KR20140115244A - 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 - Google Patents

퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 미생물에서 NCgl2522 활성이 강화되어 고수율로 퓨트레신을 생산할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법{Microorganisms having putrescine productivity and process for producing putrescine using the same}
본 발명은 퓨트레신 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 고수율로 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine) 등과 같은 폴리아민(polyamine)은 대부분의 살아있는 세포 내에 존재하는 물질로, 퓨트레신(putrescine 또는 1,4-butanediamine)은 이러한 스퍼미딘 및 스퍼민 대사에서 전구물질로 사용된다. 퓨트레신은 그람 음성 박테리아나 곰팡이에서 발견되며 다양한 종에서 고농도로 존재하기 때문에 미생물의 대사에 중요한 역할을 수행할 것으로 예측되고 있다.
일반적으로, 퓨트레신은 아디프산(adipic acid)과 반응하여 폴리아민 나일론-4,6을 합성하는 중요한 원료물질로서, 주로 프로필렌(propylene)으로부터 아크릴로니트릴(acrylonitrile) 및 숙시노니트릴(succinonitrile)을 거치는 화학 합성법으로 생산된다. 이 화학 합성법은 촉매적 산화반응 단계, 시아나이드(cyanide) 화합물을 사용하는 단계와 고압 수소를 사용하는 수소화반응 단계 등을 포함하는 3단계 공정으로, 에너지 소모가 많고 환경친화적이지 못하며 석유자원의 고갈이라는 문제점을 내포하고 있다. 따라서, 퓨트레신의 생산을 위해 보다 환경친화적이고 에너지 소비를 절감할 수 있는 바이오매스를 활용한 방법이 요구되고 있는 실정이다.
미생물의 퓨트레신 생합성 경로에서 글루타메이트(glutamate)로부터 오르니틴(ornithine) 합성까지는 아르기닌 생합성 경로와 동일하다. 중간물질로 생성된 오르니틴의 디카르복실화(decarboxylation)를 통해 퓨트레신으로 합성되거나, 아르기닌(L-arginine)으로부터 아그마틴(agmatine)을 거쳐 퓨트레신을 합성하는 2가지 경로가 알려져 있다(Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996). 상기 2가지 경로는 대사에 필요한 에너지를 생성하거나 산성에 대한 스트레스 내성을 부여한다.
미생물을 이용해 퓨트레신을 생산하는 방법으로는 대장균과 코리테박테리움을 형질전환하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 공개되었다(국제특허공개 WO06/005603; 국제특허공개 WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011). 예를 들어, WO09/125924에는 대장균에 존재하는 퓨트레신의 분해 및 이용에 관여하는 경로를 불활성화시키고, 퓨트레신의 전구체인 오르니틴이 알지닌으로 전환되는 경로를 불활성화시키는 대신, 오르니틴 생합성 경로를 강화함으로써 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, Schneider(2010)는 퓨트레신 생산능이 없는 코리네박테리움 속 균주에 오르니틴을 퓨트레신으로 전환시키는 단백질을 도입하고 이의 활성을 강화하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 개시되어 있다.
나아가, 퓨트레신 트랜스포터(transporter)에 관한 연구가 대장균, 효모, 식물 및 동물 세포를 대상으로 활발히 수행되고 있다(K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010). 대장균의 퓨트레신 유입은 총 4가지 경로에 의해 이루어지는데, ATP 가수분해를 이용한 potABCD 또는 potFGHI와, H+ 심포터(symporter)인 potE 및 puu 경로의 puuP에 의해 세포 내로 유입된다. 퓨트레신 유입에 관여하는 복합체들의 Km 값을 살펴보면, PotFGHI는 0.5 mM, potABCD는 1.5 mM, potE는 1.8 mM, 및 puuP는 3.7 mM을 나타내어, 4가지 퓨트레신 유입 경로 중에서 potFGHI 복합체가 가장 적합한 것으로 고려된다. 또한, potE 트랜스포터는 퓨트레신 유입과 배출 기능을 모두 가지고 있는데, 중성 pH에서는 퓨트레신이 양성자와 함께 세포 내로 유입된다. 그러나, pH가 산성조건으로 바뀌면 퓨트레신 합성효소인 speF와 같이 발현되면서 세포 외의 오르니틴이 세포 내로 유입됨과 동시에 세포 내에서 합성된 퓨트레신이 세포 외로 배출된다(Kurihara et.al., J. Bacteriology 191: 8, 2776-2782, 2009).
효모의 퓨트레신 배출 단백질로서, 바실러스의 다약제 트랜스포터(multidrug transporter)인 Blt의 아미노산 서열과 유사성이 높은 TPO1과 TPO4가 알려져 있다. 상기 2개의 배출 단백질은 대장균의 potE와 같은 특성을 가지고 있는데, 염기성 조건에서는 퓨트레신, 스퍼미딘, 스퍼민을 세포 내로 유입하는 반면, 산성 조건에서는 이들을 세포 외로 배출하는 기능을 가지고 있다. 또한 golgi 또는 post-golgi secretory vesicles에 위치하는 TPO5의 경우, 발현 강화시 120 mM 퓨트레신에 대한 내성을 보이는 반면 결손시 90 mM 퓨트레신에 대한 민감성을 보인다(Tachihara et. al,, J. Biological Chemistry, 280(13): 12637-12642, 2005).
동물 세포에서 퓨트레신의 합성과 분해, 유입과 배출은 다양한 조절을 받는다. 폴리아민 배출에 관해 대장균이나 효모만큼 많은 연구가 진행되어 있지는 않지만, 결장 상피세포(colon epithelial cell)에서 아르기닌/다이아민 익스포터(exporter)인 SLC3A2가 세포 외의 아르기닌을 세포 내로 들여오면서 퓨트레신, 아세틸스퍼미딘, 아세틸스퍼민을 세포 외로 배출하는 작용을 하는 것이 보고되었다. 그러나 식물 세포에서는 아직까지 퓨트레신 유입 및 배출에 대해 보고된 바 없다(Igarashi et al., Plant Physiol. & Biochem. 48: 506-512, 2010).
한편, 코리네박테리움 속 미생물은 퓨트레신 생합성 경로를 가지고 있지 않기 때문에 퓨트레신 배출에 관한 연구도 전무한 상태이다. 하지만 최근의 보고에 따르면, 폴리아민의 일종인 카다베린(cadaberine) 생산 균주에서 cg2983 막단백질의 발현을 강화하면 세포성장이 회복되면서 카다베린의 생산성이 증가한 결과가 보고되었다(Kind et. al., Metabolic Engineering 13: 617-627, 2011).
그러나, 아직까지 퓨트레신의 배출 단백질과 관련하여 퓨트레신 생산능이나 퓨트레신 생산능을 가지는 미생물의 생장성에 대해 보고된 바는 없으며, 상기 문헌에서도 cg2983 막단백질과 퓨트레신 배출 기능의 연관성은 전혀 언급되고 있지 않다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 퓨트레신을 보다 고수율로 생산할 수 있는 균주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 퓨트레신 생산 균주인 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl2522가 퓨트레신의 배출 단백질로서 기능함을 밝히고 NCgl2522의 활성을 내재적 활성에 비해 강화시키면 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 퓨트레신 생산경로를 가지고 있는 대장균에 NCgl2522를 발현시켰을 때 배양액 내 퓨트레신 양이 증가함을 확인함으로써 NCgl2522가 대장균에서도 퓨트레신 배출 단백질로서 작용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 NCgl2522 활성이 강화되도록 변이되어 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호: 21 또는 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 강화되도록 변형된, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 미생물이 추가로 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제(ArgF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화되도록 변형되고, 오르니틴 디카복실라아제(ODC)의 활성이 도입된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제(ArgF)가 서열번호: 29로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)이 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 오르니틴 디카복실라아제(ODC)가 서열번호: 33으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 미생물이 추가적으로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)가 각각 서열번호: 25, 26, 27 및 28로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 미생물이 추가적으로 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 약화된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 아세틸트렌스퍼라아제가 서열번호: 31 또는 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 미생물이 에스케리키아속 미생물 또는 코리네형 미생물인 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 미생물이 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는 퓨트레신의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl2522 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되도록 변형되어 퓨트레신 생산성이 향상된 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "NCgl2522"는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 동정된 막단백질로서 MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 퍼미아제(permease)를 의미한다. 상기 NCgl2522는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 다이아미노펜탄(diaminopentane)을 세포 외로 배출시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는, NCgl2522가 세포 내에서 생성된 퓨트레신을 세포 외로 배출하는 역할을 담당하는 트랜스포터로 작용함을 확인하였다. 이를 근거로 NCgl2522 활성을 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형시켜 세포 내에서 생성된 퓨트레신의 배출을 증가시킴으로써 고수율의 퓨트레신 생산성을 나타내는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하고, "내재적 활성에 비해 강화되도록 변형"된다는 의미는 변형 전 상태의 효소 활성과 비교할 때 당해 활성이 신규로 도입되거나 더 향상된 것을 의미한다.
본 발명에서 "효소 활성의 강화"란, 효소 자체의 활성이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현조절서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자내 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함한다.
본 발명에서 "내재적 활성에 비하여 강화되도록 변형"되었다는 것은, 활성을 나타내는 유전자가 도입되거나 또는 당해 유전자의 카피수 증가, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실 또는 발현조절서열의 변형, 예를 들어 개량된 프로모터의 사용 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성이 증가된 상태를 의미한다.
본 발명에 의해 활성이 증가되는 NCgl2522는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호: 21 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열의 단백질일 수 있다. 또한, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 즉, 활성을 강화시킴으로써 퓨트레신 생산성 증가에 도움이 될 수 있는 단백질인 한, 서열번호: 21 또는 23의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있다. 이때, "수 개"란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 2 내지 5개이다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 폴리펩티드의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하여 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이(variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다.
코리네박테리움 속 미생물에는 퓨트레신 생합성 경로가 없지만 외부로부터 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)를 도입하면 퓨트레신이 합성되면서 세포 외로 퓨트레신이 배출된다. 이는 코리네박테리움 속 미생물의 수많은 막단백질 중에서 퓨트레신 통로로서 작용하는 배출 단백질, 즉 트랜스포터가 존재함을 나타내는 것이다. 이에 본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물에서 퓨트레신 배출 단백질을 동정하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 라이브러리를 제작하고 이를 퓨트레신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에 형질전환한 후 퓨트레신 함유 최소배지에서 성장하는 균주를 선별하였다. 3차의 콜로니 선발을 통해 퓨트레신 내성을 갖는 클론(B19)을 최종 선발하였고, 염기서열 분석을 통해 NCgl2522를 함유하고 있음을 확인하였다(도 1 참조). 이와 같이 퓨트레신 배출 단백질로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl2522는 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열과 98% 상동성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl2522는 서열번호: 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 NCgl2522를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 NCgl2522 단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호: 21 또는 23의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호: 20 또는 22의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기에서 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0을 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 NCgl2522를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 20 또는 22의 염기서열 또는 상기 염기서열로부터 유래된 프로브(probe)와 엄격한 조건(stringent conditions)에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 NCgl2522를 코딩하는 변이형일 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란, 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 엄격한 조건은 문헌(J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에서 "NCgl2522의 활성을 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형"하는 것은, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열의 변형, 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있다.
상기에서 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 pDZ 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터 혹은 CJ7 프로모터와 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있다. 여기서 lysCP1 프로모터는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 부위 염기서열 치환을 통해 개량한 프로모터로서 아스파테이트 키나제 유전자의 발현량 증대를 통해 당 효소의 활성을 야생형 대비 5배 정도 높일 수 있는 강력한 프로모터이다(WO 2009/096689). 또한, CJ7 프로모터는 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 강력한 프로모터 서열을 갖는 영역을 탐색하던 중 코리네박테리움 암모니아게네스 및 에세리키아에서 발현가능하고, 강력한 프로모터 활성을 갖는 것이 확인된 프로모터로서 코리네박테리움 글루타미쿰에서 역시 높은 강도로 발현 가능한 프로모터이다(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO 2006/065095).
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서는 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하기 위하여 퓨트레신 배출에 관여하는 NCgl2522를 코딩하는 서열번호: 20 또는 22의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내에 도입하여 유전자 카피수를 증가시키거나, NCgl2522 자체 프로모터를 개량된 활성을 나타내는 프로모터로 치환, 바람직하게는 서열번호: 24의 염기서열을 갖는 CJ7 프로모터를 치환할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퓨트레신 생산능을 갖는 미생물" 또는 "퓨트레신을 생산하는 미생물"이란, 퓨트레신의 생산능이 없는 모균주에 퓨트레신의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 상기 퓨트레신 생산능이 부여되거나 또는 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화하기 위해 글루타메이트를 아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트를 아세틸글루타밀 포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸글루타밀 포스페이트를 아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 세미알데히드를 아세틸오르니틴(N-acetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성을 내재적 활성에 비하여 증가시키도록 변형되어 퓨트레신의 생합성 원료로서 사용되는 오르니틴의 생산성이 향상된 것일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221), 및/또는 퓨트레신을 아세틸화시키는 단백질(NCgl469)의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시키도록 변이되고/되거나, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성을 도입하도록 변형된 것일 수 있다.
이때, 상기 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD), 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF), 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221) 및 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 각각 서열번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 33으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 퓨트레신을 아세틸화시키는 단백질(NCgl469)은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호: 31 또는 32로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 단백질 중에서 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD) 및 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)의 활성 증가는, 앞서 NCgl2522의 활성 증가와 관련하여 전술한 바와 같은 방법, 예컨대 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열의 변형, 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 상기 효소의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 조절인자의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 의해 달성될 수 있다.
또한, 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF) 및 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221), 및 퓨트레신을 아세틸화시키는 단백질(NCgl469)의 활성 약화는, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절서열의 변형, 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 및 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 의해 달성될 수 있다.
구체적으로, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 더욱 바람직하게는 1 내지 50개이다.
또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 효소의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 조절인자를 결실하는 방법은 발현 억제 인자의 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 더욱 바람직하게는 1 내지 50개이다.
한편, 본 발명의 미생물은 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물로서, 상기 서열번호: 21 또는 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되는 원핵 미생물을 포함하며, 이의 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속(Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속(Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 미생물은 에스케리키아 속에 속하는 미생물 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이며, 더욱 바람직하게는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서는, 글루타메이트에서 퓨트레신 생성 경로가 강화되어 고농도 퓨트레신 생산능을 갖는 균주로서 기탁번호 KCCM11138P의 코리네박테리움 속 미생물(대한민국 특허공개 제2012-0064046호)과 기탁번호 KCCM11240P의 코리네박테리움 속 미생물(대한민국 특허출원 제2012-0003634호)을 이용하였다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11138P 및 KCCM11240P와 각각 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a 및 DAB12-b를 이용하였다. ATCC13869 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수할 수 있다. 즉, 각 균주는 ATCC의 카탈로그에 열거된 고유의 등록 번호가 부여되어 있으며 이 등록 번호를 이용하여 주문할 수 있다. 구체적으로, 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869로부터 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF)를 코딩하는 유전자 및 글루타메이트 배출 단백질 NCgl1221을 코딩하는 유전자는 결손되고, 오르니틴 디카르복실라아제(OCD)를 코딩하는 유전자가 도입되며, 오르니틴 생합성 유전자 오페론(argCJBD)의 프로모터가 개량된 프로모터로 치환된 것을 특징으로 한다. 또한, 퓨트레신 생산 균주 DAB12-b는 상기 DAB12-a 균주에서 퓨트레신을 아세틸화시키는 단백질 NCgl1469의 활성을 내재적 활성보다 약화되도록 변형시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 먼저 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF)를 코딩하는 유전자 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)을 코딩하는 유전자가 결손되고, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 ArgCJBD 유전자군의 자체 프로모터가 개량된 프로모터로 치환되며, 오르니틴 디카복실라아제(ODC)를 코딩하는 유전자가 염색체 내에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P와, 상기 미생물에서 추가적으로 아세틸트랜스퍼라제인 NCgl1469를 코딩하는 유전자를 약화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11240P를 퓨트레신 생산 균주로 준비하였다.
한편, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl2522 결손 균주를 제작하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032유래의 NCgl2522의 염기서열을 바탕으로 플라스미드 pDZ-1'NCgl2522(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-1'NCgl2522(K/O)를 준비된 퓨트레신 생산 균주 KCCM11138P 및 KCCM11240P에 각각 형질도입한 후 NCgl2522 결손 균주로 선발하였고, 이들 균주를 각각 KCCM11138P △NCgl2522 및 KCCM11240P △NCgl2522로 명명하였다. 상기와 동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl2522 결손 균주를 제작하여 DAB12-a △NCgl2522 및 DAB12-b △NCgl2522로 명명하였다.
이렇게 제작된 4종의 NCgl2522 결손 균주와 모균주의 퓨트레신 생산능을 비교한 결과, NCgl2522이 결손된 KCCM11138P △NCgl2522, KCCM11240P △NCgl2522, DAB12-a △NCgl2522 및 DAB12-b △NCgl2522 모두에서 모균주에 비해 퓨트레신 생산량이 감소함을 확인하였다(표 3 참조). 상기 결과로부터 본 발명자들은 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522의 활성이 퓨트레신 생산성과 밀접한 관련이 있음을 확인하고, 이의 활성 강화를 통해 퓨테르신 생산성을 증가시키고자 NCgl2522 강화 균주를 제작하였다.
이를 위해, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 코리네박테리움 클루타미쿰 균주의 트랜스포존 내 NCgl2522를 추가 도입하거나 또는 염색체 내 NCgl2522 자체 프로모터를 본 출원인이 신규 개발한 CJ7 프로모터(KCCM10617, 대한민국 등록특허 제10-0620092호)로 교체하였다.
이렇게 제작된 6종의 NCgl2522 강화 균주와 모균주의 퓨트레신 생산능을 비교한 결과, 모균주에 비해 트랜스포존에 NCgl2522를 추가 도입한 균주 모두에서 퓨트레신 생산량이 증가함을 확인하였다(표 6 참조). 증가된 퓨트레신 생산능을 보이는 NCgl2522 강화 균주를 대상으로 세포 내 퓨트레신 농도를 측정한 결과, 모균주에 비해 세포 내 퓨트레신 농도가 감소함을 확인하였다(표 9 참조). 상기 결과로부터 본 발명자들은 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522의 활성이 강화됨에 따라 세포 내에서 생성된 퓨트레신의 세포 외로의 배출이 증가되어 최종적으로 퓨트레신 생산성이 향상됨을 확인하였다.
이에, 본 발명자는 퓨트레신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에서 NCgl2522의 활성이 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형되어 증가된 퓨트레신 배출능을 나타냄으로써 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 Corynebacterium glutamicum CC01-0510으로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 2013년 3월 8일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11401P를 부여받았다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은
(i) 상기 퓨트레신 생산성이 향상된 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
(ii) 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 생산방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하다. 이때, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다.
본 발명의 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물은 세포 내에서 퓨트레신을 배출하는 NCgl2522의 활성이 내재적 활성보다 강화되도록 변형되어 세포 외로의 퓨트레신의 배출을 증가시켰으며, 퓨트레신에 대한 내성도도 증가함을 확인하였다.
또한 본 발명의 퓨트레신 생산경로를 포함하는 대장균에서 NCgl2522를 발현시켰을 때 세포 밖으로 퓨트레신 양이 증가함을 확인하였다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 NCgl2522가 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물에 적용함으로써 효과적인 퓨트레신의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따라 코리네박테리움 염색체 라이브러리가 도입된 형질전환 콜로니로부터 최종 선발된 클론(B19)에 NCgl2522가 포함되어 있음을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 NCgl2522가 결실 또는 강화된 재조합 균주의 퓨트레신에 대한 내성도를 평가한 결과이다.
1: KCCM11240P
2: KCCM11240P △NCgl2522
3: KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 제작
퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제작하기 위하여, 대한민국 특허공개 제2012-0064046호에 기재된 바와 같이 오르니틴으로부터 아르기닌으로의 생합성 경로를 차단하고, 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산하는 생합성 경로의 활성을 강화시키며, 오르니틴 디카르복실라아제(OCD)를 외래로부터 도입함으로써 퓨트레신 생산능이 부여된 미생물을 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 기반으로 상기 균주의 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제(ArgF)를 암호화하는 유전자 및 글루타메이트(glutamate) 배출에 관여하는 단백질인 NCgl1221을 암호화하는 유전자를 상동재조합에 의해 결손시켜 오르니틴 전구체인 글루타메이트의 세포 내 함량을 증가시켰다. 또한, 상기 균주에 오르니틴에서 퓨트레신의 합성에 관여하는, 야생형 대장균 W3110 유래의 오르니틴 디카복실라아제(ODC)를 암호화하는 유전자를 염색체에 도입하였다. 아울러, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하는, argCJBD 유전자군의 자체 프로모터를 개량형 프로모터인 CJ7 프로모터로 치환하여 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다. 이때, 상기 argCJBD는 글루타메이트에서 오르니틴 생합성 경로에 관여하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트렌스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸오르니틴 아미노트렌스퍼라아제(ArgD)를 코딩한다. 이와 같이 제작된 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 부다페스트 조약 하에 한국미생물보존센터(KCCM)에 2010년 11월 24일자로 기탁되어, 기탁번호 KCCM11138P를 부여받았다. 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 제작과 관련하여 자세한 과정은, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 대한민국 특허공개 제2012-0064046호에 상세히 기술되어 있다.
참조예 2: 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 제작
퓨트레신 생성능을 갖는 다른 코리네박티레움 속 미생물로서, 참조예 1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에서 아세틸트렌스퍼라아제(acetyltransferase)인 NCgl1469를 암호화하는 유전자를 약화시켜 N-아세틸 퓨트레신을 생성하지 않음으로써 퓨트레신 생산량이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl1469를 암호화하는 유전자의 염기서열을 근간으로 NCgl1469의 N-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 1 및 2의 프라이머 쌍과, NCgl1469의 C-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 3 및 4의 프라이머 쌍을 하기 표 1과 같이 제작하였다.
프라이머 서열(5'-3')
NCgl1469-del-F1_BamHI(서열번호: 1) CGGGATCCAACCTTCAGAACGCGAATAC
NCgl1469-del-R1_SalI(서열번호: 2) CGCGTCGACTTGGCACTGTGATTACCATC
NCgl1469-del-F2_SalI(서열번호: 3) CGCGTCGACTTGGGTTATATCCCCTCAGA
NCgl1469-del-R2_XbaI(서열번호: 4) TGCTCTAGATAGTGAGCCAAGACATGGAA
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 2쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 수득한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소 BamHI 및 SalI으로, C-말단 부위의 단편을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-NCgl1469(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-NCgl1469(K/O)를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신(25 ㎍/㎖)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/ℓ, 소르비톨 91 g/ℓ, 한천 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 푸른색의 콜로니를 선택함으로써 상기 플라스미드 pDZ-NCgl1469(K/O)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM 배지(glucose 10 g/ℓ, polypeptone 10 g/ℓ, yeast extract 5 g/ℓ, beef extract 5 g/ℓ, NaCl 2.5 g/ℓ, urea 2 g/ℓ, pH 6.8)에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 진탕 배양하고, 각각 10-4부터 10-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체 배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택하여, NCgl1469을 코딩하는 유전자가 결실되어 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다. 이와 같이 제작된 퓨트레신 생성능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 KCCM11138P NCgl1469로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 한국미생물보존센터(KCCM)에 2011년 12월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11240P를 부여받았다. 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 제작과 관련하여 자세한 과정은, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 대한민국 특허출원 제2012-0003634호에 상세히 기술되어 있다.
실시예 1: 퓨트레신 배출 단백질의 탐색 및 퓨트레신에 대한 내성을 부여하는 라이브러리 클론의 선별
코리네박테리움 글루타미쿰에는 퓨트레신 생합성 경로가 없지만 외부로부터 오르니틴 디카르복실라아제를 도입하여 퓨트레신 합성능을 갖추게 되면 퓨트레신이 생성되면서 세포 밖으로 퓨트레신이 배출된다. 이는 코리네박테리움 속 미생물의 수많은 막단백질 중에서 퓨트레신 배출 통로로서 작용하는 트랜스포터 단백질이 존재함을 나타내는 것이다.
코리네박테리움 속 미생물에서 퓨트레신 배출 단백질을 분리, 동정하기 위하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 라이브러리를 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 제한효소 Sau3AI으로 처리하여 불완전 절단을 수행하였고, 3~5 kb 크기의 유전자 절편을 분리하여 BamHI으로 처리된 pECCG122 벡터(대장균과 코리네박테리움의 셔틀벡터; 대한민국 특허공개 제1992-0000933호)에 클로닝하였다.
이로부터 수득된 코리네박테리움 염색체 라이브러리를 참조에 1에 따른 퓨트레신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에 형질전환한 후, 0.35 M의 퓨트레신 함유 최소 배지(증류수 1 ℓ 기준으로 포도당 10 g, MgSO4ㆍ7H2O 0.4 g, NH4Cl 4 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 1 g, 요소 2 g, FeSO4ㆍ7H2O 10 ㎎, MnSO4ㆍ5H2O 1 ㎎, 니코틴아미드 5 ㎎, 티아민 염산연 5 ㎎, 바이오틴 0.1 ㎎, 1 mM 아르기닌, 카나마이신 25 ㎎, 0.35 M 퓨트레신 함유, pH 7.0)에서 성장하는 균주를 선별하였다. 코리네박테리움 염색체 라이브러리가 도입된 형질전환 콜로니 약 5.5×105 중에서 413개의 클로니를 선발하였으며, 이후 퓨트레신 내성도 2차 확인으로부터 수득된 각 라이브러리 클론을 다시 퓨트레신 생산 균주에 재도입 후 퓨트레신 내성도 3차 확인을 통해 최종 1개의 클론(B19)을 선발하였다. 상기 클론을 대상으로 염기서열 분석을 수행한 결과, NCgl2522를 포함하고 있음을 확인하였다(도 1).
퓨트레신 배출 단백질로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 분리, 동정된 NCgl2522는 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된다.
실시예 2: NCgl2522 결손 균주의 제작 및 이의 퓨트레신 생산능 확인
<2-1> ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 결손 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 NCgl2522가 퓨트레신 배출에 관여하는지 여부를 확인하기 위해, NCgl2522를 코딩하는 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 상기 NCgl2522를 코딩하는 유전자의 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 근간으로 NCgl2522의 N-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍과, NCgl2522의 C-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 7 및 8의 프라이머 쌍을 하기 표 2와 같이 제작하였다.
프라이머 서열(5'-3')
NCgl2522-del-F1_BamHI(서열번호: 5) CGGGATCCCACGCCTGTCTGGTCGC
NCgl2522-del-R1_SalI(서열번호: 6) ACGCGTCGACGGATCGTAACTGTAACGAATGG
NCgl2522-del-F2_SalI(서열번호: 7) ACGCGTCGACCGCGTGCATCTTTGGACAC
NCgl2522-del-R2_XbaI(서열번호: 8) CTAGTCTAGAGAGCTGCACCAGGTAGACG
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 2쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522 유전자의 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소 BamHI 및 SalI으로, C-말단 부위의 단편을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-1'NCgl2522(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-1'NCgl2522(K/O)를 참조예 1 및 2에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P 및 KCCM11240P에 각각 전기천공법(electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신(25 ㎍/㎖)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/ℓ, 소르비톨 91 g/ℓ, 한천 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 푸른색의 콜로니를 선택함으로써 상기 플라스미드 pDZ-1'NCgl2522(K/O)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM 배지(glucose 10 g/ℓ, polypeptone 10 g/ℓ, yeast extract 5 g/ℓ, beef extract 5 g/ℓ, NaCl 2.5 g/ℓ, urea 2 g/ℓ, pH 6.8)에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 각각 10-4부터 10-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체 배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2차 교차(crossover)에 의해 NCgl2522를 코딩하는 유전자가 결실된 균주를 최종 선발하였다. 최종 선발된 균주를 대상으로 서열번호: 5 및 8의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 NCgl2522를 코딩하는 유전자가 결실되었음을 확인하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11138P △NCgl2522 및 KCCM11240P △NCgl2522로 명명하였다.
<2-2> ATCC13869 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 결손 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11138P 및 KCCM11240P와 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a(argF 결손, NCgl1221 결손, 대장균 speC 도입, arg 오페론 프로모터 치환; 참조예 1 참고) 및 DAB12-b(argF 결손, NCgl1221 결손, 대장균 speC 도입, arg 오페론 프로모터 치환, NCgl1469 결손, 참조예 2 참고)를 대상으로 NCgl2522 결손 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2522를 코딩하는 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질 서열을 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 5 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후 서열분석을 수행한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl2522를 코딩하는 유전자는 서열번호: 22로 기재되는 염기서열을 포함하며, 이로부터 코딩되는 단백질은 서열번호: 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl2522와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl2522의 아미노산 서열을 비교한 결과, 이들은 98%의 서열 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2522를 코딩하는 유전자를 결손하기 위해 상기 실시예 <2-1>에서와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 표 2에 기재된 2쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522 유전자의 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소 BamHI 및 SalI으로, 수득된 C-말단 부위의 단편을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-2'NCgl2522(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-2'NCgl2522(K/O)를 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a 및 DAB12-b에 각각 형질전환하여 NCgl2522를 코딩하는 유전자가 결실된 균주를 선발하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 DAB12-a △NCgl2522 및 DAB12-b △NCgl2522로 명명하였다.
<2-3> NCgl2522 결손 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 결손이 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 4종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(KCCM11138P △NCgl2522, KCCM11240P △NCgl2522, DAB12-a △NCgl2522, 및 DAB12-b △NCgl2522)와 4종의 모균주(KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a, 및 DAB12-b)를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판 배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 ㎕, agar 2%, pH 6.8, 1 ℓ 기준)에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ml의 역가 배지(Glucose 8%, 대두단백질 0.25%, 옥수수 고형물 0.50%, (NH4)2SO4 4%, KH2PO4 0.1%, MgSO4ㆍ7H2O 0.05%, urea 0.15%, 바이오틴 100 g, 티아민 염산염 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, CaCO3 5% 1 ℓ 기준)에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm으로 98시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다. 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Host Genotype Putrescine(g/L)
KCCM11138P (-) 9.8
△NCgl2522 3.0
KCCM11240P
(KCCM11138P △NCgl1469)		 (-) 12.4
△NCgl2522 1.5
DAB12-a (-) 10.2
△NCgl2522 0.7
DAB12-b
(DAB12-a △NCgl1469)		 (-) 13.1
△NCgl2522 0.3
상기 표 3에 나타난 바와 같이, NCgl2522가 결손된 4종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 모두에서 퓨트레신 생산량이 현저히 감소하였음을 확인하였다.
실시예 3: NCgl2522 강화 균주의 제작 및 이의 퓨트레신 생산능 확인
<3-1> ATCC13032 염색체 내 트랜스포존 유전자 내 NCgl2522 도입
퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움속 미생물 KCCM11138P에서 NCgl2522 유전자(자가 프로모터 부위 포함)의 염색체 내 추가 삽입을 통한 퓨트레신 고생산 효과를 확인하기 위해, NCgl2522를 트랜스포존 유전자 내에 도입하였다. 코리네박테리움 속 미생물의 트랜스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자 도입을 가능하게 하는 형질전환용 벡터 pDZTn(대한민국 특허공개 제2008-0033054호)를 사용하였다.
자가 프로모터를 포함한 NCgl2522 유전자는 ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호: 9 및 10의 프라이머 쌍을 이용하여 약 1.88 kb의 유전자 단편을 증폭하였다(표 4 참조). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 또는 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZTn 벡터는 XhoI을 처리하고 ATCC13032 균주의 NCgl2522 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-1'NCgl2522라 명명하였다.
프라이머 서열(5'-3')
1'NCgl2522-F-T(서열번호: 9) TGTCGGGCCCACTAGTGGTGCGACTTCAATTGTGCTCTT
NCgl2522-R-T(서열번호: 10) GAATGAGTTCCTCGAGCTAGTGCGCATTATTGGCTCC
상기 플라스미드 pDZTn-1'NCgl2522를 참조예 1에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P에 전기천공법(electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 실시예 2와 같은 방법을 통해 트랜스포존에 NCgl2522가 도입된 균주를 선별하였다.
선발된 균주로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호: 9 및 10의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 플라스미드 pDZTn-1'NCgl2522의 도입에 의하여 트랜스포존 내 NCgl2522가 도입되었음을 확인하였다. 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분 신장 과정을 30회 반복하였다.
이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11138P Tn:1'NCgl2522 명명하였다.
<3-2> ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 프로모터 치환 균주의 제작
퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 활성을 강화하기 위하여, 염색체 내 NCgl2522 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터(WO 2006/65095)를 도입하였다.
우선, 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 갖는 CJ7 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 양끝 말단 부위는 염색체상의 NCgl2522 원래의 서열을 갖는 상동재조합 단편을 수득하였다. 구체적으로, CJ7 프로모터의 5'-말단 부위는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 11 및 12의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 수득하였다. 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 또한, CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 13 및 14의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였으며, CJ7 프로모터의 3'-말단 부위는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 15 및 16의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였다. 프로모터 치환에 사용된 프라이머는 하기 표 5에 나타난 바와 같다.
프라이머 서열(5'-3')
NCgl2522-L5(서열번호: 11) TGCAGGTCGACTCTAGAGTTCTGCGTAGCTGTGTGCC
NCgl2522-L3(서열번호: 12) GGATCGTAACTGTAACGAATGG
CJ7-F(서열번호: 13) CGTTACAGTTACGATCCAGAAACATCCCAGCGCTACTAATA
CJ7-R(서열번호: 14) AGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG
NCgl2522-R5(서열번호: 15) CAACGAAAGGAAACACTATGACTTCAGAAACCTTACAGGCG
NCgl2522-R3(서열번호: 16) TCGGTACCCGGGGATCCCACAAAAAGCGTAGCGATCAACG
상기에서 수득한 각 PCR 산물을 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-1'NCgl2522라 명명하였다.
상기에서 제조된 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'NCgl2522를 각각 참조예 1 및 2에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11138P 및 KCCM11240P에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 제조하였다. 제조된 형질전환체를 CM 배지에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 진탕 배양하고, 이로부터 수득된 배양물을 10-4 내지 10-10로 희석하여 25 ㎍/㎖ 카나마이신과 X-gal이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다.
대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차에 의해 최종적으로 NCgl2522 프로모터가 CJ7 프로모터로 치환된 균주를 선발하였다. 선발된 균주로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호: 13 및 16의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 플라스미드 pDZ-1'CJ7(NCgl2522)의 도입에 의하여 염색체 내 NCgl2522 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입되었음을 확인하였다. 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장 과정을 30회 반복하였다.
이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522 및 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522라 명명하였다.
<3-3> ATCC13869 염색체 내 트랜스포존 유전자 내 유전자 NCgl2522 도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 퓨트레신 균주로부터 NCgl2522 유전자의 염색체 내 추가 삽입을 통한 퓨트레신 고생산 효과를 확인하기 위해, NCgl2522(프로모터 부위 포함)를 트랜스포존 유전자 내에 도입하기로 결정하였다 NCgl2522 유전자는 ATCC13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호: 17 및 10의 프라이머 쌍을 이용하여 약 1.97 kb의 유전자 단편을 증폭하였다(표 6 참조). 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 또는 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 NCgl2522 PCR 단편을 XhoI으로 처리한 pDZTn 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn-2'NCgl2522라 명명하였다.
프라이머 서열(5'-3')
2'NCgl2522-F-T(서열번호: 17) TGTCGGGCCCACTAGTCTTCAATTCGAGTTGCTGCCAC
NCgl2522-R-T(서열번호: 10) GAATGAGTTCCTCGAGCTAGTGCGCATTATTGGCTCC
상기 플라스미드 pDZTn-2'NCgl2522를 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a에 형질전환하여 트랜스포존 내 NCgl2522가 도입되었음을 확인하였다.
이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-a Tn:2'NCgl2522 명명하였다
<3-4> ATCC13869 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 프로모터 치환 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2522의 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터를 도입하기 위해 상기 실시예 <3-2>에서와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 표 7에 기재된 3쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 CJ7 프로모터 부위, 그의 N-말단 부위 및 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 CJ7 프로모터 부위, 그의 N-말단 부위 및 C-말단 부위의 PCR 단편을 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-2'NCgl2522라 명명하였다.
프라이머 서열(5'-3')
2'NCgl2522-L5(서열번호: 18) TGCAGGTCGACTCTAGACAATTCGAGTTGCTGCCACAC
NCgl2522-L3(서열번호: 12) GGATCGTAACTGTAACGAATGG
CJ7-F(서열번호: 13) CGTTACAGTTACGATCCAGAAACATCCCAGCGCTACTAATA
CJ7-R(서열번호: 14) AGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG
NCgl2522-R5(서열번호: 19) CAACGAAAGGAAACACTATGATTTCAGAAACTTTGCAGGCG
NCgl2522-R3(서열번호: 17) TCGGTACCCGGGGATCCCACAAAAAGCGTAGCGATCAACG
상기 플라스미드 pDZ-'P(CJ7)-2'NCgl2522를 실시예 <3-2>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a 및 DAB12-b에 각각 형질전환하여 NCgl2522 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 선발하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 및 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522로 명명하였다.
<3-5> NCgl2522 강화 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 프로모터 치환에 의한 NCgl2522 활성 강화가 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <3-1> 내지 <3-4>에서 제작된 6종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(KCCM11138P Tn:1'NCgl2522, KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522, KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-a Tn:2'NCgl2522, DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 및 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)와 4종의 모균주(KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a 및 DAB12-b)의 퓨트레신 생산능을 비교하였다. 각 균주를 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 배양한 후 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
　Host Genotype Putrescine(g/L)
KCCM11138P (-) 9.8
Tn:1'NCgl2522 11.7
P(CJ7)-NCgl2522 13.5
KCCM11240P (-) 12.4
P(CJ7)-NCgl2522 15.5
DAB12-a (-) 10.2
Tn:2'NCgl2522 12.3
P(CJ7)-NCgl2522 14.1
DAB12-b (-) 13.1
P(CJ7)-NCgl2522 15.9
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 트랜스포존에 NCgl2522를 추가 도입하거나 프로모터 치환을 통해 NCgl2522 활성이 강화된 6종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 모두에서 퓨트레신 생산량이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 4: NCgl2522 강화 균주의 세포 내 퓨트레신 농도 측정
NCgl2522 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에서 퓨트레신 배출능이 향상됨에 따라 세포 내 퓨트레신 농도가 감소하였는지를 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11138P Tn:1'NCgl2522 및 모균주 KCCM11138P를 대상으로 유기용매를 이용한 추출방법으로 세포 내 퓨트레신 농도를 측정하였다. 세포 내 대사물질(intracellular metabolite) 분석방법은 문헌(Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4491-4498, 2007)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11138P Tn:1'NCgl2522 및 모균주 KCCM11138P를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 액상 배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 l, pH 6.8, 1 ℓ 기준) 25 ml 에 접종한 후 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 도중 세포 성장이 지수증식기(exponential phase)에 도달하면 급속 진공 여과(rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA)를 통해 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포가 흡착된 필터를 10 ml의 냉각수로 2회 세척한 후, 5 M 모르폴린 에탄설폰산(morpholine ethanesulfonic acid) 및 5 M 메티오닌 설폰(methionine sulfone)을 함유한 메탄올에 10분간 담가두었다. 이로부터 얻은 추출액에 동량의 클로로포름과 0.4배 부피의 물을 잘 혼합한 후, 수층(aqueous phase)만을 스핀 칼럼(spin column)에 적용하여 단백질 오염물을 제거하였다. 여과된 추출액을 모세관 전기영동 질량분석기(capillary electrophoresis mass spectrometry)를 사용하여 분석하고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
Strain Putrescine(mM)
KCCM11138P 7
KCCM11138P Tn:1'NCgl2522 2
상기 표 9에 나타난 바와 같이, 모균주 KCCM11138P에 비해 NCgl2522 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11138P Tn:1'NCgl2522의 세포 내 퓨트레신 농도가 감소하였음을 확인하였다. 이는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11138P Tn:1'NCgl2522에서 NCgl2522 활성 강화로 인해 퓨트레신 배출능이 향상됨에 따라 세포 내에서 생성된 퓨트레신이 세포 외로 원활히 배출되는 것으로 예측된다.
실시예 5: NCgl2522 결실 또는 강화된 균주의 퓨트레신 내성도 평가
NCgl2522의 퓨트레신 내성에 대한 영향성을 확인하기 위해 상기에서 제작한 KCCM11240P, KCCM11240P △NCgl2522, 및 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 균주를 대상으로 퓨트레신 내성도를 평가하였다.
각 균주를 2 ㎖의 CMA 액체배지에 접종하여 30℃에서 약 10시간 동안 배양한 후, 105, 104, 103, 102 및 101 순으로 희석하였다. 준비된 각각의 희석액을 퓨트레신 0 M 또는 0.8 M을 포함한 CMA 평판배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%. agar 1.8%, 1 mM arginine, pH 6.8)에 점적(spotting)한 후 30℃, 48시간 동안 배양하여 균주간 성장을 비교하였다.
그 결과, 상기 균주들은 2가지 다른 성장 양상을 나타내었는데, 도 2에 나타난 바와 같이 NCgl2522 유전자가 결손된 균주에서는 퓨트레신이 고농도로 함유되어 있는 조건에서 성장하지 못한 반면, NCgl2522 유전자의 발현이 강화된 균주에서는 동일한 조건에서 세포 성장이 증가하였다. 이는 NCgl2522 유전자의 강화로 인한 퓨트레신 배출능 증가가 고농도의 퓨트레신이 포함된 조건에서 모균주 대비 높은 세포 성장성을 확인한 결과로서, 고농도 퓨트레신 발효를 위해 NCgl2522의 도입 및 강화가 필수적임을 나타내는 것이다.
실시예 6: 대장균에 NCgl2522 도입을 통한 퓨트레신 발효
퓨트레신 생합성 경로를 갖는 대장균 야생형 균주 W3110에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl2522 발현시 퓨트레신 생산 증가 효과를 확인하기 위해 W3110에 퓨트레신 합성효소인 speC 발현벡터와 NCgl2522 발현벡터를 각각 도입하였다.
speC 발현벡터를 제작하기 위해 W3110 염색체를 주형으로 서열번호: 34 및 35 프라이머를 이용하여 약 2.1 kb의 speC 유전자 단편을 증폭하였다(표 10 참조). 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. Trc 프로모터를 포함한 pSE280 벡터(Invitrogen)를 NcoI 및 EcoRI로 처리한 후 speC PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하여 수행하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pSE280-speC라 명명하였다.
NCgl2522 발현벡터를 제작하기 위해 pSE280을 주형으로 서열번호: 36 및 37 프라이머를 이용하여 Trc 프로모터 단편을 수득하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체를 주형으로 서열번호: 38 및 39 프라이머를 이용하여 NCgl2522 단편을 수득하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. HindIII로 처리된 pcc1BAC에 trc 프로모터 단편과 NCgl2522 단편을 퓨전 클로닝하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522라 명명하였다.
프라이머 서열(5'-3')
SPEC-F(서열번호: 34) CACAGGAAACAGACCATGGATGAAATCAATGAATATTGCCGCCA
SPEC-R(서열번호: 35) GTGCAGGTGCTGAATTCTTACTTCAACACATAACCGTACAAC
Ptrc-F(서열번호: 36) TGCAGGCATGCAAGCTTCGACATCATAACGGTTCTGGC
Ptrc-R(서열번호: 37) ATTATACGAGCCGGATGATTAATTG
NCgl2522-F(서열번호: 38) CATCCGGCTCGTATAATATGACTTCAGAAACCTTACAGGC
NCgl2522-R(서열번호: 39) ATAGAATACTCAAGCTTCTAGTGCGCATTATTGGCTCC
상기 플라스미드 pSE280-speC와 pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522를 W3110에 형질전환하였다. 대장균 내 형질전환은 2× TSS 용액(Epicentre)을 사용하여 수행하였고, pSE280-speC가 도입된 대장균은 엠피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 평판배지(Tryptone 10 g, yeast extract 5 g, Nacl 10 g, agar 2%, 1 ℓ 기준)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522가 도입된 대장균은 클로람페니콜(35 ㎍/㎖)이 함유된 LB 평판배지에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 상기에서 수득한 균주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 확인하였다.
구체적으로, W3110, W3110 pSE280-speC, 및 W3110 pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522를 각각 LB, LA 및 LC 고체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고, 이를 각각 25 ㎖ 역가 배지((NH4)2PO4 2 g, KH2PO4 6.75 g, citric acid 0.85 g, MgSO4·7H2O 0.7 g, trace element 0.5%(v/v), glucose 10 g, AMS 3 g, CaCO3 30 g, 1 ℓ 기준)에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 미량 금속 용액(Trace metal solution)은 1 ℓ당 5 M HCl: FeSO4·7H2O 10 g, ZnSO4·7H2O 2.25 g, CuSO4·5H2O 1 g, MnSO4·5H2O 0.5 g, Na2B4O7·10H2O 0.23 g, CaCl2·2H2O 2 g, (NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1 g을 포함한다.
각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
Host Plasmid Putrescine(mg/L)
W3110 (-) 11
pSE280-speC 56
pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522 250
상기 표 11에 나타난 바와 같이, 퓨트레신 생합성 효소 speC가 도입된 W3110 pcc1BAC-pSE280-speC 균주 대비 NCgl2522가 도입된 W3110 pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522에서 퓨트레신 생산량이 더 증가하였음을 확인하였다.
이는 상기 NCgl2522 유전자가 대장균에서도 퓨트레신 배출 단백질로서 활성을 가지고 있음을 입증하는 것이다.
본 발명자는 퓨트레신 생성능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 KCCM11138P 에서 트랜스포존 내 NCgl2522를 추가도입하여 NCgl2522 활성을 강화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 증가된 퓨트레신 배출능을 통해 고수율로 퓨트레신을 생산할 수 있음을 확인하고, 상기 균주를 Corynebacterium glutamicum CC01-0510으로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2013년 03월 08일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11401P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11138P 20101124 한국미생물보존센터(국외) KCCM11240P 20111226 한국미생물보존센터(국외) KCCM11401P 20130308
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Microorganisms having putrescine productivity and process for producing putrescine using the same <130> KPA121079-KR-P1 <150> 10-2013-0030020 <151> 2013-03-20 <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1469-del-F1_BamHI <400> 1 cgggatccaa ccttcagaac gcgaatac 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1469-del-R1_SalI <400> 2 cgcgtcgact tggcactgtg attaccatc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1469-del-F2_SalI <400> 3 cgcgtcgact tgggttatat cccctcaga 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1469-del-R2_XbaI <400> 4 tgctctagat agtgagccaa gacatggaa 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-del-F1_BamHI <400> 5 cgggatccca cgcctgtctg gtcgc 25 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-del-R1_SalI <400> 6 acgcgtcgac ggatcgtaac tgtaacgaat gg 32 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-del-F2_SalI <400> 7 acgcgtcgac cgcgtgcatc tttggacac 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-del-R2_XbaI <400> 8 ctagtctaga gagctgcacc aggtagacg 29 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1'NCgl2522-F <400> 9 tgtcgggccc actagtctta aattccagtt gttgccacg 39 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-R-T <400> 10 gaatgagttc ctcgagctag tgcgcattat tggctcc 37 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-L5 <400> 11 tgcaggtcga ctctagagtt ctgcgtagct gtgtgcc 37 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-L3 <400> 12 ggatcgtaac tgtaacgaat gg 22 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7-F <400> 13 cgttacagtt acgatccaga aacatcccag cgctactaat a 41 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7-R <400> 14 agtgtttcct 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gcatatcccc tgctcatggc gggccttctt ttgggtaccg gcactttggg tgacaaaatc 240 ggccaccgcc ggatgttcct catgggcttg agcattttcg gaatcgcttc acttggtgct 300 gcgtttgctc caactgcgtg ggctcttgtt gctgcgagag ctttccttgg catcggtgcg 360 gcaacgatga tgcctgcaac cttggctctg atccgcatta cgtttgagga tgagcgtgag 420 cgcaacactg caattggtat ttggggttcc gtggcaattc ttggcgctgc ggcaggcccg 480 atcattggtg gtgcgctgtt ggaattcttc tggtggggtt cggttttcct cattaacgtt 540 ccggtggctg ttatcgcgtt gatcgctacg ctttttgtgg cgccggccaa tatcgcgaat 600 ccgtctaagc attgggattt cttgtcgtcg ttctatgcgc tgctcacact tgctgggttg 660 atcatcacga tcaaggaatc tgtgaatact gcacgccata tgcctcttct tttgggtgca 720 gtcatcatgt tgatcattgg tgcggtgttg tttagcagtc gtcagaagaa gatcgaggag 780 ccacttctag atctgtcgtt gttccgtaat cgccttttct taggcggtgt ggttgctgcg 840 ggcatggcga tgtttactgt gtccggtttg gaaatgacta cctcgcagcg tttccagttg 900 tctgtgggtt tcactccact tgaggctggt ttgctcatga tcccagctgc attgggtagc 960 ttcccgatgt ctattatcgg tggtgcaaac ctgcatcgtt ggggcttcaa accgctgatc 1020 agtggtggtt ttgctgccac tgccgttggc atcgccctgt gtatttgggg cgcgactcat 1080 actgatggtt tgccgttttt catcgcgggt ctattcttca tgggcgcggg tgctggttcg 1140 gtaatgtctg tgtcttccac tgcgattatc ggttccgcgc cggtgcgtaa ggctggcatg 1200 gcgtcgtcga tcgaagaggt ctcttatgag ttcggcacgc tgttgtctgt cgcgattttg 1260 ggtagcttgt tcccattctt ctactcgctg catgccccgg cagaggttgc ggataacttc 1320 tcggcgggtg ttcaccacgc gattgatggc gatgcggcgc gtgcatcttt ggacaccgca 1380 tacattaacg tgttgatcat tgccctagta tgcgcagtag cggctgctct gatcagcagt 1440 taccttttcc gcggaaatcc gaagggagcc aataatgcgc actag 1485 <210> 21 <211> 494 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 NCgl2522 <400> 21 Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg 1 5 10 15 Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val 20 25 30 Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu 35 40 45 Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu 50 55 60 Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile 65 70 75 80 Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala 85 90 95 Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala 100 105 110 Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu 115 120 125 Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro 145 150 155 160 Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe 165 170 175 Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe 180 185 190 Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu 195 200 205 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Ile Thr Ile 210 215 220 Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Met Pro Leu Leu Leu Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys 245 250 255 Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu 260 265 270 Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser 275 280 285 Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe 290 295 300 Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser 305 310 315 320 Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe 325 330 335 Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ala Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala 340 345 350 Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile 355 360 365 Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val 370 375 380 Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met 385 390 395 400 Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser 405 410 415 Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala 420 425 430 Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile 435 440 445 Asp Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val 450 455 460 Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His 485 490 <210> 22 <211> 1485 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 NCgl2522 <400> 22 atgatttcag aaactttgca ggcgcaagcg cctacgaaaa cccaacgttg ggctttcctc 60 gctgttatca gcggtggtct ctttctgatc ggtgtagaca actcaatcct ctacaccgca 120 ctccccctgc tgcgtgaaca actcgcagcc actgaaaccc aagcgttgtg gatcatcaac 180 gcatatcccc tgctcatggc gggtcttctt ttgggtaccg gcactttggg tgacaaaatc 240 ggccaccgcc ggatgttcct catgggcttg agcattttcg gaatcgcttc acttggcgct 300 gcgtttgctc caactgcgtg ggctcttgtt gctgcgagag ctttccttgg catcggtgcg 360 gcgacgatga tgcccgcaac cttggctctg atccgcatta cgtttgaaga tgaacgcgaa 420 cggaacaccg cgattggcat ttggggttct gtggcaattc ttggcgcggc ggcaggtccg 480 atcattggtg gtgcgctgtt ggaattcttc tggtggggtt cggttttcct cattaacgtt 540 ccggtggctg ttatcgcgtt gatcgctacg ctttttgtgg cgccggccaa tatcgcgaat 600 ccgtccaagc actgggattt cttatcctcg ttctatgcat tgcttaccct tgcaggtttg 660 attgtcacca tcaaagaatc ggtaaacact gcacgtcatc tgccactgct tgtaggtgcc 720 atcatcttgc ttatcattgg tgcggtgttg tttagcagtc gtcagaagaa gatcgaggag 780 ccacttctag atctgtcgtt gttccgtaat cgccttttct taggcggtgt ggttgctgcg 840 ggcatggcga tgtttactgt gtccggtttg gaaatgacta cctcgcagcg tttccagttg 900 tctgtgggtt tcactccact tgaggctggt ttgctcatga tcccagctgc attgggtagc 960 ttcccgatgt ctattatcgg tggtgcaaac ttgcatcgtt ggggcttcaa accgctgatc 1020 agtggtggtt tccttgccac ggcagtcggc atcgccctgt gtatttgggg cgcgactcat 1080 actgatggtt tgccgttttt catcgcgggt ctgttcttca tgggcgcggg tgctggttcg 1140 gtaatgtctg tgtcttccac tgcgattatc ggttccgcgc cggtgcgtaa ggctggcatg 1200 gcgtcgtcga tcgaagaggt ctcttatgag ttcggcacgc tgttgtctgt cgcgattttg 1260 ggtagcttgt tcccattctt ctactcgctg catgccccgg cagaggttgc ggataacttc 1320 tcggcgggtg ttcaccacgc gatttatggc gatgcggcgc gtgcatcttt ggacaccgca 1380 tacattaacg tgttgatcat tgccctagta tgcgcagtag cggctgctct gatcagcagt 1440 taccttttcc gcggaaatcc gaagggagcc aataatgcgc actag 1485 <210> 23 <211> 494 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 NCgl2522 <400> 23 Met Ile Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg 1 5 10 15 Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val 20 25 30 Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu 35 40 45 Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu 50 55 60 Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile 65 70 75 80 Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala 85 90 95 Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala 100 105 110 Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu 115 120 125 Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro 145 150 155 160 Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe 165 170 175 Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe 180 185 190 Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu 195 200 205 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Val Thr Ile 210 215 220 Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Leu Pro Leu Leu Val Gly Ala 225 230 235 240 Ile Ile Leu Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys 245 250 255 Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu 260 265 270 Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser 275 280 285 Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe 290 295 300 Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser 305 310 315 320 Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe 325 330 335 Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Leu Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala 340 345 350 Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile 355 360 365 Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val 370 375 380 Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met 385 390 395 400 Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser 405 410 415 Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala 420 425 430 Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile 435 440 445 Tyr Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val 450 455 460 Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His 485 490 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> CJ7 promoter <400> 24 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 25 <211> 357 <212> PRT <213> N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase (ArgC) <400> 25 Met Ile Met His Asn Val Tyr Gly Val Thr Met Thr Ile Lys Val Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly Glu Ile Leu Arg Leu Leu 20 25 30 Leu Gly His Pro Ala Tyr Ala Ser Gly Glu Leu Glu Ile Gly Ala Leu 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Asp Leu Val Gly Leu Ile Asn Ser His Gly Pro Tyr Ala Val Gly Thr 115 120 125 Ser Gly Glu Asp Ala Gly Leu Phe Thr Ala Gln Lys Arg Met Val Asn 130 135 140 Ile Asp Gly Val Pro Thr Asp Ile Gly Leu Val Gly Asp Ile Ile Asn 145 150 155 160 Val Asp Ala Ser Ser Leu Met Asp Ile Ile Glu Ala Gly Arg Ile Pro 165 170 175 Val Val Ser Thr Ile Ala Pro Gly Glu Asp Gly Gln Ile Tyr Asn Ile 180 185 190 Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu 195 200 205 Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp Pro 210 215 220 Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu Ala 225 230 235 240 Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser Cys 245 250 255 Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp Gly 260 265 270 Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly Ile 275 280 285 Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro Glu 290 295 300 Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu 305 310 315 <210> 28 <211> 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<223> Ptrc-F primer <400> 36 tgcaggcatg caagcttcga catcataacg gttctggc 38 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc-R primer <400> 37 attatacgag ccggatgatt aattg 25 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-F primer <400> 38 catccggctc gtataatatg acttcagaaa ccttacaggc 40 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2522-R primer <400> 39 atagaatact caagcttcta gtgcgcatta ttggctcc 38

Claims (10)

  1. 서열번호: 21 또는 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 강화되도록 변형된, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 추가로 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제(ArgF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화되도록 변형되고, 오르니틴 디카복실라아제(ODC)의 활성이 강화된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  3. 제3항에 있어서, 상기 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제(ArgF)가 서열번호: 29로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)이 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 오르니틴 디카복실라아제(ODC)가 서열번호: 33으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)가 각각 서열번호: 25, 26, 27 및 28로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 아세틸트렌스퍼라아제(NCgl1469)의 활성이 약화된 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아세틸트렌스퍼라아제(NCgl1469)가 서열번호: 31 또는 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네형 미생물인 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물.
  10. (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 생산방법.
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RU2015142261A RU2665825C2 (ru) 2013-03-20 2014-02-25 Микроорганизмы, продуцирующие путресцин, и способ получения путресцина с использованием этих микроорганизмов
AU2014238707A AU2014238707B2 (en) 2013-03-20 2014-02-25 Recombinant microorganism for putrescine production and method for producing putrescine using same
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HUE14768563A HUE048852T2 (hu) 2013-03-20 2014-02-25 Putreszcint termelõ mikroorganizmusok és eljárás putreszcin elõállítására azok alkalmazásával
MYPI2015001984A MY172080A (en) 2013-03-20 2014-02-25 Microorganisms having putrescine productivity and process for producing putrescine using the same
JP2016504226A JP6297134B2 (ja) 2013-03-20 2014-02-25 プトレシン生産性を有する微生物及びそれを用いたプトレシン生産方法
US14/778,383 US10221433B2 (en) 2013-03-20 2014-02-25 Microorganisms having putrescine productivity and process for producing putrescine using the same
EP14768563.0A EP2977443B1 (en) 2013-03-20 2014-02-25 Microorganisms having putrescine productivity and process for producing putrescine using the same
TW105108481A TWI657142B (zh) 2013-03-20 2014-03-19 具有腐胺生產力之微生物及使用其產生腐胺之方法
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150124398A (ko) * 2014-04-25 2015-11-05 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
EP3109318A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
WO2017014532A1 (ko) * 2015-07-20 2017-01-26 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
WO2017159976A1 (ko) 2016-03-15 2017-09-21 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법
WO2018230977A1 (ko) 2017-06-14 2018-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
WO2018230978A1 (ko) 2017-06-14 2018-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
WO2019017706A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
US10450262B2 (en) 2015-05-08 2019-10-22 Cj Cheiljedang Corporation Method for purifying 1,4-diaminobutane

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101607741B1 (ko) 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
EP3135757B1 (en) 2014-04-25 2019-02-20 CJ Cheiljedang Corporation Diamine-producing microorganism and method for producing diamine using same
EP3135758B1 (en) 2014-04-25 2021-12-29 CJ Cheiljedang Corporation Diamine-producing microorganism and method for producing diamine using same
JP6663757B2 (ja) * 2016-03-11 2020-03-13 日清ファルマ株式会社 ポリアミン高含有酵母及びその製造方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920000933B1 (ko) 1989-07-28 1992-01-31 삼성전관 주식회사 평면 방전형 칼라 방전 표시 패널
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
JP4479283B2 (ja) 2004-03-04 2010-06-09 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
NZ552631A (en) * 2004-07-15 2009-09-25 Dsm Ip Assets Bv Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100882259B1 (ko) 2006-10-12 2009-02-09 주식회사 코캣 탈질, 탈황, 함산소 화합물 제조를 위한 탄화수소 기질의선택산화 방법
RU2355759C1 (ru) * 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
MY175283A (en) * 2008-04-10 2020-06-18 Korea Advanced Inst Sci & Tech Mutant microorganisms having high ability to produce putrescine and method for producing putrescine using the same
KR20120003634A (ko) 2010-07-05 2012-01-11 현대위아 주식회사 차륜용 회전 지지 장치
KR101348461B1 (ko) * 2010-12-08 2014-01-08 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
CN103492553B (zh) 2011-02-22 2018-06-12 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
ES2655764T3 (es) * 2012-01-11 2018-02-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada de producción de putrescina y un procedimiento para producir putrescina utilizando el mismo
US9290771B2 (en) * 2012-01-20 2016-03-22 Cj Cheiljedang Corporation Recombinant microorganism having an enhanced ability to produce putrescine and a method for producing putrescine using the same
KR101607741B1 (ko) * 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
CN106459888B (zh) * 2014-04-25 2019-12-24 Cj第一制糖株式会社 用于产生腐胺的微生物和使用其产生腐胺的方法

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150124398A (ko) * 2014-04-25 2015-11-05 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
US10450262B2 (en) 2015-05-08 2019-10-22 Cj Cheiljedang Corporation Method for purifying 1,4-diaminobutane
CN107849576A (zh) * 2015-06-24 2018-03-27 Cj第制糖株式会社 用于产生腐胺或鸟氨酸的微生物以及使用这些微生物产生腐胺或鸟氨酸的方法
EP3109318A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
US11053525B2 (en) 2015-06-24 2021-07-06 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
CN107922955A (zh) * 2015-07-20 2018-04-17 Cj第制糖株式会社 用于产生腐胺或鸟氨酸的微生物和使用其产生腐胺或鸟氨酸的方法
WO2017014532A1 (ko) * 2015-07-20 2017-01-26 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
US11365400B2 (en) 2015-07-20 2022-06-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism for producing ornithine and process for producing ornithine using them
US11268074B2 (en) 2015-07-20 2022-03-08 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
CN107922955B (zh) * 2015-07-20 2021-04-27 Cj第一制糖株式会社 用于产生腐胺或鸟氨酸的微生物和使用其产生腐胺或鸟氨酸的方法
AU2016297226B2 (en) * 2015-07-20 2019-06-27 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
US10815464B2 (en) 2015-07-20 2020-10-27 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine and process for producing putrescine using them
US10640753B2 (en) 2015-07-20 2020-05-05 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
WO2017159976A1 (ko) 2016-03-15 2017-09-21 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법
KR20170107615A (ko) * 2016-03-15 2017-09-26 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법
US11124812B2 (en) 2016-03-15 2021-09-21 Cj Cheiljedang Corporation Putrescine-producing microorganism and method for producing putrescine using the same
JP2020523988A (ja) * 2017-06-14 2020-08-13 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規なポリペプチド及びこれを用いたオルニチン系産物の生産方法
US10870871B2 (en) 2017-06-14 2020-12-22 Cj Cheiljedang Corporation Polypeptide and method for producing ornithine-based product using the same
JP2022001049A (ja) * 2017-06-14 2022-01-06 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規なポリペプチド及びこれを用いたオルニチン系産物の生産方法
WO2018230978A1 (ko) 2017-06-14 2018-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
WO2018230977A1 (ko) 2017-06-14 2018-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
US11492648B2 (en) 2017-06-14 2022-11-08 Cj Cheiljedang Corporation Modified polypeptide having an activity of ornithine-based product exporter and method for producing ornithine-based product using cells expressing the polypeptide
US10801047B2 (en) 2017-07-19 2020-10-13 Cj Cheiljedang Corporation Putrescine-producing microorganism and method of producing putrescine using the same
WO2019017706A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법

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