção de L-Histidina das cepas selecionadas no Exemplo 3 foram medidas para confirmar os efeitos das variantes de ATP fosforribosiltransferase que têm atividades aumentadas na produção de L-histidina.

[073] A Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que é uma cepa parente, e as variantes ATCC13032-161, HCJ-96, HCJ-161, HCJ-162, HCJ-163, HCJ-164 e HCJ-165 foram, cada uma, inoculadas em um frasco com reentrância nos cantos (250 ml) que contém um meio de semente (25 ml), e foram cultivadas a 30 °C por 20 horas com agitação a 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. Depois disso, a solução de cultura de semente (1 ml) foi inoculada em um frasco com reentrância nos cantos (250 ml) que contém um meio de produção (24 ml), e foi cultivado a 30 °C por 45 horas a 200 rpm para produzir L-histidina. Após conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-histidina foi medida com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Métodos analíticos detalhados e concentrações são mostrados na Tabela 8 abaixo. TABELA 8 TABELA 9

[074] Como resultado, confirmou-se que a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo selvagem não produziu de forma alguma L-histidina, e que a ATCC 13032-161 transformada com a variante de ATP fosforribosiltransferase da presente revelação produziu L-histidina (0,5 g/l). Adicionalmente, a HCJ-161 produziu L-histidina (2,3 g/l), cuja quantidade foi maior que aquela da HCJ-86, uma cepa parente, em 43,75% (Tabela 9). Confirmou-se que todas as cepas HCJ-86, HCJ-96, HCJ-162, HCJ-163 e HCJ-164 produziram histidina em níveis de 1,6 g/l a 1,9 g/l, e que a cepa HCJ-161 que tem a variante de ATP fosforribosiltransferase (N215R/G233H/T235Q) mostrou a maior atividade enzimática e habilidade de produção de L-histidina. Como resultado, confirmou-se que L-histidina pode ser produzida com alta eficiência e alto rendimento com o uso da variante de ATP fosforribosiltransferase (N215R/G233H/T235Q) da presente revelação.

[075] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica à qual a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste do espírito da técnica ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas ao invés da descrição detalhada, e deve ser compreendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes da mesma são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (8)

1. Variante de ATP fosforribosiltransferase CARACTERIZADA pelo fato de que possui substituição de uma asparagina na posição 215 por arginina, substituição de glicina na posição 233 por uma histidina, e substituição de uma treonina na posição 235 por glutamina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

2. Variante de ATP fosforribosiltransferase, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de ATP fosforribosiltransferase consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

3. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase, como definida na reivindicação 1, em que a sequência de polinucleotídeos consiste na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

4. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo que codifica a variante de ATP fosforribosiltransferase, como definida na reivindicação 1, em que a sequência de polinucleotídeos consiste na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

5. Microrganismo do gênero Corynebacterium que produz histidina, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo compreende a variante de ATP fosforribosiltransferase, como definida na reivindicação 1, ou o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 3, ou é transformado com o vetor, como definido na reivindicação 4, em que a sequência de polinucleotídeos consiste na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

7. Método para produzir histidina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: cultivar um microrganismo do gênero Corynebacterium que produz histidina, como definido na reivindicação 5, em um meio; e recuperar histidina a partir do microrganismo cultivado ou meio cultivado.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.