DE60038560T2

DE60038560T2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin

Info

Publication number: DE60038560T2
Application number: DE60038560T
Authority: DE
Inventors: Vehary Sakanyan; Frederic Marc; Anitchika Hovsepyan; Michèle Lecocq
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2020-10-28
Also published as: CN1367244A; EP1201758A9; US6897048B2; CN1367244B; JP4078515B2; EP1201758B1; US20020098555A1; EP1201758A1; JP2002315571A; DE60038560D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur L-Argininherstellung durch Fermentation.
L-Arginin ist eine industriell anwendbare Aminosäure als Inhaltsstoff für leberfunktionsfördernde Mittel, Transfusionslösungen, Nahrungszusätze und dergleichen.
STAND DER TECHNIK
Bei Mikroorganismen verläuft die Biosynthese von L-Arginin in acht enzymatischen Schritten, ausgehend von dem Vorläufer L-Glutamat, und folgt zwei unterschiedlichen Stoffwechselwegen, dem linearen Stoffwechselweg oder dem zyklischen Acetylstoffwechselweg, abhängig von dem betreffenden Mikroorganismus (Cunin et al., 1986; Davis, 1986). Bei beiden biosynthetischen Stoffwechselwegen ist der erste Schritt die N-Transacetylierung von Glutamat, katalysiert durch die Enzyme, die N-Acetylglutamatsynthaseaktivität zeigen.
Bei dem linearen Stoffwechselweg wird die Acetylglutamatsynthaseaktivität bereitgestellt durch das Enzym Acetyl-CoA: L-Glutamat-N-Acetyltransferase (EC 2.3.1.1.), kodiert durch das argA-Gen, und bei diesem Stoffwechselweg wird das Intermediat N-Acetyl-L-Ornithin umgewandelt in L-Ornithin im fünften enzymatischen Schritt über die Deacetylierung durch N²-Acetyl-L-Ornithin-Amidohydrolase (EC 3.5.1.16), kodiert durch das argE-Gen.
Bei Mikroorganismen wie Escherichia coli wird daher L-Arginin synthetisiert aus L-Glutamat über N-Acetylglutamat, N-Acetylglutamylphosphat, N-Acetylglutamatsemialdehyd, N-Acetylornithin, Ornithin, Citrullin und Argininosuccinat. Diese Intermediate werden synthetisiert durch aufeinanderfolgende Reaktionen, katalysiert durch Enzyme, die allgemein bekannt sind unter den Namen N-Acetylglutamatsynthase, N-Acetylglutamatkinase, N-Acetylglutamylphosphatreduktase, Acetylornithinaminotransferase, N-Acetylornithinase, Ornithincarbamyltransferase, Argininosuccinatsynthase und Argininosuccinase. Diese Enzyme werden jeweils kodiert durch argA-, argB-, argC-, argD-, argE-, argF-, argG- und argH-Gene.
Bei dem zyklischen Acetylstoffwechselweg wird die Acetylgruppe von N-Acetylornithin überführt auf L-Glutamat durch das Enzym Ornithinacetyltransferase (N²-Acetyl-L-Ornithin: L-Glutamat-N-Acetyltransferase; EC 2.3.1.35), die kodiert ist durch das argJ-Gen. Aufgrund dieses Enzyms ist der Argininbiosynthesestoffwechselweg rezykliert unter den ersten und fünften enzymatischen Schritten, und solch ein zyklischer Acetylstoffwechselweg ist energetisch vorteilhaft gegenüber dem linearen Stoffwechselweg, da N-Acetylornithin als Acetylgruppendonor verwendet werden kann, wenn der Stoffwechselweg einmal von Acetyl-CoA als einem Donor initiiert ist.
Der zyklische Acetylstoffwechselweg leitet den L-Argininfluß in prokaryotischen Organismen wie Corynebacterium glutamicum (Udaka und Kinoshita, 1958), Cyanobacterien (Hoare und Hoare, 1966), Pseudomonas Aeruginosa (Haas et al., 1972), Neisseria Gonorrhoeae (Shinners und Catlin, 1978), methanogenen Archaea (Meile und Leisinger, 1984), Thermotoga Maritima (Van de Casteele et al., 1990), Vertreter von Bacillus (Sakanyan et al., 1992), Streptomyces Coelicolor (Hindle et al., 1994), Thermus Thermophilus (Baetens et al., 1998), einem Archaeon Methanococcus Jannaschii (Marc et al., 2000) und in einigen eukaryotischen Organsimen (De Deken, 1962). Die Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, welche Ähnlichkeit mit dem argJ-Gen oder seinem Produkt teilen, sind verfügbar für vollständig oder teilweise sequenzierte Genome, und die Ähnlichkeit zeigt die Gegenwart des zyklischen Acetylstoffwechselwegs in diesen Organismen an.
Das argJ-kodierte Produkt, welches nur Ornithinacetyltransferase zeigt, wird als ein monofunktionales Enzym betrachtet, und Eigenschaften solcher Enzyme sind beschrieben worden (Haas et al., 1972; Sakanyan et al., 1996; Baetens et al., 1998; Marc et al., 2000). Einige Mikroorganismen ergeben hingegen die alternative Version des argJ-Gens, das das Enzym kodiert, welches zusätzlich zu der Ornithinacetyltransferaseaktivität die N-Acetylglutamatsynthaseaktivität kodiert. Solche Gene und entsprechende bifunktionale Enzyme sind beschrieben worden für Neisseria Gonorrhoeae (Picard und Dillon, 1989; Martin und Mulks, 1992), B. stearothermophilus (Sakanyan et al., 1990 und, 1993), Saccharomyces cerevisiae (Crabeel et al., 1997), T. neapolitana (Marc et al., 2000).
Die monofunktionalen argJ-Enzyme können unterschieden werden von bifunktionalen Enzymen auf zwei Arten: (i) durch enzymatischen Test unter Verwendung von zwei Acylgruppendonoren, N-Acetyl-L-Ornithin und Acetyl-CoA; (ii) durch Komplementationstest unter Verwendung von argE- und argA-Mutanten von Escherichia coli für das clonierte argJ-Gen. Das monofunktionale ArgJ-Enzym überführt die einzige Acetylgruppe von N-Acetyl-L-Ornithin zu L-Glutamat und komplementiert nur die argE-Mutante, wohingegen das bifunktionale ArgJ-Enzym die Acetylgruppe sowohl von N-Acetyl-L-Ornithin und Acetyl-CoA überführt und sowohl argE- als auch argA-Mutantenstämme ergänzt.
Beide biosynthetischen Stoffwechselwege unterliegen genetischer und enzymatischer Regulation jeweils durch einen spezifischen Transkriptionsrepressor und durch Inhibition von enzymatischen Schritten durch L-Arginin oder intermediäre Produkte (Maas, 1994; Glansdorff, 1996). Des weiteren stehen die frühen metabolischen Schritte, die der L-Glutamatvorläuferbildung vorangehen, und die späten Abbauschritte, die dem L-Argininabbau folgen, unter Kontrolle von Regulationsmechanismen. Die Synthese von L-Arginin und die Herstellungsausbeute dieser Aminosäure können folglich moduliert werden durch Einführung von Mutationen an verschiedenen Zielorten im Genom eines vorgegebenen Mikroorganismus oder durch Beeinträchtigung der Kultivierungsbedingungen eines vorgegebenen Mikroorganismus oder durch beeinträchtigende Membranpermeabilität eines vorgegebenen Mikroorganismus.
Konventionelle L-Argininherstellung durch Fermentation ist ausgeführt worden unter Verwendung von mikrobiellen Stämmen, die L-Arginin erzeugen, speziell Vertreter von coryneformen Bakterien, unter Verwendung von einem corynformen Bakterium, das resistent gegenüber bestimmten antimetabolischen Mitteln ist, einschließlich 2-Thioazoalanin, α-Amino-β-Hydroxyvalerinsäure, Argininhydroxamat, Cysteinanaloga, Sulfonamidderivate und dergleichen, unter Verwendung von einem corynformen Bakterium, das Auxotropie für einige Aminosäuren zeigt, einschließlich für L-Prolin, L-Histidin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Tryptophan als auch unter Verwendung von einem corynformen Bakterium, das beide oben genannten Resistenzen und Auxotropien für Aminosäuren zeigt. In dieser Hinsicht kann Bezug genommen werden auf die folgenden Patente: FR 2 084 059 , 2 119 755 , 2 490 674 , 2 341 648 , 2 225 519 , EP 0 379903 B1 , EP 0 378 223 B1 , EP 0 336 387 B1 .
Andererseits sind Verfahren offenbart worden zur Herstellung von L-Arginin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Art Corynebacterium, Brevibacterium oder Escherichia gehört, transformiert durch rekombinierte DNA, welche ein wohl definiertes Gen der Argininbiosynthese enthält, das es ermöglicht, die genkodierte Enzymaktivität für einen vorgegebenen begrenzenden Schritt zu verstärken. Der Wildtypstamm oder die Mutante für den Transkriptionsrepressor oder die Mutante, welche eine relevante Resistenz oder Auxotropie trägt, sind als rekombinante Wirtszelle für Fermentationen verwendet worden.
Die meisten der rekombinanten Mikroorganismen, die verwendet werden zur Erzeugung von L-Arginin gehören zur Art Corynebacterium oder Brevibacterium. Unter diesem Aspekt kann Bezug genommen werden auf die folgenden Patente: FR 2 143 238 ; FR 2 484 448 ; EP 0 259858 B1 ; EP 0 261627 B1 ; EP 0 332233 A1 ; EP 0 999267 A1 ; EP 1016710 A2 .
Der Escherichia coli K12-Stamm mit dem vollständig sequenzierten Genom (Blattner et al., 1997) und mit Anwendbarkeit bei verschiedenen genetischen Ansätzen und vorteilhafteren Vektoren, um diesen Stamm oder seine Derivate zu manipulieren, ist auch ein attraktiver Wirt für die Herstellung von Aminosäuren einschließlich L-Arginin. Die verstärkte Produktion von L-Arginin durch rekombinante Escherichia coli Stämme kann erzielt werden unter Verwendung des klonierten argA-Gens auf Plasmidvektoren und gefolgt von Isolierung von feedbackresistenten Mutationen durch das für E. coli beschriebene Verfahren (Eckhard and Leisinger, 1975; Rajagopal et al., 1998). Unter diesem Aspekt kann Bezug genommen werden auf EP 1 016 710 A2 .
L-Argininproduktion durch rekombinante Mikroorganismen ist daher verbessert worden durch Verstärkung der Anzahl von Kopien des Gens, das für N-Acetylglutamatsynthaseaktivität kodiert, nämlich ein Wildtyp arg-Gen, oder seiner feedbackresistenten Mutanten.
Die Anwendung des mutanten argA-Gens ist hingegen beschränkt in diesem Zusammenhang auf eine Möglichkeit, die Produktivität des L-Arginins weiter durch rekombinante Stämme zu erhöhen.
Es ist nun gefunden worden, daß es möglich ist, L-Arginin mit einem Mikroorganismus mit L-Argininerzeugervermögen zu erzeugen, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der L-Arginin synthetisiert und eine rekombinante DNA trägt, die ein argJ-Gen umfaßt, das ein Enzym mit einer Ornithinacetyltransferaseaktivität kodiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ergibt einen Mikroorganismus mit L-Arginin-Herstellungsvermögen, der eine rekombinante DNA trägt, die ein argJ-Gen umfaßt, das für ein Enzym mit einer Ornithinacetyltransferaseaktivität kodiert, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Escherichia gehört.
Die vorliegende Erfindung ergibt auch den oben genannten Mikroorganismus, wobei das argJ-Gen für ein monofunktionales oder vorzugsweise für ein bifunktionales Enzym kodiert.
Vorzugsweise kodiert das argJ-Gen für ein mono- oder bifunktionales Enzym, das frei von Inhibition durch L-Arginin ist.
Bevorzugter ist das argJ-Gen abgeleitet aus dem thermophilen Mikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung ergibt auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, umfassend die Schritte des Kultivierens des oben genannten Mikroorganismus in einem Medium, um L-Arginin zu erzeugen und anzureichern und L-Arginin aus dem Medium zu gewinnen.
Der Ausdruck "L-Argininerzeugungsvermögen", der in der vorliegenden Beschreibung benutzt wird, bedeutet das Vermögen des Organismus der vorliegenden Erfindung, L-Arginin in einem Kulturmedium anzureichern, wenn er in dem Medium kultiviert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 sind die Restriktionskarten von Plasmiden pACYC184; pJ-B; pJ-T und pJ-M.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroorganismus mit L-Argininerzeugungsvermögen, bei welchem dieses Vermögen geliefert wird durch das argJ-Gen, das Ornithinacetyltransferase kodiert und darin durch rekombinante DNA-Techniken eingeführt ist.
Bevorzugt sind argJ-Gene, die bei der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, Gene, die Enzyme mit Ornithinacetyltransferaseaktivität kodieren oder Enzyme mit Ornithinacetyltransferase- und N-Acetylglutamatsynthaseaktivitäten, wobei die Aktivitäten von mono- oder bifunktionalen Enzymen frei von Inhibition durch L-Arginin sind.
Das argJ-Gen wird vorteilhaft geliefert von einem thermophilen Mikroorganismus, wie zum Beispiel Methanococcus jannasschii oder Bacillus stearothermophilus oder Thermotoga neapolitana.
Sequenzen dieser Gene sind offenbart in den folgenden Artikeln, die hier als Literaturangaben eingefügt sind:

– argJ of Methanococcus jannaschii: Bult et al., 1996;
– argJ of Bacillus stearothermophilus NClB8224: Sakanyan et al., 1993;
– argJ of Thermotoga neapolitana: Dimova et al., 2000.

Beispiele geeigneter argJ-Gene sind jene, die abgeleitet sind aus Bacillus stearothermophilus NClB8224, ATCC12980, ATCC7953, ATCC10149, Thermotoga neapolitana DSM5068, ATCC49049, Methanococcus jannaschii DSM2661.
Bevorzugte argJ-Gene sind jene, die abgeleitet sind aus Bacillus stearothermophilus oder Thermotoga neapolitana.
Der Mikroorganismus, der L-Arginin erzeugt, ist jeder Mikroorganismus, der in der Lage ist, L-Arginin entweder durch den biosynthetischen linearen Stoffwechselweg oder durch den zyklischen Stoffwechselweg zu erzeugen und welcher das klonierte argJ-Gen darin eingefügt durch Gentechnik beherbergt.
Der Mikroorganismus ist bevorzugt ein Mikroorganismus, der Arginin über den linearen biosynthetischen Stoffwechselweg synthetisiert.
Beispiele von Bakterien der Art Escherichia, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind wie folgt gelistet:
Escherichia coli K12-Stamm und seine Derivate, insbesondere Escherichia coli P4XB2 (Hfr, metB, relA, argR) (Sakanyan et al., 1996). Dieser Escherichia coli P4XB2-Stamm wurde am 9. Oktober 2000 unter Nummer 12571 bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" (CNCM) des Pasteur-Instituts hinterlegt.
Der Wirtsstamm ist vorzugsweise frei von der transkriptionalen Repression (argR^–), die involviert ist bei der Negativ-Kontrolle des L-Arginin-Biosynthesestoffwechselwegs in Mikroorganismen.
Das argJ-Gen wird amplifiziert durch PCR (Polymerasekettenreaktion, siehe White T. J. et al. Trends Genet., 5, 185 (1989)) unter Verwendung geeigneter Primer und danach ligiert mit einem DNA-Vektor gemäß den Verfahren, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Solche Verfahren sind offenbart durch Sambrook et al. in Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989).
Der Vektor, der verwendet wird zur Klonierung von argJ kann ein Plasmid sein, das autonom replizierbar ist in den Mikroorganismen mit einer geringen oder moderaten oder hohen Anzahl von Kopien, ein Beispiel davon ist das Plasmid pACYC184, beschrieben in Sambrook et al., in Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989). Ein Phagen-Vektor kann auch verwendet werden. Die Integration eines argJ-Gens auf die chromosomale DNA des Wirtsbakteriums kann auch ausgeführt werden durch homologe Rekombination ohne Verwendung eines Vektorsystems. Ein autonom-replizierbarer Shuttle-Vektor in unterschiedlichen Mikroorganismen, die L- Arginin synthetisieren, kann auch verwendet werden zur Einführung von argJ in die Wirtszellen, die von Escherichia verschieden sind.
Um rekombinante DNA-Moleküle herzustellen durch Ligieren eines Gens, das ein DNA-Fragment trägt, und eines DNA-Vektors, wird der Vektor verdaut durch Restriktionsenzym(e), entsprechend den Enden des amplifizierten Gens. Ligation wird allgemein ausgeführt unter Verwendung einer Ligase, wie T4DNA-Polynukleotidligase.
Der DNA-Vektor ist bevorzugt ein Expressionsvektor, der vorzugsweise einen Promotor enthält, welcher gefolgt ist von einer Ribosombindungsstelle stromaufwärts des zu exprimierenden Gens. Der Vektor enthält auch einen Replikationsursprung und einen Selektionsmarker.
Der Promotor kann schwach oder moderat oder stark sein. Der letztere wird einer kontrollierten Wirkung unterzogen und ergibt daher eine kontrollierte Genexpression. Geeignete Promotoren sind zum Beispiel tet- oder amp-Promotoren und dergleichen.
Der Selektionsmarker ist vorteilhaft ein Gen, das verantwortlich ist für Resistenz gegen Antibiotika wie Tetracyclin, Ampicillin, Chloramphenicol und dergleichen.
Die rekombinante DNA, die in dem betreffenden Mikroorganismus geeignete Mittel zur Expression des argJ-Gens umfaßt, wird in den Mikroorganismus durch konventionelle Verfahren wie Elektroporation, CaCl₂-vermittelte Transformation und dergleichen eingeführt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Mikroorganismus der Erfindung zusätzlich eine rekombinante DNA beherbergen, die das argA-Gen umfaßt, das für N-Acetylglutamatsynthase kodiert und einen DNA-Vektor, der gemäß den obigen Verfahren hergestellt ist. Das argA-Gen kann genommen werden aus Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas aeruginosa und dergleichen.
Der DNA-Vektor kann weiterhin zusätzlich ein Gen zur Verwendung einer von Glucose verschiedenen Kohlenstoffquelle enthalten, wie ein Gen, das für Sucrase, Levanase, Levansucrase und dergleichen kodiert, vorzugsweise ein Gen, das für Levanase kodiert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von L-Arginin umfaßt die Schritte des Kultivierens des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung in einem Kulturmedium, um die Aminosäure in dem Medium zu erzeugen und anzureichern und die Aminosäure aus dem Medium zu gewinnen.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung des Mikroorganismus, der zur Art Escherichia gehört, Sammeln und Reinigen von Aminosäure aus dem Flüssigmedium ausgeführt werden in einer ähnlichen Weise zu jener der konventionellen Verfahren zur Erzeugung einer Aminosäure durch Fermentation unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums oder Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Ein Medium, das zur Kultivierung verwendet wird, kann entweder eine synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle und Mineralien und, wenn notwendig, Nährstoffe, welche das verwendete Bakterium zum Wachstum erfordert, in geeigneten Mengen umfaßt. Die Kohlenstoffquelle kann verschiedene Kohlehydrate umfassen wie Glucose und Sucrose und verschiedene organische Säuren. Die Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise Sucrose. Abhängig vom Assimilationsvermögen des verwendeten Bakteriums kann Alkohol, einschließlich Ethanol und Glycerin, verwendet werden. Als Stickstoffquelle werden Ammoniak, verschiedene Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat oder Stickstoffverbindungen wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle wie Pepton, Sojabohnenhydrolyt und verdaute fermentative Mikrobe verwendet. Als Mineralien werden Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kalziumcarbonat verwendet.
Die Kultivierung wird bevorzugt ausgeführt unter aeroben Bedingungen wie einer Schüttelkultur und einer Belüftung und Rühren der Kultur. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 20 bis 40°C, vorzugsweise 28 bis 38°C. Der pH der Kultur liegt gewöhnlich zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH der Kultur kann eingestellt werden mit Ammoniak, Kalziumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern. Gewöhnlich führt eine 1- bis 3-tägige Kultivierung zur Ansammlung der vorgegebenen Aminosäure in dem Medium.
Gewinnen von L-Arginin kann ausgeführt werden durch konventionelle Verfahren, zum Beispiel Entfernen von Feststoffen wie Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Membranfiltration nach Kultivierung und dann Sammeln und Reinigen von L-Arginin durch Zonenaustausch, Konzentration und Kristallfraktionierungsverfahren und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter in den folgenden Beispielen offenbart, die nur für veranschaulichende Zwecke angegeben sind.
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION VON PLASMIDEN, DIE DAS argJ-GEN TRAGEN
Die folgenden argJ-Gene, kloniert aus dem moderaten thermophilen Bakterium Bacillus stearothermophilus (Sakanyan et al., 1993) und dem hyperthermophilen Bakterium Thermotoga neapolitana (Dimova et al., 2000) haben jeweils die DNA-Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3, welche für die Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4 jeweils kodieren. Die argJ-Sequenz aus dem hyperthermophilen Archaeon Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996) hat die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 5, welche für das Protein mit der Aminosäure-SEQ ID Nr. 6 kodiert. Die Primer, die den 5'- und 3'-Enden von den drei argJ-Genen entsprechen, abgeleitet aus diesen drei Mikroorganismen, sind synthetisiert worden. Die Oligonukleotide, die dem Anfang des argJ-Gens entsprechen, enthaltend eine GGAG-Shine/Dalgarno-Stelle, haben die folgenden Sequenzen:
BS 5'-GAAGGAGAGTATACCATGACGATCACAAAACAAACGG-3' (SEQ ID Nr. 7)
TN 5'-GAAGGAGAGTATACCATGTTCGTTCCGAGGGGATTCAG-3' (SEQ ID Nr. 8)
MJ 5'-GAAGGAGAGTATACCATGAGAGTTATTGATGGTGGAG-3' (SEQ ID Nr. 9)
Die Oligonukleotide, die dem Ende des argJ-Gens entsprechen, das eine GGATCC BamHI-Stelle enthält, haben die folgenden Sequenzen:
BS 5'-AAAGGATCCTTACGTCCGATAGCTGGCG-3' (SEQ ID Nr. 10)
TN 5'-AAAGGATCCTCATGTCCTGTACCTCCCG-3' (SEQ ID Nr. 11)
MJ 5'-AAAGGATCCTTAAGTTGTATATTCAGCG-3' (SEQ ID Nr. 12)
Amplifikation des argJ-Gens aus verschiedenen DNA-Templaten wurde ausgeführt durch PCR mit DNA-Polymerase Pfu (Stratagene). Die verwendeten Bedingungen waren wie folgt:

Anfängliche Denaturierung 95°C, 5 min

Denaturierung 94°C, 1 min

Annealen 47°C, 1 min 30 Zyklen

Verlängerung 72°C, 2 min

Abschließende Verlängerung 72°C, 7 min 4°C
Die PCR-Produkte wurden nachfolgend phosphoryliert, verdaut mit BamHI und dann vermischt mit dem Plasmidvektor pACYC184, vorverdaut mit dem Enzym EcoRV, dephosphoryliert und dann verdaut mit dem zweiten Enzym BamHI. Nach Ligation mit T4-DNA-Ligase wurden die rekombinanten DNAs überführt auf Escherichia coli K12 XS1D2R-Stamm [F^– Δ(ppc-argE) nalA rpoB λ^– hsdR recA] durch Elektroporation (2500 V, 21 μF, 400 Ω, 10 msec). Die rekombinanten Klone wurden selektiert auf M9-Minimalmedium (Miller, 1992) ohne Arginin, verfestigt mit Agar (1,5%), versetzt mit 0,2% Succinat und das Chloramphenicolantibiotikum enthaltend (25 μg/ml). Die Cm^r ArgE⁺-Kolonien wurden selektiert nach drei Tagen Inkubation bei 37°C und die rekombinanten Plasmide, die das argJ-Gen des entsprechenden thermophilen Mikroorganismus tragen, wurden isoliert für solche Klone. Die erhaltenen Plasmid-DNAs wurden sequenziert, um die klonierten DNA-Sequenzen zu überprüfen und die Plasmide, in welchen die argJ-Gen-Transkription orientiert ist unter Kontrolle des tet-Genpromotors, wurden selektiert. Ihre Restriktionskarten sind gezeigt in 1. Die erhaltenen Plasmide, die das argJ-Gen von Bacillus stearothermophilus, Thermotoga neapolitana oder Methanococcus jannaschii enthalten, wurden jeweils pJ-B, pJ-T und pJ-M genannt.
BEISPIEL 2: GENETISCHE ANALYSEN DER REKOMBINANTEN PLASMIDE
Mit genetischen und enzymatischen Analysen ist es möglich, die beiden Typen des argJ-Enzyms zu erkennen. Das monofunktionale Enzym, welches die einzige Ornithinacetyltransferaseaktivität besitzt, ist in der Lage, die argE-Mutante von Escherichia coli K12 zu vervollständigen, wohingegen das bifunktionale Enzym, welches sowohl Ornithinacetyltransferaseaktivität als auch Acetylglutamatsynthaseaktivität zeigt, in der Lage ist, die argE- und argA-Mutanten von Escherichia coli K12 zu komplementieren.
Die drei Plasmide, die erhalten sind, wurden überführt durch Elektroporation auf Escherichia coli K12 XA4-Stamm, welcher die einzige argA-Mutation trägt und den Doppeltmutantenstamm Escherichia coli K12 XA4::argE, welcher die argA- und argE-Mutationen trägt, unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen. Die rekombinanten Kolonien wurden selektiert auf LB-reichem Medium, das verfestigt ist mit Agar (1,2%) und welches das Chloramphenicol-Antibiotikum enthält (25 μg/ml). 50 Kolonien aus jeder Schale wurden resuspendiert in NaCl-Lösung (0,9%) und dann repliziert auf Schalen mit einem Minimalmedium M9, das verfestigt ist mit Agar (1,2%) und mit oder ohne L-Arginin (150 μg/ml), aber das immer Chloramphenicol (25 μg/ml) enthält. Nach zwei Tagen Inkubation bei 37°C entwickelten sich alle 50 Klone von Escherichia coli K12-Stämmen XA4 (pJ-B), XA4::argE (pJ-B), XA4 (pJ-T) und XA4::argE (pJ-T) auf den beschriebenen selektiven Medien. Keine Kolonien der Escherichia coli K12-Stämme XA4 (pJ-M) und XA4::argE (pJ-M) wuchsen hingegen auf argininfreiem Medium, wohingegen sie deutlich sichtbar nach zwei Tagen auf Medium waren, das versetzt ist mit L-Arginin. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das argJ-Gen von Bacillus stearothermophilus und Thermotoga neapolitana für ein bifunktionales Enzym kodiert, während das argJ-Gen von Methanococcus jannaschii für ein monofunktionales Enzym kodiert.
BEISPIEL 3: ENZYMATISCHE ANALYSE
Die Escherichia coli K12-Stämme XS1D2 (pJ-B), XS1D2 (pJ-T) und XS1D2 (pJ-M) wurden kultiviert in einem M9-Minimalmedium, befreit von Arginin, aber versetzt mit Succinat (0,2%) und Chloramphenicol (25 μg/ml) enthaltend, bei 37°C für 24 Stunden.
Die Zellen wurden dann pelletiert, zweimal gewaschen mit Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 8) und dann lysiert durch Beschallen (15 Minuten pro Puls von 10s bei 19 kHz). Die enzymatischen Aktivitäten wurden gemessen in dem folgenden Puffer: 0,1 M MES, 0,1 M PIPES, 0,1 M Tris, 0,1 M Glycin und 0,1 M K₂HPO₄, unter Verwendung eines Acetylgruppendonors, Acetyl-CoA oder N-Acetylornithin bei 37°C oder bei 70°C, und dann wurde das Reaktionsprodukt, das heißt N-Acetylglutamat, quantifiziert durch HPLC. Die Proben wurden analysiert auf einer Luna C18-Säule (Phenomenex) auf einem HPLC-System (Kontron) unter Verwendung eines Gemisches von 0,1 M Phosphorsäure und Methanol (90:10 v:v) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min als die mobile Phase. Das Reaktionsprodukt wurde detektiert bei 215 nm. Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die drei Enzyme die Ornithinacetyltransferaseaktivität bei 37°C und 70°C besitzen.

Tabelle 1: Ornithinacetyltransferase- und Acetylglutamatsynthaseaktivitäten (μMol·min^–1·mg^–1 Protein), gemessen bei 37°C und 70°C für rekombinante thermostabile argJ-Enzyme

Stamm/Plasmid	37°C				70°C
	Ornithinacetyltransferaseaktivität	Ornithinacetyltransferaseaktivität in Gegenwart von 10 mM of L-Arginin	Acetylglutamatsynthaseaktivität	Acetylglutamatsynthaseaktivität in Gegenwart von 10 mM of L-Arginin	Ornithinacetyltransferaseaktivität	Acetylglutamatsynthaseaktivität
XS1 D2 (pJ-B)	4	4	0.5	0.5	25	2
XS1 D2 (pJ-T)	5	5	0.4	0.4	190	7
XS1 D2 (pJ-M)	4.5	4.5	0	0	165.5	0

Die Acetylglutamatsynthaseaktivität wurde nur detektiert für die Enzyme für Bacillus stearothermophilus und Thermotoga neapolitana bei beiden Temperaturen.
Die Ergebnisse bestätigen, daß die argJ-Enzyme aus Bacillus stearothermophilus und Thermotoga neapolitana tatsächlich bifunktionale Enzyme sind, während jenes aus Methanococcus jannaschii ein monofunktionales Enzym ist. Keine Verminderung der Enzymaktivitäten wurde detektiert durch Zugabe von 10 mM L-Arginin.
BEISPIEL 4: L-ARGININ-HERSTELLUNG DURCH REKOMBINANTE ESCHERICHIA COLI K12 P4XB2-STÄMME
Die Plasmide pJ-B, pJ-T und pJ-M wurden überführt auf den Escherichia coli K12 P4XB2-Stamm durch Elektroporation unter den oben beschriebenen Bedingungen in Beispiel 1. Die entsprechenden Klone wurden ausgewählt auf LB-reichem Medium, verfestigt mit Agar (1,2%) und Chloramphenicol (25 μg/ml) enthaltend. Drei unabhängige Kolonien von jedem rekombinanten Stamm wurden gewählt zur Bewertung der hergestellten Menge an L-Arginin bei den Fermentationen. Für diesen Zweck wurden die Kolonien, die aus den Schalen genommen wurden, resuspendiert in einem LB-Medium, das Chloramphenicol enthält, und kultiviert bei 30°C bis die optische Dichte 0,8 bei 600 nm erreichte. 1 ml dieser Vorkultur wurden zugegeben zu 14 ml Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 2.8% of (NH₄)₂SO₄, 0.2% K2HPO₄, 0.5% Hefeextrakt, 0.05% MgSO₄, 0.001% FeSO₄, 0.001% MnSO₄, 10 μg/ml Thiamin, 100 μg/ml Methionin, 5% Glucose, 2.5% CaCO₃, 25 μg/ml Chloramphenicol; pH 7.2. Die Fermentation wurde ausgeführt in 750 ml konischen Kolben mit einem Kreisschüttler bei einer Geschwindigkeit von 320 rpm bei 30°C für 40 Stunden. Nach Fermentation wurden die Proben gewonnen und die Menge an L-Arginin wurde bewertet gegen einen L-Arginin-Kalibrierungsmaßstab, entweder durch Papierchromatographie oder durch Dünnschichtchromatographie und Entwicklung mit 0,5% Ninhydrin, gelöst in Aceton oder durch Spectrophotometrie oder durch einen Aminosäureanalysator. Die Ergebnisse dieser Fermentation sind gezeigt in Tabelle 2.
Tabelle 2: Herstellung von L-Arginin durch Escherichia coli K12 P4XB2-Stamm und seine rekombinanten Derivate, die das clonierte argJ-Gen ergeben.

Stamm/Plasmid L-Arginin (g/l)

P4XB2 < 0.2

P4XB2 (pJ-M) 0.5

P4XB2 (pJ-B) 9.0

P4XB2 (pJ-T) 9.0
Die Ergebnisse zeigten, daß alle argJ-tragenden Plasmide das Vermögen besitzen, die Ausbeute von L-Arginin in Escherichia coli K12 Wirtszellen zu erhöhen. Dieses Produktionsniveau von L-Arginin in Escherichia coli ist offensichtlich viel größer als in jenen Stämmen, welche pJ-B- oder pJ-T-Plasmide enthalten, verglichen mit den Escherichia coli K12-Stämmen, welche das pJ-M-Plasmid enthalten. Dies zeigt, daß die Expression des Gens, das für das bifunktionale ArgJ-Enzym kodiert, eine größere Produktionsausbeute von L-Arginin verglichen mit dem Gen sicherstellt, das für ein monofunktionales ArgJ-Enzym kodiert.
BEISPIEL 5: SYNTHESE VON L-ARGININ IN DEM ESCHERICHIA COLI K12-STAMM, DER ZWEI PLASMIDE TRAGT
Das Plasmid pARG2S macht es möglich, L-Arginin in Escherichia coli K12 zu erzeugen. Dieses Plasmid trägt das argA-Gen aus Escherichia coli K12 und das Levanase-Gen (sacC) aus Bacillus subtilis Marburg 168 auf dem pBR327-kan-Vektor. Das Wildtyp-argA-Gen aus Eschericia coli K12 wurde kloniert durch Komplementieren der argA-Mutante von Escherichia coli K12 (Nersisyan et al., 1986). Das sacC-Gen aus Bacillus subtilis Marburg 168 wurde selektiert in der pQB79,1 Cosmid-Bank (Fouet et al., 1982) unter Verwendung eines M9-Minimalmediums, das Sucrose als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Das sacC-Gen, identifiziert mit einem 6,7 kb EcoRI-HindIII-DNA-Fragment, wurde eingefügt in das Plasmid pBR327-kan, verdaut durch EcoRI und HindIII. Dann wurde ein 1,5 kb BamHI-SalI-DNA-Fragment, das argA trägt, eingefügt in das erhaltene Plasmid, das verdaut ist durch BamHI und SalI durch Selektion von rekombinanten Klonen, die das pARGS2-Plasmid tragen. Das pARGS2-Plasmid stellt das Wachstum von Escherichia coli K12 argA Mutantenzellen auf einem selektiven Medium M9 mit Sucrose als einziger Kohlenstoffquelle sicher ohne oder mit L-Arginin.
Plasmide pJ-B, pJ-T und pJ-M wurden überführt auf Escherichia coli K12 P4XB2 (pARGS2)-Stamm und die rekombinanten Klone wurden selektiert auf LB-Medium, das zwei Antibiotika enthält, Chloramphenicol (25 μg/ml) und Kanamycin (40 μg/ml). Drei Kolonien jedes transformierten Stammes des Originalstammes wurden getestet auf die Produktion von L-Arginin unter den Bedingungen, die in Beispiel 4 verwendet sind, außer daß das Medium nur das Kanamycin (40 g/ml) für Escherichia coli K12 P4XB2 (pARGS2) oder Kanamycin zusätzlich zu der Zusammensetzung enthielt, die für die transformierten Klone beschrieben ist.
Die Ergebnisse der Fermentationen sind angegeben in Tabelle 3.
Tabelle 3: Herstellung von L-Arginin durch Escherichia coli K12 P4XB2-Stamm, der das Plasmid pARGS2 allein oder in Kombination mit pJ-M, pJ-B oder pJ-T trägt.

Stamm/Plasmid L-Arginin (g/l)

P4XB2 < 0.2

P4XB2 (pARGS2) 6.5

P4XB2 (pARGS2/pJ-M) 7.0

P4XB2 (pARGS2/pJ-B) 13

P4XB2 (pARGS2/pJ-T) 13
Diese Ergebnisse zeigen, daß die konkomitante Gegenwart von jedem der drei Plasmide, die das argA-Gen tragen, zusammen mit dem pARGS2-Plasmid in demselben Escherichia coli-Wirtsstamm eine höhere Herstellung von L-Arginin ergibt. Die L-Arginin-Ausbeute ist hingegen größer in Escherichia coli K12 P4XB2-Stamm, der pARGS2 und pJ-B oder pJ-T-Plasmide ergibt, als in dem Escherichia coli K12 P4XB2-Stamm, der pARGS2 und pJ-M-Plasmide beherbergt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Koexistenz des argJ-Gens (des pARGS2-Plasmids) mit dem argJ-Gen, das für das bifunktionale Enzym Ornithinacetyltransferase (die pJ-B oder pJ-T-Plasmide) in demselben Stamm kodiert, eine größere Ausbeute von L-Arginin sicherstellt als das argJ-Gen, das für ein monofunktionales Enzym (das pJ-M-Plasmid) kodiert.
BEISPIEL 6: HERSTELLUNG VON L-ARGININ IN EINEM FERMENTATIONSMEDIUM, DAS SUCROSE ENTHÄLT.
Das Plasmid pARGS2 ermöglicht es den Escherichia coli K12-Stämmen, Sucrose als Kohlenstoffquelle zu konsumieren. Der Wildtyp Escherichia coli K12 Stamm und seine Derivate sind natürlich nicht in der Lage, sich in einem Minimalmedium, in welchem Glucose durch Sucrose ersetzt ist, zu entwickeln.
Die in Beispiel 5 beschriebenen Stämme wurden verwendet, um Fermentationen für die Herstellung von L-Arginin unter Bedingungen auszuführen, die oben beschrieben sind, außer daß Glucose ersetzt wird mit Sucrose (6%) und die Kultivierung für 44 Stunden fortgesetzt ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4: Herstellung von L-Arginin durch rekombinante Escherichia coli K12 P4XB2 Stämme auf Sucrose-enthaltendem Fermentationsmedium

Stamm/Plasmid L-Arginin (g/l)

P4XB2 < 0.2

P4XB2 (pARGS2) 8.5

P4XB2 (pARGS2/pJ-M) 8.5

P4XB2 (pARGS2/pJ-B) 14.0

P4XB2 (pARGS2/pJ-T) 14.0
Die Ergebnisse zeigen erneut, daß das bifunktionelle argJ-Enzym, verglichen mit dem monofunktionellen Enzym, höhere Ausbeuten für L-Arginin in Escherichia coli K12-Stämmen ergibt, die das zweite Plasmid pARGS2 mit dem argA und das Sucrose verbrauchende Gen sacC tragen, bei der Fermentation in einem Medium, in welchem Glucose durch Sucrose ersetzt ist.
LITERATURANGABEN

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SEQUENZPROTOKOLL
ÜBERSETZUNG DES TEXTES IN DEN ZEICHNUNGEN

1

PCR with creation of BamHI and EcoRV sites at extremities

PCR mit Erzeugung von BamHI- und EcoRV-Stellen an den Enden

Claims

Mikroorganismus mit L-Arginin-Herstellungsvermögen, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der L-Arginin synthetisiert und eine rekombinante DNA trägt, die ein argJ-Gen umfaßt, das für ein Enzym mit einer Ornithinacetyltransferaseaktivität kodiert, wobei der Mikroorganismus frei von Argininrepression ist und zur Gattung Escherichia gehört.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das argJ-Gen für ein bifunktionales Enzym mit sowohl Ornithinacetyltransferaseaktivität als auch Acetylglutamatsynthaseaktivität kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 1 bis 2, wobei das Enzym frei von Inhibition durch L-Arginin ist.
Mikroorganismus mit L-Arginin-Herstellungsvermögen, wobei der Mikroorganismus L-Arginin synthetisiert und eine rekombinante DNA trägt, die ein argJ-Gen umfaßt, das für ein bifunktionales Enzym mit einer Ornithinacetyltransferaseaktivität und Acetylglutamatsynthaseaktivität kodiert, wobei der Mikroorganismus frei von Argininrepression ist und zur Gattung Escherichia gehört.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das argJ-Gen aus einem thermophilen Mikroorganismus abgeleitet ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das argJ-Gen abgeleitet ist aus dem thermophilen Mikroorganismus, der zur Spezies Bacillus stearothermophilus und Thermotoga neapolitana gehört.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus kultiviert wird mit Glucose als Kohlenstoffquelle und eine weitere rekombinante DNA beherbergt, die ein argA-Gen umfaßt, das für die N-Acetylglutamatsynthase kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 3, welcher eine weitere rekombinante DNA beherbergt, die ein argA-Gen umfaßt, das für die N-Acetylglutamatsynthase kodiert.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die rekombinante DNA eine Plasmid-DNA mit einer geringen oder moderaten Anzahl von Kopien ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Enzym mit Ornithinacetyltransferaseaktivität wie dargelegt in SEQ-ID Nr. 2 ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der Escherichia coli K12-Stamm ist oder seine Derivate.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welcher Escherichia coli P4XB2 wie hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" (CNCM) des Pasteur-Instituts am 9. Oktober 2000 unter der Nummer 12571, ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, umfassend die Schritte des Kultivierens des Mikroorganismus wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem Kulturmedium, um L-Arginin in dem Medium zu erzeugen und anzureichern und welches L-Arginin aus dem Medium gewinnt.