BR112015018599B1 - Micro-organismos com produtividade de putrescina e processo para produzir putrescina que utiliza os mesmos - Google Patents

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Abstract

MICRO-ORGANISMOS COM PRODUTIVIDADE DE PUTRESCINA E PROCESSO PARA PRODUZIR PUTRESCINA QUE UTILIZA OS MESMOS. A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante capaz de produzir putrescina, em que o micro-organismo foi modificado para apresentar atividade aumentada de NCgl2522, produzindo deste modo putrescina com um rendimento elevado, e a um método para produzir putrescina que utiliza o micro-organismo.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante com uma produtividade de putrescina melhorada e a um método para produzir putrescina com um rendimento elevado por meio desse micro-organismo.
2. Descrição da Técnica Relacionada
[002] As poliaminas, tais como a espermidina, a espermina ou semelhantes, estão presentes na maioria das células vivas, e a putrescina (ou 1,4-butanodiamina) é utilizada como precursor nos metabolismos da espermidina e da espermina. A putrescina pode ser encontrada em bactérias Gram-negativas ou em fungos, e está presente em concentrações elevadas em várias espécies, sugerindo que desempenha um papel importante nas vias metabólicas dos micro-organismos.
[003] Em geral, a putrescina é uma matéria-prima importante na síntese da poliamina nylon-4,6, que é produzida por reação com ácido adípico. A putrescina é produzida principalmente por síntese química, via acrilonitrilo e succinonitrilo, a partir de propileno. Esta síntese química é um processo de três passos, que inclui uma reação de oxidação catalítica, uma reação que utiliza um composto de cianeto, e uma reação de hidrogenação com hidrogênio de alta pressão. Apresenta desvantagens na medida em que não é favorável ao ambiente e também consome bastante energia, contribuindo para o esgotamento do petróleo. Por isso, há necessidade de desenvolver um método de produtividade de putrescina mais respeitador do ambiente e eficaz do ponto de vista energético, através do uso de biomassa.
[004] Nos micro-organismos, uma via biossintética da putrescina é igual à via de síntese da arginina a partir de glutamato para formar ornitina. A putrescina pode ser biossintetizada por duas vias a partir de micro-organismos. Em uma via, a ornitina, como intermediário, é descarboxilada para sintetizar putrescina. Em outra via, a agmatina é produzida pela descarboxilação da arginina sintetizada a partir de ornitina, e a putrescina é depois sintetizada a partir da agmatina (Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996). Estas duas vias produzem a energia necessária para o metabolismo, ou permitem que a célula possua resistência ao estresse oxidativo.
[005] Como método para produzir putrescina por meio de um microorganismo, foi relatado um processo de produtividade de putrescina em uma concentração elevada através da transformação de E. coli e de Corynebacterium (Publicação de Patente Internacional N°. WO06/005603; Publicação de Patente Internacional N°. WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011). Por exemplo, WO09/125924 revela um método para produzir putrescina com um rendimento elevado através da intensificação da via biossintética da ornitina, em vez da inativação das vias envolvidas na degradação e utilização da putrescina que estão presentes em E. coli e da inativação da conversão da ornitina como precursor da putrescina em arginina. Adicionalmente, Schneider (2010) revela um método para produzir putrescina a uma concentração elevada, que introduz e aumenta uma proteína capaz de converter ornitina em putrescina em uma estirpe de Corynebacterium sp. isenta de produtividade de putrescina.
[006] Para, além disso, foram realizados estudos intensivos sobre transportadores de putrescina em células de E. coli, levedura, plantas e animais (K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010). A incorporação de putrescina em E. coli ocorre através de 4 vias; potABCD ou potFGHI conduzida pela hidrólise de ATP, e potE com simportador de H+ e puuP da via puu. Em relação aos valores de Km destes complexos envolvidos na incorporação da putrescina, os de PotFGHI, potABCD, potE e puuP são 0,5 mM, 1,5 mM, 1,8 mM, e 3,7 mM respectivamente. Entre as quatro vias de incorporação da putrescina, o complexo potFGHI é considerado como o mais adequado. Adicionalmente, o transportador potE possui ambas as funções, incorporação e excreção de putrescina. A putrescina é importada em conjunto com o protão para as células a pH neutro. Contudo, como a putrescina-sintase (speF) é expressa em condições de pH ácido, a incorporação intracelular da ornitina extracelular e a excreção extracelular da putrescina sintetizada nas células ocorre simultaneamente (Kurihara et.al., J. Bacteriology 191: 8, 2776-2782, 2009).
[007] Como exportadores de putrescina em leveduras são conhecidos o TPO1 e o TPO4. Estas sequências de aminoácidos são muito semelhantes à sequência de aminoácidos do transportador de multifármacos dos bacilos Blt.
[008] Estes dois exportadores partilham características com potE em E. coli, e possuem funções de importação de putrescina, espermidina, e espermina em condições básicas e da sua exportação em condições ácidas. Adicionalmente, a célula de levedura que sobre-expressa o gene TPO5 é resistente a 120 mM de putrescina enquanto um mutante com o gene TPO5 desativado é sensível a 90 mM de putrescina (Tachihara et. al., J. Biological Chemistry, 280(13): 1263712642, 2005).
[009] A síntese e a degradação, e a incorporação e excreção da putrescina em células animais são reguladas de vários modos. Embora não tenham sido realizados estudos sobre a excreção de poliamina em células animais, nem em E. coli ou leveduras, foi relatado que um SLC3A2 (exportador de arginina/diamina) tem como função importar arginina para as células e exportar putrescina, acetilespermidina, e acetilespermina em células epiteliais do cólon. Todavia, não foi relatada nem a incorporação, nem a exportação de putrescina em células vegetais (Igarashi et al., Plant Physiol. & Biochem. 48: 506-512, 2010).
[010] Por outro lado, uma vez que o micro-organismo Corynebacterium sp. não possui via biossintética da putrescina, não foram realizados estudos sobre a exportação da putrescina. De acordo com um relato recente, o crescimento celular é restaurado e a produtividade da cadaverina é aumentada através da sobre-expressão da proteína membranar cg2983 em uma estirpe que produz uma cadaverina (Kind et. al., Metabolic Engineering 13: 617-627, 2011).
[011] Não foi contudo relatada a associação entre o exportador da putrescina e a produtividade da putrescina ou o crescimento de microorganismos produtores de putrescina. Na literatura atrás referida, não há menção sobre a associação entre a proteína membranar cg2983 e a capacidade de exportação da putrescina.
[012] Neste cenário, os presentes inventores envidaram esforços para desenvolver uma estirpe capaz de produzir putrescina com um rendimento mais elevado. Como resultado, as funções da NCgl2522 foram reveladas como exportadora de putrescina em uma estirpe produtora de putrescina, o microorganismo Corynebacterium sp., e a putrescina pode ser produzida com um rendimento elevado pelo aumento da atividade da NCgl2522 em comparação com a sua atividade endógena. Por outro lado, uma vez que a quantidade de putrescina em um meio de cultura pode ser aumentada pela expressão da NCgl2522 em E. coli detentora da via sintética da putrescina, os presentes inventores sugeriram que a NCgl2522 também funciona como exportador de putrescina em E. coli, dando por esse modo concluída a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[013] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um micro-organismo recombinante, modificado com vista a uma atividade aumentada da NCgl2522, produzindo desse modo putrescina com um rendimento elevado.
[014] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para produzir putrescina com um rendimento elevado por meio do micro-organismo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[015] O diagrama da FIG. 1 demonstra que a NCgl2522 está incluída em um clone (B19) selecionado entre colônias transformadas introduzidas com uma biblioteca cromossômica de Corynebacterium de acordo com a presente invenção; e
[016] a FIG. 2 é o resultado da avaliação da resistência a putrescina da estirpe recombinante com a NCgl2522 eliminada ou aumentada, de acordo com a presente invenção. 1: KCCM11240P 2: KCCM11240P △NCgl2522 3: KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS
[017] Em um aspecto, a fim de alcançar o referido objeto, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, que foi modificado para aumentar a atividade de uma proteína com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21 ou 23.
[018] Em uma forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que o micro-organismo foi ainda modificado para possuir atividades enfraquecidas da ornitina- carbamoiltransferase (ArgF) e uma proteína (NCgl1221) envolvida na exportação de glutamato, em comparação com a sua atividade endógena, e é introduzido com a atividade da ornitina-descarboxilase (ODC).
[019] Em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que a ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) possui uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29, a proteína (NCgl1221) envolvida na exportação de glutamato possui uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, e a ornitina-descarboxilase (ODC) possui uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33.
[020] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que o micro-organismo foi ainda modificado para possuir atividades aumentadas da acetil-gama-glutamil-fosfato-redutase (ArgC), acetilglutamato-sintase ou ornitina- acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato-cinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD), comparada com as suas atividades endógenas.
[021] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que a acetil-gama-glutamil-fosfato-reductase (ArgC), acetilglutamato-sintase ou ornitina-acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato-cinase (ArgB), e acetilornitina- aminotransferase (ArgD) possuem as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 25, 26, 27 e 28, respectivamente.
[022] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que a atividade da acetiltransferase (NCgl1469) do micro-organismo se encontra ainda mais enfraquecida.
[023] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que a acetiltransferase possui uma sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NO: 31 ou 32.
[024] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que o micro-organismo é uma Escherichia sp. ou um Corynebacterium sp.
[025] Ainda em outra forma de realização específica, a presente invenção proporciona um micro-organismo com produtividade de putrescina, em que o micro-organismo é E. coli ou Corynebacterium glutamicum.
[026] Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir putrescina, compreendendo os passos de cultivar um micro-organismo com produtividade de putrescina para obter uma cultura de células e recuperar a putrescina da cultura de micro-organismos ou cultura de células.
[027] De aqui em diante, a presente invenção será descrita em pormenor.
[028] A presente invenção proporciona um micro-organismo Corynebacterium sp. recombinante, em que o micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina foi modificado para exibir atividade aumentada da NCgl2522 em comparação com a sua atividade endógena, e por isso apresenta uma produtividade de putrescina melhorada.
[029] Como aqui utilizado, o termo “NCgl2522” refere-se à permease que pertence a MFS (major facilitator superfamily/superfamília do facilitador principal), que é uma proteína de membrana isolada a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13032. A NCgl2522 é conhecida por exportar diaminopentano a partir de Corynebacterium glutamicum. Na presente invenção, foi confirmado que a NCgl2522 funciona como um transportador que serve para exportar extracelularmente a putrescina produzida nas células. Com base neste fato, a presente invenção proporciona um micro-organismo recombinante que apresenta uma produtividade de putrescina com elevado rendimento, em que a NCgl2522 foi modificada para apresentar maior atividade do que a sua atividade endógena, e desse modo, aumentar a exportação a putrescina produzida intracelularmente.
[030] Como aqui utilizado, o termo “atividade endógena” refere-se à atividade de uma enzima que um micro-organismo possui no seu estado nativo, nomeadamente no estado sem modificação, e o termo “modificado para apresentar maior atividade do que a atividade endógena” significa que a atividade da enzima foi introduzida de novo ou melhorada em comparação com a atividade da enzima correspondente antes da modificação.
[031] Na presente invenção, “aumento da atividade enzimática” inclui o aumento na atividade enzimática através do aumento na atividade do gene endógeno, amplificação do gene endógeno por fatores internos ou externos, deleção de um fator regulador para suprimir a expressão do gene, aumento do número de cópias do gene, aumento na atividade através da introdução de um gene estranho ou modificação de uma sequência de regulação de expressão, em particular, substituição ou modificação de um promotor e mutação em um gene, assim como a introdução ou aumento na atividade da própria enzima para alcançar efeitos superiores aos das funções endógenas.
[032] Na presente invenção, “modificado a fim de apresentar atividade aumentada em comparação com a atividade endógena” significa que a atividade do micro-organismo foi aumentada após manipulação, tal como introdução de um gene que apresenta a referida atividade, aumento no número de cópias do gene, deleção de um fator de regulação para suprimir a expressão do gene, ou modificação de uma sequência reguladora de expressão, por exemplo, utilização de um promotor melhorado, em comparação com a atividade do microorganismo antes da manipulação.
[033] A NCgl2522 com a sua atividade aumentada de acordo com a presente invenção pode ser, mas sem lhes estar particularmente limitada, uma proteína com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 ou 23 ou uma sequência de aminoácidos com 70% ou mais de homologia com esta, preferencialmente 80% ou mais homologia com esta, mais preferencialmente 90% ou mais homologia com esta, muito mais preferencialmente 95% ou mais homologia com esta, muito more preferencialmente 98% ou mais homologia com esta, e muito preferencialmente 99% ou mais homologia com esta. Além disso, dado que a sequência de aminoácidos da proteína que apresenta a atividade pode variar consoante a espécie ou estirpe de micro-organismo, a proteína não está limitada a esta. Isto é, a proteína pode ser uma proteína mutante ou uma variante artificial com uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 21 ou 23, desde que a proteína ajude a melhorar a produtividade de putrescina aumentando a sua atividade. Como aqui utilizado, o termo “vários” aminoácidos significa especificamente de 2 a 20, preferencialmente de 2 a 10, e mais preferencialmente de 2 a 5 aminoácidos, embora possa diferir dependendo da posição ou tipo de resíduo de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína. Além disso, a substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de aminoácidos pode incluir mutações que ocorrem naturalmente devido a diferenças de indivíduos ou espécies do micro-organismo que possui a atividade do polipeptídeo ou variação artificial.
[034] Não existem vias biossintéticas da putrescina no micro-organismo Corynebacterium sp. Contudo, quando é introduzida ornitina-descarboxilase (ODC) externa, a putrescina é sintetizada e excretada extracelularmente, indicando a presença de um transportador, isto é, um exportador que funciona como uma passagem para a putrescina entre em numerosas proteínas de membrana do micro-organismo Corynebacterium sp. Consequentemente, a fim de isolar o exportador da putrescina no micro-organismo Corynebacterium sp., os presentes inventores prepararam uma biblioteca de cromossomas de Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem ATCC13032, e transformaram uma estirpe produtora de putrescina, Corynebacterium glutamicum KCCM11138P, com a biblioteca e selecionaram estirpes que cresciam em um meio mínimo contendo putrescina. Através da seleção terciária de colônias, um clone (B19) com resistência à putrescina foi por fim selecionado e a análise da sequência de bases foi realizada para confirmar que o clone continha NCgl2522 (ver FIG. 1). Como exportador da putrescina, a NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 possui a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21, e a NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, com 98% de homologia com a sequência de aminoácidos anterior, possui a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23.
[035] Um polinucleotídeo codificante da NCgl2522 da presente invenção pode incluir um polinucleotídeo codificante da proteína que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 ou 23, ou a sequência de aminoácidos que possui 70% ou mais de homologia com esta, preferencialmente 80% ou mais de homologia com esta, mais preferencialmente 90% ou mais de homologia com esta, muito mais preferencialmente 95% ou mais de homologia com esta, muito mais preferencialmente 98% ou mais de homologia com esta, e muito preferencialmente 99% ou mais de homologia com esta, desde que a proteína possua atividade semelhante àquela da proteína NCgl2522, e muito preferencialmente, pode incluir uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 20 ou 22.
[036] Como aqui utilizado, “homologia” refere-se à semelhança entre duas sequências de aminoácidos e pode ser determinada pelos conhecidos métodos que utilizam BLAST 2.0, o qual calcula parâmetros tais como classificação, identidade, e semelhança.
[037] Para além disso, o polinucleotídeo da presente invenção que codifica a NCgl2522 pode ser uma variante que hibrida em condições restringentes com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 20 ou 22, ou uma sonda derivada da sequência de nucleotídeos anterior, desde que codifique uma NCgl2522 funcional. Como aqui utilizado, o termo “condições restringentes” significa condições que permitem uma hibridação específica entre polinucleotídeos. Condições restringentes estão descritas em detalhe, por exemplo, na literatura (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).
[038] Na presente invenção, “modificado a fim de apresentar atividade da NCgl2522 aumentada em comparação com a atividade endógena” pode ser realizado através de um método selecionado entre métodos de aumento do número de cópias do polinucleotídeo codificante da proteína, modificação de uma sequência de regulação de expressão a fim de aumentar a expressão do polinucleotídeo, modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossoma a fim de aumentar a atividade da enzima, eliminação de um fator de regulação a fim de suprimir a expressão do gene, e suas combinações.
[039] O número de cópias do polinucleotídeo pode ser aumentado, sem lhes estar particularmente limitado, pela ligação operacional do polinucleotídeo a um vetor ou pela sua integração no genoma da célula hospedeira. Especificamente, o número de cópias do polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira pode ser aumentado introduzindo na célula hospedeira o vetor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo codificante da proteína da presente invenção e se replica e funciona independentemente da célula hospedeira, ou introduzindo na célula hospedeira o vetor que está ligado operacionalmente ao polinucleotídeo e é capaz de integrar o polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira.
[040] Como aqui utilizado, o termo “vetor” refere-se a uma construção de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos codificante da proteína desejada, que está ligada operacionalmente a uma sequência de regulação de expressão apropriada para expressar a proteína desejada em uma célula hospedeira. A sequência reguladora inclui um promotor que pode iniciar a transcrição, uma sequência operadora opcional para regular a transcrição, uma sequência codificante de um local de ligação ao ribossomo do mRNA adequado, e uma sequência que regula a terminação da transcrição e da tradução. Depois de o vetor ser transformado na célula hospedeira adequada, pode replicar-se ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, e pode ser integrado no próprio genoma.
[041] O vetor utilizado na presente invenção não está particularmente limitado, desde que seja capaz de se replicar na célula hospedeira, e pode ser utilizado qualquer vetor conhecido na técnica. Exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo, cosmídeo, vírus e bacteriófago natural ou recombinante. Por exemplo, pode-se utilizar pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, e Charon21A como vetor fágico ou vetor cosmídico. Como vetor plasmídico, pode ser utilizado do tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET. Um vetor utilizável na presente invenção não está particularmente limitado, e pode ser utilizado qualquer vetor de expressão conhecido. Preferencialmente, pode ser utilizado o vetor pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, ou pCC1BAC, e mais preferencialmente, pode ser utilizado o vetor pDZ.
[042] Além disso, o polinucleotídeo codificante da proteína desejada no cromossoma pode ser substituído por um polinucleotídeo mutado utilizando um vetor para inserção cromossômica. A inserção do polinucleotídeo no cromossoma pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossoma por recombinação homóloga, pode ainda incluir um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica. O marcador de seleção destina-se a selecionar células transformadas com o vetor, isto é, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores que proporcionem fenótipos selecionáveis, tais como resistência a fármacos, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos, ou expressão de proteína de superfície. Apenas as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou apresentar diferentes fenótipos no ambiente tratado com o agente seletivo, e deste modo podem ser selecionadas as células transformadas.
[043] Como aqui utilizado, o termo “transformação” significa a introdução de um vetor portador de um polinucleotídeo codificante de uma proteína alvo em uma célula hospedeira para que a proteína codificada pelo polinucleotídeo seja expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, pode ser integrado em, ou colocado no cromossoma da célula hospedeira, ou existir extracromossomicamente. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e seja aí expresso. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de uma cassete de expressão, que é uma construção genética com todos os elementos necessários para a sua expressão autónoma. Tipicamente, a cassete de expressão inclui um promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, sinais de terminação de transcrição, sítios de ligação ao ribossomo, ou sinais de terminação de tradução. A cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. O polinucleotídeo em si pode também ser introduzido na célula hospedeira e ligado operacionalmente às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira.
[044] Além disso, como aqui utilizado, o termo “ligado operacionalmente” significa uma ligação funcional entre uma sequência polinucleotídica codificante da proteína desejada e uma sequência de promotor que inicia e media a transcrição da sequência polinucleotídica.
[045] Igualmente, a modificação da sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo pode ser realizada, sem lhes estar limitada, por indução de uma modificação na sequência reguladora de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência de nucleotídeos, ou uma combinação destas, a fim de aumentar ainda mais a atividade da sequência reguladora de expressão, ou por substituição da sequência de regulação de expressão com uma sequência de nucleotídeos com atividade mais forte. A sequência de regulação de expressão inclui, sem lhes estar particularmente limitada, um promotor, uma sequência de operador, uma sequência codificante para um local de ligação ao ribossomo, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e de tradução.
[046] Um promotor heterólogo forte, em vez do promotor original, pode ser ligado a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo, e exemplos do promotor forte podem incluir o promotor CJ7, o promotor lysCP1, o promotor EF- Tu, o promotor groEL, o promotor aceA ou aceB, e mais preferencialmente, o promotor lysCP1 ou o promotor CJ7 como o promotor derivado de Corynebacterium, e o polinucleotídeo codificante da enzima está ligado operacionalmente a este de modo que a sua taxa de expressão possa ser aumentada. Aqui, o promotor lysCP1 é um promotor melhorado pela substituição da sequência de nucleotídeos da região do promotor do polinucleotídeo codificante da aspartato-cinase e a semialdeído de aspartato-desidrogenase, e é um promotor forte que aumenta a expressão do gene da aspartato-cinase, conduzindo a uma atividade da enzima correspondente 5 vezes maior do que a do tipo selvagem (WO 2009/096689). Além disso, o promotor CJ7 é um promotor que foi encontrado durante a exploração de uma sequência de promotor forte em Corynebacterium ammoniagenes e que foi confirmado como sendo expresso em Corynebacterium ammoniagenes e Escherichia e possuindo uma forte atividade de promotor. O promotor CJ7 é um promotor que também apresenta uma atividade de expressão elevada em Corynebacterium glutamicum (Patente Coreana N.° 0620092 e WO 2006/065095).
[047] Além disso, a modificação de uma sequência de polinucleotídeos no cromossoma pode ser realizada, sem lhes estar particularmente limitada, por indução de uma mutação na sequência de regulação de expressão através de deleção, inserção, substituição não-conservadora ou conservadora da sequência de polinucleotídeos, ou uma sua combinação, a fim de aumentar ainda mais a atividade da sequência de polinucleotídeos, ou por substituição da sequência com uma sequência de polinucleotídeos modificada para apresentar uma atividade mais forte.
[048] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a fim de se obter um micro-organismo Corynebacterium sp. com a produtividade de putrescina melhorada, o número de cópias do gene pode ser aumentado introduzindo no cromossoma o polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 22 codificante da NCgl2522 envolvida na excreção da putrescina, ou o próprio promotor da NCgl2522 pode ser substituído com um promotor com atividade melhorada, preferencialmente o promotor CJ7 com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 24.
[049] Como aqui utilizado, o termo “micro-organismo com produtividade de putrescina” ou “micro-organismo que produz putrescina” refere-se a um micro-organismo que é preparado conferindo produtividade de putrescina à estirpe parental isenta de produtividade de putrescina. O micro-organismo a que é conferida produtividade de putrescina ou que produz putrescina pode ser, sem lhe estar particularmente limitado, um micro-organismo com produtividade melhorada de ornitina para ser utilizada como material de partida para a biossíntese da putrescina, em que o micro-organismo é modificado para possuir atividades mais elevadas da acetilglutamato-sintase, que converte glutamato em acetilglutamato (N-acetilglutamato), ou da ornitina-acetiltransferase (ArgJ), que converte acetilornitina em ornitina, da acetilglutamato-cinase (ArgB), que converte acetilglutamato em acetilglutamilfosfato (N-acetilglutamilfosfato), da acetil-gama-glutamilfosfato-reductase (ArgC), que converte acetilglutamilfosfato em semialdeído de acetilglutamato (semialdeído de N-acetilglutamato), ou da acetilornitina-aminotransferase (ArgD), que converte semialdeído de acetilglutamato em acetilornitina (N-acetilornitina) do que a atividade endógena, a fim de aumentar a via biossintética de glutamato a ornitina. Para além disso, o micro-organismo é um micro-organismo que foi modificado para possuir uma atividade mais fraca da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF), envolvida na síntese da arginina a partir da ornitina, da proteína (NCgl1221), envolvida na excreção do glutamato, e/ou da proteína (NCgl469), que acetila a putrescina, do que a atividade endógena, e/ou que foi modificado para possuir atividade de ornitina-descarboxilase (ODC).
[050] A este respeito, a acetil-gama-glutamilfosfato-reductase (ArgC), a acetilglutamato-sintase ou ornitina-acetiltransferase (ArgJ), a acetilglutamato- cinase (ArgB), a acetilornitina-aminotransferase (ArgD), a ornitina- carbamoíltransferase (ArgF), a proteína (NCgl1221) envolvida na exportação do glutamato e a ornitina-descarboxilase (ODC) podem preferencialmente possuir, sem lhes estar particularmente limitadas, as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 33, respectivamente, ou as sequências de aminoácidos que possuem 70% ou mais de homologia com estas, mais preferencialmente 80% ou mais de homologia com estas, ou muito mais preferencialmente 90% ou mais de homologia com estas, respectivamente. Adicionalmente, a proteína (NCgl469) que acetila a putrescina pode preferencialmente possuir, sem lhes estar particularmente limitada, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 31 ou 32, ou uma sequência de aminoácidos com 70% ou mais de homologia com esta, mais preferencialmente 80% ou mais de homologia com esta, ou muito mais preferencialmente 90% ou mais de homologia com esta.
[051] Das proteínas, o aumento nas atividades da acetil-gama- glutamilfosfato- reductase (ArgC), acetilglutamato-sintase ou ornitina- acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato-cinase (ArgB), acetilornitina- aminotransferase (ArgD), e ornitina-descarboxilase (ODC) pode ser alcançado pelo método descrito atrás de aumento da atividade da NCgl2522, por exemplo, por um método selecionado entre métodos de aumento do número de cópias do polinucleotídeo codificante da proteína, modificação de uma sequência de regulação de expressão a fim de aumentar a expressão do polinucleotídeo, modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossoma a fim de aumentar a atividade da enzima, eliminação de um fator de regulação a fim de suprimir a expressão do polinucleotídeo da enzima, e suas combinações.
[052] Além disso, as atividades da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF), da proteína (NCgl1221) envolvida na exportação de glutamato e da proteína (NCgl469) que acetila a putrescina podem ser diminuídas por um método selecionado do grupo que consiste em uma deleção parcial ou total de um polinucleotídeo que codifica a proteína, modificação de uma sequência de regulação de expressão para suprimir a expressão do polinucleotídeo, modificação da sequência do polinucleotídeo no cromossoma para diminuir a atividade da proteína, e uma combinação destas.
[053] Especificamente, pode ser realizada uma deleção parcial ou total do polinucleotídeo que codifica a proteína introduzindo um vetor para inserção cromossômica em um micro-organismo, substituindo desse modo o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena no cromossoma por um polinucleotídeo parcialmente removido ou um gene marcador. O “parcial” pode variar dependendo do tipo de polinucleotídeo, mas refere-se especificamente a de 1 a 300, preferencialmente de 1 a 100, e mais preferencialmente de 1 a 50 nucleotídeos.
[054] Também, a modificação da sequência de regulação de expressão pode ser realizada por indução de uma modificação na sequência de regulação de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência de nucleotídeos, ou uma combinação destas, a fim de diminuir a atividade da sequência de regulação da expressão, ou por substituição da sequência de regulação de expressão por uma sequência de nucleotídeos com atividade mais fraca. A sequência de regulação de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência codificante para o sítio de ligação ao ribossomo, e a sequência que regula a terminação da transcrição e tradução.
[055] Para além disso, a modificação de uma sequência do polinucleotídeo no cromossoma pode ser realizada por indução de uma mutação na sequência através de deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência do polinucleotídeo, ou uma combinação destas, a fim de diminuir ainda mais a atividade enzimática, ou por substituição da sequência por uma sequência do polinucleotídeo modificada a fim de possuir atividade mais fraca.
[056] Além disso, um fator de regulação para suprimir a expressão do polinucleotídeo da enzima pode ser eliminado substituindo um polinucleotídeo do fator de supressão da expressão por um polinucleotídeo parcialmente removido ou por um gene marcador. O “parcial” pode variar dependendo do tipo de polinucleotídeo, mas especificamente refere-se a de 1 a 300, preferencialmente de 1 a 100, e mais preferencialmente de 1 a 50 nucleotídeos.
[057] Por outro lado, o micro-organismo da presente invenção é um microorganismo que possui produtividade de putrescina, e inclui um micro-organismo procariótico que expressa a proteína com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21 ou 23, e os seus exemplos podem incluir micro-organismos que pertencem a Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. ou semelhantes. O micro-organismo da presente invenção é preferencialmente um micro-organismo que pertence a Escherichia sp. ou um micro-organismo que pertence a Corynebacterium sp., e mais preferencialmente, E. coli ou Corynebacterium glutamicum.
[058] Em uma forma de realização específica da presente invenção, um micro-organismo Corynebacterium sp. com o N.° de Acesso KCCM11138P (Publicação da Patente Coreana N.° 2012-0064046) e um micro-organismo Corynebacterium sp. com o N.° de Acesso KCCM11240P (Publicação da Patente Coreana N.° 2012-0003634) são utilizados como estirpes que possuem uma via sintética aumentada de glutamato a putrescina, produzindo desse modo putrescina em uma concentração elevada.
[059] Ainda em outra forma de realização da presente invenção, são utilizadas as estirpes produtoras de putrescina baseadas em Corynebacterium glutamicum ATCC13032, designadamente KCCM11138P e KCCM11240P, e as estirpes produtoras de putrescina baseadas em Corynebacterium glutamicum ATCC13869, designadamente DAB12-a e DAB12-b, que possuem o mesmo genótipo. A estirpe ATCC13869 pode ser obtida da American Type Culture Collection (ATCC), que atribui a cada estirpe um número de acesso único, o qual está listado no catálogo da ATCC, e a estirpe pode ser encomendada utilizando este número de acesso. Especificamente, a estirpe produtora de putrescina DAB12-a é caracterizada pela deleção de um gene codificante da ornitina- carbamoíltransferase (ArgF) e de um gene codificante do exportador do glutamato NCgl1221, introdução de um gene codificante da ornitina- descarboxilase (OCD), e substituição do promotor do operão do gene biossintético da ornitina (argCJBD) por um promotor melhorado no Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Além disso, a estirpe produtora de putrescina DAB12-b é caracterizada por ser preparada através da modificação da estirpe DAB12-a a fim de possuir atividade enfraquecida da proteína (NCgl1469) que acetila a putrescina, em comparação com a atividade endógena.
[060] De acordo com um Exemplo preferido, foram preparadas como estirpes produtoras de putrescina a Corynebacterium glutamicum KCCM11138P, preparada por deleção do gene codificante da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) e de um gene codificante do exportador de glutamato NCgl1221, substituição do próprio promotor do agrupamento de genes ArgCJBD que codificam uma enzima envolvida na síntese da ornitina a partir de glutamato por um promotor melhorado, e introdução do gene codificante da ornitina- descarboxilase (ODC) no cromossoma em Corynebacterium glutamicum ATCC13032 do tipo selvagem; e a Corynebacterium glutamicum KCCM11240P, preparada pelo enfraquecimento adicional de um gene codificante da acetiltransferase NCgl1469 no micro-organismo.
[061] Por outo lado, a fim de preparar uma estirpe derivada da Corynebacterium glutamicum ATCC13032 com a NCgl2522 eliminada, foi preparado o plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O) baseado na sequência de nucleotídeos da NCgl2522 derivada da Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
[062] O plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O) foi utilizado para transformar as estirpes produtoras de putrescina preparadas, a KCCM11138P e a KCCM11240P, selecionadas como estirpes com a NCgl2522 eliminada, e estas estirpes foram designadas como KCCM11138P NCgl2522 e KCCM11240P NCgl2522, respectivamente. Do mesmo modo, estirpes com a NCgl2522 eliminada derivadas da Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foram preparadas e designadas como DAB12-a NCgl2522 e DAB12-b NCgl2522.
[063] As produtividades de putrescina dos 4 tipos de estirpes com a NCgl2522 eliminada assim preparadas foram comparadas com a da estirpe parental, e observou-se que a produtividade da putrescina estava reduzida em todas as estirpes KCCM11138P NCgl2522, KCCM11240P NCgl2522, DAB12-a NCgl2522, e DAB12-b NCgl2522 com a NCgl2522 eliminada, em comparação com a estirpe parental (ver Tabela 3). Com base neste resultado, os presentes inventores confirmaram que a atividade da NCgl2522 na estirpe produtora de putrescina está intimamente relacionada com a produtividade de putrescina, e subsequentemente prepararam estirpes com a NCgl2522 aumentada a fim de aumentar a produtividade da putrescina através do aumento da atividade.
[064] Com este objetivo, em um Exemplo preferido da presente invenção, foi introduzida mais NCgl2522 no transposão da estirpe Corynebacterium glutamicum, ou então o próprio promotor da NCgl2522 no cromossoma foi substituído pelo promotor CJ7 (KCCM10617, Patente Coreana N°. 10-0620092) que foi um desenvolvimento original dos presentes inventores.
[065] As produtividades de putrescina de 6 tipos de estirpes preparadas com aumento de NCgl2522 foram comparadas com a da estirpe parental, e observou-se que a produtividade da putrescina era maior em todas as estirpes preparadas pela introdução de NCgl2522 adicional no transposão, em comparação com a estirpe parental (ver Tabela 6). As concentrações de putrescina intracelular foram medidas nas estirpes com NCgl2522 aumentada que apresentavam maior produtividade de putrescina, e observaram-se concentrações reduzidas de putrescina intracelular em comparação com a estirpe parental (ver Tabela 9). Com base nestes resultados, os presentes inventores confirmaram que a exportação extracelular da putrescina produzida intracelularmente aumenta com o aumento na atividade da NCgl2522 nas estirpes produtoras de putrescina, melhorando desse modo a produtividade da putrescina.
[066] Consequentemente, o micro-organismo Corynebacterium sp. com uma produtividade de putrescina aumentada, no qual a estirpe produtora de putrescina Corynebacterium glutamicum KCCM11138P foi modificada para possuir uma atividade aumentada de NCgl2522 em comparação com a atividade endógena, e exibe por isso uma capacidade melhorada para exportar putrescina, foi designado Corynebacterium glutamicum CC01-0510 e depositado de acordo com o Tratado de Budapeste no Centro de Culturas de Microorganismos Coreano (KCCM) em 8 de março de 2013, com o N.° de Acesso KCCM11401P.
[067] De acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para produzir putrescina, que inclui os seguintes passos: (i) cultivar o micro-organismo que possui produtividade de putrescina para obter uma cultura de células; e (ii) recuperar a putrescina do micro-organismo cultivado ou da cultura de células.
[068] No método, o passo de cultivar o micro-organismo pode ser preferencialmente realizado, sem lhe estar particularmente limitado, por cultura descontínua, cultura contínua, e cultura semicontínua como conhecido na técnica. A este respeito, as condições de cultura não estão particularmente limitadas, mas poderá ser mantido um pH ótimo (e.g., um pH de 5 a 9, preferencialmente um pH de 6 a 8, e mais preferencialmente um pH de 6,8) utilizando um reagente químico básico (e.g., hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um reagente químico ácido (e.g., ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Podem também ser mantidas condições aeróbicas pela adição à cultura celular de oxigênio ou de uma mistura de gás contendo oxigênio. A temperatura da cultura poderá ser mantida entre 20 e 45°C, e preferencialmente entre 25 e 40°C. Adicionalmente, a cultura é preferencialmente realizada durante cerca de 10 até 160 horas. A putrescina produzida por esta cultura pode ser excretada para um meio de cultura, ou pode permanecer no interior da célula.
[069] Além disso, o meio de cultura a ser utilizado pode incluir açúcar e hidratos de carbono (e.g., glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleo e gordura (e.g., óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de melaço e óleo de coco), ácidos gordos (e.g., ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcool (e.g., glicerol e etanol), e ácidos orgânicos (e.g., ácido acético), individualmente ou em combinação, como fonte de carbono; compostos orgânicos contendo azoto (e.g., peptona, extrato de levedura, líquidos de carne, extrato de malte, solução de milho, farinha de soja em pó e ureia), ou compostos inorgânicos (e.g., sulfato de amônia, cloreto de amônia, fosfato de amônia, carbonato de amônia, e nitrato de amônia), individualmente ou em combinação, como fonte de azoto; di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato de dipotássio, ou um sal contendo sódio correspondente a estes, individualmente ou em combinação, como fonte de fósforo; outras substâncias essenciais para estimular o crescimento, incluindo sais metálicos (e.g., sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[070] O método para recuperar a putrescina que é produzida no passo de cultura da presente invenção pode ser, por exemplo, um método adequado conhecido na técnica de acordo com a cultura descontínua, cultura contínua, ou cultura semicontínua, recolhendo desse modo os aminoácidos desejados da cultura.
[071] De aqui em diante, a presente invenção será descrita em mais pormenor por referência aos Exemplos. Contudo, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar a invenção. Exemplo de Referência 1: Preparação do micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina
[072] A fim de preparar um micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina, a via biossintética da arginina a partir da ornitina foi bloqueada, a via biossintética da ornitina a partir do glutamato foi aumentada, e ornitina-descarboxilase estranha (OCD) foi introduzida, de acordo com a preparação de um micro-organismo com produtividade de putrescina descrita na Publicação de Patente Coreana N°. 10-2012-0064046.
[073] Especificamente, com base na Corynebacterium glutamicum ATCC13032, um gene codificante da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF), e um gene codificante de NCgl1221, que é uma proteína envolvida na exportação do glutamato no cromossoma da estirpe, foram eliminados por recombinação homóloga a fim de aumentar o conteúdo intracelular de glutamato, que é um precursor da ornitina. Além disso, um gene codificante da ornitina-descarboxilase (ODC) derivado de E. coli W3110 de tipo selvagem, que está envolvido na síntese da putrescina a partir da ornitina, foi introduzido no cromossoma da estirpe. Por outro lado, o próprio promotor do grupo de genes argCJBD codificante para uma enzima envolvida na síntese da ornitina a partir de glutamato foi substituído por um promotor melhorado do promotor CJ7 para preparar uma estirpe de Corynebacterium glutamicum com produtividade de putrescina. Presentemente, argCJBD codifica a aceti-gama-glutamilfosfato- reductase (ArgC), a acetilglutamato-sintase ou ornitina-acetiltransferase (ArgJ), a acetilglutamato-cinase (ArgB) e a acetilornitina-aminotransferase (ArgD) que estão envolvidas na via biossintética da ornitina a partir de glutamato. A estirpe de Corynebacterium glutamicum com produtividade de putrescina assim preparada foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste no Centro de Cultura de Micro-organismos Coreano (KCCM) em 24 de novembro de 2010, com o N° de Acesso KCCM11138P. Uma descrição detalhada da preparação do micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina é fornecida na Publicação de Patente Coreana No. 10-2012-0064046, cuja descrição é aqui incorporada integralmente por referência. Exemplo de Referência 2: Preparação do micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina
[074] Um gene codificante da acetiltransferase NCgl1469 na Corynebacterium glutamicum KCCM11138P preparada no Exemplo de Referência 1 foi enfraquecido para não produzir N-acetilputrescina, preparando- se desse modo a estirpe de Corynebacterium glutamicum com uma produtividade de putrescina melhorada como outro micro-organismo de Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina.
[075] Especificamente, com base na sequência de nucleotídeos do gene codificante NCgl1469 da Corynebacterium glutamicum ATCC13032, foi construído um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 1 e 2 para obter um fragmento de recombinação homóloga na região N-terminal da NCgl1469 e um par de iniciadores das SEQ ID NOs: 3 e 4, para obter um fragmento de recombinação homóloga da região C-terminal de NCgl1469, tal como na Tabela 1 a seguir.
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[076] Uma reação de PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e dois pares de iniciadores a fim de obter fragmentos de PCR das regiões N-terminal e C- terminal, respectivamente. Estes fragmentos de PCR foram separados por eletroforese para obter os fragmentos desejados. A reação de PCR foi então realizada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos a 72 °C. O fragmento da região N-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição BamHI e SalI e o fragmento da região C-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição SalI e XbaI. Os fragmentos tratados foram clonados em um vetor pDZ tratado com as enzimas de restrição BamHI e XbaI, para se construir o plasmídeo pDZ-NCgl1469(K/O).
[077] O plasmídeo pDZ-NCgl1469(K/O) foi transformado na Corynebacterium glutamicum KCCM11138P por eletroporação para se obter um transformante. Depois, o transformante foi plaqueado e cultivado em uma placa de BHIS (37 g/l de infusão de coração de Braine, 91 g/l de sorbitol, 2% ágar) contendo canamicina (25 g/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D- galactosídeo) para formação de colônias. A partir das colônias formadas na placa, foram selecionadas colônias de cor azul como sendo da estirpe com o plasmídeo pDZ-NCgl1469(K/O) introduzido.
[078] A estirpe selecionada foi inoculada em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne, 2,5 g/l de NaCl, 2 g/l de ureia, pH 6,8) e cultivada sob agitação a 30 °C durante 8 horas. Subsequentemente, cada cultura de células foi diluída em série desde 10-4 até 10-10. As amostras diluídas foram depois plaqueadas e cultivadas em um meio sólido contendo X-gal para a formação de colônias.
[079] Das colônias formadas, foram selecionadas as colônias brancas, que eram menos frequentes, para preparar uma estirpe de Corynebacterium glutamicum com produtividade de putrescina melhorada por deleção do gene codificante da NCgl1469. A estirpe de Corynebacterium glutamicum com uma produtividade de putrescina melhorada assim preparada foi designada KCCM11138P NCgl1469 e depositada de acordo com o Tratado de Budapeste no Centro de Cultura de Micro-organismos Coreano (KCCM) em 26 de dezembro de 2011, com o N.° de Acesso KCCM11240P. Uma descrição detalhada referente à preparação do micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina é fornecida no Pedido de Patente Coreana N°. 102012-0003634, cuja descrição é aqui incorporada integralmente por referência. Exemplo 1: Exploração do exportador de putrescina e Seleção de clones da biblioteca com resistência à putrescina
[080] O Corynebacterium glutamicum não possui vias biossintéticas para a putrescina. Contudo, quando ornitina-descarboxilase externa é introduzida no Corynebacterium glutamicum para lhe conferir capacidade produtora de putrescina, este produz e excreta putrescina extracelularmente. Foi indicada a presença de uma proteína de transporte que funciona como passagem da putrescina entre em numerosas proteínas de membrana do micro-organismo Corynebacterium sp..
[081] A fim de separar e isolar o exportador de putrescina do microorganismo Corynebacterium sp., foi preparada uma biblioteca de cromossomas de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de tipo selvagem. Especificamente, o cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi tratado com a enzima de restrição Sau3AI até uma clivagem incompleta. Um fragmento de gene de 3~5 kb foi separado e foi clonado em um vetor pECCG122 tratado com BamHI (vetor transportador de E. coli e Corynebacterium; Publicação da Patente Coreana No. 10-1992-0000933).
[082] A biblioteca de cromossomas de Corynebacterium assim obtida foi transformada na estirpe produtora de putrescina Corynebacterium glutamicum KCCM11138P de acordo com o Exemplo de Referência 1, e a seguir selecionaram-se as estirpes que cresciam em meio mínimo contendo putrescina 0,35 M (contendo 10 g de glicose, 0,4 g de MgSO<7H2O, 4 g de NH4CI, 1 g de KH2PO4, 1 g de K2HPO4, 2 g de ureia, 10 mg de FeSO4^7H2O, 1 mg de MnSO4^5H2O, 5 mg de nicotinamida, 5 mg de cloridrato de tiamina, 0,1 mg de biotina, 1 mM de arginina, 25 mg de canamicina, 0,35 M de putrescina, com base em 1 l de água destilada, pH 7,0). De entre cerca de 5,5x105 transformantes introduzidos com a biblioteca de cromossomas de Corynebacterium, foram selecionadas 413 colônias, e depois cada clone de biblioteca, cuja resistência à putrescina foi também confirmada por examinação secundária, foi reintroduzido na estirpe produtora de putrescina. Por fim, selecionou-se um clone (B19), cuja resistência à putrescina foi confirmada por examinação terciária. O clone foi sujeito a análise da sequência de nucleotídeos. Como resultado, verificou-se a presença de NCgl2522 no clone B19 (FIG. 1).
[083] A NCgl2522 isolada como exportador de putrescina da Corynebacterium glutamicum ATCC13032 possui a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21, que é codificada por um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 20. Exemplo 2: Preparação da estirpe com NCgl2522 eliminada e Avaliação da sua produtividade de putrescina
[084] <2-1> Preparação da estirpe com NCgl2522 eliminada a partir da estirpe produtora de putrescina baseada em ATCC13032
[085] A fim de avaliar se a NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 estava envolvida na exportação da putrescina, foi construído um vetor para eliminar o gene codificante de NCgl2522.
[086] Especificamente, com base na sequência de nucleotídeos do gene codificante de NCgl1469 representado pela SEQ ID NO: 20, foi construído um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 5 e 6 para obter um fragmento de recombinação homóloga da região N-terminal de NCgl1469 e um par de iniciadores das SEQ ID NOs: 7 e 8 para obter um fragmento de recombinação homóloga da região C-terminal de NCgl1469 como apresentado na Tabela 2 a seguir.
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[087] Uma reação de PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e dois pares de iniciadores a fim de amplificar os fragmentos de PCR das regiões N-terminal e C- terminal do gene de NCgl2522. Estes fragmentos de PCR foram sujeitos a eletroforese para se obterem os fragmentos desejados. A reação de PCR foi então realizada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos a 72 °C. O fragmento da região N-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição BamHI e SalI e o fragmento da região C-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição SalI e XbaI. Os fragmentos assim tratados foram clonados no vetor pDZ tratado com as enzimas de restrição BamHI e XbaI a fim de se construir o plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O).
[088] O plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O) foi utilizado para transformar Corynebacterium glutamicum KCCM11138P e KCCM11240P dos Exemplos de Referência 1 e 2 por eletroporação, respectivamente, para se obter transformantes. Os transformantes foram depois plaqueados e cultivados em uma placa de BHIS (37 g/l de infusão de coração de Braine, 91 g/l de sorbitol, 2% ágar) contendo canamicina (25 g/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D- galactósido) para a formação de colônias. Das colônias formadas na placa, as colônias de cor azul foram selecionadas como a estirpe com o plasmídeo pDZ- 1’NCgl2522(K/O) introduzido.
[089] As estirpes selecionadas foram cultivadas sob agitação em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne, 2,5 g/l de NaCl, 2 g/l de ureia, pH 6,8) a 30°C durante 8 horas. Subsequentemente, cada cultura celular foi diluída em série desde 10-4 até 10-10. As amostras diluídas foram depois plaqueadas e cultivadas em um meio sólido contendo X-gal para formação de colônias. Das colônias formadas, foram selecionadas as colônias brancas de frequência relativamente baixa para se obter as estirpes com o gene codificante NCgl2522 eliminado por cruzamento secundário. As estirpes selecionadas foram por último sujeitas a PCR utilizando um par de iniciadores de SEQ ID NO: 5 e 8 para confirmar a deleção do gene codificante NCgl2522. As estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum foram designadas CM11138P NCgl2522 e KCCM11240P NCgl2522, respectivamente.
[090] <2-2> Preparação da estirpe com deleção de NCgl2522 a partir da estirpe com base na ATCC13869 produtora de putrescina
[091] A estirpe com deleção de NCgl2522 foi preparada a partir das estirpes baseadas na Corynebacterium glutamicum ATCC13869 produtora de putrescina, designadamente a DAB12-a (deleção de argF, deleção de NCgl1221, introdução de speC de E. coli, substituição de promotor do operão arg; ver Exemplo de Referência 1) e a DAB12-b (deleção de argF, deleção de NCgl1221, introdução de speC de E. coli, substituição de promotor do operão arg, deleção de NCgl1469, ver Exemplo de Referência 2) com o mesmo genótipo de KCCM11138P e KCCM11240P, que são estirpes baseadas na Corynebacterium glutamicum ATCC13032 que produz putrescinas.
[092] Especificamente, para examinar as sequências do gene codificante da NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e a proteína expressa a partir deste, o PCR foi realizado utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 5 e 8. A reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 2 minutos a 72 °C. O produto de PCR assim obtido foi separado por eletroforese, e sujeito a sequenciação. Como resultado, verificou-se que a sequência de nucleotídeos do gene codificante da NCgl2522 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 é representado por SEQ ID NO: 22, e a sequência de aminoácidos da proteína codificada por este é representada pela SEQ ID NO: 23. Quando a sequência de aminoácidos de NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi comparada com a de NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, verificou-se uma homologia de sequência de 98%.
[093] A fim de remover o gene codificante da NCgl2522 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, da mesma maneira que no Exemplo <2-1>, PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como molde e dois pares de iniciadores da Tabela 2 a fim de amplificar os fragmentos de PCR das regiões N-terminal e C-terminal do gene NCgl2522, respectivamente. Estes fragmentos de PCR foram sujeitos a eletroforese para obter os fragmentos desejados. A seguir, a reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos a 72 °C. O fragmento da região N-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição BamHI e SalI e o fragmento da região C-terminal assim obtido foi tratado com as enzimas de restrição SalI e XbaI. Os fragmentos tratados foram clonados no vetor pDZ tratado com as enzimas de restrição BamHI e XbaI, para se construir o plasmídeo pDZ-2’NCgl2522(K/O).
[094] Da mesma maneira que no Exemplo <2-1>, o plasmídeo pDZ- 2’NCgl2522(K/O) foi transformado em Corynebacterium glutamicum DAB12-a e DAB12-b, respectivamente. Selecionaram-se as estirpes com o gene NCgl2522 removido. As estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum assim selecionadas foram designadas DAB12-a NCgl2522 e DAB12-b NCgl2522, respectivamente.
[095] <2-3> Avaliação da produtividade de putrescina da estirpe com deleção de NCgl2522
[096] A fim de confirmar o efeito da deleção de NCgl2522 na produtividade de putrescina da estirpe produtora de putrescina, as produtividades de putrescina das estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum preparadas nos Exemplos <2-1> e <2-2> foram comparadas.
[097] Especificamente, 4 tipos de mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11138P NCgl2522, KCCM11240P NCgl2522, DAB12-a NCgl2522, e DAB12-b NCgl2522) e 4 tipos de estirpes parentais (KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a, e DAB12-b) foram plaqueados em placas com meio CM (1% de glicose, 1% de polipeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 L de 50% de NaOH, 2% de ágar, pH 6,8, com base em 1 L) contendo arginina 1 mM, e cultivadas a 30°C durante 24 horas, respectivamente. Uma ansa de platina de cada estirpe assim cultivada foi inoculada em 25 mL de meio de titulação (8% de glicose, 0,25% de proteína de soja, 0,50% de sólidos de sólidos de licor de milho, 4% de (NH^SO4, 0,1% de KH2PO4, 0,05% de MgSO^HaO, 0,15% de ureia, 100 g de biotina, 3 mg de cloridrato de tiamina, 3 mg de ácido pantoténico- cálcio, 3 mg de nicotinamida, 5% de CaCO3, com base em 1L), e depois cultivada sob agitação a 30°C e 200 rpm durante 98 horas. Adicionou-se arginina 1 mM ao meio de cultura de todas as estirpes. A concentração de putrescina em cada cultura foi medida, e os resultados estão apresentados Tabela 3 a seguir.
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[098] Como se pode ver na Tabela 3, uma notável redução na produção de putrescina foi observada em 4 tipos de estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum com deleção de NCgl2522.
Exemplo 3: Preparação da estirpe com NCgl2522 aumentada e Avaliação da sua produtividade em putrescina
[099] <3-1> Introdução de NCgl2522 no gene do transposão no cromossoma ATCC13032
[100] A fim de confirmar a elevada produção de putrescina pela inserção cromossômica adicional do gene NCgl2522 (contendo uma região autopromotora) no micro-organismo Corynebacterium sp. KCCM11138P com produtividade de putrescina, introduziu-se NCgl2522 em um gene de transposão. Foi utilizado um vetor para transformação, o bpDZTn (Publicação de Patente Coreana N°. 10-2008-0033054), que permite a introdução do gene em um gene de transposão no cromossoma do micro-organismo Corynebacterium sp..
[101] O gene NCgl2522 contendo o autopromotor foi amplificado utilizando o cromossoma da estirpe ATCC13032 como molde e um par de iniciadores das SEQ ID NO: 9 e 10 (ver Tabela 4). A seguir, realizou-se a reação de PCR com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos ou 2 minutos a 72 °C. Através da PCR, foi obtido um fragmento do gene com um tamanho de 1,88 kb. Este produto de PCR foi sujeito a eletroforese em um gel de agarose a 0,8% a fim de eluir e purificar uma banda do tamanho desejado. O vetor pDZTn foi tratado com XhoI, e foi efetuada clonagem em fusão do produto de PCR de NCgl2522 da estirpe ATCC13032. Foi utilizado o kit In-FusionHD Cloning (Clontech) na clonagem em fusão. O plasmídeo resultante foi designado pDZTn- 1’NCgl2522.
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[102] O plasmídeo pDZTn-1’NCgl2522 foi transformado na Corynebacterium glutamicum KCCM11138P descrita no Exemplo de Referência 1 por eletroporação para obter os transformantes. A partir dos transformantes, uma estirpe com a NCgl2522 introduzida no transposão foi selecionada da mesma maneira que no Exemplo 2.
[103] Realizou-se PCR utilizando DNA genômico da estirpe selecionada e um par de iniciadores das SEQ ID NOs: 9 e 10 para confirmar que NCgl2522 tinha sido introduzida no transposão pela introdução do plasmídeo pDZTn- 1’NCgl2522. A reação de PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação, durante 30 segundos a 94 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 2 minutos a 72 °C.
[104] A estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum assim selecionada foi designada KCCM11138P Tn:1’NCgl2522.
[105] <3-2> Preparação da estirpe com o promotor de NCgl2522 substituído a partir da estirpe baseada na ATCC13032 produtora de putrescina
[106] A fim de aumentar a atividade de NCgl2522 na estirpe produtora de putrescina, foi introduzido um promotor CJ7 (WO 2006/65095) à frente do codão de iniciação de NCgl2522 no cromossoma.
[107] Primeiro, obteve-se um fragmento de recombinação homóloga contendo um promotor CJ7 com a sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 24 e com uma sequência de NCgl2522 original em ambas as extremidades do promotor. Especificamente, a PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 11 e 12 para obter a região 5’-terminal do promotor CJ7. A reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 94 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos a 72 °C. Uma PCR foi também realizada utilizando um par de iniciadores das SEQ ID NOs: 13 e 14, sob as mesmas condições, para se obter a região do promotor CJ7. Por fim, uma PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e um par de iniciadores das SEQ ID NOs: 15 e 16 sob as mesmas condições para se obter a região 3’-terminal do promotor CJ7. Os iniciadores utilizados na substituição do promotor foram os da Tabela 5 a seguir.
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[108] Cada produto de PCR assim obtido foi clonado em fusão no vetor pDZ tratado com BamHI e XbaI. Foi utilizado o kit In-FusionHD Cloning (Clontech) na clonagem em fusão. O plasmídeo resultante foi designado pDZ- P(CJ7)-1’NCgl2522.
[109] O plasmídeo pDZ-P(CJ7)-1’NCgl2522 assim preparado foi transformado nas Corynebacterium glutamicum KCCM11138P e KCCM11240P de acordo com os Exemplos de Referência 1 e 2 por eletroporação a fim de preparar transformantes. Os transformantes preparados foram inoculados em meio CM e cultivados sob agitação a 30 °C durante 8 horas. Cada cultura de células obtida destes foi diluída de 10-4 para 10-10, e plaqueada e cultivada em placas de BHIS contendo 25 g/mL de canamicina e X-gal para formação de colônias.
[110] As colônias brancas eram pouco frequentes em comparação com a maioria das colônias de cor azul e foram selecionadas para se obter uma estirpe com o promotor NCgl2522 substituído pelo promotor CJ7 por cruzamento secundário. A PCR foi realizada utilizando como molde o DNA genômico da estirpe selecionada e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 13 e 16 para confirmar que o promotor CJ7 tinha sido introduzido à frente do codão de iniciação de NCgl2522 no cromossoma pela introdução do plasmídeo pDZ- 1’CJ7(NCgl2522). A reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos, a 94 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 1 minuto a 72°C.
[111] As estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum selecionadas deste modo foram designadas KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522 e KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, respectivamente.
[112] <3-3> Introdução do gene NCgl2522 no gene do transposão no cromossoma de ATCC13869
[113] A fim de confirmar a produção elevada de putrescina pela inserção cromossômica adicional do gene de NCgl2522 na estirpe de putrescina derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, a introdução de NCgl2522 (contendo a região do promotor) em um gene de transposão foi determinada. O gene de NCgl2522 foi amplificado utilizando o cromossoma da estirpe ATCC13869 como molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 17 e 10 (ver Tabela 6). A reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 94 °C, emparelhamento durante 30 segundos a 55 °C, e extensão durante 30 segundos ou 2 minutos a 72 °C. Por PCR, foi obtido um fragmento do gene com um tamanho de 1,97 kb. O fragmento de PCR de NCgl2522 preparado deste modo foi clonado em fusão no vetor pDZTn tratado com XhoI. Foi utilizado o kit In-FusionHD Cloning (Clontech) na clonagem em fusão. O plasmídeo resultante foi designado pDZTn-2’NCgl2522.
Figure img0009
[114] O plasmídeo pDZTn-2’NCgl2522 foi transformado em Corynebacterium glutamicum DAB12-a da mesma maneira que no Exemplo <31> para confirmar a introdução de NCgl2522 no transposão.
[115] Uma estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum assim selecionada foi designada DAB12-a Tn:2’NCgl2522.
[116] <3-4> Preparação da estirpe com o promotor de NCgl2522 substituído a partir da estirpe baseada em ATCC13869 produtora de putrescina
[117] A fim de introduzir o promotor CJ7 à frente do codão de iniciação de NCgl2522 da Corynebacterium glutamicum ATCC13869, uma PCR foi realizada utilizando o DNA genômico da Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como molde e os três pares de iniciadores dados na Tabela 7 que se segue da mesma maneira que no Exemplo <3-2>, respectivamente. Consequentemente, os fragmentos de PCR da região do promotor CJ7, a sua região N-terminal e a região C-terminal foram amplificados e depois sujeitos a eletroforese para obter os fragmentos desejados. A reação de PCR foi efetuada com 30 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 94°C, emparelhamento durante 30 segundos a 55°C, e extensão durante 30 segundos a 72°C. Os fragmentos de PCR da região do promotor CJ7, a sua região N-terminal e região C-terminal assim obtidas foram clonadas em fusão no vetor pDZ tratado com BamHI e XbaI. Foi utilizado o kit In-FusionHD Cloningt (Clontech) na clonagem em fusão. O plasmídeo resultante foi designado pDZ-P(CJ7)-2’NCgl2522.
Figure img0010
Figure img0011
[118] O plasmídeo pDZ-’P(CJ7)-2’NCgl2522 foi transformado em cada uma de Corynebacterium glutamicum DAB12-a e DAB12-b da mesma maneira que no Exemplo <3-2> para selecionar estirpes, em que o promotor CJ7 foi introduzido à frente do codão de iniciação de NCgl2522. As estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum assim selecionadas foram designadas DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 e DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522.
[119] <3-5> Avaliação da produtividade de putrescina pela estirpe de NCgl2522 aumentada
[120] A fim de confirmar o efeito do aumento da atividade de NCgl2522 pela substituição do promotor na produtividade de putrescina na estirpe produtora de putrescina, as produtividades de putrescina de 6 tipos de estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11138P Tn:1’NCgl2522, KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522, KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-a Tn:2’NCgl2522, DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 e DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522) preparadas nos Exemplos <3-1> to <3-4> e de 4 tipos de estirpes parentais (KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a e DAB12-b) foram comparadas. Cada estirpe foi cultivada do mesmo modo que no Exemplo 2-3 e a concentração de putrescina em cada cultura foi determinada. Os resultados estão apresentados na seguinte Tabela 8.
Figure img0012
Figure img0013
[121] Como se pode ver na Tabela 8, um aumento na produção de putrescina foi observado em todos os 6 tipos de estirpes mutantes de Corynebacterium glutamicum, nas quais a atividade de NCgl2522 foi aumentada pela introdução adicional de NCgl2522 no transposão ou por substituição do promotor.
Exemplo 4: Medição da concentração intracelular de putrescina da estirpe de NCgl2522 aumentada
[122] A fim de confirmar que a concentração intracelular de putrescina é reduzida pelo aumento na capacidade exportadora de putrescina na estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum com atividade aumentada de NCgl2522, as concentrações intracelulares de putrescina na estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11138P Tn:1’NCgl2522 e na estirpe parental KCCM11138P foram medidas por extração utilizando um solvente orgânico. A análise de metabolitos intracelulares foi efetuada de acordo com um método descrito na literatura (Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 44914498, 2007).
[123] Primeiro, a estirpe mutante Corynebacterium glutamicum KCCM11138P Tn:1’NCgl2522 e a estirpe parental KCCM11138P foram inoculadas em 25 mL de meio CM líquido (1% de glicose, 1% de polipeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 L de 50% de NaOH, pH 6,8, com base em 1 L) contendo 1 mM de arginina, e cultivadas sob agitação a 30°C e 200 rpm. Quando o crescimento celular atingiu a fase exponencial durante a cultura, as células foram separadas do meio de cultura por filtração a vácuo rápida (Durapore HV, 0,45 m; Millipore, Billerica, MA). O filtro com células adsorvidas foi lavado duas vezes com 10 mL de água arrefecida , e depois mergulhado em metanol contendo ácido morfolinoetanossulfónico 5 M e metioninassulfona 5 M durante 10 minutos.
[124] O líquido de extração obtido foi misturado com um volume igual de clorofórmio e 0,4 vezes o volume de água, e a fase aquosa foi apenas aplicada a uma coluna de centrifugação para remover contaminantes de proteína. O líquido de extração filtrado foi analisado por espectrometria de massa de eletroforese capilar, e os resultados estão apresentados na Tabela 9 a seguir.
Figure img0014
[125] Como se pode ver na Tabela 9, uma redução na concentração intracelular de putrescina foi observada na estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum, a KCCM11138P Tn:1’NCgl2522 com atividade aumentada de NCgl2522, em comparação com a estirpe KCCM11138P parental. Isto sugere que uma capacidade melhorada para exportar putrescina pelo aumento na atividade de NCgl2522 na estirpe mutante KCCM11138P Tn:1’NCgl2522 de Corynebacterium glutamicum conduz à exportação extracelular eficaz de putrescina intracelular.
Exemplo 5: Avaliação da resistência a putrescina da estirpe com deleção ou aumento de NCgl2522
[126] A fim de examinar o efeito de NCgl2522 na resistência a putrescina, a resistência a putrescina das estirpes de KCCM11240P, a KCCM11240P △NCgl2522 e a KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, foi avaliada.
[127] Cada estirpe foi inoculada em 2 mL de líquido CM contendo meio de arginina 1 mM e foi cultivada a 30 °C durante cerca de 10 horas, seguida por diluição na ordem de 105, 104, 103, 102 e 101. Cada diluição assim preparada foi colocada em uma placa CMA contendo putrescina 0 M ou 0,8 M (1% de glicose, 1% de polipeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 1,8% de ágar, arginina 1 mM, pH 6,8, com base em 1 L) e depois cultivada a 30 °C durante 48 horas para comparar diferenças de crescimento entre estirpes.
[128] Como resultado, as estirpes apresentaram dois padrões de crescimento diferentes. Como se pode ver na FIG. 2, a estirpe com deleção do gene de NCgl2522 não cresceu em condições de concentração elevada de putrescina, enquanto a estirpe com o gene de NCgl2522 aumentado cresceu nas mesmas condições. Este resultado mostra que o crescimento celular aumentado de KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 em condições de concentração elevada de putrescina em comparação com a estirpe parental é causado pela capacidade aumentada para exportar putrescina devido ao aumento no gene de NCgl2522. Como resultado, a introdução e aumento de NCgl2522 são essenciais para a fermentação de concentrações elevadas de putrescina.
Exemplo 6: Fermentação de putrescina através da introdução de NCgl2522 em E. coli
[129] A fim de confirmar se a produção de putrescina é aumentada quando NCgl2522 de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é expressa na estirpe W3110 de E. coli do tipo selvagem com uma via biossintética de putrescina, um vetor que expressa speC, que é uma enzima de síntese da putrescina, ou um vetor que expressa NCgl2522 foram introduzidos em W3110.
[130] A fim de preparar o vetor que expressa speC, foram utilizados o cromossoma de W3110 como molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 34 e 35 para amplificar um fragmento do gene de speC de cerca de 2,1 kb (ver Tabela 10). Este produto de PCR foi sujeito a eletroforese em um gel de 0,8% de agarose, e depois uma banda do tamanho desejado foi eluída e purificada. O vetor pSE280 (Invitrogen) contendo o promotor Trc foi tratado com NcoI e EcoRI, e depois o produto de PCR de speC foi clonado em fusão neste vetor. O kit InFusion® HD Cloning (Clontech) foi utilizado nesta clonagem em fusão. O plasmídeo resultante foi designado pSE280-speC.
[131] A fim de preparar o vetor de expressão de NCgl2522, foram utilizados pSE280 como molde e um par de iniciadores SEQ ID NOs: 36 e 37 para obter um fragmento do promotor de Trc, e o cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 38 e 39 foram utilizados para obter um fragmento de NCgl2522. Estes produtos de PCR foram sujeitos a eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, e depois as bandas de tamanho desejado foram eluídas e purificadas. O fragmento do promotor trc e o fragmento de NCgl2522 foram clonados em fusão no pcc1BAC tratado com HindIII. O plasmídeo resultante foi designado pcc1BAC-P(trc)- NCgl2522.
Figure img0015
[132] Os plasmídeos pSE280-speC ou pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522 foram transformados em W3110. A transformação em E. coli foi efetuada utilizando solução 2 x TSS (Epicentre). A E. coli com pSE280-speC foi plaqueada e cultivada em uma placa LB (10 g de Triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, 2% de ágar, com base em 1 L) contendo ampicilina (100 g/mL) para formação de colônias. A E. coli com pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522 foi plaqueada e cultivada em uma placa de LB contendo cloranfenicol (35 g/mL) para formação de colônias. As produtividades de putrescina das estirpes assim obtidas foram avaliadas.
[133] Especificamente, W3110, W3110 pSE280-speC, e W3110 pcc1BAC- P(trc)-NCgl2522 foram inoculados em placas LB, LA e LC, respectivamente, e cultivadas a 37°C durante 24 horas, e depois inoculados em 25 mL de meio de titulação (2 g de (NH4)2PO4, 6,75 g de KH2PO4, 0,85 g de ácido cítrico, 0,7 g de MgSO<7H2O, 0,5% (v/v) de elementos vestigiais, 10 g de glicose, 3 g de AMS, 30 g de CaCO3, com base em 1 L) e cultivadas a 37 °C durante 24 horas. Uma solução de metais vestigiais contém 5 M de HCl, 10 g de FeSO4^7H2O, 2,25 g de ZnSO4^7H2O, 1 g de CuSO4-5H2O, 0,5 g de MnSO4-5H2O, 0,23 g de Na2B4Or10H2O, 2 g de CaCl2-2H2O, e 0,1 g de (NH4)6Mo7O2-4H2O em 1 L.
[134] A concentração de putrescina em cada cultura foi determinada, e os resultados estão apresentados na Tabela 11 a seguir.
Figure img0016
[135] Como se pode ver na Tabela 11, observou-se produtividade elevada de putrescina na estirpe W3110 pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522 com NCgl2522introduzida, em comparação com a estirpe W3110pcc1BAC-pSE280- speC com a enzima biossintética de putrescina speC introduzida.
[136] Este resultado demonstra que a proteína NCgl2522 tem também a capacidade de exportar putrescina em E. coli.
[137] Os presentes inventores verificaram que a introdução adicional de NCgl2522 no transposão de KCCM11138P do micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina foi realizada para aumentar a atividade de NCgl2522 da estirpe de Corynebacterium glutamicum, e deste modo a putrescina podia ser produzida em um rendimento elevado devido ao aumento na capacidade de exportação da putrescina, denominaram a estirpe Corynebacterium glutamicum CC01-0510 e depositaram-na sob o tratado de Budapeste no Centro de Cultura de Micro-organismos Coreano (KCCM) em 8 de março de 2013, com o número de acesso KCCM11401P.
[138] Com base na descrição acima, deve ser entendido pelos peritos na especialidade que outras formas de realização específicas podem ser empregues na prática da sem se afastar da ideia técnica ou características essenciais da invenção. A este respeito, os exemplos atrás descritos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não se destina a ser limitada por estes exemplos. O âmbito da presente invenção deve ser entendido como incluindo todas as modificações ou formas modificadas derivadas do significado e âmbito das seguintes reivindicações ou seus conceitos equivalentes, em vez da descrição detalhada acima.
[139] Efeito da invenção
[140] Um micro-organismo Corynebacterium sp. com produtividade de putrescina melhorada da presente invenção é modificado para apresentar uma atividade melhorada de NCgl2522 de exportação de putrescina intracelular, em comparação com a sua atividade endógena, resultando no aumento da exportação de putrescina extracelular e aumento da resistência a putrescina.
[141] Além disso, quando a NCgl2522 foi expressa em E. coli contendo uma via sintética de putrescina da presente invenção, verificou-se que a quantidade de putrescina extracelular aumentou. De acordo com o exposto, a NCgl2522 derivada de Corynebacterium glutamicum pode ser aplicada em um micro-organismo com produtividade de putrescina, que pode ser amplamente utilizado na produtividade eficaz de putrescina.

Claims (9)

1. Micro-organismo recombinante de Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum com produtividade de putrescina, caracterizado por ser modificado para apresentar maior atividade de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 21 ou 23, em comparação com a atividade da proteína de um microorganismo não modificado, pela introdução de um promotor heterólogo forte em vez do promotor original, ou pela introdução de um polinucleotídeo com a sequência nucleotídica consistindo na SEQ ID NO: 20 ou 22.
2. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo ser adicionalmente modificado para apresentar atividades enfraquecidas da ornitina- carbamoíltransferase (ArgF) e de uma proteína (NCgl1221) envolvida na exportação do glutamato, em comparação com a atividade da proteína de um microorganismo não modificado, pela exclusão dos genes argF e NCgl1221 parcial ou totalmente, e para apresentar maior atividade da ornitina- descarboxilase (ODC), em comparação com a atividade da proteína de um microorganismo não modificado, pela introdução de um gene odc ou pela introdução de um promotor heterólogo forte em vez do promotor original do referido gene.
3. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) possuir a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 29, a proteína (NCgl1221) envolvida na exportação de glutamato possuir a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 30, e a ornitina-descarboxilase (ODC) possuir a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 33.
4. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo ser adicionalmente modificado para ter atividades aumentadas da acetil-gama-glutamil-fosfato- reductase (ArgC), da acetilglutamato-sintase ou ornitina-acetiltransferase (ArgJ), da acetilglutamato-cinase (ArgB), e da acetilornitina-aminotransferase (ArgD), em comparação com as atividades endógenas, pela introdução dos genes argC, argJ, argB e argD, ou pela introdução de um forte promotor heterólogo em vez do promotor original dos referidos genes.
5. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a acetil-gama-glutamil-fosfato-reductase (ArgC), a acetilglutamato-sintase ou ornitina-acetiltransferase (ArgJ), a acetilgutamato-cinase (ArgB) e a acetilornitina-aminotransferase (ArgD) possuírem as sequências de aminoácidos consistindo nas SEQ ID NOs: 25, 26, 27 e 28, respectivamente.
6. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a atividade da acetiltransferase (NCgl1469) do micro-organismo ser adicionalmente enfraquecida, em comparação com a atividade da proteína de um microorganismo não modificado, pela exclusão do gene NCgl1469 parcial ou totalmente.
7. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a acetiltransferase (NCgl1469) possuir a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 31 ou 32.
8. Micro-organismo com produtividade de putrescina de acordo com a reivindicação 1,2 ou 4, caracterizado por o promotor forte ser selecionado do grupo que consiste em promotor CJ7, promotor lysCP1, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB e, mais preferencialmente, promotor lysCP1 ou promotor CJ7.
9. Método para produzir putrescina, caracterizado por compreender os passos de: (i) cultivar o micro-organismo com produtividade de putrescina de qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 para obter uma cultura de células; e (ii) recuperar putrescina do micro-organismo cultivado ou da cultura de células.
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