CN114990039B - 一种利用半乳糖原料合成l-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

一种利用半乳糖原料合成l-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用半乳糖原料合成L‑鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用。所述重组菌为在谷氨酸棒杆菌中表达乳酸菌来源的半乳糖变位酶、半乳糖激酶、半乳糖‑1‑磷酸尿苷转移酶和UDP半乳糖4‑差向异构酶，使其可以代谢半乳糖。本发明构建的半乳糖到L‑鸟氨酸的合成路径，使谷氨酸棒杆菌能够利用含半乳糖粗原料中的半乳糖合成L‑鸟基酸，并且有利于生物质资源的开发利用，在降低L‑鸟氨酸生产成本的同时有效减少了工农业废弃物的浪费。

Description

一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用。
背景技术
L-鸟氨酸是一种非必需氨基酸，具有补充营养、缓解生理疲劳、保肝护肝、控制肿瘤扩增等多重功效。除此之外，L-鸟氨酸在人体内参与尿素循环，可转化为精氨酸，满足婴幼儿生长需要，同时可以促进伤口愈合，提高机体免疫力，因此被广泛应用于食品、医药与保健品行业。相比于提取法、化学合成法、精氨酸水解法，微生物发酵法生产L-鸟氨酸条件成熟、环境污染小、成本相对较低、产量提高潜力大，是目前最具发展前景的L-鸟氨酸生产方式。
谷氨酸棒杆菌生长迅速且可以在细胞外积累L-谷氨酸，多用于工业生产谷氨酸衍生氨基酸(如L-鸟氨酸、L-瓜氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸等)。在氨基酸工业生产中，谷氨酸棒杆菌均使用以淀粉或大米等粮食为原料生产的葡萄糖作为唯一碳源，造成粮食的大量消耗，较高的生产成本也不利于氨基酸工业生产规模的扩大。
近年来，随着化石能源的减少和环境污染的增加，寻找能够替代化石能源等一次性能源的新型可再生能源迫在眉睫。生物质能是以生物质为载体储存化学能的一种可再生能源，具有廉价、清洁、储量丰富、分布广泛的特点，其利用以植物、动物粪便和工农业废弃物为主。我国是豆制品、乳品消耗和产糖大国，工业制造过程中会产生大量的豆渣、乳清废水和糖蜜等废弃物。这些副产物营养丰富，水解可得大量半乳糖及其他未利用成分，直接排放会造成环境污染和生物质资源浪费问题。若能将其作为微生物发酵的碳源，不但能降低对环境的影响，还能带来一定经济价值。在实际工业生产中，这些廉价原料已经应用于乙醇、柠檬酸等产品的发酵。
由于细胞内缺少分解半乳糖的酶，野生的谷氨酸棒杆菌不能利用半乳糖。因此通过代谢工程改造使其能够利用半乳糖是谷氨酸棒杆菌利用豆渣、糖蜜等廉价发酵的前提。目前还没有对谷氨酸棒杆菌进行半乳糖代谢途径的构建以共利用葡萄糖和半乳糖双碳源发酵生产L-鸟氨酸的报道，因此建立一种在谷氨酸棒杆菌中利用半乳糖合成L-鸟氨酸的方法对鸟氨酸生产工业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用方法，可以有效解决谷氨酸棒杆菌发酵底物单一问题、降低L-鸟氨酸的生产成本。
本发明的出发菌株是L-鸟氨酸生产菌株C.glutamicum jp-07092，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15856。
本发明实现谷氨酸棒杆菌中利用半乳糖合成L-鸟氨酸的构建是通过以下技术方案实现的：
细胞内的β-D-半乳糖首先在半乳糖变位酶GalM的催化下转化为α-D-半乳糖。随后在谷氨酸棒杆菌中表达异源的半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶和UDP半乳糖4-差向异构酶，使α-D-半乳糖先被半乳糖激酶GalK磷酸化，生成的半乳糖-1-P在半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶GalT的作用下与尿苷二磷酸葡萄糖UDP-glucose的葡萄糖部分交换形成UDP-半乳糖和葡萄糖-1-P。其中，葡萄糖-1-P在磷酸葡萄糖变位酶PGM的催化下转化为葡萄糖-6-P,可进入糖酵解途径代谢；UDP-半乳糖在UDP半乳糖4-差向异构酶GalE的作用下转化为UDP-葡萄糖。
所述在谷氨酸棒杆菌中表达异源的半乳糖变位酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶和UDP半乳糖4-差向异构酶：扩增来源于L.lactis MG1363的galMKTE序列并整合到质粒pK18mobSacB上，构建整合质粒pK18mobSacB-ΔldhA::galMKTE并电转至L-鸟氨酸生产菌株C.glutamicum jp-07092中进行基因整合并验证筛选，得到重组菌C.glutamicumgal-orn。
构建方法，具体包括如下步骤：
1)、以乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363基因组为模板，利用
上游引物galMKTE-F：atcgaaaatg gaaattacaa caaaagattttggtttagga agt，
下游引物galMKTE-R：ccaaagattcagtagccttttggatgactttgatg
PCR扩增得到galMKTE片段；
2)、以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum jp-07092基因组为模板，利用ldhA-up-F：cggtacccgg ggatcggaacaccatgcgattaaggtgc和ldhA-up-R：atttccattttcgatcccacttcctgattPCR扩增得到ldhA-up片段；利用ldhA-down-F：ctactgaatctttggcgcct agttggc和ldhA-down-R：atgcctgcaggtcgagtctgggacgttgatgacgcPCR扩增得到ldhA-down片段；
3)、以ldhA-up、galMKTE、ldhA-down三个片段为模板，利用ldhA-up-F和ldhA-down-R引物重叠延伸PCR得到ΔldhA::galMKTE融合片段，用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒pK18mobSacB后，将线性化的pK18mobSacB与ΔldhA::galMKTE融合片段用一步克隆试剂盒进行连接，得到pK18mobSacB-ΔldhA::galMKTE重组质粒；
4)、将重组质粒转入到C.glutamicumjp-07092感受态细胞中，得到重组菌C.glutamicum gal-orn。
所述的重组谷氨酸棒杆菌在利用含半乳糖原料合成L-鸟氨酸中的应用。
所述重组菌株C.glutamicum gal-orn先在种子液培养基中于28～32℃、200±20rpm/min条件下培养8-10h获得种子液，再将所得种子液按3～5％接种量接种于发酵培养基中，于28～32℃，200±20rpm/min条件下发酵60～80h，即得到含L-鸟氨酸的发酵液。
所述种子液培养基配方为：葡萄糖20～60g/L，K2HPO4·3H2O 1～2g/L，KH2PO4 0.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.4～0.8g/L，尿素2.5～4g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.04g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.04g/L，生物素0.1～0.2mg/L，VB10.1～0.2mg/L，精氨酸0.01～0.05g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10min。
所述发酵培养基配方为:K2HPO4·3H2O 1～2g/L，KH2PO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O0.25～0.5g/L，(NH4)2SO420～50g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.04g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.04g/L，ZnCl2 1～2mg/L，CuSO40.1～0.2mg/L，生物素0.1～0.2mg/L，VB10.1～0.2mg/L，精氨酸0.01～0.05g/L，以含半乳糖粗原料水解液替代水配制培养基，然后用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10min。
所述含半乳糖粗原料水解液为豆渣水解液、糖蜜水解液、乳清水解液等粗原料水解液中的一种或几种。
所述豆渣水解液的制备方法为：将新鲜豆渣置于烘箱50～70℃烘干水分，打粉过筛。过筛后的豆渣用稀硫酸，加热水解1～3h。再将其pH用氨水调节至6.0后，加入纤维素酶，置于50℃的水浴锅中过夜,酶处理完成后的到粘稠状的固液混合体，将其离心取上清液，经旋蒸仪浓缩后得到高浓度豆渣水解液。
乳清水解液的制作：将乳清废水置于40～65℃恒温水浴中，边搅拌边滴加NaOH调pH至8.5，加入Alcalase碱性蛋白酶反应2～4h，在反应过程中不断搅拌并滴加NaOH以维持pH恒定不变。反应到终点时停止搅拌，并将度迅速升到80～90℃，维持15min以钝化酶。冷却后离心取上清液，经旋蒸仪浓缩后得到高浓度乳清水解液。
所述L-鸟氨酸的检测方法为:采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定氨基酸的HPLC法，高效液相色谱分析仪为美国戴安(DIONEX)公司UltiMate3000，分析仪色谱柱使用DIONEX C18分析柱，规格为4.6mm×250mm；流动相A：0.1mol/L醋酸钠水溶液，pH 6.5；流动相B：80％乙腈水溶液流动相；柱温：40℃；流速：1ml/min；检测条件：紫外波长254nm。
有益效果：
本发明在谷氨酸棒杆菌中构建一条半乳糖代谢途径，使谷氨酸棒杆菌能够利用廉价粗原料水解液中的半乳糖合成L-鸟基酸，并且有利于生物质资源的开发利用，在降低L-鸟氨酸生产成本的同时有效减少了工农业废弃物的浪费。这是目前首次以谷氨酸棒杆菌利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的试验。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
以下实施例中所涉及的菌株为：出发菌株C.glutamicum jp-07092来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15856；表达质粒构建所用菌株E.coli DH5α购于天根生化科技(北京)有限公司；gal-MKTE基因来源菌株Lactococcuslactis MG1363购于宝赛质粒菌株保藏公司。整合表达所用质粒为pK18mobSacB，购买于BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心。用到的PCR酶2×Phanta MaxMaster Mix和限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ购于诺唯赞公司，一步克隆试剂盒ClonExpress IIOne Step Cloning Kit购于Takara公司。引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。Alcalase碱性蛋白酶购买于北京诺和诺德生物制剂有限公司。所使用的液相色谱仪为美国戴安生产的A Dionex UltiMate 3000，液相色谱柱为日本昭和生产的Shodex Sugar SC1011。
实施例1：在谷氨酸棒杆菌中表达乳酸乳球菌来源的半乳糖变位酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶和UDP半乳糖4-差向异构酶
(1)整合质粒的构建：以乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363基因组为模板，利用上游引物galMKTE-F：atcgaaaatg gaaattacaa caaaagattttggtttagga agt(如序列表SEQ.No.1所示)，下游引物galMKTE-R：ccaaagattcagtagccttttggatgactttgatg(如序列表SEQ.No.2所示)PCR扩增得到galMKTE片段(GenBank:AM406671.1，如序列表中SEQ.No.3galMKTE序列所示)。其中PCR条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃5min，最终延伸72℃5min，保存4℃59min；循环数30cycles。
以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum jp-07092基因组为模板，利用ldhA-up-F：cggtacccgg ggatcggaacaccatgcgattaaggtgc(如序列表SEQ.No.4所示)和ldhA-up-R：atttccattt tcgatcccacttcctgatt(如序列表SEQ.No.5所示)PCR扩增得到ldhA-up片段(GenBank:CP025533.1，如序列表中SEQ.No.6ldhA-up序列所示)。其中PCR条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃1min，最终延伸72℃5min，保存4℃59min；循环数30cycles。
利用ldhA-down-F：ctactgaatctttggcgcct agttggc(如序列表SEQ.No.7所示)和ldhA-down-R：atgcctgcaggtcgagtctgggacgttgatgacgc(如序列表SEQ.No.8所示)PCR扩增得到ldhA-down片段(GenBank:CP025533.1，如序列表中SEQ.No.9ldhA-down序列所示)。其中ldhA-down片段PCR条件同ldhA-up片段。
以ldhA-up、galMKTE、ldhA-down三个片段为模板，利用ldhA-up-F和ldhA-down-R引物重叠延伸PCR得到ΔldhA::galMKTE融合片段。用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒pK18mobSacB后，将线性化的pK18mobSacB与ΔldhA::galMKTE融合片段用一步克隆试剂盒进行连接，得到pK18mobSacB-ΔldhA::galMKTE重组质粒。
(2)电转及基因整合：取-80℃保存的C.glutamicum jp-07092感受态细胞放到冰上融化，添加5～10μL重组质粒pK18mobSacB-ΔldhA::galMKTE，冰浴20min后转入预冷的电转杯中，再冰浴10min。在2kv 4ms条件下进行电转，在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上筛选发生第一次重组的卡那霉素抗性克隆。将阳性克隆挑于装有5ml液体LB培养基的摇管中过夜培养后，涂布于含10％蔗糖的LB固体培养基上筛选发生第二次重组的阳性克隆，挑选其中对卡那霉素敏感的单菌落以galMKTE-F和galMKTE-R为引物进行菌落PCR验证，经过凝胶电泳验证条带大小为4997bp即为验证正确，得到重组菌C.glutamicum gal-orn。
其中，LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，121℃灭菌20min。
卡那霉素母液：称取2.5mg卡那霉素溶解于100ml超纯水中，过膜保存于-20℃冰箱。
含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min后加入1‰的卡那霉素母液。
含10％蔗糖的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，蔗糖10g/L，105℃灭菌10min。
实施例2：重组谷氨酸棒杆菌菌株利用豆渣水解液发酵
(1)培养基配制
配制LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min。
配制种子液培养基：葡萄糖20g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，尿素2.5g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，生物素0.1mg/L，VB10.1mg/L，精氨酸0.02g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10min。
豆渣水解液的制作：将新鲜豆渣(含水量80％)置于烘箱60℃烘干水分，打粉过筛。过筛后的豆渣置于50ml试管中，加入1mol/L的稀硫酸，料液比为1:5，并置于100℃水浴加热2h。再将其pH用氨水调节至6.0后，加入纤维素酶，置于50℃的水浴锅中过夜。为防止水分析出，全程用橡皮塞塞住试管，酶处理完成后的到粘稠状的固液混合体，将其离心取上清液，经旋蒸仪浓缩后得到高浓度豆渣水解液。
配制豆渣发酵培养基：K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，(NH4)2SO4 40g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，ZnCl21mg/L，CuSO40.1mg/L，生物素0.1mg/L，VB10.1mg/L，精氨酸0.02g/L，以高浓度豆渣水解液代替纯水配置后用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10min。
(2)取-80℃保存的C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn分别涂布于新鲜的LB固体培养基中，30℃恒温过夜活化培养。
(3)分别从C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn的活化平板上挑取一环接种于种子液培养基中，30℃，200rpm单独培养10h，获得种子液。
(4)将种子液分别按3％接种量接种于豆渣发酵培养基中培养72h，采用分光光度法测定C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn的发酵液的菌体生物量并计算出菌体干重(DCW)；采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定氨基酸的HPLC法测定L-鸟氨酸产量，结果如下表：
表1重组菌利用豆渣水解液培养基发酵72h的DCW、和产酸量
Figure BDA0003674448630000071
由表1可知，重组菌C.glutamicum gal-orn在利用豆渣水解液培养基发酵时菌体生长情况及L-鸟氨酸产量明显高于出发菌株。首次实现了在谷氨酸棒杆菌中利用豆渣中半乳糖向L-鸟氨酸的转化。虽然半乳糖向氨基酸的转化率低于葡萄糖，但是并不影响重组菌的利用率，重组菌单位菌体产酸量相对出发菌株也有所提高。
实施例3：重组谷氨酸棒杆菌菌株利用乳清废水合成L-鸟氨酸
(1)培养基配制
配制LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min。
配制种子液培养基：葡萄糖20g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，尿素2.5g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，生物素0.1mg/L，VB10.1mg/L，精氨酸0.02g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10min。
乳清水解液的制作：将乳清废水置于55℃恒温水浴中，边搅拌边滴加2.0mol/LNaOH调pH至8.5，加入Alcalase碱性蛋白酶反应3h。在反应过程中不断搅拌并滴加1.0mol/LNaOH以维持pH恒定不变。反应到终点时停止搅拌，并将度迅速升到85℃，维持15min以钝化酶。冷却后离心取上清液，经旋蒸仪浓缩后得到高浓度乳清水解液。
配制乳清发酵培养基：K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，(NH4)2SO4 40g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，ZnCl2 1mg/L，CuSO40.1mg/L，生物素0.1mg/L，VB10.1mg/L，精氨酸0.02g/L，以高浓度乳清水解液代替纯水配置后用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10min。
(2)取-80℃保存的C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn分别涂布于新鲜的LB固体培养基中，30℃恒温过夜活化培养。
(3)分别从C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn的活化平板上挑取一环接种于种子液培养基中，30℃，200rpm单独培养10h，获得种子液。
(4)将种子液分别按3％接种量接种于乳清发酵培养基中培养72h，采用分光光度法测定C.glutamicum jp-07092和C.glutamicum gal-orn的发酵液的菌体生物量并计算出菌体干重(DCW)；采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定氨基酸的HPLC法测定L-鸟氨酸产量，结果如下表：
表2重组菌利用乳清水解液培养基发酵72h的DCW、和产酸量
Figure BDA0003674448630000081
由表2可知，在乳清发酵培养基中重组菌C.glutamicum gal-orn的干重比出发菌株提高了近两倍，L-鸟氨酸产量也明显高于出发菌株。首次实现了在谷氨酸棒杆菌中利用乳清废水中半乳糖向L-鸟氨酸的转化。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(galMKTE-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 1
atcgaaaatg gaaattacaa caaaagattt tggtttagga agt 43
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(galMKTE-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 2
ccaaagattc agtagccttt tggatgactt tgatg 35
<210> 3
<211> 4997
<212> DNA
<213> 人工序列(galMKTE(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 3
atggaaatta caacaaaaga ttttggttta ggaagtagcc taattagtct aacgaacaaa 60
aatgatgtta caattgcttt tacaaactta ggagctcgca ttgttgattg gcaaaaagac 120
gggaaacatt ttattttagg atttgattcc gcccaagaat atttagaaaa agatgcttat 180
ccaggggcca cagttggacg tacagctggc agaatcaaag atggtttggt tgatatttct 240
ggaaaaacat atcatttaaa tcaaaatgaa gctccccaaa ccttacatgg tggagaagat 300
agcattcata ccaaactttg gacttatgaa attaatgatt taggagatga agttcaagtc 360
aaatttagct tagtttccaa tgatggagaa aatggatatc ctggtaaaat agagatgtcg 420
gtgactcatt cttttgatga agagaacaat tggaaaatta agtatgaagc aatttctgac 480
aaagatacgg tatttaatcc cacaggacat gtctatttca acttaaatgg ggatgctagc 540
aagtctattg aaaatcatca actcaagctt gctgcttcaa gatttgtacc tttaaaagat 600
caaacagaaa ttgtccgtgg cgatatcgtt gatacaaaaa atactgactt agacttccgt 660
caggaaaaac aattatcaaa agccttagag tctagcatgg aacaagttca actggttggt 720
ggaattgacc accccttctt attagatgaa cagagccttg agaaagaaca agcgcgttta 780
tctttagatg acttgtcagt ttccgtttat actgaccaac caagtattgt aatttttaca 840
gcaaactttg gagatttggg gaccgtttat cacgggaaaa atcaagttca tcatggtggt 900
attacctttg aatgtcaagt ttcacccggg tcacaacaga ttccagaact tggagacatt 960
agtttaaagg caggagatga atatcaagcc accaccattt atagtttaca tacaaattaa 1020
ggaaatgaat ttagaggaga gaagaaatgt caatagttgt cgaaaatagt actgtattat 1080
cagcgttaac agaaaaattt gcagaagttt ttggagatac aaaaaaagtt gaatactttt 1140
tcagtccagg acggattaat ctgattggtg aacatactga ttacaatggg ggatatgttt 1200
tcccagcatc aattacaatc ggaacgacag gacttgctcg tttgcgagaa gataataaag 1260
tcaaacttta ctcagaaaat tttcctaaat tgggcgtcat cgaatttgac ttagatgatg 1320
ttgaaaataa ggatggtgaa ctttggtcta actatgtcaa aggaatgatt gtcatgctca 1380
aaggagcagg atatgaaatt gacaaaggtt ttgaactgtt gattaaagga gaaattccta 1440
cagcatcagg cctttcgtca tcagcttcac ttgagctttt agtgggtgtt gttttggatg 1500
atttatttaa gctaagtgtt cctcgtcttg aactggttca attgggacaa aaaacagaaa 1560
atgattatat tggtgtcaac tccggaattt tggaccaatt cgccattggt tttggtgaag 1620
tcaaaaaggc aatcttgttg gattgcaaca ctttaaaata tgaaatggtt cctgttgaac 1680
ttcgtgatta tgatattgtt atcatgaaca ctaacaaacc gcgggcattg actgaatcaa 1740
aatacaacga acgttttgct gaaacacgtg aagcactcaa aagaatgcaa actaaattgg 1800
acattcaatc acttggagaa ctatcaaatg aagaatttga tgccaatacc gatttgatag 1860
gtgatgaaac attaattaaa cgtgcacgtc atgccgttta tgaaaataat cggacgaaaa 1920
ttgcccaaaa ggcatttgtt gctggaaatc taacaaaatt tggagaactt cttaatgctt 1980
cacacgcttc tttaaaagat gattacgaag tcactggact tgaacttgat accttagcag 2040
aaactgctca aaaacaagcc ggcgtattag gggctcgaat gactggagct ggatttggtg 2100
gttgtgcaat cgctcttgtt gctcatgaca atgtttcagc ctttgaaaaa gctgtcggtg 2160
aagtttacga agaagttgtc ggttatccag caagcttcta tgttgctcaa attggttctg 2220
gctcaacaaa gctagatgtt gaataacacc aaataatatt taaaacttta atgagtgatt 2280
taagtgagtt aacattaaat tagtgatagc aaattcaagc actcaaaatt aagtgcttga 2340
attttgtatt cattcccaaa actcattaat aaagaaaagc aagaacttta cttacagaag 2400
taaattagaa agtattttat gtcaatttat caatcaattc aagatttcat tagtcttgct 2460
ttacaaaatg gaacgattga gccacttgat gagctctatc atagaaatca acttcttcat 2520
tttcttggtc taaatgattg ggcagaagtt gataaagagg ttcatgaaac taattcatta 2580
attttgatgg accaacttct ggcgattgca aatgaaaata atgtgattgc gaaagggcaa 2640
gatgaatttt atgaagccgc tctgatgaat tttatgacac cacgtccaag taaaattaat 2700
catgatttct gggaaaaata tcaggcttct ccagatgatg caactcaata tttttatgaa 2760
ttagcacagc aagtgaatca agtaaaaact cgggatattg cacgcaatat tgcttttagt 2820
catttaacaa aatatggaaa actagaaata acaattaatc tctcaaaacc agaaaaagac 2880
cccaaagcga ttgcagcagc caaattagta aaggcttcct cttatccggc ttgtcaactt 2940
tgcttggaaa atgaaggatt ttatggccta ggaaataagc ctgctcgttc caatcatcga 3000
attattcaag tttcaattaa cggcgaggac tggggctttc aatattctcc atacgcctat 3060
tttaatgaac actctatttt attaaatgct aaacatcaac caatggagat taataaacga 3120
gcttttgata atcttctagg attcttggat aaatttccta actatatgat tggttcaaat 3180
gcagatttac caattgtggg tggttcaatt ttgacacatg atcattatca agcaggtcgt 3240
catgattttc caatggcaaa ggctgaactt cgtgaaacta ttgaactcgc tcattttcca 3300
gaagtttctt gtgggatagt taattggcca atgtcagtcc taagattagc aagtgaaaat 3360
caagtagaac tttcaaaagc tgcggatgac tttttaaaaa aatggcaagt ttatagtgat 3420
gaaagtcttc agattaaagc aaaaagtaca gatggaacac ctcatcatac cattacgccg 3480
attgctcgaa ttcgagatgg aaaatatgaa ttagatttgg tcttacgcga taataatact 3540
aatgaaaaat atccagatgg tatttttcat ccacatccag ccctacacca tattaaaaaa 3600
gaaaatattg gtttaattga agtgatggga cttgcaattt tgcctgcccg tttgggaacg 3660
gaacttttgg aggttgaaaa gtatcttctt aatcaggaca accaaatgga cgaaattcat 3720
aaagcttggg ctgaacagct taaaaatgag gaacatttta ctagagaaac ggttcatgcc 3780
actgttcaag gggcagtagg agaagtgttt gaagaagtcc taaaagacgc aggtgtattt 3840
aaggatactc aagaaggaca tgaaggtttt cgtaaattta ttgattttgt gaatcaataa 3900
gagatattat gaagcattat ttagtggaga aattctctga ttatgaaata agaatgatta 3960
gaagttgata caaacttaaa aaaatctgat ataataaata gaaaatggag gatcttatga 4020
cagttttagt acttggtgga gcaggatatg taggaagcca tgcggtagat atgcttgtta 4080
atcgtggtta cgatgtggca gttgttgata atttagtaac aggtcatcgc gaggctgtgt 4140
cagaaaaagt acgtttttat gagggagatg tacgggacca tgctttctta gctagtgttt 4200
ttgaaaagga aaatattgaa ggaattatgc atttttgcgc ttattcatta gtgggtgagt 4260
caatgcaaaa accattgatg tatttcaata acaatgtcgg cggagctcag gtgattctag 4320
aaacaatgga agaatttggt gttaagcata ttgttttctc aagtaccgca gctacttttg 4380
gtattcctga ggaaagtcca atttctgaaa aaacaccaca aaaaccaatt aatccttacg 4440
gcgaaagtaa attaatcatg gaaaaaatga tgaaatggca atcgcaagcc acagatatga 4500
cttatgttgc tctgcgctat ttcaatgttg ctggtgccaa agatgatggg tcaattggtg 4560
aagcccataa aaatgaaaca catttaattc caattatcct acaaactgca cttggacaaa 4620
gagaatttat taccatttat ggtgatgatt atcagactcc tgatggaaca tgtatccgtg 4680
attatattga tatggaagat ttgattgaag cacatatcaa agcacttgaa tatcttaaat 4740
ctggtgggaa atctgaccaa tttaatcttg gctcaagtaa aggttattca aatcttgaag 4800
tgcttgaaac agcacgaaaa gtaacaggaa aagaaattcc aagtcaaatg ggtgaacgtc 4860
gtcctggcga tccagatgaa cttgtagcgg actcaacaaa agccggcgaa attttaggat 4920
ggaaagtaaa aaatgatttg gaacacatca ttacaaatgc ttgggaatgg catcaaagtc 4980
atccaaaagg ctactga 4997
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-up-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 4
cggtacccgg ggatcggaac accatgcgat taaggtgc 38
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-up-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 5
atttccattt tcgatcccac ttcctgatt 29
<210> 6
<211> 943
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-up(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 6
ggaacaccat gcgattaagg tgcgctgctt gaattgcaga attatgcaag atgcgccgca 60
acaaaacgcg atcggccaag gtcaaagtgg tcaatgtaat gaccgaaacc gctgcgatga 120
aacttatcca cggcggtaaa aacctctcaa ttaggagctt gacctcatta atactgtgct 180
gggttaattc gccggtgatc agcagcgcgc cgtaccccaa ggtgccgaca ctaatgcccg 240
cgatcgtctc cttcggtcca aaattcttct gcccaatcag ccggatttgg gtgcgatgcc 300
tgatcaatcc cacaaccgtg gtggtcaacg tgatggcacc agttgcgatg tgggtggcgt 360
tgtaaatttt cctggatacc cgccggttgg ttctggggag gatcgagtgg attcccgtcg 420
ctgccgcatg ccccaccgct tgtaaaacag ccaggttagc agccgtaacc caccacggtt 480
tcggcaacaa tgacggcgag agagcccacc acattgcgat ttccgctccg ataaagccag 540
cgcccatatt tgcagggagg attcgcctgc ggtttggcga cattcggatc cccggaacta 600
gctctgcaat gacctgcgcg ccgagggagg cgaggtgggt ggcaggtttt agtgcgggtt 660
taagcgttgc caggcgagtg gtgagcagag acgctagtct ggggagcgaa accatattga 720
gtcatcttgg cagagcatgc acaattctgc agggcatagg ttggttttgc tcgatttaca 780
atgtgatttt ttcaacaaaa ataacacttg gtctgaccac attttcggac ataatcgggc 840
ataattaaag gtgtaacaaa ggaatccggg cacaagctct tgctgatttt ctgagctgct 900
ttgtgggttg tccggttagg gaaatcagga agtgggatcg aaa 943
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-down-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 7
ctactgaatc tttggcgcct agttggc 27
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-down-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 8
atgcctgcag gtcgagtctg ggacgttgat gacgc 35
<210> 9
<211> 959
<212> DNA
<213> 人工序列(ldhA-down(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 9
atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 60
ttggtttacg ggcacaatga aactgttgga tggaatttag agtgtttgta gcttaaggag 120
ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 180
taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 240
caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 300
tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 360
cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 420
gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 480
acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 540
tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 600
gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 660
tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 720
tcgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 780
gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 840
acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 900
aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagac 959

Claims (7)

1. 一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363来源的半乳糖变位酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶 和UDP半乳糖4-差向异构酶表达框galMKTE整合到谷氨酸棒杆菌IdhA位点中，得到的重组菌Corynebacteriumglutamicumgal-orn；所述谷氨酸棒杆菌为鸟氨酸生产菌株Corynebacteriumglutamicum jp-07092。
2. 一种利用半乳糖原料合成L-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、以乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363基因组为模板，利用
上游引物galMKTE-F：atcgaaaatg gaaattacaa caaaagattt tggtttagga agt，
下游引物galMKTE-R：ccaaagattc agtagccttt tggatgactt tgatg
PCR扩增得到galMKTE片段；
2）、以谷氨酸棒杆菌C. glutamicum jp-07092基因组为模板，利用ldhA-up-F：cggtacccgg ggatcggaac accatgcgat taaggtgc和ldhA-up-R：atttccattt tcgatcccacttcctgattPCR扩增得到ldhA-up片段；利用ldhA-down-F：ctactgaatc tttggcgcct agttggc和ldhA-down-R：atgcctgcag gtcgagtctg ggacgttgat gacgcPCR扩增得到ldhA-down片段；
3）、以ldhA-up、galMKTE、ldhA-down三个片段为模板，利用ldhA-up-F和ldhA-down-R引物重叠延伸PCR得到ΔldhA::galMKTE融合片段，用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒pK18mobSacB后，将线性化的pK18mobSacB与ΔldhA::galMKTE融合片段用一步克隆试剂盒进行连接，得到pK18mobSacB-ΔldhA::galMKTE重组质粒；
4）、将重组质粒转入到C.glutamicum jp-07092感受态细胞中，得到重组菌Corynebacteriumglutamicumgal-orn。
3.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌在利用含半乳糖原料合成L-鸟氨酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组菌Corynebacteriumglutamicumgal-orn先在种子液培养基中于28~32℃、200±20rpm条件下培养8-10h获得种子液，再将所得种子液按3~5％接种量接种于发酵培养基中，于28~32℃，200±20rpm条件下发酵60~80h，即得到含L-鸟氨酸的发酵液。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子液培养基配方为：葡萄糖20~60g/L，K2HPO4·3H2O 1~2g/L，KH2PO4 0.5~1g/L，MgSO4·7H2O 0.4~0.8g/L，尿素2.5~4g/L，MnSO4·H2O 0.01~0.04g/L，FeSO4·7H2O 0.01~0.04g/L，生物素0.1~0.2mg/L，VB1 0.1~0.2mg/L，精氨酸0.01~0.05g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基配方为: K2HPO4·3H2O 1~2g/L，KH2PO4 1~2g/L，MgSO4·7H2O 0.25~0.5g/L，(NH4)2SO4 20~50g/L，MnSO4·H2O 0.01~0.04g/L，FeSO4·7H2O 0.01~0.04g/L，ZnCl2 1~2 mg/L，CuSO4 0.1~0.2 mg/L，生物素0.1~0.2mg/L，VB1 0.1~0.2mg /L，精氨酸0.01~0.05g/L，以含半乳糖粗原料水解液替代水配制培养基，用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基配方中的含半乳糖粗原料水解液为豆渣水解液、糖蜜水解液、乳清水解液粗原料水解液中的一种或几种。
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