WO2018230977A1

WO2018230977A1 - 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법

Info

Publication number: WO2018230977A1
Application number: PCT/KR2018/006732
Authority: WO
Inventors: 김선혜; 박수진; 이경민; 나경수; 리홍선; 배현정; 심지현; 양영렬; 엄혜원; 이효형; 강민경; 김혜원; 송병철; 오해나; 이한형
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2018-12-20
Also published as: US20200208182A1; BR112019026883A2; KR20180136612A; EP3640258A1; KR101937569B1; US11492648B2; CN111406064A; JP2020523989A; EP3640258A4; JP7203475B2

Abstract

본 출원은 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 신규한 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 오르니틴계 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법

오르니틴(L-ornithine)은 식물, 동물, 미생물에서 널리 발견되는 물질로 글루타메이트로부터 생합성 되며, 퓨트레신, 시트룰린 및 프롤린의 생합성에 사용되는 전구체이다. 또한, 고등동물의 생체 내 대사에서 오르니틴 회로를 통해 아미노산 또는 암모니아로부터 요소를 생성하여 체외로 배출하는 경로에서 중요한 역할을 한다. 오르니틴은 근육 생성과 체지방 감소에 효과가 있기 때문에, 영양보충제로 사용되고 있고, 간경화와 간기능 장애를 개선하는 의약품으로도 이용되고 있다. 이러한 오르니틴을 생산하는 방법으로는 우유 카제인(casein)을 소화 효소로 처리하는 방법 및 형질전환된 대장균 또는 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 방법이 알려져 있다 (대한민국 등록번호 제10-1372635호; T. Gotoh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 33:773-777, 2010).

퓨트레신 (또는 1,4-부탄다이아민)은 나일론 4, 6을 포함하는 폴리아미드 4, 6의 생산을 위한 중요한 원료물질이다. 퓨트레신은 수소 시안화물 (hydrogen cyanide) 첨가에 의해 아크릴로니트릴 (acrylonitrile)로 생산되는 숙시노니트릴 (succinonitrile)의 수소화 방법을 통해 산업적 규모로 생산될 수 있다. 이러한 화학물질의 합성경로에서는 비 재생적인 석유화학적 산물을 원료 물질로서 필요로 한다. 또한 상대적으로 복잡한 제조단계, 설비뿐만 아니라, 값비싼 촉매시스템과 관련한 높은 온도와 압력이 필요하다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 재생가능한 바이오매스 유래 탄소원으로부터 퓨트레신의 생산이 요구되고, 최근에는 산업적으로 이용 가능한 고농도의 폴리아민 (퓨트레신)을 생산하기 위하여 친환경적인 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. (Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng, 104: 651-662, 2009; Schneider J, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 88: 859-868, 2010).

한편, 퓨트레신 배출능을 가지는 NCgl2522 유전자가 규명된 바 있다 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호). 그러나 보다 높은 수율로 퓨트레신을 생산하기 위해, 퓨트레신 생산 균주로부터 더욱 효과적으로 퓨트레신을 배출시킬 수 있는 배출능 향상 단백질을 개발하는 것이 여전히 필요한 실정이다.

L-아르기닌은 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 종합 아미노산 제제 등의 의약용으로 사용되고 있으며, 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용 등의 식품용으로도 최근 각광받고 있는 물질이다. 산업적으로 이용 가능한 고농도의 아르기닌을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있으며, 글루타민산(glutamate) 생산 균주인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법, 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산 균주를 이용하는 방법 등이 보고되었다. 한편, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물은 L-lysine 배출능을 가지는 lysE가 동일한 염기성 아미노산인 L-아르기닌도 배출한다고 보고된 바 있으며 (Bellmann A, et al, Microbiology, 147:1765-1774, 2001), 상기 유전자의 강화를 통해 L-아르기닌 생산균주의 생산능을 향상시키는 방법이 알려져 있다(특허번호 US 2002-196232).

본 발명자들은 오르니틴 산물 배출능이 증진되어 보다 생산능을 향상시킬 수 있는 배출 단백질의 변이체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, NCgl2522 단백질의 아미노산 서열 중 특정 위치에 변이를 도입 시, 오르니틴계 산물의 배출능이 향상됨을 확인하였다. 이에, 오르니틴계 산물인 퓨트레신 또는 아르기닌을 생산하는 미생물에 상기 변이된 단백질을 도입하여, 오르니틴계 산물인 퓨트레신 또는 아르기닌을 고수율로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 신규 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 오르니틴계 산물을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 오르니틴계 산물을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 오르니틴계 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 오르니틴계 산물 생산방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드는 우수한 오르니틴계 산물 배출 활성을 가지므로, 오르니틴계 산물 생산 미생물에 그 활성이 도입될 경우 오르니틴계 산물의 생산능을 더욱 향상시킬 수 있다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 오르니틴계 산물 배출 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 77 번째 글리신 (Glycine) 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 신규 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 출원에서 상기 오르니틴계 산물 배출 단백질은 오르니틴을 전구체로하여 생합성되는 산물을 배출하는 세포 외로 배출하는데 관여하는 단백질을 의미하며, 구체적으로는 퓨트레신 또는 아르기닌을 세포 외로 배출하는데 관여하는 단백질을 의미한다. 보다 구체적으로 대한민국 공개특허 제2014-0115244호에 개시된 NCgl2522 단백질일 수 있다. 상기 NCgl2522 단백질은 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함하며, 당업자는 공지의 데이터베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 서열 정보를 얻을 수 있다.

본 출원의 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 신규 폴리펩타이드는, 상기 오르니틴계 산물 배출 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 77 번째 글리신 (Glycine) 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하며, 이를 통해 비변이 폴리펩타이드, 구체적으로는 77 번째 글리신 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩타이드에 비하여 향상된 오르니틴계 산물의 배출능을 갖는다. 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩티드는, 예를 들어, 오르니틴계 산물 배출 단백질의 아미노산 서열에서 77 번째 글리신이 알라닌 또는 아르기닌으로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드, 또는 상기 서열과 70 % 이상, 80 % 이상, 구체적으로는 85 % 이상, 더욱 구체적으로는 90 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열일 수 있으나, 77 번째 글리신이 다른 아미노산으로 치환되어 오르니틴계 배출능을 가지는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지는 서열로서, 실질적으로 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 역시 본 출원의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 출원에서 용어, “오르니틴계 산물은” 오르니틴을 전구체로하여 생합성할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로 오르니틴을 전구체로 하여, 오르니틴 회로를 통해 생산될 수 있는 물질로, 퓨트레신, 시트룰린, 프롤린, 아르기닌 일 수 있으나, 오르니틴을 전구체로 하여 생합성 될 수 있는 물질이면 이에 제한되지 않는다. 그 예로 오르니틴계 산물은 퓨트레신과 아르기닌 일 수 있다. 또한, 본 출원의 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 신규 폴리펩타이드에 의해 배출될 수 있는 오르니틴을 전구체로 하여 합성되는 물질은 제한없이 포함된다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드와 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 70 % 이상, 80 % 이상, 구체적으로는 85 % 이상, 더욱 구체적으로는 90 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.

상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85 % 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. Sambrook et al.,supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.

또한, "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하며, 경우에 따라서는 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

용어 "상동성" 및 "동일성"은 종종 상호 교환적으로 이용된다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성 또는 동일성이 있는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 일반적으로 모두 또는 타겟 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 엄격도 또는 높은 엄격도에서 하이브리드할 것이다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 적어도 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(바람직하게는, 버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 “상동성” 또는 "동일성"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 또 다른 양태는, 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 오르니틴계 산물을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

구체적으로는, 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 퓨트레신 또는 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움속(the genus Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, “미생물”은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물일 수 있다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 고농도의 퓨트레신 또는 아르기닌에 노출되더라도 세포 생장과 생존에 영향을 적게 받는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 출원에서 용어 "오르니틴계 산물을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 오르니틴계 산물의 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 상기 오르니틴계 산물을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화하기 위해 글루타메이트를 아세틸글루타메이트 (N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제 (ArgJ), 아세틸글루타메이트를 아세틸글루타밀 포스페이트 (N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 키나아제 (ArgB), 아세틸글루타밀 포스페이트를 아세틸글루타메이트 세미알데히드 (N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 세미알데히드를 아세틸오르니틴 (N-acetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가시키도록 변형되어 오르니틴의 생산성이 향상된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 "퓨트레신 또는 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 퓨트레신 또는 아르기닌 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물은 퓨트레신을 생산하지 않으며, 아르기닌은 생산할 수 는 있으나 아르기닌의 생산능이 현저히 낮다. 따라서, 본 출원에서 퓨트레신 또는 아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 균주 자체 또는 외부 퓨트레신 또는 아르기닌 생산 기작과 관련된 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 퓨트레신 또는 아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.

또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 추가적으로 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 (ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질, 퓨트레신을 아세틸화시키는 아세틸트랜스퍼라아제로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 약화되도록 변이되고/되거나, 오르니틴 디카르복실라아제 (ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입되도록 변이된 것일 수 있다.

또한, 상기 아르기닌을 생산하는 미생물은 추가적으로 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 (ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 아르기니노숙신산 합성효소 (Argininosuccinate synthase, argG), 아르기니노숙신산 분해효소 (Argininosuccinate lyase, argH), 아스파테이트 암모니아 리아제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 강화되도록 변이된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, 단백질의 활성의 “강화”는 상기 단백질의 활성이 도입되거나, 또는 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 활성의 “도입”은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 폴리펩타이드의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다.

본 출원에서 용어, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 “증가”한다는 것은, 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 “내재적 활성”은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다. 변형 전 활성으로 혼용되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 출원에서 활성 증가는,

1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,

4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는

5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

본 출원에서 용어, 단백질 활성의 “약화”는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하고, 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 구체적으로는 1 내지 300개, 보다 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 양태는 (i) 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된 오르니틴계 산물을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 오르니틴계 산물을 회수하는 단계를 포함하는 오르니틴계 산물 생산방법을 제공한다.

구체적인 예로, (i) 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산방법을 제공한다.

또 다른 구체적인 예로, (i) 상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된 L-아르기닌을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-아르기닌 생산방법을 제공한다.

상기 오르니틴계 산물의 배출능을 가지는 폴리펩타이드 및/또는 오르니틴계 산물을 생산하는 미생물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 오르니틴계 산물을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 미생물 또는 배지로부터 목적하는 산물을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 오르니틴계 산물을 회수하는 방법은 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 퓨트레신 배출 단백질의 아르기닌 배출능 확인

코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 NCgl2522은 퓨트레신의 배출능이 있는 것으로 밝혀진 바 있으나(대한민국 공개특허 제2014-0115244호), 퓨트레신 외에도, 오르니틴을 출발물질로 하여 생합성 될 수 있는 시트룰린, 프롤린 및 아르기닌을 배출할 수 있는지 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, 오르니틴을 출발 물질로 하여 생합성될 수 있는 산물 중 대표적인 예로 아르기닌 배출능이 있는지 확인하였다.

<1-1> 아르기닌 생산균주 기반 NCgl2522 강화 벡터 및 균주 제작

아르기닌 생산능을 가진 야생형 ATCC21831 균주와 KCCM10741P (대한민국 등록특허 제10-0791659호)에서 NCgl2522 활성을 강화하기 위하여, 염색체 내 NCgl2522의 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터(WO 2006/065095 A)를 도입하였다.

WO 2006/065095 A에 공지된 CJ7 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 양끝 말단 부위는 염색체상의 NCgl2522 원래의 서열을 갖는 상동재조합 단편을 수득하였다. 구체적으로, CJ7 프로모터의 5'-말단 부위는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 또는 KCCM10741P의 게놈 DNA를 주형으로 하고 표 1의 서열번호: 17 및 18의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 수득하였다. 이때 PCR 반응은 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 또한, CJ7 프로모터 부위는 표 1의 서열번호: 19 및 20의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였으며, CJ7 프로모터의 3'-말단 부위는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 또는 KCCM10741P의 게놈 DNA를 주형으로 하고 표 1의 서열번호: 21 및 22의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였다. 프로모터 치환에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

프라이머	서열 (5' -> 3')
NCgl2522-L5 (서열번호: 17)	TGCAGGTCGACTCTAGA GTTCTGCGTAGCTGTGTGCC
NCgl2522-L3 (서열번호: 18)	GATGTTTCT GGATCGTAACTGTAACGAATGG
CJ7-F (서열번호: 19)	AGAAACATCCCAGCGCTACTAATA
CJ7-R (서열번호: 20)	AGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG
NCgl2522-R5 (서열번호: 21)	CAACGAAAGGAAACACT ATGATTTCAGAAACTTTGCAGGCG
NCgl2522-R3 (서열번호: 22)	TCGGTACCCGGGGATCC CACAAAAAGCGTAGCGATCAACG

상기에서 수득한 각 PCR 산물을 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 50 ℃에서 10 분 동안 반응시켰으며, 이를 통해 얻은 플라스미드를 각각 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-21831 및 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-10741P 라 명명하였다.

상기에서 제조된 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-21831 및 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-10741P 를 아르기닌 생산균주인 ATCC21831 및 KCCM10741P 에 전기천공법 (electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신 (25 ㎍/㎖)과 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지 (Braine heart infusion 37 g/L, 소르비톨 91 g/L, 한천 2 %)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 상기 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-21831 또는 pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-10741P가 도입된 균주를 선별하였다.

상기 선별된 균주를 CM 배지 (글루코스 10 g/L, 폴리펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 소고기 추출물 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, 요소 2 g/L, pH 6.8)에서 진탕 배양 (30 ℃, 8 시간)하고, 각각 10^-4부터 10^-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2 차 교차 (crossover)에 의해 최종적으로 NCgl2522 유전자의 프로모터가 CJ7으로 치환된 균주를 선별하였다. 최종 선발된 균주를 대상으로 표 1의 프라이머 쌍 (서열번호 19 및 22)을 이용해 PCR을 수행하여 수득한 산물을 염기서열 분석하여 염색체 내 NCgl2522 개시 코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입되었음을 확인하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

이로부터 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 및 KCCM10741P_Pcj7 NCgl2522로 명명하였다.

<1-2> 아르기닌 생산균주 기반 NCgl2522 강화 균주의 생산능 확인

NCgl2522 유전자가 오르니틴계 산물 중 하나인 아르기닌 배출능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 참고예에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 및 KCCM10741P_Pcj7 NCgl2522를 대상으로 아르기닌 생산능을 비교하였다.

이 때 대조군으로서는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831, KCCM10741P 를 사용하였으며, 생산 배지 [포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 이스트 익스트렉트 0.5%, 비오틴 100ug/L, pH7.2] 25 ml을 넣은 250ml 코너-바플 플라스크에 1 백금이의 균주를 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하여 생산하였다. 배양종료 후 HPLC로 아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2과 같았다.

균주	OD	아르기닌농도 (g/L)	오르니틴농도 (g/L)	아르기닌Fold (%)
KCCM10741P	91	3.0	0.3	100
KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522	72	3.6	0.4	120
ATCC21831	102	4.2	0.3	100
ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522	86	4.8	0.4	114

상기 표 2에 나타난 바와 같이, KCCM10741P 및 ATCC21831에 NCgl2522 유전자의 프로모터를 CJ7으로 치환하여 강화하였을 때, 상기 변이주인 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 모균주 대비 각각 아르기닌 생산량이 20%, 14% 증가하였음을 확인하였다. 또한, 아르기닌으로 전환되기 전 단계 물질인 오르니틴의 농도도 상기 변이주에서 모균주 대비 증가함을 확인하였다.

이를 토대로 NCgl2522 유전자는 퓨트레신의 배출유전자일 뿐만 아니라, 오르니틴을 포함하여 이를 출발물질로 하여 생합성되는 산물들에 대한 배출능을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 결과로부터 NCgl2522 유전자 및 본 원의 변이체는 바이오매스를 활용한 오르니틴계 산물 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있음을 해석할 수 있다.

실시예 2. 퓨트레신 배출 단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리 제작 및 유효 변이 확보

오르니틴계 산물 배출 단백질의 활성을 증가시키고자, 본 발명자들은 퓨트레신 배출 단백질을 코딩하는 유전자인 NCgl2522 (대한민국 등록특허 제10-1607741 호)의 변이체를 제작하였다.

구체적으로, 상기 NCgl2522 유전자 변이체 라이브러리 제작을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로, 표 3의 NCgl2522 유전자 ORF의 개시코돈을 제외시키는 특이적 프라이머 쌍 (서열번호 7 및 8)을 이용하여 임의 돌연변이유발 PCR (JENA error prone PCR)을 수행하였다.

프라이머	서열 (5' -> 3')
13032-putE-EF-FX (서열번호 7)	CCGGGGATCCTCTAGA ACTTCAGAAACCTTACAGGC
13032-putE-EF-RX (서열번호 8)	GCAGGTCGACTCTAGA CTAGTGCGCATTATTGGCTC

이와 같은 과정으로 제작한 돌연변이 유전자 단편들을 XbaI으로 자른 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 50 ℃에서 10 분 동안 반응시켰으며, 이를 통해 pDZ-N2522 변이체 플라스미드 라이브러리를 완성하였다.

그 다음 상기와 같은 과정으로 제작한 재조합 플라스미드 라이브러리들을 HTS (High Thoughput Screening)를 이용하여 스크리닝하였다. 이때, 스크리닝 기반 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 퓨트레신을 생산하는 재조합 미생물인 KCCM11240P (대한민국 등록특허 제10-1493585호)를 사용하였다.

구체적으로, 퓨트레신 배출 활성이 증가된 변이체를 확보하기 위하여, 제작한 플라스미드 라이브러리들을 KCCM11240P에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신 (25 ㎍/㎖)과 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지 (Braine heart infusion 37 g/L, 소르비톨 91 g/L, 한천 2 %)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 상기 플라스미드 pDZ-N2522 변이체 라이브러리가 도입된 균주를 선별하였다.

상기 선별된 균주를 96 Deep well plate을 이용하여 스크리닝 역가 배지 (글루코스 2 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, MgCl₂ 0.8 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, (NH₄)₂SO₄ 4 g/L, 대두단백질 가수분해물 0.48 g/L, MnSO₄·7H₂O 0.01 g/L, 티아민·HCl 200 ㎍/L, 바이오틴 200 ㎍/L, FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, 아르기닌 1 mM, 카나마이신 25 ㎍/㎖, pH 7.2)에서 진탕 배양 (30 ℃, 24 시간)하고, 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하여, 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 가장 많이 증가된 형질전환체 1 종을 선별하였다. 그 다음, 선별된 상기 형질전환체의 NCgl2522 단백질의 아미노산 서열에서 어떤 변이가 유도되었는지 확인하였다. Ncgl2522 변이체 서열의 확인은, 해당 변이체를 포함하는 형질전환체로부터 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용한 colony PCR을 수행하여 상동재조합 단편을 수득한 후, 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 유전자 서열을 해독하는 방식으로 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 상기 과정을 통해 선별된 NCgl2522 변이체는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl2522 아미노산 서열 (서열번호 1)에서 N-말단으로부터 77 번째 아미노산 잔기인 글리신 (Gly)이 알라닌 (Ala)으로 치환된 것임을 확인하였고, 이를 NCgl2522_G77A (서열번호 3)으로 명명하였다.

실시예 3. 퓨트레신 배출 단백질을 코딩하는 유전자의 77 번째 아미노산 잔기가 치환된 다양한 변이체의 확보

본 발명들은 상기 실시예 2에서 제조된 NCgl2522_G77A 변이체를 통해, N-말단으로부터 77 번째 아미노산 잔기가 NCgl2522 단백질의 활성에 중요한 위치임을 인식하였다. 이에, NCgl2522 단백질의 77 번째 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 다양한 변이체를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로, NCgl2522 유전자 ORF의 개시코돈을 제외시키는 특이적 프라이머 쌍 (서열번호 7 및 8)을 이용하여 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

그 다음 상기에서 수득한 PCR 산물을 XbaI으로 처리된 pDZ벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였고, 이를 통해 수득한 플라스미드를 pDZ-NCgl2522_G77이라 명명하였다.

다음으로, 상기에서 제작한 플라스미드 pDZ-NCgl2522_G77를 주형으로, NCgl2522의 77 번째 아미노산 잔기에 임의 돌연변이를 유발하기 위해 표 4의 프라이머 쌍(서열번호 9 및 10)을 이용하여 PCR을 수행하여 pDZ-NCgl2522_G77 변이체 플라스미드 라이브러리를 완성하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 5 분 신장 과정을 25 회 반복하여 수행하였다.

프라이머	서열 (5' -> 3')
SM_putE_G77-F (서열번호 9)	TGGGGTTCCGTGNNKATTCTTGGCGCT
SM_putE_G77-R(서열번호 10)	AGCGCCAAGAATMNNCACGGAACCCCA

그 다음 상기와 같은 과정으로 제작한 재조합 플라스미드 라이브러리들을 HTS (High Thoughput Screening)를 이용하여 스크리닝하였다. 이때, 스크리닝 기반 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 퓨트레신을 생산하는 재조합 미생물인 KCCM11240P을 이용하였다.

제작한 플라스미드 라이브러리들을 KCCM11240P에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 플라스미드 pDZ-NCgl2522_G77 변이체가 도입된 균주를 선별하였다. 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 가장 많이 증가된 형질전환체 2 종을 선별하였고, 각 형질전환체의 NCgl2522 단백질의 아미노산 서열에서 어떤 변이가 유도되었는지 실시예 2과 같은 방법으로 확인하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl2522 아미노산 서열 (서열번호 1)에서 N-말단으로부터 77 번째 아미노산 잔기인 글리신 (Glycine)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 변이체 NCgl2522_G77A (ATCC13032) (서열번호 3)외에, 아르기닌 (Arginine)으로 치환된 변이체가 확인되었고, 이를 NCgl2522_G77R (ATCC13032) (서열번호 4)으로 명명하였다.

또한, 상기 변이의 퓨트레신 생산성 증가 효과가 다른 균주 유래의 NCgl2522 단백질에도 적용될 수 있는지 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2522 단백질의 77 번째 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 다양한 변이체를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로, NCgl2522 유전자 ORF의 개시코돈을 제외시키는 특이적 프라이머 쌍 (서열번호 7 및 8)을 이용하여 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 30초 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

상기에서 수득한 PCR 산물을 XbaI으로 처리된 pDZ벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였고, 그 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-13869-NCgl2522_G77이라 명명하였다.

다음으로, 상기에서 제작한 플라스미드 pDZ-13869-NCgl2522_G77을 주형으로 하고, 77 번째 아미노산 잔기에 임의 돌연변이를 유발하기 위해 표 4의 프라이머 쌍 (서열번호 9 및 10)을 이용해 PCR을 수행하여 pDZ-13869-NCgl2522_G77 변이체 플라스미드 라이브러리를 완성하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 5분 신장 과정을 25 회 반복하여 수행하였다.

그 다음, 상기와 같은 과정으로 제작한 재조합 플라스미드 라이브러리들을 HTS (High Thoughput Screening)를 이용하여 스크리닝하였다. 스크리닝 기반 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 퓨트레신을 생산하는 재조합 미생물인 DAB12-b을 이용하였다. 그 다음, 제작한 플라스미드 라이브러리들을 DAB12-b에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 플라스미드 pDZ-13869-NCgl2522_G77 변이체가 도입된 균주를 선별하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl2522의 변이체와 마찬가지로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 NCgl2522 아미노산 서열 (서열번호 2)에서 N-말단으로부터 77 번째 아미노산 잔기가 치환된 변이체 2 종이 퓨트레신 생산량이 가장 많은 균주로 선별되었다. 이 중 77 번째 아미노산 잔기인 글리신 (Glycine)이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 변이체는 NCgl2522_G77A (ATCC13869) (서열번호 5)로, 아르기닌 (Arginine)으로 치환된 변이체는 NCgl2522_G77R (ATCC13869) (서열번호 6)으로 명명하였다.

실시예 4. NCgl2522 변이체 균주의 제작 및 이의 퓨트레신 생산능 확인

<4-1> ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 변이체 균주의 제작

퓨트레신 생산 균주에서 퓨트레신 배출능을 증가시키기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주에 NCgl2522 유전자 변이체인 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R을 염색체 내로 도입하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 14, 서열번호 12 및 13)들을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522_G77A을, 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 16, 서열번호 12 및 15)들을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522_G77R 변이 서열을 갖는 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30초 어닐링; 및 72 ℃, 30초 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

프라이머	서열 (5' -> 3')
pDC-Pself-putE-up-FX (서열번호 11)	CCGGGGATCCTCTAGA CCTCTAAGCGCCTCAAAG
pDC-putE-up-RX (서열번호 12)	GCAGGTCGACTCTAGA GATTCGCGATATTGGCCG
putE_G77A-F(서열번호 13)	CCGGCACTTTGGCTGACAAAATCG
putE_G77A-R(서열번호 14)	CGATTTTGTCAGCCAAAGTGCCGG
putE_G77R-F(서열번호 15)	CCGGCACTTTGCGTGACAAAATCG
putE_G77R-R(서열번호 16)	CGATTTTGTCACGCAAAGTGCCGG

상기에서 수득한 각 PCR 산물을 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 각각 pDZ-NCgl2522_G77A 및 pDZ-NCgl2522_G77R이라 명명하였다.

상기에서 제조된 플라스미드 pDZ-NCgl2522_G77A 또는 pDZ-NCgl2522_G77R를 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11240P (대한민국 공개특허 제2013-0082478호)에 전기천공법 (electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신 (25 ㎍/㎖)과 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지 (Braine heart infusion 37 g/L, 소르비톨 91 g/L, 한천 2 %)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 상기 플라스미드 pDZpDZ-NCgl2522_G77A 또는 pDZ-NCgl2522_G77R가 도입된 균주를 선별하였다.

상기 선별된 균주를 CM 배지 (글루코스 10 g/L, 폴리펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 소고기 추출물 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, 요소 2 g/L, pH 6.8)에서 진탕 배양 (30 ℃, 8 시간)하고, 각각 10^-4부터 10^-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2 차 교차 (crossover)에 의해 최종적으로 NCgl2522 유전자가 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R 변이체로 치환된 균주를 선별하였다. 최종 선발된 균주를 대상으로 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 12)을 이용해 PCR을 수행하여 수득한 산물을 염기서열 분석하여 변이체로 치환되었음을 확인하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30초 변성; 55 ℃, 30초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

이로부터 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11240P NCgl2522_G77A 및 KCCM11240P NCgl2522_G77R로 명명하였다.

<4-2> ATCC13869 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2522 변이체 균주의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주인 DAB12-a ΔNCgl1469 (대한민국 공개특허 제2013-0082478호)를 DAB12-b라 명명하고, 퓨트레신 생산 균주의 퓨트레신 배출능을 증가시키기 위하여 NCgl2522 유전자 변이체인 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R를 DAB12-b 균주의 염색체 내로 도입하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 5의 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 14, 서열번호 12 및 13)들을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522_G77A을, 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 16, 서열번호 12 및 15)들을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2522_G77R 변이 서열을 갖는 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 30 초 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

상기에서 수득한 각 PCR 산물을 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 각각 pDZ-NCgl2522_G77A-2 및 pDZ-NCgl2522_G77R-2라 명명하였다.

상기에서 제조된 플라스미드 pDZ-NCgl2522_G77A-2 또는 pDZ-NCgl2522_G77R-2를 DAB12-b에 전기천공법 (electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신 (25 ㎍/㎖)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지 (Braine heart infusion 37 g/L, 소르비톨 91 g/L, 한천 2 %)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상기 플라스미드 pDZ-NCgl2522_G77A-2 또는 pDZ-NCgl2522_G77R-2가 도입된 균주를 선별하였다.

상기 선별된 균주를 CM 배지 (글루코스 10 g/L, 폴리펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 소고기 추출물 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, 요소 2 g/L, pH 6.8)에서 진탕 배양 (30 ℃, 8 시간)하고, 각각 10^-4부터 10^-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2 차 교차 (crossover)에 의해 최종적으로 NCgl2522 유전자가 NCgl2522_G77A 및 NCgl2522_G77R 변이체로 치환된 균주를 선별하였다. 최종 선발된 균주를 대상으로 프라이머 쌍 (서열번호 11 및 12)을 이용해 PCR을 수행하였고, 이를 통해 수득한 산물의 염기서열을 분석하여 변이체로 치환되었음을 확인하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.

이로부터 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 DAB12-b NCgl2522_G77A 및 DAB12-b NCgl2522_G77R로 명명하였다.

<4-3> NCgl2522 변이체 도입 균주의 퓨트레신 생산능 평가

퓨트레신 생산 균주에 퓨트레신 배출능을 증가시키는 NCgl2522 유전자 변이체 도입 시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-1> 및 <4-2>에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P NCgl2522_G77A; DAB12-b NCgl2522_G77R)와 2 종의 모균주 (KCCM11240P; DAB12-b)를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판 배지 (글루코스 1 %, 폴리펩톤 1 %, 효모 추출물 0.5 %, 소고기 추출물 0.5 %, NaCl 0.25 %, 요소 0.2 %, 50 % NaOH 100 ㎕, 아가 2 %, pH 6.8, 1 L 기준)에 도말하여 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ㎖의 역가 배지 (글루코스 8 %, 대두단백질 0.25 %, 옥수수고형 0.50 %, (NH₄)₂SO₄ 4 %, KH₂PO₄ 0.1 %, MgSO₄·7H₂O 0.05 %, 요소 0.15 %, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCl 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, CaCO₃ 5 %, 1 L 기준)에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30 ℃에서 200 rpm으로 50 시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다. 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

□ 균주명	퓨트레신(g/L)	생산성(g/L/h)	Fold(%)
KCCM11240P	5.8	0.116	100
KCCM11240P NCgl2522_G77A	6.8	0.136	117
KCCM11240P NCgl2522_G77R	6.3	0.126	109
DAB12-b	6.5	0.129	100
DAB12-b NCgl2522_G77A	7.3	0.146	113
DAB12-b NCgl2522_G77R	7.1	0.142	110

상기 표 6에 나타난 바와 같이, KCCM11240P 및 DAB12-b에 각각 변이체 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R를 도입하였을 때, 상기 변이체가 도입된 모든 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 모균주 대비 퓨트레신 생산량 및 생산성이 7% 내지 13% 증가하였음을 확인하였다. 이때의 생산성은 각 형질전환체의 시간당 퓨트레신 생산량을 나타내며 g/L/h로 나타내었다.

실시예 5. 퓨트레신 배출능이 증가된 퓨트레신 생산균주에 NCgl2522 변이체 도입 및 이의 퓨트레신 생산능 확인

<5-1> 퓨트레신 배출능이 증가된 균주에 NCgl2522 변이체를 도입한 균주의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 배출능이 증가된 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호)에서, NCgl2522 유전자 변이체의 영향성을 확인하기 위하여 NCgl2522_G77A 및 NCgl2522_G77R를 각각 상기 균주의 염색체 내로 도입하였다.

구체적으로, 실시예 <4-1>에서 제작한 pDZ-NCgl2522_G77A 및 pDZ-NCgl2522_G77R를 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522에 각각 형질전환하여 염색체 내 NCgl2522 유전자가 변이체로 치환되었음을 확인하였다. 상기 과정을 통해 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77A 및 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77R로 명명하였다.

<5-2> 퓨트레신 배출능이 증가된 균주에 NCgl2522 변이체를 도입한 균주의 퓨트레신 생산능 평가

퓨트레신 배출능이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 생산균주에 NCgl2522 변이체가 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <5-1>에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주와 모균주의 퓨트레신 생산능을 비교하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77A 및 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77R)와 모균주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522)를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판 배지 (글루코스 1 %, 폴리펩톤 1 %, 효모 추출물 0.5 %, 소고기 추출물 0.5 %, NaCl 0.25 %, 요소 0.2 %, 50 % NaOH 100 ㎕, 아가 2 %, pH 6.8, 1 L 기준)에 도말하여 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ㎖의 역가 배지 (글루코스 8 %, 대두단백질 0.25 %, 옥수수고형 0.50 %, (NH₄)₂SO₄ 4 %, KH₂PO₄ 0.1 %, MgSO₄·7H₂O 0.05 %, 요소 0.15 %, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCl 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, CaCO₃ 5 %, 1 L 기준)에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30 ℃에서 200 rpm으로 50 시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다. 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

□ 균주명	퓨트레신(g/L)	생산성(g/L/h)	Fold(%)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522	6.9	0.138	100
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77A	7.6	0.152	110
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77R	7.5	0.150	109

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 퓨트레신 배출능이 강화된 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522에 변이체 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R를 도입하였을 때, 이미 퓨트레신 배출능이 강화되어 있는 모균주 대비 퓨트레신 생산량 및 생산성이 9% 내지 10% 증가하였음을 확인하였다. 이때의 생산성은 각 형질전환체의 시간당 퓨트레신 생산량을 나타내며 g/L/h로 나타내었다.

실시예 6. 아르기닌 생산균주에 NCgl2522 변이체 도입 및 이의 아르기닌 생산능 확인

<6-1> 아르기닌을 생산하는 균주에 NCgl2522 변이체를 도입한 균주의 제작

L-아르기닌 생산 균주에서 L-아르기닌 배출능을 증가시키기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 및 KCCM10741P (대한민국 등록특허 제10-0791659호) 에 NCgl2522 유전자 변이체인 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R을 염색체 내로 도입하였다.

구체적으로, 실시예 <4-2>와 같은 방법을 이용하여, 최종적으로 NCgl2522 유전자가 NCgl2522_G77A 및 NCgl2522_G77R 변이체로 치환된 균주를 선별하였다. 이로부터 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM10741P NCgl2522_G77A 및 KCCM10741P NCgl2522_G77R, ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77A, ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77R 로 명명하였다.

<6-2> NCgl2522 변이체 도입 균주의 L-아르기닌 생산능 평가

L-아르기닌 생산 균주에 L-아르기닌 배출능을 증가시키는 NCgl2522 유전자 변이체 도입 시 L-아르기닌 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <6-1>에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 L-아르기닌 생산능을 비교하였다.

이 때 대조군으로서는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, ATCC21831 및 참조예에서 제조된 KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522, ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522를 사용하였으며, 생산 배지 [포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 이스트 익스트렉트 0.5%, 비오틴 100ug/L, pH7.2] 25 ml을 넣은 250ml 코너-바플 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하여 생산하였다. 배양종료 후 HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 8과 같았다.

균주	OD	아르기닌농도 (g/L)	오르니틴농도 (g/L)	아르기닌Fold (%)
KCCM10741P	91	3.0	0.3	100
KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522	72	3.6	0.4	120
KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522_G77A	69	4.1	0.5	136.7
KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522_G77R	70	4.2	0.5	140
ATCC21831	102	4.2	0.3	100
ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522	86	4.8	0.4	114
ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77A	86	5.4	0.5	128.6
ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77R	88	5.3	0.6	126.2

상기 표 8에 나타난 바와 같이, KCCM10741P 및 ATCC21831에 각각 변이체 NCgl2522_G77A 또는 NCgl2522_G77R를 도입하였을 때, 상기 변이체가 도입된 모든 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산량이 26% 내지 40 % 증가하였음을 확인하였다.

또한, L-아르기닌으로 전환되고 남아 배출된 L- 오르니틴의 농도도, 상기 변이체가 도입된 경우 증가함을 확인하였다. 이로부터 오르니틴을 출발물질로 하여 생합성되는 산물들도 배출할 것으로 해석 될 수 있다.

종합하면, 본 발명자들은 퓨트레신 배출 단백질인 NCgl2522 유전자의 경우 N-말단에서 77 번째 아미노산 잔기가 오르니틴계 산물의 배출능에 핵심적 역할을 한다는 것을 확인하였다. 특히 상기 77 번째 아미노산이 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우, 이러한 변이체가 도입된 균주에서는 오르니틴계 산물의 생산량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 본 출원의 변이체를 미생물을 이용해 오르니틴계 산물을 생산하는 방법에 적용하여 생산량을 보다 향상시킬 수 있으므로, 바이오매스를 활용한 오르니틴계 산물 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 출원에서 퓨트레신 생산 균주에서 퓨트레신 배출능을 증가시키기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주에 NCgl2522 유전자 변이체인 NCgl2522_G77A 염색체 내로 도입하고, 상기 변이체가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 고수율 및 고생산성으로 퓨트레신을 생산할 수 있음을 확인하고, 상기균주를 KCCM11240P NCgl2522_G77A로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 9월 1일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11886P를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 오르니틴계 산물 배출 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 77 번째 글리신 (Glycine) 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 77 번째 글리신이 알라닌 (Alanine) 또는 아르기닌(Arginine)으로 치환된, 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성된, 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 오르니틴계 산물 배출능을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속(the genus Corynebacterium) 미생물.
제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제6항에 있어서, 추가로 오르니틴 디카복실라아제 (ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제6항에 있어서, 추가로 오르니틴 카르바모일 트렌스퍼라아제 (ArgF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제6항에 있어서, 추가로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제 (argJ), 아세틸글루타메이트 키나아제 (ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제6항에 있어서, 추가적으로 퓨트레신 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제12항에 있어서, 추가로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제 (argJ), 아세틸글루타메이트 키나아제 (ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제12항에 있어서, 추가로 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 (ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 아르기니노숙신산 합성효소 (Argininosuccinate synthase, argG),아르기니노숙신산 분해효소 (Argininosuccinate lyase, argH), 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 증가된, 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제12항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
(i) 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및

(ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산방법.
(i) 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및

(ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 아르기닌을 회수하는 단계를 포함하는, 아르기닌 생산방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하거나 이의 활성이 강화된, 오르니틴계 산물을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제18항에 있어서, 추가로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제 (argJ), 아세틸글루타메이트 키나아제 (ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 오르니틴계 산물을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
제18항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 오르니틴계 산물을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
(i) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계;

및 ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 오르니틴계 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 오르니틴계 산물 생산방법.