KR101174267B1

KR101174267B1 - Ｌ-오르니틴 또는 ｌ-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101174267B1
Application number: KR1020100000726A
Authority: KR
Inventors: 조진만; 김혜원; 이지혜; 조재용
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2010-01-06
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2012-08-14
Also published as: US8883460B2; EP2522720A2; JP2013512687A; BR112012016535B1; CN102712910B; US20130023016A1; ES2672894T3; WO2011083933A2; WO2011083933A3; BR112012016535A2; JP5732469B2; KR20110080475A; CN102712910A; EP2522720B1; EP2522720A4

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 오르니틴 또는 아르기닌 생합성과 관련된 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제에 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-오르니틴 또는 L-아르기닌 생산 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환체는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제의 활성이 내재적 활성 보다 강화됨으로써 고수율로 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｌ-오르니틴 또는 Ｌ-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법{Corynebacterium glutamicum Variety Producing L-ornithine or L-Arginine and Method for Fabricating the Same}

본 발명은 Ｌ-오르니틴 또는 L-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 오르니틴 또는 아르기닌 생합성과 관련된 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제에 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-아르기닌 생산 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 사람의 의약에 사용되는데, 특히 약학 산업, 식품 산업 및 동물 영양보급에 사용된다. 특히, L-아미노산 중 L-오르니틴은 아르기닌 생합성 과정의 중간 물질로 간기능을 촉진시키는 의약성분으로 알려져 있다 (Salvatore et al., 1964). 또한 L-아르기닌은 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있으며, 아미노산류 강화제로도 사용되고, 의약품, 식품 등에도 널리 이용된다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강 음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

코리네형 세균(Coryneform bacteria), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 균주의 발효에 의해 아미노산을 생산할 수 있다. 그 중요성이 크기 때문에 그 제조 방법은 지속적인 개선이 이루어지고 있으며, 예를 들어, 교반 및 산소 도입, 또는 발효 중의 당 농도와 같은 배양 배지 조성에 대한 방법적 개선이 이루어지고 있다.

이들 미생물의 아미노산 생산성을 증가시키기 위해, 미생물 선별 및 변이체 선별법이 사용된다. 이런 식으로, 항대사물질에 내성이거나 조절 관련성을 갖는 대사물질들에 대한 영양 요구성이고 L-아미노산을 생산하는 균주가 얻어진다. 예를 들면, 글루타민산(glutamate) 생산 균주인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하여 오르니틴을 생산하는 방법 (EP 0 393 708 A3)이 보고되었다. 또한, 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로서, 글루타민산(glutamate) 생산 균주인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본공개특허 소화 제57-163487호, 제60-83593호, 제62-265988호)이 보고되었다.

재조합체 DNA 기술은 코리네박테리움의 L-아미노산 생산 균주의 고유한 성질을 개선하기 위해 추가로 사용되는 방법이다. 예를 들면, 아르기닌과 프롤린 합성을 하지 못하는 균주에 오르니틴 생합성 유전자인 argCJBD를 증폭한 균주를 이용한 방법이 있다 (Hwang et al., 2008). 또, 아르기닌 생합성 오페론의 발현을 억제하는 유전자 argR을 불활성화시킨 유전자 재조합 균주를 이용하는 방법(미국특허출원 제2002/0045223A1호) 이 보고되어 있다.

한편, 개선된 생산능 증가는 또한 생합성 유전자의 강화에 의해 달성된다. 생합성 유전자의 증가된 발현에 의해 수율이 향상될 수 있다는 것은 알려져 있다. 예를 들어, 아르기닌 생합성 유전자인 argF를 과발현(over-expression)시키는 방법(대한민국 특허출원 제10-2004-107215호) 이 보고되어 있다.

또한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 아르기닌 생합성에 관련된 아세틸오르니틴 아미노기 전이효소의 유전자로 추정되는 argD2 유전자(Ncgl2355) 또는 유전자(Ncgl0990) 를 과발현시켜 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 L-아르기닌의 제조 방법이 개시되어있다(대한민국 등록특허 제10-0830289호 및 제10-0830290호).

이와 같이 고수율의 오르니틴 또는 아르기닌 생산주를 만들기 위해 생합성 유전자의 강화가 필요하고 특히 생합성 효소인 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제를 강화해줄 필요가 있다.

그러나 코리네박테리움 속 미생물에서 현재까지 보고된 바로는 아세틸글루타메이트 신타아제 유전자가 알려져 있지 않기 때문에 본 발명자들은 아세틸글루타메이트 신타아제의 기능을 수행하는 유전자를 규명하였다. 동시에 본 유전자가 argJ에 의해 암호화되는 아세틸오르니티나제와 유사한 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또, 본 유전자를 강화함으로써 오르니틴 또는 아르기닌의 농도가 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 코리네박테리아 속 유래의 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니티나제의 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리 뉴클레오티드를 신규 규명하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 과발현 시켜 오르니틴 또는 아르기닌 생산능이 향상된 균주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 오르니틴 또는 아르기닌을 고농도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제의 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공하는데 있다.

본 발명에서는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제를 암호화하는 유전자를 규명하기 위해 일반이 접근가능한 데이터베이스인 "National Insititute of Health"에 기탁된 유전자 번호 Ncgl1469가 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제를 암호화하는 것을 확인하였다. 아세틸글루타메이트를 암호화하는 유전자에 대해서는 알려진 바가 없었고, 아세틸오르니티나제는 argJ에 의해 암호화 된다고 보고 되었다 (Sakayan et al., 1996). 하지만 Ncgl1469 유전자가 두 가지 효소를 암호화하는 것에 대한 보고는 이전에는 알려져 있지 않았다. 아미노산 서열은 서열번호 1에 열거되어 있고, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 열거되어 있다.

본 발명의 또 하나의 양태는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다. 상기 벡터는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제 유전자를 포함한다. 상기에서 사용될 수 있는 플라스미드는 pZ1 (menkel et al), pEkEx1 (Eikmarms et al), pHS2-1 (Sonnen et al), pCG4 (U.S pat. No. 4,489,190), pNG2 (Serwold-Davis et al) 또는 pEKO (Eikmanns et al) 등이 가능하다. 바람직하게는 본 발명에서는 pEKO를 사용하였다. 더욱 바람직하게 당해 벡터는 서열번호 1의 아미노산 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드를 포함한다. 구체적으로 도 1에 나타나는 벡터를 예로 들 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제가 강화된 미생물 또는 형질전환된 세포 또는 재조합 세포를 제공하는데 있다. 사용된 균주는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제의 강화 이전에 이미 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 생산하는 균주를 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 임의의 형질전환 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명에서 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

일반적으로 형질전환방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

구체적으로 본 발명에서는, 전기천공법을 이용하여 상기 재조합 벡터 pEK-Ptrc::1469를 숙주미생물에 도입하여 형질전환체를 제조하였으며, 항생제 내성을 이용하여 재조합 벡터를 포함하는 균주를 분리하였다.　

본 발명에서 "내재적 활성보다 강화"라는 개념은 상기에서 언급한 효소인 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제의 세포내 활성이 천연적으로 가지는 활성에 비해 향상된 것을 의미한다. 효소의 활성을 높이기 위한 방법으로는 유전자 복제수를 높이는 것일 수 있다. 유전자의 복제 수를 높이기 위해서는 플라스미드와 같은 벡터를 이용하는 방법 또는 염색체에 추가적인 유전자를 삽입하는 방법이 사용될 수 있다. 또, 유전자 발현에 긍정적인 영향을 주는 조절 인자를 강화시킴으로써 더욱 높일 수 있다. 그래서 조절 인자 요소는 전사 수준에서 강화시킬 수 있으며, 특히 강화된 전사 신호에 사용된다. 상기 이외에도 또한 번역이 강화될 수 있으며, 이로 인하여 예를 들면 mRNA 의 안정성도 향상된다. 또한 높은 활성을 가지는 해당 효소로 코드화되는 유전자도 사용될 수 있다. 또한 해당하는 유전자의 과발현은 배지 조성을 변화시킴으로써 도달할 수 있다. 또 다른 방법으로는 프로모터를 강화시키는 것 또는 더 강한 프로모터를 교체하는 방법일 수 있다. 강한 프로모터로 사용할 수 있는 것은 예를 들어, Tac-프로모터 (Amann et al)을 사용할 수 있다. 효소의 활성을 높이기 위한 다른 방법으로는 돌연변이를 통하여 미생물에서 내인적 활성을 높이는 방법이 가능하다. 상기 종류의 돌연변이는 예를 들면, UV 광선 또는 돌연변이 해소 화학물질과 같은 전통적인 방법 또는 결실, 삽입 및/또는 뉴클레오티드 교환과 같은 유전공학적 방법으로 발생시킬 수 있다. 효소의 활성을 강화시키기 위해서는 상기에 언급한 조치를 모두 가능하게 조합하는 것이 가능하다.

본 발명에 따르면, 코리네형 세균 중에서 코리네 속 또는 브레비 속 박테리움이 사용될 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유형의 적합한 출발 균주는, 예를 들면 다음의 공지의 야생형 균주들이다. 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼(corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 써모아미노제네스(corynebacterium thermoaminogenaes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020 그리고 그들로부터 만들어진, 오르니틴 생합성 경로에 관여하는 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 결손, 알지닌 리프레서 결손 및 글루타메이트 키나제가 결손된 과량의 L-오르니틴을 생산하는 변이체 또는 알지닌 생합성에 관여하는 알지닌 리프레서가 결손된 과량의 L-아르기닌을 개선된 농도로 생산하는 변이체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로써, 상기 기술된 미생물을 L-오르니틴 또는 L-아르기닌의 생산을 목적으로 배양할 수 있다. 상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-아르기닌 메티오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다. 배양물로부터의 L-오르니틴 또는 L-아르기닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 오르니틴 또는 아르기닌 생합성과 관련된 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제에 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 L-아르기닌 생산 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 형질전환체는 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제의 활성이 내재적 활성 보다 강화됨으로써 고수율로 L-오르니틴 또는 L-아르기닌을 생산할 수 있으므로 생물의약 산업상 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 pEK-Ptrc::Ncgl1469 벡터의 구조를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: Ncgl1469 클로닝

본 실시예에서는 과발현 벡터를 제작하기 위해 먼저 trc 프로모터를 pTrc99A (Amann et al. 1988)을 주형으로 하고 서열 번호 3 및 4번의 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 또, rrnB 터미네이터를 pTrc99A를 주형으로 하고 서열 번호 5 및 6번의 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)이고, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 1분을 25회 반복하였다. NIH GenBank를 근거로 하여 NCgl1469 유전자의 염기서열 정보를 확보하고, 이에 근거하여 프라이머를 합성하였다(서열 번호 7 및 8). 합성한 프라이머를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 유전자 DNA를 주형으로 하여 PCR을 위와 동일한 방법으로 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 1분 30초를 25회 반복하였다.

pEKO (E.coli-C.glutamicum shuttle vector, Eikmanns et al.1991) 벡터를 XbaI으로 제한효소 처리하였다. 상기에서 얻어진 ptrc 프로모터 분획과 1469 ORF를 Xba1, NdeI / NedI 및 xba1으로 각각 제한효소 처리한 후, 효소 처리된 벡터와 3조각 접합하여 재조합 벡터를 얻었다. 얻어진 재조합 벡터를 HincII과 EcoRI으로 다시 효소 처리하고, PCR을 이용하여 획득한 rrnB 터미네이터 분획을 SmaI/EcoRI 제한 효소로 처리하여 프로모터 - 1469 ORF - 터미네이터가 삽입된 pEK-Ptrc::1469 재조합 벡터를 획득하였다.

실시예 2 : Ncgl1469 과발현

상기 실시예 1에서 클로닝한 Ncgl1469 유전자의 활성을 확인하기 위해 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 argJ가 파쇄된 균주를 제작할 필요가 있다. argJ가 결손된 균주를 제작하기 위해서 pK18mobsacB 인터그레이션(intergration) 벡터(Schafer et al.1994)를 이용하였다. ATCC13032를 주형으로 하여 각각 서열번호 7 및 8과 9 및 10의 서열을 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 1분 30초를 25회 반복하였다. pK18mobsacB 벡터를 XbaI으로 제한효소 처리한 후, 얻어진 두 개의 PCR 분획을 각각 XbaI/ApaI, ApaI/XbaI으로 처리하여 3조각 접합으로 재조합 벡터를 제작하였다.

제작된 재조합 벡터를 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 형질전환한 후 카나마이신 (kanamicin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 뉴클레오티드와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양배지에서 진탕 배양 (30℃, 4시간) 한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10으로 자당(sucrose)을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 자당에 의해 사멸하고 낮은 비율로 나타나는 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 서열 번호 7 과 10의 서열을 이용한 PCR을 통하여 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 선정되었다.

실시예 3: Ncgl1469의 아세틸글루타메이트 신타아제 및 아세틸오르니티나제 활성 측정

상기 실시예 2에서 선정된 균주를 액체 배지에서 배양한 후, 원심분리하여 균체를 모았다. 균체는 100mM Tris/Hcl buffer (pH 7.5)에 2번 세척하여 준비하고, 유리 비드를 이용한 방법으로 세포벽을 제거하였다.

기존에 알려진 방법에 따라 분광흡광기를 이용하여 412nm에서 5-thio-2-nitrobanzonate의 형성양을 측정하여(Errey and Blanchard, 2005) 아세틸글루타메이트 활성을 측정하였다. 아세틸오르니티나제의 활성 또한 종래의 방법(Vogel and Mcleelan , 1970)에 의해서 측정하였다.

위의 방법을 통해서 ATCC13032, argJΔ 균주에 pEKO 벡터, pEK-Ptrc::1469 을 과발현시킨 균주의 활성을 각각 측정한 결과는 아래 표1과 같다.

균주	플라스미드	특이 활성(units/mg protein)^*
		아세틸글루타메이트 신타아제^a	아세틸오르티네이즈^b
C. glutamicum argJ	pEK0	0.03	ND
	pEK-P_trc::1469	0.17	0.07

아세틸오르니티나제를 암호화하는 것으로 보고된 argJ가 결손된 균주를 제작하여 Ncgl1469을 과발현시키고 아세틸글루타메이트 및 아세틸오르니티나제 활성을 측정한 결과 Ncgl1469가 두 효소에 대한 활성을 갖는 것을 확인하였다.

실시예 4: SJ8073-pEK-Ptrc::1469 균주의 오르니틴 생산

Ncgl1469 유전자가 과발현된 균주의 오르니틴 생산능을 확인하기 위해서 오르니틴 생산주인 SJ8074 (argF-argR-proBΔ, Hwang et al. 2008) 균주를 모균주로 사용하였다.

균주는 0.8 g/L KH₂PO₄, 10g/L (NH₄)₂SO₄, 1g/L MgSO₄?7H₂O, 1.2 g/L Na₂HPO₄, 2 mg/L MnSO₄?H₂O, 10 mg/L ZnSO₄?7H₂O, 10 g 효모 추출물, 20g/L CaCO₃, 60g/L 포도당 및 10 mM IPTG 를 넣고 250 mL 배플 플라스크에서 진탕 배양하였다. 배양액 중의 오르니틴 농도는 아래 표2와 같다.

균주	플라스미드	l-오르니틴 농도 (mg/l)^a
		글루타메이트 (0 mM)	글루타메이트 (50 mM)
C. glutamicum SJ8074	pEK0	137.57	145.27
	pEK-P_trc::1469	178.81	207.84

오르니틴 생산균주인 SJ8074균주에 Ncgl1469를 과발현시킨 결과 오르니틴 생산량이 약 20% 이상 증가하였음을 확인하였다.

재조합 벡터 pEK-Ptrc::Ncgl1469를 C. glutamicum SJ8074균주에 도입하여 얻은 형질전환체를 Corynebacterium glutamicum CA06-0020라 명명하고, 2009년 12월 23일자로 한국미생물보존센터 (Korean Culture center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM　11057P로 기탁하였다.

실시예 5: ATCC21831, argR Δ - pEK-Ptrc::1469 균주의 아르기닌 생산

TL2 유전자가 과발현된 균주의 아르기닌 생산능을 확인하기 위해서 아르기닌 생산 균주인 ATCC21831 균주의 아르기닌 억제인자인 argR을 파쇄한 균주를 제작하여 모균주로 사용하였다.

균주는 0.8 g/L KH₂PO₄, 10g/L (NH₄)₂SO₄, 1g/L MgSO₄?7H₂O, 1.2 g/L Na₂HPO₄, 2 mg/L MnSO₄?H₂O, 10 mg/L ZnSO₄?7H₂O, 10 g 효모 추출물, 20g/L CaCO₃ 및 60g/L 포도당을 넣고 250 mL baffled flask 에서 진탕 배양하였다. 배양액 중의 아르기닌 농도는 아래 표 3과 같다.

균주	플라스미드	l-아르기닌 농도(mg/l)^a
		IPTG (0 mM)	IPTG (10 mM)
ATCC21831 argRΔ	pEK0	1.42	1.39
	pEK-P_trc::1469	1.39	1.56

아르기닌 생산 균주인 ATCC21831-argRΔ 균주에 Ncgl1469를 과발현 시킨 결과 아르기닌 생산량이 약 10% 증가하였음을 확인하였다.

재조합 벡터 pEK-Ptrc::Ncgl1469를 ATCC21831 argRΔ 균주에 도입하여 얻은 형질전환체를 Corynebacterium glutamicum CA06-0021라 명명하고, 2009년 12월 23일자로 한국미생물보존센터 (Korean Culture center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM　11058P로 기탁하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.　　

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11057P

20091223

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11058P

20091223

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열로 암호화되는 아세틸글루타메이트 신타제 및 아세틸오르니티나제의 활성이 강화되어 L?오르니틴 또는 L?아르기닌의 생산능이 증가된 것이 특징인 형질전환체 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 형질전환체 코리네박테리움 속 미생물.
삭제
제4항 기재의 형질전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 속 미생물을 배양하는 단계와; 상기 미생물로부터 L?오르니틴 또는 L?아르기닌을 회수하는 단계를 포함하는 L?오르니틴 또는 L?아르기닌의 제조방법.