CN114854661B - 一种双菌共培养体系利用混糖原料生产l-鸟氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L‑鸟氨酸的方法，以鸟氨酸高产菌株Corynebacteriumglutamicum jp‑07092为出发菌株构建木糖利用菌株Corynebacterium glutamicum GX01和阿拉伯糖利用菌株Corynebacterium glutamicum GA01；利用双菌共培养体系发酵生产L‑鸟氨酸。本发明方法可以利用木糖和阿拉伯糖，使其能够生产鸟氨酸的同时也在一定程度上解决了只能利用单一葡萄糖而造成的发酵成本高的问题；通过双菌共培养体系的构建，可实现谷氨酸棒杆菌利用木糖、阿拉伯糖、葡萄糖的复杂碳源生产鸟氨酸，减少了环境污染和资源浪费。

Description

一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法。
背景技术
L-鸟氨酸广泛存在于生物体的多种组织与细胞中，是精氨酸合成途径中重要的中间产物，参与尿素循环（又名鸟氨酸循环），也是脯氨酸与多胺代谢的关键中间代谢产物。L-鸟氨酸作为非蛋白质氨基酸，在调节细胞氮代谢中起到关键作用，已被用于肝脏代谢相关疾病的预防与治疗，在药物和营养化学品市场广受关注。L-鸟氨酸的制备方法主要分为天然产物提取法、化学合成法、精氨酸水解法以及微生物发酵法四种。其中天然产物提取法、化学合成法因反应步骤繁杂且产量低已经很少使用，精氨酸水解法存在成本过高、收率较低等问题，而微生物发酵法因具有条件成熟、环境污染小、成本相对较低、产量提高潜力大等特点已作为最具发展前景的氨基酸生产方式被广泛应用于工业化生产。
谷氨酸棒杆菌具有生长迅速、氨基酸积累水平高等优点，其作为重要的工业生产菌种被用于氨基酸生产已有多年的历史。在氨基酸工业生产中，均使用以淀粉或大米等粮食为原料生产的葡萄糖作为唯一碳源。大量粮食原料的使用会造成氨基酸生产成本的增加以及资源的浪费，其生产过程还会对环境造成一定的污染。目前，发酵法生产L-鸟氨酸工艺仍以精制葡萄糖为主要碳源，其大规模商业化生产的技术基础亟需廉价生物质资源的高效利用，即开发工农业废弃物作为廉价原料代替葡萄糖降低生产成本。我国的生产加工环节中，有许多被丢弃的碳源种类较为繁多的废弃资源亟待开发，如秸秆、豆渣等，其主要成分为纤维素和半纤维素。纤维素的主要成分是葡萄糖，可以被Corynebacterium glutamicum利用；半纤维素是由木糖、阿拉伯糖等戊糖构成的，传统Corynebacterium glutamicum自身无法代谢木糖、阿拉伯糖，因此通过代谢工程改造使其能够利用木糖和阿拉伯糖是谷氨酸棒杆菌利用废弃秸秆、豆渣等资源发酵的前提。
目前已有一些关于谷氨酸棒杆菌多碳源利用的报道。虽然Corynebacterium glutamicum的碳分解代谢阻遏作用较弱，但在一株菌中同时表达多个异源代谢路径会导致基因工程改造十分冗繁。除此之外，生物合成途径往往伴随着复杂的代谢途径，单种菌株无法应付代谢途径的复杂需求而造成代谢负担。这二者都会对菌株发酵性能造成影响，而运用合成生物学、发酵优化、驯养等手段构建人工混菌培养体系可以有效避免这些问题。在混菌共培养利用多种碳源及生物质水解物合成氨基酸体系中，每个菌株作为独立的表达系统或代谢模块都可以并行构建和优化，通过菌株分工来最大限度减少单个菌株的代谢负担，且可以更方便的通过改变共培养菌株的比例实现代谢途径之间的平衡与优化，实现复杂碳源利用过程中不同碳代谢的合理分配以优化生产。
目前还没有对谷氨酸棒杆菌进行木糖和阿拉伯糖代谢途径的构建以利用多碳源进行双菌共培养生产L-鸟氨酸的报道，因此建立一种利用双菌共培养体系生产L-鸟氨酸的方法对L-鸟氨酸生产工业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可利用木糖和阿拉伯糖发酵的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法。
本发明的另一目的在于建立一种可利用多碳源的双菌共培养体系生产L-鸟氨酸。
本发明在一株L-鸟氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092中异源表达木糖代谢模块关键酶和阿拉伯糖代谢模块关键酶，从而构建出能够利用木糖的菌株Corynebacterium glutamicum GX01和能够利用阿拉伯糖的菌株Corynebacterium glutamicum GA01。通过对这两株菌的共培养使其能在高产L-鸟氨酸的同时实现多碳源的利用，降低了L-鸟氨酸的生产成本并减少了资源浪费。
针对谷氨酸棒杆菌可利用碳源单一、L-鸟氨酸工业生产成本高等问题，本发明提供了一种利用双菌共培养体系生产L-鸟氨酸的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法，所述双菌为木糖利用菌株Corynebacterium glutamicum GX01和阿拉伯糖利用菌株Corynebacterium glutamicumGA01。
所述的Corynebacterium glutamicum GX01菌的构建方法是：
以L-鸟氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092为出发菌株，采用整合表达的技术对该菌株进行基因改造，步骤如下：
采用基因工程手段扩增来源于Escherichia coli DH5α的木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB构建整合质粒pK18mobSacB-ec xylAB，并电击转入L-鸟氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092中进行基因整合并验证筛选，得到重组菌Corynebacterium glutamicum GX01。
所述的Corynebacterium glutamicum GA01菌的构建方法是：
以L-鸟氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092为出发菌株，采用整合表达的技术对该菌株进行基因改造，步骤如下：
采用基因工程手段扩增来源于Escherichia coli DH5α的L-阿拉伯糖异构酶araA、核糖激酶araB和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶araD构建整合质粒pK18mobSacB-ecaraBAD并电击转入L-鸟氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092中，得到重组菌Corynebacterium glutamicum GA01。
所述双菌共培养体系为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01共培养的体系。
所述的Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicumGA01双菌共培养体系，具体构建方法包括以下步骤：
（1）分别用LB固体培养基活化-80℃保存的Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01于28~32℃恒温过夜培养后，挑取一环接种于种子液培养基中，28~32℃，200±20 rpm单独培养8-10 h，获得种子液；
（2）将步骤（1）所得种子液分别于4℃，6000 rpm条件下离心8~10 min,弃上清液后用预冷的生理盐水洗涤3~5遍,然后用预冷的生理盐水重悬至0D600=6~8,获得Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的菌悬液保存于4℃备用；
（3）将步骤（2）所得两种重悬菌液按照体积比1~5:1~5混合后按1~7%接种量接种于共培养发酵培养基中，得到谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的双菌共培养体系。
所述的两种菌悬液混合体积比优选为1:2，接种量优选为3％。
所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10~20 g/L，酵母粉5~10 g/L，氯化钠10~20g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min。
所述种子液培养基配方为：葡萄糖10~30 g/L，K2HPO4·3H2O 1~2 g/L，KH2PO40.5~1g/L，MgSO4·7H2O 0.4~0.8 g/L，尿素2.5~4 g/L，MnSO4·H2O 0.01~0.04 g/L，FeSO4·7H2O0.01~0.0 4g/L，生物素0.1~0.2 mg/L，VB10.1~0.2 mg/L，精氨酸0.01~0.05 g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
所述共培养发酵培养基配方为:葡萄糖10~30 g/L，阿拉伯糖10~30 g/L，木糖10~30 g/L，K2HPO4·3H2O 1~2 g/L，KH2PO41~2 g/L，MgSO4·7H2O 0.25~0.5 g/L，(NH4)2SO420~50 g/L，MnSO4·H2O 0.01~0.04 g/L，FeSO4·7H2O 0.01~0.04 g/L，ZnCl21~2 mg/L，CuSO40.1~0.2 mg/L，生物素0.1~0.2 mg/L，VB1 0.1~0.2 mg /L，精氨酸0.01~0.05 g/L，用KOH调pH至6.0~8.0，110℃灭菌10 min。
所述共培养发酵培养基配方优化为: 葡萄糖20 g/L，阿拉伯糖20 g/L，木糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO440 g/L，MnSO4·H2O0.02 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，ZnCl21 mg/L，CuSO4 0.1 mg/L，生物素0.1 mg/L，VB1 0.1mg /L，精氨酸0.02 g/L，用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
所述的利用双菌共培养体系生产L-鸟氨酸的方法为将获得的双菌共培养体系于30±2℃、通气比1~2 v/vm，搅拌220±20 r/min条件下好氧发酵60~80 h，即得到含L-鸟氨酸的发酵液。
所述的利用双菌共培养体系生产L-鸟氨酸的方法优化为将获得的双菌共培养体系于30℃、通气比1.5 v/vm，搅拌220 r/min条件下好氧发酵72 h，即得到含L-鸟氨酸的发酵液。
所述L-鸟氨酸的检测方法为:采用异硫氰酸苯酯(PITC）柱前衍生化测定氨基酸的HPLC 法，高效液相色谱分析仪为美国戴安（DIONEX）公司 UltiMate3000，分析仪色谱柱使用 DIONEX C18 分析柱，规格为 4.6 mm×250 mm；流动相 A：0.1 mol/L 醋酸钠水溶液，pH6.5；流动相 B：80% 乙腈水溶液流动相；柱温：40 ℃；流速：1 ml/min；检测条件：紫外波长254 nm。
有益效果：
本发明构建了谷氨酸棒杆菌的木糖利用菌株和阿拉伯糖利用菌株，扩大了谷氨酸棒杆菌的底物谱，降低了L-鸟氨酸的生产成本。同时将这两种进行菌混菌混糖发酵，通过菌株分工来最大限度减少单个菌株的代谢负担，且可以更方便的通过改变共培养菌株的比例实现代谢途径之间的平衡与优化，实现复杂碳源利用过程中不同碳代谢的合理分配以优化生产。因此对谷氨酸棒杆菌进行木糖和阿拉伯糖代谢途径的构建以利用多碳源进行双菌共培养生产L-鸟氨酸的方法对L-鸟氨酸生产工业具有重要意义。
附图说明
图1 不同比例C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01共同发酵的菌体干重；
图2 不同比例C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01共同发酵的葡萄糖残糖量；
图3 不同比例C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01共同发酵的D-木糖残糖量；
图4 不同比例C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01共同发酵的L-阿拉伯糖残糖量。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
以下实施例中所涉及的菌株为：出发菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum jp-07092），来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15856，已公开在专利201811133790.5中，是现有菌株；表达质粒构建所用菌株Escherichia coli DH5α，购于天根生化科技（北京）有限公司；整合表达所用质粒为pK18mobSacB，购买于BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心。用到的限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ和一步克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit购于Takara公司。均购于Takara公司。引物均由通用生物系统（安徽）有限公司合成。所使用的液相色谱仪为美国戴安生产的A Dionex UltiMate 3000，液相色谱柱为日本昭和生产的Shodex Sugar SC 1011。
实施例1：木糖利用菌株Corynebacterium glutamicum GX01的构建
（1）整合质粒的构建：以大肠杆菌Escherichia coli MG1655基因组为模板，利用上游引物xylAB-F:atcgaaaatgcaagcctattttgaccagct (SEQ.No.1)和下游引物xylAB-R:ccaaagatttacgccattaatggcagaagttgc (SEQ.No.2) PCR扩增得到xylAB片段（如序列表中SEQ.No.3 xylAB序列所示）。其中PCR条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 3 min，最终延伸72℃ 5 min，保存4℃ 59 min；循环数30 cycles。
以谷氨酸棒杆菌C. glutamicum jp-07092基因组为模板，利用引物ldhA-up-F1:cggtacccggggatcggaacaccatgcgattaaggtgc (SEQ.No.4)和ldhA-up-R1:gcttgcattttcgatcccacttcctgattt cc (SEQ.No.5) PCR扩增得到ldhA-up片段（如序列表中SEQ.No.6 ldhA-up序列所示）。其中PCR条件为：预变性95℃ 5min，变性95℃ 30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 1min，最终延伸72℃ 5min，保存4℃ 59min；循环数30 cycles。
利用ldhA-down-F1：ggcgtaaatctttggcgcctagttggcgac（SEQ.No.7）和ldhA-down-R1 atgcctgcaggtcgagtctgggacgttgatgacgc （SEQ.No.8）PCR扩增得到ldhA-down片段（如序列表中SEQ.No.9 ldhA-down序列所示）；其中ldhA-down片段PCR条件同ldhA-up片段。
以ldhA-up、xylAB、ldhA-down三个片段为模板，利用ldhA-up-F1和ldhA-down-R1引物重叠延伸PCR得到ΔldhA:: xylAB融合片段。其中PCR条件为：预变性95℃ 5min，变性95℃ 30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 5min，最终延伸72℃ 5min，保存4℃ 59min；循环数30cycles。
用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒pK18mobSacB后，将线性化的pK18mobSacB与ΔldhA::xylAB融合片段用一步克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit进行连接，得到pK18mobSacB-ΔldhA:: xylAB重组质粒。
（2）电转及基因整合：取-80℃保存的C.glutamicum jp-07092感受态细胞放到冰上融化，添加5~10μL重组质粒pK18mobSacB-ΔldhA::xylAB，冰浴20min后转入预冷的电转杯中，再冰浴10min。在2kv 4ms条件下进行电转，在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上筛选发生第一次重组的卡那霉素抗性克隆。将阳性克隆挑于装有5 ml液体LB培养基的摇管中过夜培养后，涂布于含10%蔗糖的LB固体培养基上筛选发生第二次重组的阳性克隆，挑选其中对卡那霉素敏感的单菌落进行菌落以xylAB-F和xylAB-R为引物进行菌落PCR验证，经过凝胶电泳验证条带大小为2849bp即为验证正确，得到重组菌Corynebacterium glutamicum GX01。
其中，LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，121℃灭菌20 min。
卡那霉素母液：称取2.5 mg卡那霉素溶解于100 ml超纯水中，过膜保存于-20℃冰箱。
含有25 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min后加入1‰的卡那霉素母液。
含10%蔗糖的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，蔗糖10 g/L，105℃灭菌10 min。
实施例2：阿拉伯糖利用菌株Corynebacterium glutamicum GA01的构建
（1）整合质粒的构建：以大肠杆菌Escherichia coli MG1655基因组为模板，利用上游引物araBAD-F：atcgaaaatggcgattgcaattggcc（SEQ.No.10）和下游引物araBAD-R：ccaaagatttactgcccgtaatatgccttcgc （SEQ.No.11）PCR扩增得到araBAD片段（如序列表中SEQ.No.12 araBAD序列所示）。其中PCR条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，最终延伸72℃ 5 min，保存4℃ 59 min；循环数30 cycles。
以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum jp-07092基因组为模板，利用ldhA-up-F2：cggtacccgg ggatcggaac accatgcgat taaggtgc（SEQ.No.13）和ldhA-up-R2：atcgccattt tcgatcccac ttcctgatt（SEQ.No.14）PCR扩增得到ldhA-up片段（如序列表中SEQ.No.6 ldhA-up序列所示）。其中PCR条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，最终延伸72℃ 5 min，保存4℃ 59 min；循环数30 cycles。
利用ldhA-down-F2：gcagtaaatc tttggcgcct agttggcg（SEQ.No.15）和ldhA-down-R2：atgcctgcag gtcgagtctg ggacgttgat gacgc （SEQ.No.16）PCR扩增得到ldhA-down片段（如序列表中SEQ.No.9 ldhA-down序列所示）。其中ldhA-down片段PCR条件同ldhA-up片段。
以ldhA-up、araBAD、ldhA-down三个片段为模板，利用ldhA-up-F2和ldhA-down-R2引物重叠延伸PCR得到ΔldhA:: araBAD融合片段。其中PCR条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 7 min，最终延伸72℃ 5 min，保存4℃ 59 min；循环数30 cycles。
用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ处理质粒pK18mobSacB后，将线性化的pK18mobSacB与ΔldhA:: araBAD融合片段用一步克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit进行连接，得到pK18mobSacB-ΔldhA:: araBAD重组质粒。
（2）电转及基因整合：取-80℃保存的Corynebacterium glutamicum jp-07092感受态细胞放到冰上融化，添加5~10 μL重组质粒pK18mobSacB-ΔldhA:: araBAD，冰浴20min后转入预冷的电转杯中，再冰浴10 min。在2kv 4ms条件下进行电转，在含有25 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上筛选发生第一次重组的卡那霉素抗性克隆。将阳性克隆挑于装有5 ml液体LB培养基的摇管中过夜培养后，涂布于含10%蔗糖的LB固体培养基上筛选发生第二次重组的阳性克隆，挑选其中对卡那霉素敏感的单菌落进行菌落以araBAD-F和araBAD-R为引物进行菌落PCR验证，经过凝胶电泳验证条带大小为4194 bp即为验证正确，得到重组菌Corynebacterium glutamicum GA01。
其中，LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，121℃灭菌20 min。
卡那霉素母液：称取2.5 mg卡那霉素溶解于100 ml超纯水中，过膜保存于-20℃冰箱。
含有25 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min后加入1‰的卡那霉素母液。
含10%蔗糖的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，蔗糖10 g/L，105℃灭菌10 min。
实施例3：一种利用Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法
（1）构建谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的双菌共培养体系
配制LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min。
配制种子液培养基：葡萄糖20 g/L，K2HPO4·3H2O 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，尿素2.5 g/L，MnSO4·H2O 0.02 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，生物素0.1 mg/L，VB1 0.1 mg/L，精氨酸0.02 g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
配制共培养发酵培养基配方为：葡萄糖20 g/L，阿拉伯糖20 g/L，木糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO4 40 g/L，MnSO4·H2O0.02 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，ZnCl2 1 mg/L，CuSO4 0.1 mg/L，生物素0.1 mg/L，VB10.1 mg /L，精氨酸0.02 g/L，用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
取-80℃保存的Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01分别涂布于新鲜的LB固体培养基中，30℃恒温过夜活化培养。
分别从Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的活化平板上挑取一环接种于种子液培养基中，30℃，200 rpm单独培养10 h，获得种子液。
将所得种子液分别于4℃，6000 rpm条件下离心8 min,弃上清液后用预冷的生理盐水洗涤3遍,然后用预冷的生理盐水重悬至0D600=7,获得Corynebacterium glutamicumGX01和Corynebacterium glutamicum GA01的菌悬液保存于4℃备用。
将所得两种重悬菌液按照体积比1:1、1:2、1:5、2:1、5:1混合后按3%接种量接种于共培养发酵培养基中，得到五种谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的双菌共培养体系。
（2）利用双菌共培养体系发酵生产L-鸟氨酸
将获得的双菌共培养体系于30℃、通气比1.5v/vm，搅拌220 r/min条件下好氧发酵72 h,，即得到含L-鸟氨酸的发酵液。
（3）采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定氨基酸的HPLC法测Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01接种比例为1:1、1:2、1:5、2:1、5:1时双菌共培养体系发酵液和对照组发酵液中的菌体干重（DCW）以及葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖残糖量，结果如图1~图4所示。
由图可知，C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01接种比例为1:2时三种碳源利用率和菌种生长情况都较好，因此选择C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01菌株接种比1:2为最佳比例进行发酵。
（4）设置C. glutamicum GX01和C. glutamicum GA01单菌发酵及C.glutamicumjp-07092对照组：
配制对照组发酵培养基：葡萄糖20 g/L，阿拉伯糖20 g/L，木糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO4 40 g/L，MnSO4·H2O 0.02 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，ZnCl2 1 mg/L，CuSO4 0.1 mg/L，生物素0.1 mg/L，VB1 0.1 mg /L，精氨酸0.02 g/L，用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
分别取-80℃保存的C. glutamicum GX01、C. glutamicum GA01和C.glutamicumjp-07092涂布于新鲜的LB固体培养基中，30℃恒温过夜活化培养。
从活化平板上挑取一环接种于种子液培养基中，30℃，200rpm培养10h，获得种子液。
将所得种子液于4℃，6000rpm条件下离心8min,弃上清液后用预冷的生理盐水洗涤3遍,然后用预冷的生理盐水重悬至0D600=7,获得C. glutamicum GX01、C. glutamicum GA01和C.glutamicum jp-07092的菌悬液保存于4℃备用。
将所得重悬菌液按3%接种量接种于对照组发酵培养基中，于30℃、通气比1.5 v/vm，搅拌220r/min条件下好氧发酵72 h，即得到对照组发酵液。
采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定氨基酸的HPLC法测Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01接种比例1:2时双菌共培养体系发酵液、C. glutamicum GX01发酵液、C. glutamicum GA01发酵液和对照组C.glutamicumjp-07092发酵液中的菌体干重（DCW）和L-鸟氨酸含量，结果如下表：
表1 GX01和GA01按1:2共培养体系发酵液、GX01单菌、GA01单菌发酵及jp-07092和对照组发酵液中的菌体干重（DCW）和L-鸟氨酸含量
由表1可知，利用Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的双菌共培养体系发酵比二者分别单独发酵和jp-07092单独发酵的菌体干重和L-鸟氨酸产量都明显提升，但单位菌体的L-鸟氨酸产量稍有降低，推测是由于导入外源基因对菌体生长造成不利影响。除此之外，GA01单独发酵菌体干重和鸟氨酸产量分别提高8.54％和5.56%，GX01单独发酵提高了19.10%和16.67%，GX01：GA01=1:2双菌共培养体系提高56.28％和50％；可见双菌共培养实现了1＋1＞2的效果。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atcgaaaatg caagcctatt ttgaccagct 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ccaaagattt acgccattaa tggcagaagt tgc 33
<210> 3
<211> 2849
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60
ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120
cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180
ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240
cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300
cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360
caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420
acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480
gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540
ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600
gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660
cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720
catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc tgaaacagtt tggtctggaa 780
aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840
catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900
gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960
gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020
aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080
gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140
aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200
ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacatcattt gtctccggtg 1260
catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa accattatct gttcgacaaa 1320
taacggctaa ctgtgcagtc cgttggcccg gttatcggta gcgataccgg gcattttttt 1380
aaggaacgat cgatatgtat atcgggatag atcttggcac ctcgggcgta aaagttattt 1440
tgctcaacga gcagggtgag gtggttgctg cgcaaacgga aaagctgacc gtttcgcgcc 1500
cgcatccact ctggtcggaa caagacccgg aacagtggtg gcaggcaact gatcgcgcaa 1560
tgaaagctct gggcgatcag cattctctgc aggacgttaa agcattgggt attgccggcc 1620
agatgcacgg agcaaccttg ctggatgctc agcaacgggt gttacgccct gccattttgt 1680
ggaacgacgg gcgctgtgcg caagagtgca ctttgctgga agcgcgagtt ccgcaatcgc 1740
gggtgattac cggcaacctg atgatgcccg gatttactgc gcctaaattg ctatgggttc 1800
agcggcatga gccggagata ttccgtcaaa tcgacaaagt attattaccg aaagattact 1860
tgcgtctgcg tatgacgggg gagtttgcca gcgatatgtc tgacgcagct ggcaccatgt 1920
ggctggatgt cgcaaagcgt gactggagtg acgtcatgct gcaggcttgc gacttatctc 1980
gtgaccagat gcccgcatta tacgaaggca gcgaaattac tggtgctttg ttacctgaag 2040
ttgcgaaagc gtggggtatg gcgacggtgc cagttgtcgc aggcggtggc gacaatgcag 2100
ctggtgcagt tggtgtggga atggttgatg ctaatcaggc aatgttatcg ctggggacgt 2160
cgggggtcta ttttgctgtc agcgaagggt tcttaagcaa gccagaaagc gccgtacata 2220
gcttttgcca tgcgctaccg caacgttggc atttaatgtc tgtgatgctg agtgcagcgt 2280
cgtgtctgga ttgggccgcg aaattaaccg gcctgagcaa tgtcccagct ttaatcgctg 2340
cagctcaaca ggctgatgaa agtgccgagc cagtttggtt tctgccttat ctttccggcg 2400
agcgtacgcc acacaataat ccccaggcga agggggtttt ctttggtttg actcatcaac 2460
atggccccaa tgaactggcg cgagcagtgc tggaaggcgt gggttatgcg ctggcagatg 2520
gcatggatgt cgtgcatgcc tgcggtatta aaccgcaaag tgttacgttg attgggggcg 2580
gggcgcgtag tgagtactgg cgtcagatgc tggcggatat cagcggtcag cagctcgatt 2640
accgtacggg gggggatgtg gggccagcac tgggcgcagc aaggctggcg cagatcgcgg 2700
cgaatccaga gaaatcgctc attgaattgt tgccgcaact accgttagaa cagtcgcatc 2760
taccagatgc gcagcgttat gccgcttatc agccacgacg agaaacgttc cgtcgcctct 2820
atcagcaact tctgccatta atggcgtaa 2849
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cggtacccgg ggatcggaac accatgcgat taaggtgc 38
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
gcttgcattt tcgatcccac ttcctgattt cc 32
<210> 6
<211> 943
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ggaacaccat gcgattaagg tgcgctgctt gaattgcaga attatgcaag atgcgccgca 60
acaaaacgcg atcggccaag gtcaaagtgg tcaatgtaat gaccgaaacc gctgcgatga 120
aacttatcca cggcggtaaa aacctctcaa ttaggagctt gacctcatta atactgtgct 180
gggttaattc gccggtgatc agcagcgcgc cgtaccccaa ggtgccgaca ctaatgcccg 240
cgatcgtctc cttcggtcca aaattcttct gcccaatcag ccggatttgg gtgcgatgcc 300
tgatcaatcc cacaaccgtg gtggtcaacg tgatggcacc agttgcgatg tgggtggcgt 360
tgtaaatttt cctggatacc cgccggttgg ttctggggag gatcgagtgg attcccgtcg 420
ctgccgcatg ccccaccgct tgtaaaacag ccaggttagc agccgtaacc caccacggtt 480
tcggcaacaa tgacggcgag agagcccacc acattgcgat ttccgctccg ataaagccag 540
cgcccatatt tgcagggagg attcgcctgc ggtttggcga cattcggatc cccggaacta 600
gctctgcaat gacctgcgcg ccgagggagg cgaggtgggt ggcaggtttt agtgcgggtt 660
taagcgttgc caggcgagtg gtgagcagag acgctagtct ggggagcgaa accatattga 720
gtcatcttgg cagagcatgc acaattctgc agggcatagg ttggttttgc tcgatttaca 780
atgtgatttt ttcaacaaaa ataacacttg gtctgaccac attttcggac ataatcgggc 840
ataattaaag gtgtaacaaa ggaatccggg cacaagctct tgctgatttt ctgagctgct 900
ttgtgggttg tccggttagg gaaatcagga agtgggatcg aaa 943
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ggcgtaaatc tttggcgcct agttggcgac 30
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
atgcctgcag gtcgagtctg ggacgttgat gacgc 35
<210> 9
<211> 959
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 60
ttggtttacg ggcacaatga aactgttgga tggaatttag agtgtttgta gcttaaggag 120
ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 180
taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 240
caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 300
tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 360
cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 420
gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 480
acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 540
tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 600
gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 660
tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 720
tcgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 780
gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 840
acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 900
aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagac 959
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
atcgaaaatg gcgattgcaa ttggcc 26
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
ccaaagattt actgcccgta atatgccttc gc 32
<210> 12
<211> 4194
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
atggcgattg caattggcct cgattttggc agtgattctg tgcgagcttt ggcggtggac 60
tgcgctaccg gtgaagagat cgccaccagc gtagagtggt atccccgttg gcagaaaggg 120
caattttgtg atgccccgaa taaccagttc cgtcatcatc cgcgtgacta cattgagtca 180
atggaagcgg cactgaaaac cgtgcttgca gagcttagcg tcgaacagcg cgcagctgtg 240
gtcgggattg gcgttgacag taccggctcg acgcccgcac cgattgatgc cgacggaaac 300
gtgctggcgc tgcgcccgga gtttgccgaa aacccgaacg cgatgttcgt attgtggaaa 360
gaccacactg cggttgaaga agcggaagag attacccgtt tgtgccacgc gccgggcaac 420
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ctgcatgtga ctcgccagga cagcgccgtg gcgcaatctg ccgcatcgtg gattgagctg 540
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gacacttgga ctgccgatat tccggtgggc accttatgcc cggaatgggc gcagcgtctc 780
ggcctgcctg aaagcgtggt gatttccggc ggcgcgtttg actgccatat gggcgcagtt 840
ggcgcaggcg cacagcctaa cgcactggta aaagttatcg gtacttccac ctgcgacatt 900
ctgattgccg acaaacagag cgttggcgag cgggcagtta aaggtatttg cggtcaggtt 960
gatggcagcg tggtgcctgg atttatcggt ctggaagcag gccaatcggc gtttggtgat 1020
atctacgcct ggtttggtcg cgtactcggc tggccgctgg aacagcttgc cgcccagcat 1080
ccggaactga aaacgcaaat caacgccagc cagaaacaac tgcttccggc gctgaccgaa 1140
gcatgggcca aaaatccgtc tctggatcac ctgccggtgg tgctcgactg gtttaacggc 1200
cgccgcacac cgaacgctaa ccaacgcctg aaaggggtga ttaccgatct taacctcgct 1260
accgacgctc cgctgctgtt cggcggtttg attgctgcca ccgcctttgg cgcacgcgca 1320
atcatggagt gctttaccga tcaggggatc gccgttaata acgtgatggc actgggcggc 1380
atcgcgcgga aaaaccaggt cattatgcag gcctgctgcg acgtgctgaa tcgcccgctg 1440
caaattgttg cctctgacca gtgctgtgcg ctcggtgcgg cgatttttgc tgccgtcgcc 1500
gcgaaagtgc acgcagacat cccatcagct cagcaaaaaa tggccagtgc ggtagagaaa 1560
accctgcaac cgtgcagcga gcaggcacaa cgctttgaac agctttatcg ccgctatcag 1620
caatgggcga tgagcgccga acaacactat cttccaactt ccgccccggc acaggctgcc 1680
caggccgttg cgactctata aggacacgat aatgacgatt tttgataatt atgaagtgtg 1740
gtttgtcatt ggcagccagc atctgtatgg cccggaaacc ctgcgtcagg tcacccaaca 1800
tgccgagcac gtcgttaatg cgctgaatac ggaagcgaaa ctgccctgca aactggtgtt 1860
gaaaccgctg ggcaccacgc cggatgaaat caccgctatt tgccgcgacg cgaattacga 1920
cgatcgttgc gctggtctgg tggtgtggct gcacaccttc tccccggcca aaatgtggat 1980
caacggcctg accatgctca acaaaccgtt gctgcaattc cacacccagt tcaacgcggc 2040
gctgccgtgg gacagtatcg atatggactt tatgaacctg aaccagactg cacatggcgg 2100
tcgcgagttc ggcttcattg gcgcgcgtat gcgtcagcaa catgccgtgg ttaccggtca 2160
ctggcaggat aaacaagccc atgagcgtat cggctcctgg atgcgtcagg cggtctctaa 2220
acaggatacc cgtcatctga aagtctgccg atttggcgat aacatgcgtg aagtggcggt 2280
caccgatggc gataaagttg ccgcacagat caagttcggt ttctccgtca atacctgggc 2340
ggttggcgat ctggtgcagg tggtgaactc catcagcgac ggcgatgtta acgcgctggt 2400
cgatgagtac gaaagctgct acaccatgac gcctgccaca caaatccacg gcaaaaaacg 2460
acagaacgtg ctggaagcgg cgcgtattga gctggggatg aagcgtttcc tggaacaagg 2520
tggcttccac gcgttcacca ccacctttga agatttgcac ggtctgaaac agcttcctgg 2580
tctggccgta cagcgtctga tgcagcaggg ttacggcttt gcgggcgaag gcgactggaa 2640
aactgccgcc ctgcttcgca tcatgaaggt gatgtcaacc ggtctgcagg gcggcacctc 2700
ctttatggag gactacacct atcacttcga gaaaggtaat gacctggtgc tcggctccca 2760
tatgctggaa gtctgcccgt cgatcgccgc agaagagaaa ccgatcctcg acgttcagca 2820
tctcggtatt ggtggtaagg acgatcctgc ccgcctgatc ttcaataccc aaaccggccc 2880
agcgattgtc gccagcttga ttgatctcgg cgatcgttac cgtctactgg ttaactgcat 2940
cgacacggtg aaaacaccgc actccctgcc gaaactgccg gtggcgaatg cgctgtggaa 3000
agcgcaaccg gatctgccaa ctgcttccga agcgtggatc ctcgctggtg gcgcgcacca 3060
taccgtcttc agccatgcac tgaacctcaa cgatatgcgc caattcgccg agatgcacga 3120
cattgaaatc acggtgattg ataacgacac acgcctgcca gcgtttaaag acgcgctgcg 3180
ctggaacgaa gtgtattacg ggtttcgtcg ctaagtagcc gcatccggta tgtaacgcct 3240
gatgcgacgc tgacgcgtct tatctggcct acacgctgcg attttgtagg ccggataagc 3300
aaagcgcatc cggcattcaa cgcctgatgc gacgctggcg cgtcttatca ggcctacgcg 3360
ctgcgatttt gtaggccgga taagcaaagc gcatccggca ttcaacgcct gatgcgacgc 3420
tggcgcgtct tatcaggcct acacgctgcg attttgtagg ccggataagc aaagcgcatc 3480
cggcacgaag gagtcaacat gttagaagat ctcaaacgcc aggtattaga agccaacctg 3540
gcgctgccaa aacacaacct ggtcacgctc acatggggca acgtcagcgc cgttgatcgc 3600
gagcgcggcg tctttgtgat caaaccttcc ggcgtcgatt acagcgtcat gaccgctgac 3660
gatatggtcg tggttagcat cgaaaccggt gaagtggttg aaggtacgaa aaagccctcc 3720
tccgacacgc caactcaccg gctgctctat caggcattcc cctccattgg cggcattgtg 3780
catacgcact cgcgccacgc caccatctgg gcgcaggcgg gtcagtcgat tccagcaacc 3840
ggcaccaccc acgccgacta tttctacggc accattccct gcacccgcaa aatgaccgac 3900
gcagaaatca acggcgaata tgagtgggaa accggtaacg tcatcgtaga aacctttgaa 3960
aaacagggta tcgatgcagc gcaaatgccc ggcgttctgg tccattccca cggcccgttt 4020
gcatggggca aaaatgccga agatgcggtg cataacgcca tcgtgctgga agaggtcgct 4080
tatatgggga tattctgccg tcagttagcg ccgcagttac cggatatgca gcaaacgctg 4140
ctggataaac actatctgcg taagcatggc gcgaaggcat attacgggca gtaa 4194
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
cggtacccgg ggatcggaac accatgcgat taaggtgc 38
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 14
atcgccattt tcgatcccac ttcctgatt 29
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 15
gcagtaaatc tttggcgcct agttggcg 28
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 16
atgcctgcag gtcgagtctg ggacgttgat gacgc 35

Claims (3)

1.一种双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别活化Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01，于28~32℃恒温过夜培养后，挑取一环接种于种子液培养基中，28~32℃，200±20rpm单独培养8-10h，获得种子液；
（2）将步骤（1）所得种子液分别离心8~10min,弃上清液后用预冷的生理盐水洗涤3~5遍,然后用预冷的生理盐水重悬至OD600=6~8,获得Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的菌悬液保存于4℃备用；
（3）将步骤（2）所得两种重悬菌液按照体积比1:2混合后按3%接种量接种于共培养发酵培养基中，谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum GX01和Corynebacterium glutamicum GA01的双菌共培养体系进行发酵培养，得到含L-鸟氨酸的发酵液；
所述共培养发酵培养基配方为:葡萄糖10~30g/L，阿拉伯糖10~30g/L，木糖10~30g/L，K2HPO4·3H2O1~2g/L，KH2PO41~2g/L，MgSO4·7H2O0.25~0.5g/L，(NH4)2SO420~50g/L，MnSO4·H2O0.01~0.04g/L，FeSO4·7H2O0.01~0.04g/L，ZnCl2 1~2 mg/L，CuSO4 0.1~0.2 mg/L，生物素0.1~0.2mg/L，VB1 0.1~0.2mg /L，精氨酸0.01~0.05g/L，用KOH调pH至6.0~8.0，110℃灭菌10 min；
双菌共培养体系于30±2℃、通气比1~2v/vm，搅拌220±20r/min条件下好氧发酵60~80h，即得到含L-鸟氨酸的发酵液；
Corynebacterium glutamicum GX01菌株是将来源于Escherichia coli DH5α的木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB构建整合质粒pK18mobSacB-ΔldhA::xylAB并电击转入L-鸟氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092中进行基因整合并验证筛选，得到的重组菌Corynebacterium glutamicum GX01；
Corynebacterium glutamicum GA01菌株是将来源于Escherichia coli DH5α的L-阿拉伯糖异构酶araA、核糖激酶araB和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶araD构建整合质粒pK18mobSacB-ΔldhA:: araBAD并电击转入L-鸟氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum jp-07092中进行基因整合并验证筛选，得到的重组菌Corynebacterium glutamicum GA01。
2.根据权利要求1所述的双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，所述种子液培养基配方为：葡萄糖10~30g/L，K2HPO4·3H2O1~2g/L，KH2PO40.5~1g/L，MgSO4·7H2O0.4~0.8g/L，尿素2.5~4g/L，MnSO4·H2O0.01~0.04g/L，FeSO4·7H2O0.01~0.04g/L，生物素0.1~0.2mg/L，VB10.1~0.2mg/L，精氨酸0.01~0.05g/L，用H3PO4调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
3.根据权利要求1所述的双菌共培养体系利用混糖原料生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，所述共培养发酵培养基配方为: 葡萄糖20 g/L，阿拉伯糖20 g/L，木糖10 g/L，K2HPO4·3H2O1 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O0.25 g/L，(NH4)2SO440 g/L，MnSO4·H2O0.02g/L，FeSO4·7H2O0.02 g/L，ZnCl2 1 mg/L，CuSO4 0.1 mg/L，生物素0.1 mg/L，VB1 0.1 mg /L，精氨酸0.02 g/L，用KOH调pH至7.0，110℃灭菌10 min。
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微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述;李燕军;赵岩;黄龙辉;李娟;谢希贤;陈宁;;发酵科技通讯(第01期);第54-59页 *
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