BR112019021322B1 - Homosserina desidrogenase modificada, polinucleotídeo, microorganismo do gênero corynebacterium e método para produzir homosserina ou um l-aminoácido derivado de homosserina - Google Patents

Homosserina desidrogenase modificada, polinucleotídeo, microorganismo do gênero corynebacterium e método para produzir homosserina ou um l-aminoácido derivado de homosserina Download PDF

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Abstract

homosserina desidrogenase modificada, polinucleotídeo, micro-organismo do gênero corynebacterium e método para produzir homosserina ou um l-aminoácido derivado de homosserina. a presente revelação refere-se à homosserina desidrogenase modificada e a um método para produzir homosserina ou um l-aminoácido derivado de homosserina com o uso do mesmo.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente revelação refere-se à homosserina desidrogenase modificada e, especificamente, a homosserina desidrogenase modificada com um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de desidrogenase de homosserina, na qual a substituição de aminoácidos está que compreende a substituição do aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos com histidina; e um método para a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina usando a homosserina desidrogenase modificada.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0002] Entre L-aminoácidos, L-treonina, L-isoleucina e L-metionina comumente usam homosserina produzida pela homosserina desidrogenase (doravante no presente documento, “Hom”; EC:1.1.1.3) de aspartato-semialdeído (doravante no presente documento, “ASA”). Portanto, para produzir os aminoácidos por um método de fermentação, é essencial manter as atividades das enzimas usadas na via biossintética em um determinado nível ou mais, e pesquisas intensivas foram conduzidas.
[0003] Em particular, sabe-se que a atividade da homosserina desidrogenase que atua no ponto de ramificação das vias biossintéticas da L-lisina e L-treonina é regulada pela L-treonina e L-isoleucina. Recentemente, houve vários relatos de Hom dessensibilizados à inibição de feedback pela L-treonina e um método para produzir L-treonina usando o mesmo. Em 1991, Eikmann et al. na Alemanha relataram Hom dessensibilizado por substituição de glicina, que é o resíduo de aminoácido na posição 378 de Hom, por glutamato (Eikmanns BJ et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 617 a 222, 1991); e em 1991, Archer et al. relataram que a dessensibilização ocorre quando o terminal C de Hom é danificado devido a uma mutação de mudança de quadro (Archer JA et al., Gene 107: 53 a 59, 1991).
REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[0004] Os presentes inventores conduziram um estudo sobre dessensibilização à inibição de feedback pela treonina e, como resultado, eles isolaram um novo gene que codifica Hom modificado e confirmaram que a capacidade de produção de L-aminoácido é aprimorada em um micro-organismo em que o novo gene é transduzida, completando assim a presente revelação.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[0005] Um objetivo da presente invenção é fornecer homosserina desidrogenase modificada, em que em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade da homosserina desidrogenase, o aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos é substituído por histidina.
[0006] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica a desidrogenase modificada.
[0007] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que compreende a homosserina desidrogenase modificada.
[0008] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina, que compreende a cultura do micro-organismo em um meio; e recuperar homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.
[0009] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para aumentar a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina em um micro-organismo, que compreende aumentar a atividade da homosserina desidrogenase modificada.
[0010] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um uso da homosserina desidrogenase modificada para aumentar a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina.
EFEITOS VANTAJOSOS
[0011] A homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser amplamente usada para produção em massa eficiente de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina porque a inibição de feedback por um produto final é dessensibilizada em comparação com o tipo natural ou selvagem.
MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[0012] A seguir, a presente revelação será descrita em detalhes. Enquanto isso, cada uma das explicações e modalidades exemplificadoras reveladas neste documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificadoras. Ou seja, todas as combinações de vários fatores aqui revelados se enquadram no escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela descrição específica fornecida abaixo.
[0013] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece homosserina desidrogenase modificada com um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade da homosserina desidrogenase, na qual a substituição de aminoácidos é que compreende a substituição do aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos por outro aminoácido.
[0014] Especificamente, a presente revelação fornece homosserina desidrogenase modificada com um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com atividade de homosserina desidrogenase, na qual a substituição de aminoácidos compreende a substituição do aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos com histidina. Mais especificamente, a presente revelação fornece homosserina desidrogenase modificada, na qual o aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é substituído por histidina.
[0015] Na presente revelação, homosserina desidrogenase (EC:1.1.1.3) se refere a uma enzima que catalisa a síntese de homosserina, que é um intermediário comum para a biossíntese de metionina, treonina e isoleucina em plantas e micro-organismos. Na presente revelação, a homosserina desidrogenase pode ser incluída, independentemente de sua origem, desde que tenha a atividade de conversão acima, e uma enzima derivada de qualquer organismo (plantas, micro-organismos, etc.) pode ser usada como a homosserina desidrogenase. Especificamente, a homosserina desidrogenase pode ser derivada de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e mais especificamente pode ser derivada de Corynebacterium glutamicum. Por exemplo, a homosserina desidrogenase pode ser uma proteína incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. A proteína incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser usada de forma intercambiável com o termo “proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1” ou “proteína que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1”.
[0016] Na presente revelação, vários métodos bem conhecidos na técnica podem ser usados como o método para obter a homosserina desidrogenase. Exemplos de tais métodos podem incluir técnicas de síntese gênica, incluindo otimização de códons, de modo a obter proteínas com alta eficiência em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que é comumente usado para a expressão de proteínas, e métodos para rastrear recursos enzimáticos úteis usando métodos bioinformáticos na informação metagenômica de micro-organismos, mas os métodos não estão limitados a isso.
[0017] Na presente revelação, a proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase não exclui uma mutação que pode ocorrer devido à adição de uma sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos de uma proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase (por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1), ou uma mutação que ocorre naturalmente, ou uma mutação silenciosa nela. Além disso, desde que a proteína tenha atividade igual ou correspondente à proteína, incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, a proteína também corresponde à proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação. Como um exemplo específico, a proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com uma homologia de pelo menos 80%, em pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%.
[0018] Além disso, embora seja descrito como “proteína ou polipeptídeo incluindo a sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO específica” na presente revelação, é aparente que qualquer proteína tendo uma sequência de aminoácidos com exclusão, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente revelação, desde que a proteína tenha uma sequência de aminoácidos com qualquer uma das homologias acima e exiba um efeito correspondente à proteína acima. Por exemplo, na presente revelação, a proteína que tem a atividade de homosserina desidrogenase pode ser homosserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum. Mais especificamente, a proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase pode ser a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) da homosserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) da homosserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC14067, ou a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 41) de homosserina desidrogenase derivada de ATCC13869 Corynebacterium glutamicum. Uma vez que as desidrogenases de homosserina que possuem as sequências acima mostram uma homologia de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% ou entre si, e uma vez que essas desidrogenases de homosserina exibem efeitos correspondentes aos da desidrogenase de homosserina, é aparente que eles estão incluídos na proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação.
[0019] Como usado aqui, o termo “homologia” se refere à porcentagem de identidade entre duas porções polinucleotídicas ou polipeptídicas. A homologia se refere a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica e pode ser expressa como uma porcentagem. Na presente revelação, uma sequência de homologia com uma atividade idêntica ou semelhante à dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos é expressa como “% de homologia”. A homologia entre sequências de uma porção para outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser confirmada usando o software padrão (isto é, BLAST 2.0) para calcular parâmetros (por exemplo, pontuação, identidade e semelhança) ou comparando sequências por meio de experimentos de hibridação Southern. As condições de hibridação apropriadas a serem definidas podem ser determinadas por um método conhecido dos especialistas na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York).
[0020] Como usado aqui, o termo “modificação”, “modificado” ou “variante” se refere a uma cultura ou um indivíduo que mostra uma alternância herdável ou não herdável em um fenótipo estabilizado. Especificamente, esses termos podem se referir a uma variante na qual sua atividade é eficientemente aumentada porque um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos correspondentes a uma proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase são modificados em comparação com os do tipo selvagem, um nativo tipo ou tipo não modificado; uma variante na qual é liberada a inibição da retroalimentação por isoleucina, treonina ou um análogo ou seu derivado; ou uma variante na qual o aumento da atividade e a liberação da inibição do feedback são alcançados.
[0021] Na presente revelação, o termo “homosserina desidrogenase modificada” pode ser usado de forma intercambiável com “variante da homosserina desidrogenase”. Enquanto isso, essa variante pode não ocorrer naturalmente.
[0022] Especificamente, a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína modificada tendo um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma proteína que tem a atividade de homosserina desidrogenase, na qual a substituição de aminoácidos compreende a substituição de o aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos com histidina. A sequência de aminoácidos da proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase é como descrito acima e pode ser, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Além disso, o “aminoácido na posição 407” pode se referir ao aminoácido na posição correspondente ao 407o aminoácido do terminal N da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e, especificamente, pode se referir ao 407o aminoácido do terminal N da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. O aminoácido na posição 407 pode ser aquele em que a arginina é substituída por histidina. Mais especificamente, a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Além disso, a proteína não exclui uma mutação que pode ocorrer devido à adição de uma sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos, uma mutação que ocorre naturalmente ou uma mutação silenciosa e qualquer proteína que tenha a atividade idêntica ou correspondente ao da homosserina desidrogenase modificada corresponde à proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase modificada da presente revelação. Como um exemplo específico, a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos com uma homologia com a sequência de aminoácidos acima de em pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% enquanto o 407o aminoácido do terminal N da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é fixo.
[0023] Além disso, ao contrário da proteína do tipo selvagem ou nativa ou de uma proteína não modificada com a atividade de homosserina desidrogenase, a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser aquela em que a inibição de feedback por um produto final (ou seja, isoleucina, treonina, metionina, homosserina ou um derivado ou análogo do mesmo) é liberado ou dessensibilizado. Como usado aqui, o termo “inibição de feedback” significa que um produto final do metabolismo impede a reação do estágio anterior. Portanto, quando a inibição da retroalimentação da homosserina desidrogenase é liberada ou dessensibilizada, a produtividade da homosserina e a de um L-aminoácido derivado da homosserina podem ser melhoradas em comparação com quando a inibição da retroalimentação não é liberada ou dessensibilizada.
[0024] O L-aminoácido derivado da homosserina se refere a um L- aminoácido que pode ser biossintetizado usando L-homosserina como precursor, e não está limitado desde que seja um material que possa ser biossintetizado a partir de L-homosserina. O L-aminoácido derivado da homosserina pode incluir não apenas um L-aminoácido derivado da homosserina, mas também um seu derivado. Por exemplo, o L-aminoácido derivado da homosserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-L-homosserina, O-succinil-L-homosserina, O-fosfo-L-homosserina, L- metionina e/ou glicina, mas o L-aminoácido derivado da homosserina não está limitado a isso. Mais especificamente, o L-aminoácido derivado da homosserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-L-homosserina, O-succinil-L-homosserina e/ou L-metionina, mas o L derivado de homosserina -aminoácido não está limitado a isso.
[0025] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a homosserina desidrogenase modificada.
[0026] A homosserina desidrogenase e a variante (uma modificada) são como descritas acima.
[0027] Como usado aqui, o termo “polinucleotídeo” se refere a um polímero de nucleotídeo composto por monômeros de nucleotídeos covalentemente ligados em uma cadeia longa (por exemplo, fitas de DNA ou RNA com um comprimento predeterminado ou mais longo) e, mais especificamente, se refere a um fragmento de polinucleotídeo que codifica a homosserina desidrogenase modificada. O polinucleotídeo que codifica a proteína modificada da presente revelação pode ser incluído sem limitação, desde que tenha uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína modificada com a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação.
[0028] Na presente revelação, o polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da variante da homosserina desidrogenase pode ser especificamente derivado de um micro-organismo do gênero Corynebacterium e mais especificamente derivado de Corynebacterium glutamicum. No entanto, o micro-organismo não está limitado a isso.
[0029] Além disso, devido à degenerescência do códon ou em consideração aos códons preferidos em um organismo no qual a proteína deve ser expressa, no polinucleotídeo que codifica a proteína, várias modificações podem ser feitas na região de codificação sem alterar uma sequência de aminoácidos da proteína. Especificamente, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo incluindo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína ou uma sequência de polinucleotídeo com uma homologia com a sequência de polinucleotídeo acima de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%. Além disso, é aparente que uma sequência polinucleotídica com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente revelação, desde que seja uma sequência polinucleotídica que codifique a proteína com as homologias acima e exibindo um efeito substancialmente igual ou correspondente à proteína acima. O polinucleotídeo que codifica a proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, mas não está limitada a isso. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e, especificamente, pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica SEQ ID NO: 8. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 7, mas não está limitada a isso.
[0030] Além disso, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, qualquer sequência que hibrida com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência polinucleotídica sob condições rigorosas para codificar uma proteína com a atividade da homosserina desidrogenase da presente revelação, também pode ser incluída sem limitação. As “condições rigorosas” significam condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos. Tais condições são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., Supra). As condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais os genes com alta homologia, homologia de 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, ainda muito mais especificamente 99% ou mais de homologia são hibridizados entre si e genes com homologia inferior à homologia acima não são hibridados entre si ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern (isto é, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1 x SSC, SDS a 0,1%, especificamente, 60 °C, 0,1 x SSC, SDS a 0,1%, e mais especificamente 68 °C, 0,1 x SSC, SDS a 0,1%). A hibridação requer que dois polinucleotídeos contenham sequências complementares, embora possam ocorrer incompatibilidades entre as bases, dependendo do rigor da hibridação. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que são hibridáveis entre si. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação também pode incluir um fragmento de nucleotídeo isolado complementar à sequência inteira, bem como uma sequência de nucleotídeos substancialmente semelhante a ela. Especificamente, a homologia polinucleotídeo tendo podem ser detectados utilizando condições de hibridação, incluindo um passo de hibridação a um valor Tm de 55 °C sob as condições acima descritas. Além disso, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado pelos especialistas na técnica, dependendo da finalidade do mesmo. O rigor apropriado para hibridar polinucleotídeos depende do comprimento dos polinucleotídeos e do grau de complementação, e essas variáveis são bem conhecidas na arte (consulte Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
[0031] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada. Especificamente, a presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina, que compreende a homosserina desidrogenase modificada.
[0032] A homosserina desidrogenase e variante são como descritas acima.
[0033] Especificamente, o micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação se refere a um micro-organismo que inerentemente tem a capacidade de produzir homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina ou um micro-organismo ao qual a capacidade de produzir homosserina ou um derivado de homosserina O aminoácido L é conferido à sua cepa progenitora sem a capacidade de produzir homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina. Especificamente, o micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase pode ser um micro-organismo com capacidade de expressar a homosserina desidrogenase modificada, na qual o aminoácido na posição 407 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é substituído por histidina, mas o micro-organismo não está limitado a isso. O micro-organismo pode ser uma célula ou micro-organismo, que inclui um polinucleotídeo que codifica a homosserina desidrogenase modificada ou tem a capacidade de expressar um polipeptídeo modificado por transformação com um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica a homosserina desidrogenase modificada. Para os fins da presente revelação, a célula ou micro-organismo hospedeiro pode ser qualquer micro-organismo com capacidade de produzir homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina, que inclui o polipeptídeo modificado.
[0034] O micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação tem a capacidade aprimorada de produzir homosserina e um L-aminoácido derivado de homosserina em comparação com o tipo selvagem ou um micro-organismo incluindo uma proteína com a atividade de homosserina desidrogenase não modificada. Portanto, a homosserina e um L- aminoácido derivado da homosserina podem ser obtidos com alto rendimento a partir do micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada da presente revelação.
[0035] Na presente revelação, o tipo de micro-organismo incluindo a homosserina desidrogenase modificada não é particularmente limitado, mas pode ser um micro-organismo do gênero Enterobacter, um micro-organismo do gênero Escherichia, um micro-organismo do gênero Erwinia, um micro-organismo do gênero Serratia, um micro-organismo do gênero Pseudomonas, um micro-organismo do gênero Providencia, um micro-organismo do gênero Corynebacterium ou um micro-organismo do gênero Brevibacterium. Mais especificamente, o micro-organismo pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[0036] Na presente revelação, o “micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium termoaminogenes, Corynebacterium eficiens, etc., mas o micro-organismo do gênero Corynebacterium não está limitado a isso. Mais especificamente, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum.
[0037] Enquanto isso, o micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada pode ser um micro-organismo no qual é introduzido um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma variante da homosserina desidrogenase. Especificamente, a introdução pode ser realizada por transformação, mas o método de introdução não está limitado a isso.
[0038] Como usado aqui, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA incluindo uma sequência nucleotídica de um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo, na qual a proteína-alvo está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada, de modo que a proteína-alvo possa ser expressa de forma apropriada hospedeiro. A sequência de controle pode incluir um promotor com capacidade de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para o controle da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que controla a terminação da transcrição e tradução. O vetor, após transformação em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.
[0039] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que seja com capacidade de se replicar em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados como um vetor de fago ou vetor cosmídeo; e o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET, etc. podem ser usados como um vetor plasmídico. Especificamente, os vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser usados, mas o vetor não está limitado a isso.
[0040] Um vetor utilizável na presente revelação não é particularmente limitado e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo pode ser inserido no cromossomo através de um vetor para inserção cromossômica. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga), mas o método não está limitado a isso. O vetor pode ainda incluir um marcador de seleção para confirmar a inserção do polinucleotídeo no cromossomo. Um marcador de seleção é para rastrear as células transformadas com o vetor, isto é, para determinar se a molécula polinucleotídica alvo está inserida. Os marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis (por exemplo, resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes tóxicos celulares ou expressão de proteínas de superfície) podem ser usados. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver, ou as células podem mostrar fenótipos diferentes e, portanto, as células transformadas podem ser selecionadas por esse método.
[0041] Como aqui usado, o termo “transformação” se refere à introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira de tal maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo seja expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, não importa se o polinucleotídeo transformado está integrado no cromossomo da célula hospedeira e colocado no mesmo ou localizado extracromossômica. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso nela. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de gene incluindo todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. O cassete de expressão pode incluir um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, terminador de transcrição, sítio de ligação ao ribossomo ou sinal de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira como está e operacionalmente ligado às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, mas o método de introdução do polinucleotídeo não está limitado a isso. O método de transformação inclui qualquer método de introdução de um polinucleotídeo em uma célula e pode ser realizado selecionando uma técnica padrão adequada conhecida na técnica, dependendo de uma célula hospedeira. Exemplos do modo incluem eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (Ca(H2PO4)2, CaHPO4, ou Ca3(PO4)2), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, um polietilenoglicol método (PEG), um método DEAE-dextrano, um método lipossômico catiônico, um método acetato de lítio-DMSO, etc., mas os métodos de transformação não estão limitados a ele.
[0042] Além disso, o termo “ligação operável” significa que uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição de um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo da presente revelação está funcionalmente ligada à sequência de polinucleotídeos. A ligação operável pode ser preparada usando uma técnica de recombinação de genes conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas do local podem ser preparadas usando enzimas de restrição e ligases conhecidas, mas os métodos da ligação operável não estão limitados a isso.
[0043] O micro-organismo que compreende a homosserina desidrogenase modificada pode ser um que foi transformado para incluir a homosserina desidrogenase modificada em um micro-organismo do gênero Corynebacterium. Por exemplo, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode incluir uma cepa resistente ao 2-amino-3-hidroxi-valerato (AHV); uma cepa que produz L-treonina substituindo a leucina (isto é, o aminoácido na posição 377 da aspartato-quinase (lisC)) pela lisina, de modo a resolver a inibição de realimentação da lisC (ou seja, a primeira enzima importante que atua na via biossintética de treonina); uma cepa que produz L-isoleucina substituindo o aminoácido na posição 323 do gene ilvA, que codifica L-treonina desidratase (ou seja, a primeira enzima que atua na via biossintética da isoleucina) na cepa produtora de L-treonina, por alanina (Appl. Enviro. Microbiol., Dezembro de 1996, páginas 4.345 a 4.351); uma cepa que produz O-acetil- homosserina, por inativação O-acetil-homosserina (tiol)-liase, o qual está envolvido na via de degradação da O-acetil-homosserina, e cistationina-gama sintase; ou uma cepa que produz metionina por inativação de fatores reguladores transcricionais de metionina e cisteína, mas as cepas do micro-organismo do gênero Corynebacterium não se limitam a elas.
[0044] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina, que compreende: cultivar o micro-organismo descrito acima em um meio.
[0045] O método para a produção de um aminoácido L pode compreender a recuperação de homosserina ou um aminoácido L derivado de homosserina a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.
[0046] Como descrito acima, o micro-organismo pode ser um microorganismo do gênero Corynebacterium, que compreende a variante da homosserina desidrogenase da presente revelação e, mais especificamente, pode ser Corynebacterium glutamicum. Além disso, o micro-organismo do gênero Corynebacterium ou Corynebacterium glutamicum pode ser um micro-organismo que produz homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina. O L-aminoácido derivado da homosserina pode incluir não apenas um L-aminoácido derivado da homosserina, mas também um seu derivado. Por exemplo, o L-aminoácido derivado da homosserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-L-homosserina, O-succinil- L-homosserina, O-fosfo-L-homosserina, L-metionina e/ou glicina, mas o L-aminoácido derivado da homosserina não está limitado a isso. Mais especificamente, o L- aminoácido derivado da homosserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-L- homosserina, O-succinil-L-homosserina e/ou L-metionina, mas o L derivado de homosserina -aminoácido não está limitado a isso.
[0047] O homosserina ou L-aminoácido derivado de homosserina pode ser um meio de cultura de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina, que é produzido pelo micro-organismo descrito na presente revelação ou pode estar em uma forma purificada. É evidente para os especialistas na matéria que o L- aminoácido da homosserina ou derivado da homosserina inclui não apenas ele próprio, mas também um sal do mesmo.
[0048] O método para produzir o L-aminoácido homosserina ou derivado da homosserina pode ser facilmente determinado pelos especialistas na técnica sob condições de cultura otimizadas e condições de atividade enzimática conhecidas na técnica.
[0049] No método acima, o micro-organismo pode ser cultivado em um processo descontínuo, processo contínuo, processo descontínuo, etc. conhecido na técnica, mas o processo de cultura não é particularmente limitado a isso. Em particular, com relação às condições da cultura, o pH da cultura pode ser ajustado para um pH adequado (por exemplo, pH 5 a pH 9, especificamente pH 6 a pH 8 e, mais especificamente, pH 6,8) com um composto básico apropriado (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e a condição aeróbica da cultura pode ser mantida pela introdução de oxigênio ou uma mistura gasosa de oxigênio na cultura. A temperatura da cultura pode geralmente estar na faixa de 20 °C a 45 °C, e especificamente de 25 °C a 40 °C por cerca de 10 a 160 horas, mas as condições de cultura não estão limitadas a ela. A treonina, isoleucina ou acetil homosserina produzida pelo processo de cultura pode ser secretada na cultura ou pode ser retida nas células.
[0050] Além disso, como fontes de carbono para o meio de cultura, açúcar e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose); óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco); ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico); álcoois (por exemplo, glicerol e etanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético); etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas as fontes de carbono não estão limitadas a isso. Como fontes de nitrogênio para o meio de cultura, compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de maceração de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas as fontes de nitrogênio não estão limitadas a isso. Como fontes de fósforo para o meio de cultura, o di-hidrogenofosfato de potássio, o hidrogenofosfato dipotássico, os sais correspondentes contendo sódio, etc., podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas as fontes de fósforo não estão limitadas a isso. Além disso, o meio pode conter outros sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, vitaminas, etc., que são materiais essenciais para promover o crescimento.
[0051] Na presente revelação, o método para recuperar o L-aminoácido de homosserina ou derivado de homosserina produzido no processo de cultura pode ser realizado coletando o produto alvo do caldo de cultura usando um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, métodos como centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados, e o material alvo, que é o L-aminoácido derivado de homosserina ou homosserina, pode ser recuperado de um meio de cultura ou micro-organismo cultivado usando um método apropriado conhecido na técnica. Além disso, a recuperação pode incluir um processo de purificação adicional e pode ser realizada usando um método apropriado conhecido na técnica.
[0052] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso da homosserina desidrogenase modificada para aumentar a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina.
[0053] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a produção de homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina em um micro-organismo, que compreende aumentar a atividade da homosserina desidrogenase modificada.
[0054] Como usado aqui, o termo “a ser expresso/sendo expresso” se refere a um estado em que uma proteína-alvo é introduzida em um micro-organismo ou, no caso em que a proteína está presente no micro-organismo, a atividade da proteína é aumentada em comparação à atividade de sua proteína endógena ou à atividade antes de sua modificação.
[0055] Especificamente, o termo “introdução de uma proteína” significa que um micro-organismo exibe a atividade de uma proteína específica que não era originalmente possuída no micro-organismo ou o micro-organismo exibe atividade aprimorada em comparação com sua atividade endógena ou a atividade da proteína antes da modificação. Por exemplo, pode significar que um polinucleotídeo que codifica uma proteína específica é introduzido no cromossomo de um micro-organismo ou um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína específica é introduzido em um micro-organismo e, assim, exibe sua atividade. Além disso, o termo “aprimoramento da atividade” significa que a atividade de uma proteína específica é melhorada em comparação com sua atividade endógena ou com a atividade antes de sua modificação. O termo “proteína endógena” se refere à atividade de uma proteína específica originalmente possuída por uma cepa-mãe de um microorganismo, no caso em que uma característica de um micro-organismo é alterada devido a modificação genética causada por um fator natural ou artificial.
[0056] Especificamente, na presente revelação, o aprimoramento da atividade pode ser alcançado por um ou mais dos seguintes métodos: um método para aumentar o número de cópias intracelulares de um gene que codifica a variante de proteína; um método de introdução de uma modificação na sequência de controle de expressão de um gene que codifica a variante de proteína; um método para substituir a sequência de controle de expressão de um gene que codifica a variante de proteína por uma sequência com atividade forte; um método de substituição de um gene que codifica a proteína nativa no cromossomo que tem a atividade da desidrogenase da homosserina por um gene que codifica a variante da proteína; um método para introduzir uma modificação adicional em um gene que codifica a proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase, de modo a aumentar a atividade da variante da proteína; e um método de introdução da variante de proteína em um microorganismo, mas os métodos não estão limitados a isso.
[0057] Acima, o número de cópias de um gene pode ser aumentado de uma forma em que o gene está operacionalmente ligado a um vetor ou inserindo o gene no cromossomo de uma célula hospedeira, mas o método não está particularmente limitado a isso. Especificamente, o número de cópias de um gene pode ser aumentado através da introdução de um vetor em uma célula hospedeira, em que o vetor está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica a proteína da presente revelação e tem a capacidade de se replicar e funcionar independentemente da célula hospedeira. Alternativamente, o número de cópias de um gene pode ser aumentado através da introdução de um vetor, ao qual o polinucleotídeo está operacionalmente ligado, no cromossomo de uma célula hospedeira. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser alcançada por um método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga).
[0058] Então, para aumentar a expressão de um polinucleotídeo, a sequência de controle de expressão pode ser modificada induzindo uma modificação nela por exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação dos mesmos, de modo a aprimorar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão; ou substituindo a sequência de controle de expressão por uma sequência de ácido nucleico com atividade mais forte, mas o método de modificação não é particularmente limitado a isso. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução, etc., mas a sequência de controle de expressão não está limitada a isso.
[0059] Um promotor forte pode estar ligado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo em vez do promotor original, mas o método não está limitado a isso. Exemplos de promotores fortes conhecidos na técnica podem incluir promotores cj1 a cj7 (patente no KR 10-0620092), promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR de fago lambda, promotor PL, promotor tet, promotor gapA, Promotor SPL7, promotor SPL13 (sm3) (patente no KR 10-1783170), promotor O2 (patente no KR 10-1632642), promotor tkt, promotor yccA, etc., mas os promotores não estão limitados a isso.
[0060] Além disso, a modificação da sequência polinucleotídica no cromossomo pode ser realizada induzindo uma modificação na sequência de controle de expressão por exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação das mesmas, de modo a aumentar ainda mais a atividade da sequência polinucleotídica; ou substituindo a sequência polinucleotídica por uma sequência polinucleotídica modificada para ter uma atividade mais forte, mas o método de modificação não é particularmente limitado a isso.
[0061] A introdução e o aprimoramento da atividade proteica, conforme descrito acima, geralmente podem aumentar a atividade ou concentração da proteína correspondente em pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100 %, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% e, no máximo, 1.000% ou 2.000%, com base na atividade ou concentração da proteína em um cepa de micro-organismo não modificada ou do tipo selvagem, mas o intervalo não é limitado a isso.
[0062] A sequência de aminoácidos da proteína que tem a atividade da homosserina desidrogenase, o aminoácido na posição 407 e o micro-organismo são como descritos acima.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0063] A seguir, a presente revelação será descrita em detalhes através de modalidades exemplificadoras. No entanto, essas modalidades exemplificadoras são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente revelação.
EXEMPLO 1: TRIAGEM DE MICRO-ORGANISMOS RESISTENTES A AHV ATRAVÉS DE MODIFICAÇÃO ARTIFICIAL
[0064] Nesse exemplo, uma experiência de conferir resistência a 2-amino- 3-hidroxi-valerato (doravante no presente documento, “AHV”), que é um análogo de L-treonina, foi conduzida usando Corynebacterium glutamicum KFCC10881 (patente n° KR 0159812) como um cepa progenitora, de modo a libertar a inibição da retroalimentação por L-treonina da homosserina desidrogenase (doravante no presente documento, “Hom”, CE:1.1.1.3).
[0065] A modificação foi induzida por um método de modificação artificial usando N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (doravante no presente documento, “NTG”). A cepa KFCC10881, que foi cultivada em um meio de semente por 18 horas, foi inoculada em 4 ml do meio de semente e, em seguida, cultivada até OD 660 atingir cerca de 1,0. O meio de cultura foi centrifugado para recuperar as células e, em seguida, as células foram lavadas duas vezes com um tampão Tris-malato 50 mM (pH 6,5) e suspensas nos 4 ml finais do mesmo tampão. Uma solução de NTG (2 mg/ml em tampão Tris-malato 0,05 M (pH 6,5)) foi adicionada à suspensão de células para ter uma concentração final de 150 mg/l e, em seguida, deixada repousar à temperatura ambiente por 20 minutos. Depois disso, as células foram recuperadas por centrifugação e lavadas duas vezes com o mesmo tampão para remover o NTG. As células finalmente lavadas foram suspensas em 4 ml de uma solução de glicerol a 20% e depois armazenadas a -70 °C até o uso. As cepas tratadas com NTG foram plaqueadas em um meio mínimo contendo 3 g/l de AHV e, em seguida, 126 cepas resistentes a AHV derivadas de KFCC10881 foram obtidas através do procedimento acima.
MEIO DE SEMENTES (PH 7,0)
[0066] glicose 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO47H2O 0,5 g, biotina 100 μg, tiamina HCl 1.000 μg, pantotenato de cálcio 2.000 μg, nicotinamida 2.000 μg (à base del l de água destilada)
MEIO MÍNIMO (PH 7,2)
[0067] glicose 5 g, KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 5 g, MgSO47H2O 0,4 g, NaCl 0,5 g, biotina 200 μg, tiamina HCl 100 μg, pantotenato de cálcio 100 μg, nicotinamida 0,03 g, ureia 2 g, Na2B4O7 10H2O 0,09 mg, (NH4)6Mo7O27 4H2O 0,04 mg, ZnSO4 7H2O 0,01 mg, CuSO4 5H2O, MnCl2 4H2O 0,01 mg, FeCl3 6H2O 1 mg, CaCl2 0,01 mg (à base de 1 l de água destilada)
EXEMPLO 2: ENSAIO DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA PARA CEPAS RESISTENTES A AHV DERIVADAS DE KFCC10881
[0068] Um teste para a capacidade de produção de L-treonina foi realizado nas cepas resistentes a 126 AHV obtidas no Exemplo 1. As 126 cepas obtidas no Exemplo 1 foram inoculadas em cada balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de semente (25 ml) e depois cultivadas com agitação a 30 °C a 200 rpm por 20 horas. O meio de cultura de sementes (1 ml) foi inoculado em cada balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de produção de L-treonina (24 ml) abaixo e, em seguida, cultivado com agitação a 30 °C a 200 rpm por 48 horas.
MEIO DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA (PH 7,2)
[0069] glicose 30 g, KH2PO4 2 g, ureia 3 g, (NH4)2SO4 40 g, peptona 2,5 g, CSL (Sigma) 5 g (10 ml), MgSO4 7H2O 0,5 g, leucina 400 mg, CaCO3 20 g (à base de 1 l de água destilada)
[0070] Após a cultura, as quantidades de vários aminoácidos produzidos foram medidas usando HPLC. As concentrações dos aminoácidos no meio de cultura para as 5 principais cepas, que demonstraram ter excelentes habilidades de produção de L-treonina entre as 126 cepas experimentadas, são mostradas na Tabela 1. As 5 cepas candidatas confirmadas através do procedimento acima foram nomeadas de KFCC10881-1 a KFCC10881-5. [TABELA 1] EXPERIMENTOS NA PRODUÇÃO DE L-TREONINA DE EXCELENTES CEPAS RESISTENTES A AHV
[0071] Como mostrado na Tabela 1, as quantidades de L-treonina, L- homosserina, glicina, L-alanina e L-isoleucina, produzidas pelos 5 tipos de cepas com resistência ao AHV, foram aumentadas em comparação com um grupo controle, enquanto a quantidade de L-lisina produzida diminuiu.
[0072] As vias biossintéticas da L-treonina e L-lisina são separadas do aspartato-semialdeído (daqui em diante, “ASA”) como um ponto de ramificação. Ou seja, a quantidade de L-lisina produzida diminui à medida que a quantidade de L- treonina produzida é aumentada. Consequentemente, as quantidades de homosserina (Hse), glicina (Gly) e L-isoleucina (Ile), que podem ser subprodutos da via biossintética da L-treonina, podem ser aumentadas à medida que a quantidade de L-treonina produzida é aumentada, e, portanto, a quantidade total produzida (Thr + Hse + Gly + Ile) também foi confirmada.
[0073] Portanto, entre as cepas resistentes ao AHV acima, a cepa KFCC10881-1, que mostrou uma quantidade reduzida de produção de L-lisina, uma alta quantidade de produção de L-treonina e uma alta quantidade total (Thr + Hse + Gly + Ile), foi selecionada como a mais excelente cepa resistente ao AHV.
EXEMPLO 3: ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS DE CEPAS COM EXCELENTE CAPACIDADE DE PRODUZIR TREONINA DERIVADA DE KFCC10881
[0074] Para analisar as sequências nucleotídicas das enzimas de biossíntese de L-treonina da cepa selecionada no Exemplo 2 acima, foi realizada a seguinte experiência. Com base nas informações genéticas fornecidas pela Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas (KEGG), cada uma das sequências nucleotídicas de hom (SEQ ID NO: 2, NCgl1136), que codifica a homosserina desidrogenase de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e a sequência nucleotídica de thrB (SEQ ID NO: 3, Gene No. NCgl1137), que codifica a homosserina- quinase, foram obtidas. Ambos os genes hom e thrB são conhecidos por terem uma estrutura operon (Peoples et al., Mol. Biol. 2 (1): 63-72, 1988).
[0075] Para obter o fragmento de DNA contendo o operon hom - thrB da cepa selecionada, a PCR foi realizada utilizando o DNA genômico da cepa como modelo e um conjunto de primers de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: 30 ciclos de desnaturação a 96 °C por 30 segundos, recozimento a 52 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 3 minutos. Como resultado, foi possível amplificar um fragmento de gene (2.778 pb; SEQ ID NO: 6), que inclui a sequência nucleotídica (300 pb) contendo uma região promotora a montante do códon de iniciação da SEQ ID NO: 2 para incluir o 200 pb a jusante do códon de terminação da SEQ ID NO: 3.
[0076] A sequência nucleotídica foi determinada utilizando os primers preparados por um Analisador ABI PRISM 3730XL (tipo capilar 96; Applied Biosystems). Na sequência nucleotídica correspondente ao hom do operon hom - thrB na cepa KFCC10881-1, a guanina (isto é, o nucleotídeo na posição 1.220 da SEQ ID NO: 2) foi modificada para adenina e, portanto, o códon do gene CGT que codifica uma arginina o resíduo foi modificado para o códon do gene CAT que codifica um resíduo de histidina (doravante no presente documento, “modificação R407H”; SEQ ID NO: 7). Enquanto isso, nenhuma modificação foi constatada no gene thrB correspondente à SEQ ID NO: 3.
[0077] A partir das análises da sequência de nucleotídeos acima, foi possível concluir que a inibição da retroalimentação pela L-treonina foi dessensibilizada pela modificação da arginina (isto é, o 407o resíduo de aminoácido) do Hom (SEQ ID NO: 8) no KFCC10881-1 à histidina (doravante no presente documento, “modificação R407H”).
EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CEPAS INOVADORAS ÀS QUAIS É INTRODUZIDA A HOMOSSERINA DESIDROGENASE
[0078] Um conjunto de primers de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 foi preparado de modo a preparar cepas nas quais a variante (R407H) identificada no Exemplo 2 foi introduzida em suas cepas de tipo selvagem.
[0079] Para preparar as cepas a que cada um dos modificação R407H hom é introduzido, a PCR foi realizada utilizando o DNA genômico extraído a partir da cepa KFCC10811-1 como um modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: 28 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos. Como resultado, um fragmento de gene (1.668 pb) incluindo uma região promotora (cerca de 300 pb) do gene hom (1.338 pb) foi obtido. O produto amplificado foi purificado usando um kit de purificação por PCR (QIAGEN) e usado como um fragmento de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, após o tratamento com a enzima de restrição SmaI, a proporção da concentração molar (M) do vetor pDZ (patente n° KR 10-0924065) tratada termicamente a 65 °C por 20 minutos para o fragmento de DNA inserido amplificado pela PCR acima foi definido como 1:2, e o vetor foi clonado usando um kit de clonagem de infusão (TaKaRa) de acordo com o manual do fabricante e, assim, o vetor para introdução da modificação R407H no cromossomo pDZ-R407H foi preparado.
[0080] O vetor pDZ-R407H foi transformado em Corynebacterium glutamicum ATCC13032 por eletroporação e sujeito a cruzamento secundário e, assim, uma cepa na qual foi obtida uma substituição de um nucleotídeo modificado no cromossomo. Utilizando os conjuntos de primers listados abaixo e uma técnica de PCR para Amplificação Específica de Alelo Mutante (MASA) (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112 a 117 (1993)), a adequação da substituição foi determinada principalmente pela seleção da cepa amplificada usando o conjunto de primers correspondente à sequência modificada (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12). Além disso, a análise da sequência hom da cepa selecionada foi realizada para confirmar secundariamente a adequação da substituição usando o conjunto de primers de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13 e analisando a sequência modificada da mesma maneira como no Exemplo 2. A cepa substituída com o nucleotídeo modificado foi denominada CA09-0900.
[0081] A cepa CA09-0900 foi depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos (KCCM), uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste, em 14 de dezembro de 2018, e recebeu o número de acesso KCCM12418P.
EXEMPLO 5: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DA HOMOSSERINA DESIDROGENASE
[0082] A atividade da enzima Hom foi medida na cepa preparada. A cepa de tipo selvagem ATCC13032 (o grupo controle) e a cepa CA09-0900 preparada no Exemplo 4 foram inoculadas em 25 ml do meio de semente e cultivadas até que as cepas atingissem a fase tardia do registro. As células de cada cepa foram recuperadas por centrifugação, lavadas duas vezes com tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,6) e finalmente suspensas em 2 ml do mesmo tampão contendo glicerol a uma concentração de 30%. Cada suspensão celular foi interrompida fisicamente por um método convencional de vórtice de esferas de vidro por 10 minutos, e cada sobrenadante foi recuperado através de duas centrifugações (13.000 rpm, 4 °C, 30 minutos) e usado como um extrato bruto para medir a atividade de Hom. Para a medição da atividade de Hom, uma solução de coenzima (0,1 ml) foi adicionada a uma solução de reação para medir a atividade enzimática (um tampão de fosfato de potássio (pH 7,0), NADPH 25 mM, NADPH 25 mM, semialdeído aspartato 5 mM) e reagiu a 30 °C. A atividade da enzima Hom U foi definida como o número de NADPH μmol consumido por minuto, de acordo com a presença de L-treonina (0 mM, 10 mM), e os resultados das medições da atividade enzimática são mostrados na Tabela 2 abaixo. [TABELA 2] MEDIÇÃO DA ATIVIDADE HOM (U) E dessensibilização por L- treonina
[0083] Como resultado do experimento, foi confirmado que, no Hom, incluindo a modificação R407H, a inibição da atividade foi reduzida sob a condição em que 10 mM de L-treonina estava contida, diferentemente do Hom de tipo selvagem, confirmando a ocorrência de dessensibilização à L-treonina.
EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS DE MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM COM CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA
[0084] As cepas que produzem L-treonina foram desenvolvidas a partir do Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem ATCC13032. Especificamente, para resolver a inibição da retroalimentação pela aspartato-quinase (lisC) (isto é, uma enzima importante que atua primeiro na via da biossíntese da treonina), a leucina (isto é, um aminoácido na posição 377 da lisC) foi substituída pela lisina (SEQ ID NO: 14).
[0085] Mais especificamente, para preparar as cepas nas quais a modificação de lysC (L377K) é introduzida, a PCR foi realizada usando o cromossomo ATCC13032 como modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 15 e 16 ou SEQ ID NOS: 17 e 18. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: 28 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto. Como resultado, foram obtidos um fragmento de DNA (515 pb) na região 5’ a montante e um fragmento de DNA (538 pb) na região 3' a jusante, com o local de modificação do gene lysC como centro. A PCR foi realizada com os dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 18. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C por 5 minutos; 28 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos; e polimerização a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, o fragmento de DNA (1.023 pb) incluindo a modificação do gene lysC, que codifica uma variante de aspartoquinase, na qual a leucina na posição 377 é substituída por lisina, foi amplificada. O produto amplificado foi purificado usando um kit de purificação por PCR (QIAGEN) e usado como um fragmento de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, após o tratamento com a enzima de restrição SmaI, a proporção da concentração molar (M) do vetor pDZ (patente n° KR 10-0924065) tratada termicamente a 65 °C por 20 minutos para o fragmento de DNA inserido amplificado pela PCR acima foi definido como 1: 2 e o vetor foi clonado usando um kit de clonagem de infusão (TaKaRa) de acordo com o manual do fabricante e, assim, o vetor para introdução da modificação L377K no cromossomo pDZ-L377K foi preparado.
[0086] O vetor pDZ-L377K preparado foi transformado na cepa ATCC13032 e sujeito a cruzamento secundário e, desse modo, uma cepa na qual foi obtida uma substituição de um nucleotídeo modificado no cromossoma. A cepa foi denominada CJP1. A cepa CJP1 foi nomeada novamente como CA01-2307, depositada no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (KCCM), uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste, em 29 de março de 2017, e recebeu o número de acesso KCCM12000P.
[0087] Para confirmar claramente as alterações na produção de L-treonina da cepa acima, a modificação identificada no Exemplo 4 foi introduzida num gene que codifica a homosserina desidrogenase. Especificamente, para introduzir a modificação R407H na cepa CJP1, o vetor pDZ-R407H preparado no Exemplo 4 foi transformado na cepa CJP1 por eletroporação e sujeito a um cruzamento secundário e, portanto, uma cepa na qual um nucleotídeo modificado foi introduzido no cromossomo foi obtido. A cepa substituída com um nucleotídeo modificado foi denominada CJP1-R407H. [TABELA 3] CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TREONINA DE CEPAS PREPARADAS
[0088] Como resultado, na cepa onde a modificação foi introduzida, a quantidade de L-lisina produzida diminuiu e a quantidade de L-treonina produzida foi aumentada em 1,14 g/l, em comparação com a cepa CJP1 (grupo controle), portanto confirmando uma melhora significativa no efeito de dessensibilização.
EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS DE MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZEM L- ISOLEUCINA
[0089] Para preparar cepas produtoras de isoleucina, foi preparado um vetor para melhorar a expressão do gene modificado ilvA (V323A) (Appl. Enviro. Microbiol., dezembro de 1996, páginas 4.345 a 4.351), que codifica L-treonina desidratase conhecida (a primeira enzima na via de biossíntese da isoleucina), nas cepas preparadas no Exemplo 6.
[0090] Especificamente, para preparar um vetor para a introdução de uma modificação, que tem como alvo o gene ilvA, um par de primers (SEQ ID NOS: 19 e 20) para amplificar a região a montante 5’ e um par de primers (SEQ ID NOS: 21 e 22) para amplificar a região 3’ a jusante foram criados com o local de modificação como o centro. Os sítios da enzima de restrição BamHI foram inseridos em cada extremidade dos primers da SEQ ID NOS: 19 e 22, e os primers da SEQ ID NOS: 20 e 21 foram projetados de modo que uma modificação substituída por nucleotídeo possa ser posicionada em uma região onde um cruzamento deve ser induzido.
[0091] A PCR foi realizada com o cromossomo da cepa do tipo selvagem como modelo usando os primers da SEQ ID NOS: 19, 20, 21 e 22. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C por 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (627 pb) na região 5’ a montante e um fragmento de DNA (608 pb) na região 3' a jusante foram obtidos com o local de modificação do gene ilvA como centro.
[0092] A PCR foi realizada usando os dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 19 e 22. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C por 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 60 segundos; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (1.217 pb) foi amplificado, no qual o fragmento de DNA incluiu uma modificação do gene ilvA que codifica uma variante de IlvA em que a valina na posição 323 foi substituída por alanina. O vetor pECCG117 (Patente n° KR 10-0057684) e o fragmento de DNA (1. 217 pb) foram tratados com a enzima de restrição BamHI, ligados usando DNA ligase e depois clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo assim obtido foi denominado pECCG117-ilvA (V323A).
[0093] O vetor pECCG117-ilvA (V323A) foi introduzido na cepa CJP1- R407H preparada no Exemplo 6 por eletroporação e plaqueado em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l) para obter as cepas transformadas. As cepas transformadas assim obtidas foram cultivadas pelo mesmo método de cultura em frasco do Exemplo 2, e as concentrações de L-isoleucina no meio de cultura foram analisadas. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo. [TABELA 4] CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE PRODUTIVA DE L- ISOLEUCINA DAS CEPAS PREPARADAS
[0094] Como resultado, foi confirmado que na cepa incluindo a modificação hom (R407H), a capacidade de produção de L-isoleucina foi melhorada em 0,7 g/l em comparação com a cepa de controle.
EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA PRODUTORA DE O- ACETIL-HOMOSSERINA (OAH) SUBSTITUÍDA COM HOM MODIFICADA 8-1. PREPARAÇÃO DA CEPA ATCC13032 SUBSTITUÍDA COM HOM MODIFICADA
[0095] A modificação de R407H foi introduzida no gene hom da cepa ATCC13032 da mesma maneira que no Exemplo 4, e a cepa assim preparada foi denominada ATCC13032::HomFBR.
8-2. DELEÇÃO DO GENE metB
[0096] Nesse exemplo, o gene metB que codifica a cistationina gama- sintase na via de degradação de O-acetil-homosserina foi obtido por PCR usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo. Com base no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidas as informações da sequência nucleotídica do metB (Registro NCBI Ncgl2360; SEQ ID NO: 23). Além disso, com base nisso, os primers (SEQ ID NOS: 24 e 25) que contêm o terminal N e a sequência ligante do gene metB e os primers (SEQ ID NOS: 26 e 27) que contêm o terminal C e a sequência ligante do gene metB foram sintetizados. A PCR foi realizada usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo e os oligonucleotídeos das sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 24 e 25 e SEQ ID NOS: 26 e 27, como os conjuntos de primers. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) foi usada como polimerase. A PCR foi realizada da seguinte forma: 30 ciclos de desnaturação a 96 °C por 30 segundos, recozimento a 53 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foi obtido um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal N e o ligante do gene metB e um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal C e o ligante do gene metB.
[0097] A PCR foi realizada usando os dois genes amplificados assim obtidos como modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 24 e 27 nas seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação a 96 °C por 60 segundos, recozimento a 50 °C por 60 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foi obtido um gene A metB amplificado (1.000 pb), que é um cassete de inativação metB contendo o N-terminal-ligante-C-terminal do gene metB. O gene metB obtido através da PCR foi tratado com as enzimas de restrição XbaI e SalI incluídas nos terminais e, em seguida, clonado em um vetor pDZ, que foi tratado previamente com as enzimas de restrição XbaI e SalI, por ligação. Depois disso, foi preparado um vetor recombinante pDZ- AmetB no qual o cassete de inativação metB é finalmente clonado.
[0098] O vetor pDZ-Δ metB preparado foi transformado nas cepas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e ATCC13032::HomFBR. Após cruzamento secundário, as cepas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e ATCC13032 ΔmetB::HomFBR ΔmetB, em que o gene é inativado metB no cromossoma, foram obtidos. O gene metB inativado foi finalmente confirmado através da PCR usando o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 24 e 27, seguido por comparação da sequência com a cepa ATCC13032 na qual o gene metB não está inativado.
8-3. DELEÇÃO DO GENE metY
[0099] Nesse exemplo, o gene metY que codifica O-acetil-homosserina (tiol) -liase na via de degradação de O-acetil-homosserina foi obtido por PCR usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo. Com base no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidas as informações da sequência nucleotídica do gene metY (registro NCBI Ncgl0625; SEQ ID NO: 28). Além disso, com base nisso, os primers (SEQ ID NOS: 29 e 30) que contêm o terminal N e a sequência ligante do gene metY e os primers (SEQ ID NOS: 31 e 32) que contêm o terminal C e a sequência ligante do gene metY foram sintetizados.
[0100] A PCR foi realizada com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo usando os oligonucleotídeos das sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 29 e 30 e SEQ ID NOS: 31 e 32, como os conjuntos de primers. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) foi usada como polimerase. A PCR foi realizada da seguinte forma: 30 ciclos de desnaturação a 96 °C por 30 segundos, recozimento a 53 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foi obtido um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal N e o ligante do gene metY e um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal C e o ligante do gene metY. A PCR foi realizada usando os dois genes amplificados assim obtidos como modelo e o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 29 e 32 nas seguintes condições: 10 ciclos de desnaturação a 96 °C por 60 segundos, recozimento a 50 °C por 60 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foi obtido um gene A metY amplificado (1.000 pb), que é um cassete de inativação metY contendo o N-terminal-ligante-C-terminal do gene metY.
[0101] O gene metY obtido através da PCR foi tratado com as enzimas de restrição XbaI e SalI incluídas nos terminais e depois clonado em um vetor pDZ, que foi tratado previamente com as enzimas de restrição XbaI e SalI, por ligação. Depois disso, foi preparado um vetor recombinante pDZ- AmetY no qual o cassete de inativação metY é finalmente clonado.
[0102] O vetor pDZ-Δ metY preparado foi transformado nas cepas Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032 Δ metB, e ATCC13032::HomFBR ΔmetB. Após cruzamento secundário, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Δ Mety, ATCC13032::HomFBR ΔMety, ATCC13032 ΔmetB ΔMety, e ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔMety, em que o gene é inativado Mety no cromossoma, foram obtidos. O gene metY inativado foi finalmente confirmado através da PCR usando o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 29 e 32, seguido por comparação da sequência com ATCC13032 na qual o gene metY não está inativado.
8-4. PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA QUE PRODUZ O-ACETIL- HOMOSSERINA
[0103] Foi realizada uma comparação entre as capacidades de produção de O-acetil-homosserina das cepas ATCC13032, ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔMety, e ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔMety preparadas nos Exemplos 8-1 a 8-3, em que os genes metB, Mety, e metBY são eliminados e o gene modificado é hom substituído nisso.
[0104] Especificamente, as colônias únicas foram cultivadas em meio LB sólido durante a noite em uma incubadora a 32 °C e uma alça de cada uma das colônias únicas foi inoculada no meio de titulação de O-acetil-homosserina (25 ml) e, em seguida, os resultantes foram cultivados em 32 °C a 250 rpm por 42 a 64 horas. A O-acetil-homosserina de cada cultura foi analisada por HPLC, e seus resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo.
MEIO DE PRODUÇÃO DE O-ACETIL-L-HOMOSSERINA (PH 7,2)
[0105] glicose 30 g, KH2PO4 2 g, ureia 3 g, (NH4)2SO4 40 g, peptona 2,5 g, CSL (Sigma) 5 g (10 ml), MgSO4 7H2O 0,5 g, metionina 400 mg, leucina 400 mg, CaCO3 20 g (à base de 1 l de água destilada) [TABELA 5] AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE O-ACETIL-HOMOSSERINA
[0106] Como resultado, como mostrado na Tabela 5 acima, a O-acetil-L- homosserina não foi acumulada quando Corynebacterium glutamicum ATCC13032, a cepa de controlo, foi cultivada; Considerando que a O-acetil-L-homosserina foi acumulada em uma quantidade de 0,3 g/l, 0,3 g/l e 0,5 g/l para cada uma das cepas ATCC13032 Δ metB, ATCC13032 ΔmetY e ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, respectivamente, em que os genes metB, metY e metBY são inativados.
[0107] Além disso, no caso da cepa ATCC13032::HomFBR na qual o gene hom é substituído na forma de R407H, e as cepas ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetY e ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY nas quais os genes metB, metY e metBY estão inativados, respectivamente, confirmou-se que a O- acetil-L-homosserina foi acumulada em uma quantidade de 1,3 g/l, 1,5 g/l e 3,7 g/l para cada uma dessas linhagens.
[0108] Portanto, foi confirmado a partir dos resultados acima que a quantidade de produção do aminoácido alvo, da qual a homosserina é um precursor, pode ser significativamente aumentada usando o hom modificado da presente revelação.
EXEMPLO 9: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS QUE PRODUZEM L-METIONINA EXEMPLO 9-1: PREPARAÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE PARA DELEÇÃO DE GENE mcbR
[0109] Nesse exemplo, para preparar cepas produtoras de metionina, foi preparado um vetor para inativação do gene mcbR (J. Biotechnol. 103: 51 A 65, 2003), que codifica proteínas reguladoras da transcrição conhecidas de metionina e cisteína nas cepas preparadas no Exemplo 6.
[0110] Especificamente, um vetor plasmídeo recombinante foi preparado usando o método abaixo, de modo a excluir o gene mcbR no cromossomo de Corynebacterium ATCC13032. Com base nas sequências nucleotídicas relatadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidos o gene mcbR e sua sequência circundante (SEQ ID NO: 33) de Corynebacterium glutamicum.
[0111] Para fins de exclusão de mcbR, a PCR foi realizada usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo e os conjuntos de primers de SEQ ID NOS: 34 e 35 e SEQ ID NOS: 36 e 37 sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 53 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, foram obtidos fragmentos de DNA (700 pb).
[0112] Um vetor pDZ, que não pode ser replicado em Corynebacterium glutâmico e os fragmentos do gene mcbR amplificado foram tratados com a enzima de restrição SmaI para inserção cromossômica. Posteriormente, eles foram ligados usando DNA ligase, transformados em E. coli DH5α e semeados no mesmo meio LB sólido contendo canamicina (25 mg/l). As colônias transformadas com o vetor, no qual fragmentos deletados dos genes-alvo são inseridos por PCR, foram selecionados e um plasmídeo foi obtido usando um método de extração de plasmídeo. O plasmídeo assim obtido foi denominado pDZ-ΔmcbR.
EXEMPLO 9-2: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DE CEPAS DE MICRO-ORGANISMO DE GÊNERO CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZ L-METIONINA
[0113] O vetor pDZ-ΔmcbR preparado no Exemplo 9-1 por recombinação homóloga no cromossomo foi transformado em cada uma das cepas CJP1-R407H e CJP1, que foram preparadas no Exemplo 6, por eletroporação (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 541 a 545, 1999). Depois disso, a recombinação secundária foi realizada em um meio sólido contendo X-gal. As cepas nas quais o gene mcbR é deletado foram confirmadas por um método de PCR com as cepas transformadas de Corynebacterium glutamicum, nas quais a recombinação secundária foi concluída, usando o conjunto de primers de SEQ ID NOS: 38 e 39. Essas cepas recombinantes foram denominadas “CJP1-R407HΔ mcbR” e “CJP1Δ mcbR”, respectivamente.
[0114] Para analisar a capacidade de produção de L-metionina da cepa CJP1-R407HΔ mcbR preparada, a cepa foi cultivada em conjunto com a cepa CJP1Δ mcbR da seguinte maneira.
[0115] Corynebacterium glutamicum CJP1/Δ mcbR e a cepa da invenção (Corynebacterium glutamicum CJP1-R407HΔ mcbR) foram inoculadas em um balão defletor de canto de 250 ml contendo o meio de semente abaixo (25 ml) e depois cultivadas com agitação a 30 °C a 200 rpm por 20 horas. Posteriormente, o meio de cultura de sementes (1 ml) foi inoculado em um balão defletor de canto de 250 ml contendo o meio de produção abaixo (24 ml) e depois cultivado com agitação a 30 °C a 200 rpm por 48 horas. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes. MEIO DE SEMENTES (PH 7,0) glicose 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0,5 g, biotina 100 μg, tiamina HCl 1.000 μg, cálcio pantotenato 2.000 μg, nicotinamida 2.000 μg (à base de 1 l de água destilada) MEIO DE PRODUÇÃO (PH 8,0) glicose 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, extrato de levedura 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 1,2 g, biotina 100 μg, tiamina HCl 1.000 μg, pantotenato de cálcio 2.000 μg, nicotinamida 3.000 μg, CaCO3 30 g (à base de 1 l de água destilada) Após o cultivo usando o método de cultivo acima, a concentração de L- metionina em cada meio de cultura foi analisada e os resultados são mostrados na Tabela 6. [TABELA 6] AVALIAÇÃO DAS CAPACIDADES DE PRODUÇÃO DE L- METIONINA DE CEPAS PREPARADAS
[0116] Como resultado, foi confirmado que na cepa incluindo a modificação hom de R407H, a capacidade de produção de L-metionina foi melhorada em 0,18 g/l em comparação com a cepa de controle.
[0117] Com base nos resultados acima, foi confirmado que a quantidade de L-metionina produzida pode ser significativamente aumentada usando o hom modificado da presente revelação.
[0118] Pelo exposto, um versado na técnica na técnica à qual a presente revelação se refere terá a capacidade de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificadoras reveladas neste documento são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação pretende abranger não apenas as modalidades exemplificadoras, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e escopo da presente revelação, conforme definido pelas reivindicações anexas

Claims (9)

1. Homosserina desidrogenase modificada CARACTERIZADA pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, na qual o aminoácido na posição 407 é substituído com histidina.
2. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a homosserina desidrogenase modificada, como definida na reivindicação 1, em que apresenta a sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou a sequência degenerada da mesma, na qual os nucleotídeos nas posições 1219 a 1221 são substituídos com nucleotídeos que codificam histidina.
3. Micro-organismo do gênero Corynebacterium CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma dentre a homosserina desidrogenase modificada, como definida na reivindicação 1, e o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 2.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium produz homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina.
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o L-aminoácido derivado de homosserina é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-homosserina e L-metionina.
6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
7. Método para produzir homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar em um meio, um micro-organismo do gênero Corynebacterium que compreende a homosserina desidrogenase modificada, como definida na reivindicação 1; recuperar homosserina ou um L-aminoácido derivado de homosserina do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o L-aminoácido derivado de homosserina é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-homosserina e L-metionina.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
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