KR100791659B1

KR100791659B1 - 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법

Info

Publication number: KR100791659B1
Application number: KR1020060065950A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 김혜원; 이지혜; 황수연
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2006-07-13
Filing date: 2006-07-13
Publication date: 2008-01-03
Also published as: WO2008007915A1; JP4864138B2; US20090311757A1; US8034602B2; JP2009542255A; CN101517066A; CN101517066B; EP2041265B8; ATE542886T1; EP2041265A1; EP2041265B1; ES2379018T3; EP2041265A4

Abstract

본 발명은 L-알지닌(L-arginine)을 생산하는 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 CJR0500 및 그를 이용한 L-알지닌 생산방법에 관한 것으로, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 균주의 변이주로서 L-알지닌을 생산하는 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 CJR0500 및 이 미생물을 발효배지에서 30℃에서 16시간 활성화 시킨 후 다시 72시간동안 진탕배양하여 L-알지닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움, 글루타미컴, L-알지닌

Description

알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의 제조방법 {Method for producing L-arginine using Corynebacterium glutamicum}

본 발명은 L-알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 L-알지닌을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 균주의 변이주로서 알파-아미노뷰티릭액시드에 내성을 가지고, 트립토판에 의해 생육이 촉진되는 L-알지닌을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 CJR0500 및 이를 이용한 L-알지닌 생산방법에 관한 것이다.

L-알지닌은 의약품, 식품, 기타 동물사료등에 널리 이용되는 준필수 천연 아미노산의 일종으로 의약용으로는 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

종래에 알려져 있는 생물학적 발효법에 의한 L-알지닌의 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-알지닌을 생산하는 방법으로서 글루타민산 생산균주인 브레 비박테리움 또는 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본공개 소화 57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본공개 소화 59-158185), 재조합 유전자로 형질전환된 균주를 이용하는 방법(일본공개 소화 63-79597, 미국특허 4775623)등이 있다.

본 발명자들은 종래의 상기 균주들보다 수율이 좋은 L-알지닌 생산균주를 얻기 위한 연구를 수행하던 중 글루타민산 생산주를 이용하여, 이로부터 글루타민을 생합성하는 경로를 강화해주는 경우 알지닌 생산능을 높여줄 것이라 기대하였다. 이는 알지닌 생합성시 글루타민산 1분자와 글루타민 1분자가 필요하다는 경로상의 특성에 기인한 것으로 아미노산중 하나인 이소루신의 유사체인 알파-아미노뷰티릭액시드에 대한 내성을 가진 균주가 글루타민 생산능을 높여주기 때문이다(대한민국 특허공개번호 특2002-0038204호). 따라서 설파구아니딘 및 O-디아졸아세틸-L-세린에 내성을 가지는 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10680(대한민국 특허공고번호 제91-7818호)를 모균주로하여 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트에 대한 내성변이주를 구한 결과, 알파-아미노뷰티릭액시드에 대해 내성을 가지지 않는 균주보다 높은 수율로 L-알지닌을 생성한다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 L-알지닌을 생산하고, 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌,알지닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 CJR0500을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이주를 발효배지에서 활성화 시킨 후 다시 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 L-알지닌의 생산방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L-트립토판의 첨가에 의해 알지닌 발효시간이 단축되는 것을 특징으로 하는 변이주 CJR0500를 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 L-알지닌을 생산하고, 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 변이주 CJR0500에 관한 것이다.

변이주를 유도하는 방법은 다음과 같다. 설파구아니딘 및 O-디아졸아세틸-L-세린에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10680에 일반적인 변이처리 방법인 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG:N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin)을 처리한 후 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트가 첨가된 최소배지(주1)에 도말하여 각각에 대해 500mg/L, 500mg/L, 10g/L 내성을 가지는 균주를 획득하였다.

변이주를 유도하는 방법을 좀 더 자세히 설명하면 다음과 같다. 활성화배지(주2)에서 16시간동안 배양하여 활성화된 균주를 121℃에서 5분간 멸균한 종배지( 주3)에서 14시간동안 배양한 후 이중 5ml을 100mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후 NTG를 최종농도 200mg/L가 되게 첨가한 후 20분동안 처리하고, 100mM 인산 완충용액(phosphate buffer)로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 최소배지(주1)에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 85%였다. 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트에 대한 공통 내성 변이주를 구하기 위해서 NTG가 처리된 균주를 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드의 최종농도가 각각 500mg/L, 500mg/L, 10g/L 되게 첨가된 최소배지(주1)에 도말하고 30℃에서 5일간 배양하여 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드의 공통 내성 변이주를 구하였다. 구해진 내성변이주들을 알지닌 생산배지(주4)에서 72시간 진탕용 삼각플라스크에 배양하여 알지닌이 생산되는 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드의 내성 변이주를 선별하였고, 이를 코리네박테리움 글루타미컴 CJR0500이라 명명하였다.

본 출원인은 상기 미생물 코리네박테리움 글루타미컴 CJR0500을 제3자에게 일반 분양될 수 있도록 한국미생물보존센터(KCCM)에 2006년 3월 15일자로 수탁번호 KCCM-10741P로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 변이주를 발효배지에서 30℃에서 16시간 동안 배양하여 활성화시킨 후 다시 72시간 동안 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 L-알지닌의 생산방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법에 의할 때, L-알지닌의 생산이 더욱 증가하였다(실시예 1).

또 다른 양태로서, 본 발명은 L-트립토판의 첨가에 의해 알지닌 발효시간이 단축되는 것을 특징으로 하는 변이주 CJR0500에 관한 것이다.

L-트립토판을 첨가하는 경우, 알지닌의 발효시간이 더욱 단축되어 동일한 시간 내에 L-트립토판을 첨가하지 않은 경우보다 더욱 많은 양의 L-알지닌을 생산할 수 있다(실시예 3).

본 발명 미생물의 특성은 다음과 같다.

(주1) 최소배지:포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산 제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.0001%, 비오틴 200㎍/L, 한천 2%, pH7.0

(주2) 활성화배지: 육즙 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모엑기스 0.5%, 한천 2%, pH7.2

(주3) 종배지: 포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모엑기스 1%, 비오틴 3㎍/L, 요소 0.4%, pH7.0

(주4) 알지닌 생산배지: 포도당 4.0%, 황산암모늄 3%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200㎍/L, pH7.2

NTG를 이용한 돌연변이 유도방법에 의해 알지닌 생산성이 향상된 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드의 내성주인 코리네박테리움 글루타미컴 CJR0500의 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드 에 대한 내성은 다음과 같다(표1).

카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트, 알파-아미노뷰티릭액시드에 대한 내성 비교

균주	카나바닌 농도(mg/L)				알지닌하이드록사메이트 농도(mg/L)				알파-아미노뷰티릭액시드농도(g/L)
균주	0	300	500	800	0	300	500	800	0	1	5	10	20
KFCC-10659	+++	-	-	-	+++	-	-	-	+++	++	+	-	-
CJR0500	+++	+++	++	-	+++	+++	++	-	+++	+++	+++	++	-

한편 최소배지에서 L-트립토판의 농도별 생육도를 확인한 결과, 표2에서와 같이 코리네박테리움 글루타미컴 CJR0500가 L-트립토판을 요구한다는 사실을 확인할 수 있다.

트립토판 첨가에 따른 생육도 비교

균주	트립토판 농도(mg/L)
균주	0	25	50	75	100
KFCC-10659	+++	+++	+++	+++	+++
CJR0500	+	++	+++	+++	+++

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

사용균주: KFCC-10680, CJR0500

발효배지: 포도당 4.0%, 황산암모늄 3%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200㎍/L, pH7.2

(주4와 동일)

발효방법 및 결과: 상기 발효배지 24ml을 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 30℃ 종배지(주3)에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 접종(1ml)하여 30℃에서 72시간동안 진탕배양하였다. 발효 종료액의 결과는 다음과 같다(표 3).

	KFCC-10680	CJR0500
알지닌 농도(g/L)	0.9	2.8

실시예 2

사용균주: KFCC-10680, CJR0500

발효배지: 포도당 10.0%, 황산암모늄 4%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200㎍/L, pH7.2

발효방법 및 결과: 상기 발효배지 24ml을 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 30℃ 종배지(주3)에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 접종(1ml)하여 30℃에서 72시간동안 진탕배양하였다. 발효 종료액의 결과는 다음과 같다(표 4). 다음의 결과로부터 알파-아미노뷰티릭액시드에 대한 내성을 가지는 내성변이주가 내성을 갖지 않는 균주보다 더 높은 수율로 L-알지닌을 생성한다는 사실을 알 수 있다.

	KFCC-10680	CJR0500
알지닌 농도(g/L)	1.0	3.5

실시예 3

사용균주: KFCC-10680, CJR0500

발효배지: 포도당 10.0%, 황산암모늄 4%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200㎍/L, 트립토판 50mg/L, pH7.2

발효방법 및 결과: 상기 발효배지 24ml을 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 30℃ 종배지(주3)에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 접종(1ml)하여 30℃에서 64시간동안 진탕배양하였다. 발효 종료액의 결과는 다음과 같다(표5). 다음의 결과로부터 트립토판 첨가시에 CJR0500 변이주의 생육이 촉진되어 더 빠른 시간에 높은 수율로 L-알지닌을 생성한다는 사실을 알 수 있다.

	KFCC-10680	CJR0500
알지닌 농도(g/L)	0.8	3.45

이상에서 살펴본 바와 같이, 알파-아미노뷰티리액시드에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 CJR0500는 L-알지닌 생산성이 더욱 증가하였다. 또한, L-트립토판을 첨가하는 경우에는 알지닌의 발효시간이 단축되어 동일한 시간 내에 더 많은 양의 L-알지닌을 생산할 수 있어 매우 유용하다.

Claims

L-알지닌을 생산하고, 알파-아미노뷰티릭액시드, 카나바닌, 알지닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM-10741P.
제1항에 따른 미생물 균주 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM-10741P를 발효배지에서 30℃에서 16시간 활성화 시킨 후 다시 72시간 동안 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 L-알지닌의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 변이주는 L-트립토판의 첨가에 의해 생육이 더욱 촉진되는 변이주 KCCM-10741P.