CN114456964B - 一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用 - Google Patents

一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母构建方法及其应用。本发明通过插入24‑亚甲基甾醇C‑甲基转移酶基因SMT2和C22‑去饱和酶基因CYP710A11以及过表达基因Arh1，构建高产豆甾醇的解脂亚罗酵母工程菌。优化培养方法后，经验证在摇瓶阶段豆甾醇生产可达48.37mg/L，为豆甾醇的工业化生产奠定了基础。

Description

一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆 甾醇的发酵培养基及应用
【技术领域】
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母及其构建方法，还涉及用于产豆甾醇的发酵培养基，及其在生产豆甾醇中的应用。
【背景技术】
豆甾醇是广泛分布于植物界的甾醇，是一种具有生理价值的物质，它在医药、化妆品、动植物生长及及纸张加工、印刷、食品领域有着广泛的用途。但是豆甾醇与其它植物甾醇结构与性质相似，难以分离。传统豆甾醇的提取多采用植物提取的方式，无论是化学法还是物理法都面临操作工程繁琐、收率低、溶剂安全隐患、排放污染严重以及工业化程度低等缺点，因此豆甾醇单品不仅市场供应不足并且价格较高。
微生物合成是一种成本低、产量高、污染小并且产品纯度高生产方法，广泛应用在生物提取行业。目前针对植物甾醇的生物合成主要以改造酵母菌株为主，这是由于菜油甾醇与微生物来源的主要甾醇(麦角甾醇)的区别在于C7-8和C22-23位是饱和单键，中国发明专利申请CN 113604470 A公开了苟元元等人以解脂亚罗酵母为宿主，敲除了C-22去饱和酶编码基因ERG5以此截断了麦角固醇合成路径，表达了来自斑马鱼的7-脱氢胆固醇还原酶编码的基因DHCR7并且表达强启动子TEF30，获得高产菜油甾醇。
菜油甾醇和谷甾醇的合成路径区别在于，在合成24-亚甲基苯酚后没有甲基转移酶合成24-亚乙基苯酚，而谷甾醇与豆甾醇的区别在于C22-23是饱和单键。如果在甾醇合成通路上添加24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶以及C22-去饱和酶，可以将菜油甾醇转化为豆甾醇。目前还没有直接合成的豆甾醇工程菌，可能是由于以下几个方面原因：①豆甾醇合成通路上的24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因以及C22-去饱和酶基因存在于植物、藻类或藓类上，野生型菌株中不存在；②细胞膜上脂质双层酰基链的堆积密度受甾醇组成的影响，豆甾醇增强膜秩序的能力小于菜油甾醇和谷甾醇，高含量的豆甾醇可能会导致胞内的氧化还原调节、激素转运和信号传导受到影响；③豆甾醇在对不利温度的耐受中发挥作用，目前的生物发酵更追求微生物在适宜的环境下生长，没有对温度胁迫的发掘；④发明人认为目前针对生产豆甾醇的生物改造通常目标为通路上基因的表达，对于物质合成的能量供给关注较少，导致能量无法供给合成豆甾醇的相关物质，不能达到生物合成的要求。
本发明针对目前缺少直接生物合成的豆甾醇工程菌，工程菌培养时豆甾醇组成的膜秩序能力不强，缺乏增加豆甾醇含量的工程菌培养方法以及没有发现增强酶的基因等问题，发明了一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母构建方法及其应用。通过大量实验研究与分析总结，终于完成了本发明。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，并提供其构建方法。
本发明的另一个目的是通过所述重组解脂亚罗酵母实现高产豆甾醇，并提供其培养方法及培养基。
本发明的思路是采用24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2和C22-去饱和酶基因CYP710A11这两个合成豆甾醇通路上的必须基因，尝试对插入了这两个基因的重组工程菌株作进一步改进，使酵母能高产豆甾醇。
基于此，本发明提供一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母是通过插入24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2和C22-去饱和酶基因CYP710A11，并过表达基因Arh1得到的重组解脂亚罗酵母工程菌。
在本发明中，所述24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2来自小立碗藓、序列如SEQ ID NO.1所示；所述C-22去饱和酶基因CYP710A11来自番茄序列如SEQ ID NO.2所示、来自烟草序列如SEQ ID NO.3所示、或来自小立碗藓序列如SEQ ID NO.4所示；所述的Arh1基因来自解脂亚罗酵母，其序列SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供上述重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2的工程菌
合成经密码子优化后的小立碗藓24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因PpSMT2，以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述基因PpSMT2，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-PpSMT2，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母菌株中，获得重组解脂亚罗酵母菌株YL-PpSMT2，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
(2)构建含有C-22去饱和酶基因的工程菌
分别合成经密码子优化后的来自番茄、烟草和小立碗藓的C-22去饱和酶基因序列SlCYP710A11、NaCYP710A11和PpCYP710A1，经密码子优化后分别以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述C-22去饱和酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SlCYP710A11、ploxpura3loxp-NaCYP710A11和ploxpura3loxp-PpCYP710A1，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(1)得到的YL-SMT2中，获得的重组菌株分别记为YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(3)工程菌的Arh1基因的过表达
获取解脂亚罗酵母的全基因组后，得到目的基因Arh1，将基因Arh1连接到载体pJN44的多酶切位点上，得到质粒pJN44-Arh1；所得质粒通过酶切验证后分别转入步骤(2)的重组菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1中，得到高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+、YL-PpSMT2-NaCYP710A11-Arh1+和YL-PpSMT2-PpCYP710A11-Arh1+，所得重组菌株经菌落PCR验证正确。
在本发明中，所述菌落PCR验证的反应体系如下：
Figure BDA0003548464870000041
PCR程序：
Figure BDA0003548464870000042
进一步地，为了适应发酵罐培养，本发明的方法还优选地包括对所得重组解脂亚罗酵母去除ura3标记的步骤。去除重组工程菌株的ura3标记是本领域的现有技术，例如利用ploxp-ura3-loxp为载体构建敲除质粒，将构建好的敲除质粒选择合适的酶切位点线性化转入步骤(3)得到的重组菌株，挑取正确的菌落，提取基因组DNA验证双交换结果，在菌株中转入pJN44-cre，及逆行定向切割，利用PCR验证ura3成功后，连续培养3-5代去除菌体中的pJN44-cre；所得重组解脂亚罗酵母在SD-ura培养基上培养，所述SD-ura培养基上生长的单菌落即为去除了ura3标记的高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母。
基于此，本发明还提供上述重组解脂亚罗酵母在生产豆甾醇中的应用。
优选地，所述重组解脂亚罗酵母能够以浓度小于2g/L的葵花籽油、大豆油或牡丹籽油为碳源生产豆甾醇，在摇瓶阶段实现产量48.37mg/L。
为此，本发明还提供一种有利于产豆甾醇的培养基，所述培养基含有以重量体积比计0.35％植物油和0.01-0.1％神经酰胺，所述植物油选自葵花籽油、大豆油或牡丹籽油。
根据一种优选的实施方式，所述培养基还含有以重量体积比计葡萄糖2％，酵母粉1％和蛋白胨2％。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次利用代谢工程与生物合成技术，通过在解脂亚罗酵母体内引入外源的24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶SMT2和在菜油甾醇合成通路末端添加C22-去饱和酶基因CYP710A11，并通过提高活性基因Arh1在解脂亚罗酵母内的表达以实现高含量的豆甾醇，本发明通过增加豆甾醇的生物合成通路以及提高C22-去饱和酶活性，通过提高电子转移，靶向提高NADPH到基因CYP710A11的通量，从而实现高效的豆甾醇生物合成。整个过程工业化程度高，快捷，无污染，原料限制程度小，具有广阔的应用前景。
2、本发明提供的生产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+制备的豆甾醇产量，在摇瓶阶段可达48.37mg/L。
3、本发明提供了一种高效豆甾醇的重组解脂亚罗酵母菌株的发酵方法，在常规配方方法的基础上，添加了神经酰胺并且降低了培养温度，由于细胞膜的脂质双层酰基链的堆积密度是受甾醇组成的影响，而菜油甾醇的排序能力要高于豆甾醇，但是为了提高豆甾醇的产量，本发明特别添加了神经酰胺，在膜上通过鞘脂糖基肌醇磷酸神经酰胺-豆甾醇相互作用域，可以增强豆甾醇的排序能力，并且所导入的外源基因可以通过环境胁迫将菜油甾醇更多的转化为豆甾醇，进一步提高豆甾醇的产量。
【附图说明】
图1为豆甾醇合成途径。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
本发明采用的仪器、试剂皆为普通市售品，皆可在市场购得。
本发明设计以下培养基：
LB培养基(w/v)：蛋白胨1％，氯化钠1％，酵母粉0.5％，固体培养基加入1.7％琼脂粉；
YPD培养基(w/v)：葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨2％，固体培养基加入1.7％琼脂粉；
SD-ura培养基(w/v)：葡萄糖2％，(NH4)2SO40.5％，YNB(Yeast nitrogen base)0.17％，Drop-out Mix Synthetic Minus Tryptophan w/o YNB0.2％，固体培养基加入2.5％琼脂粉；
SD-LEU培养基(w/v)：葡萄糖2％，(NH4)2SO4 0.5％，YNB(Yeast nitrogen base，without amino acids and ammonium sulfate)0.17％，Drop-out Mix Synthetic MinusTryptophan w/o YNB 0.2％，固体培养基加入2.5％琼脂粉；
发酵培养基(w/v)：葡萄糖4％，(NH4)2SO4 1.51％，YNB 0.85％，KH2PO4 1.25％，MgSO4·7H2O 0.25％，Uracil 1％。
下列发明涉及以下基因
表1. 24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因及其来源
Figure BDA0003548464870000061
Figure BDA0003548464870000071
表2.C-22去饱和酶基因及其来源
Figure BDA0003548464870000072
表3.Arh1基因及其来源
Figure BDA0003548464870000073
本发明涉及以下引物：
表4引物
Figure BDA0003548464870000074
Figure BDA0003548464870000081
本发明涉及的菌落PCR验证的反应体系如下：
反应体系：
Figure BDA0003548464870000082
PCR程序：
Figure BDA0003548464870000083
在本发明中，豆甾醇产量的提取检测方法是取3～5ml发酵液，4000～6000r/min离心10～15min后弃上清，将下层转入100ml锥形瓶中，加入8～10g NaOH和32～40ml 60％的乙醇溶液，80～90℃皂化1.5～2h。冷却后加入10～15ml水，25～30ml石油醚，震荡10～15min，静置待分层后取上层，使用石油醚稀释10～15倍，在波长280nm下测定，计算豆甾醇浓度及产量。
公式如下：
豆甾醇产量(mg/L)＝C×V×F×1000/V0
式中：C为样品中豆甾醇浓度(mg/ml)；V为萃取溶剂体积；F为稀释倍数；V0为所取发酵液体积(ml)。
实施例1构建含有24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因的工程菌
从NCBI上获取来源于小立碗藓的24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因序列PpSMT2，根据序列使用prime5.0设计引物，送生工优化合成后于载体ploxp-ura3-loxp经酶切简介获得重组质粒，具体基因序列如SEQ ID NO.1所示。
以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-PpSMT2，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入重组菌株YL中，获得重组菌株记为YL-PpSMT2，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确。
相关重组菌株基因型为：
Figure BDA0003548464870000091
实施例2构建含有C-22去饱和酶基因的工程菌
从NCBI上获取来源于番茄(SlCYP710A11)、烟草(NaCYP710A11)和小立碗藓(PpCYP710A1)的C-22去饱和酶基因序列，根据序列使用prime5.0设计引物，送生工优化合成后于载体ploxp-ura3-loxp经酶切简介获得重组质粒，具体基因序列如SEQ ID NO.2～4所示。
分别以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述C-22去饱和酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SlCYP710A11、ploxpura3loxp-NaCYP710A11、ploxpura3loxp-PpCYP710A1，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入实施例1得到的YL-PpSMT2中，获得重组菌株分别记为YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确。
相关重组菌株基因型为：
Figure BDA0003548464870000101
实施例3工程菌的Arh1基因的过表达
获取出发菌株即解脂亚罗酵母的全基因组后，得到如SEQ ID NO.5所示的目的基因Arh1，将基因连接到载体pJN44的多酶切位点上，得到质粒pJN44-Arh1；将获得的质粒通过酶切验证后分别转入实施例2的重组菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1中，得到高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，所得重组菌株经菌落PCR验证正确。
所得重组菌株基因型为：
Figure BDA0003548464870000102
实施例4重组解脂亚罗酵母在摇瓶中的发酵结果
分别将实施例1、实施例2和实施例3中的菌株1-8在YPD固体培养基上划线活化，生长48h后，得到单菌落；
挑取单菌落接入10mL/mL的小瓶液体YPD培养基中，在28℃、200rpm条件下培养24h，得到种子液。将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量转移至50mL/250mL的液体YPD培养基中，所述液体YPD培养基中添加以重量体积比计0.35％葵花籽油和0.01％神经酰胺，在30℃，200rpm条件下培养48h后，将培养基中的菌体置于50mL无菌离心管中，8000-12000rpm离心5min，去上清，收集细胞转移至50mL/250mL添加0.35％植物油和0.01％神经酰胺的YPD培养基中进一步发酵96h，收集细胞进行豆甾醇提取检测，记录不同菌落获得的豆甾醇含量及菌液的OD值。
不同菌株豆甾醇产量：
Figure BDA0003548464870000111
实验发现，尽管24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2和C22-去饱和酶基因CYP710A11是合成豆甾醇通路上的必须基因，然而仅仅插入这两个基因后，菌株3-5与1-2相比证明转入基因CYP710A11后确实可以将菜油甾醇转化为豆甾醇，但产量较低。而进一步过表达Arh1基因后，菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+在合适的条件下的豆甾醇含量最高，产量大幅提高，表明过表达Arh1基因提高了合成豆甾醇的通量。
实施例5重组菌株在摇瓶中不同温度下生产豆甾醇的含量比较
将实施例4中离心后收集的菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+转移至50mL/250mL的YPD培养基中，设置3组不同温度梯度的摇瓶发酵实验，发酵培养基添加重量体积比计0.35％葵花籽油和0.01％神经酰胺，控制发酵温度分别为25℃、28℃和30℃，发酵96h结束，取10mL发酵液于50mL离心管中，8000-12000rmp离心5min，去上清，收集菌体，进行豆甾醇的提取于检测，记录不同温度获得的豆甾醇含量及菌液的OD值。
不同温度下豆甾醇产量
Figure BDA0003548464870000121
通过实施例5发现，菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+在不同温度下豆甾醇产量是不同的，虽然菌株OD值在30℃时最高表明此温度为最适生长温度，但是豆甾醇产量在28℃时最高，印证了豆甾醇的合成与温度相关，温度相对较低时豆甾醇合成更高，但更低的温度会导致菌株生长受限，所以28℃为重组菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+生产豆甾醇的最适温度。
实施例6重组菌株在摇瓶不同神经酰胺浓度下生产豆甾醇的含量比较
将实施例4中离心后收集的菌株转移至50mL/250mL的YPD培养基中，设置5组不同神经酰胺浓度的摇瓶发酵实验，培养基添加重量体积比计0.35％植物油，5组培养基分别添加0，0.001％，0.005％，0.01％，0.02％神经酰胺，控制发酵温度28℃，发酵96h结束，取10mL发酵液于50mL离心管中，8000-12000rmp离心5min，去上清，收集菌体，进行豆甾醇的提取于检测，记录不同温度获得的豆甾醇含量及菌液的OD值。
不同神经酰胺含量对豆甾醇产量的影响：
Figure BDA0003548464870000131
通过实施例6发现，神经酰胺的浓度与豆甾醇的产量和生长速率呈正相关，但是当浓度大于0.01％后，豆甾醇生产效率和菌株生长速度增速放缓。这可能是由于当合成豆甾醇较多时细胞膜结构会受到损伤，影响细胞生长发育，导致发酵体系中的豆甾醇达到一定浓度时，重组菌不再产豆甾醇。因此，在不含有神经酰胺的培养基中，豆甾醇的最终产量较低。而培养基中的神经酰胺能与豆甾醇相互结合，增加细胞膜膜序，在本发明选择的较低发酵温度(28℃)下能对酵母产生胁迫，刺激豆甾醇合成，以大幅提升产物浓度。以上结果证明添加神经酰胺保证了细胞膜的膜序，保证了豆甾醇的生长效率以及菌株的生长状态。
综上所述，本发明首次实现通过重组解脂亚罗酵母发酵产生高含量的豆甾醇，在摇瓶阶段产量达48.37mg/L，其工业化程度高，快捷、无污染，原料限制程度小，具备广阔的应用前景。
序列表
<110> 陕西海斯夫生物工程有限公司
<120> 一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1122
<212> DNA
<213> 来自小立碗藓的24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2(Physcomitrium patens)
<400> 1
atggggagcg taggtggaag tggaggtagt gggacggagg cgtgggcgac gtgggggatg 60
ttcttgggtg caatgggtgc tatgggtgcc ggtgcatact acatgctggt gatgacaggc 120
gcagcggagc ggaaaggcaa gcgggctgtg gatttaggag gtgggagtat cacccgggag 180
caagtgaaga gcagttacca gaaatacgcc tcgtttttcg agaaaccgaa gcagatcgag 240
gcgaaggaca acgtgccgaa cttcgtggat actttctaca atttggtgac ggatatctat 300
gagtgggggt gggggcagag cttccatttc tcgcctgcgg tgcctgggaa gtcgcacaag 360
gagtcgacgc ggatacatga ggagcgtgtg gtggatctgc tggggctgaa gcctggggag 420
aaggtgttgg acgtgggatg tggcgttggc ggacccatgc gggcaatcgc ggcgtactcg 480
caagcgtttg tgactggtat cactatcaac gactaccagg tggagcgcgc gaggagccac 540
aataagaaag cagggctaga tagattgtgc gaggttgtgt gcgggaactt cttgcagatg 600
cctttcgaag acaacagctt cgacggcgct tattccatcg aggcgacgtg ccatgcaccg 660
gagctgaagg atgtatactc ggaggtgttc cgggtgctga aacctggtca cctgtacgtg 720
acgtacgagt gggtgactac ccctctgttc agggcggaca atgctgagca cgtggagtgc 780
attcacggca ttgagcacgg ggacgcgctt cccggcctga ggagttacaa gcaggtgggc 840
gagattgcga aggaggtggg gttcgttgtg ctggaggaca gggacctggc attgccaccc 900
gcgaaaccct ggtggacccg cctgaagatg gggcgtttgg cgtactaccg gaatcatctg 960
atgatcgcgt tgttgtcatt cctgggtatt gctccgaagg gcgtggtgga tgtgcacgag 1020
atgctcttta agacggccga ccatttgacc cgtggagggg aaacagggat cttcagcccc 1080
atgcatttgc tgttgctgca gaagccagaa aagagctcgt ga 1122
<210> 2
<211> 1506
<212> DNA
<213> 来自番茄的C-22去饱和酶基因CYP710A11(Solanum lycopersicum)
<400> 2
atggcatcca tttggggttt gttatctcca tggatacctt atttcatttc tttcatagct 60
tttttacttc ttcttgaaca gatctcttac atcaagaaga agcgttttct tcctggccca 120
actcttgtat tccccttcct tggcaacgta attcccttag tcacaaatcc aactaaattc 180
tgggaccttc aatcagcttt agctaagtct actagccatg gtttttctgt taactacatc 240
ataggtaagt tcattcttta catccactca actgacctct ctcataaggt ctttgccaat 300
gtccgccctg acgctttcca tcttatcggt cacccttttg ggaaaaagct attcggcgaa 360
cataacttga tttacatgtt tgggcaagaa cataaagacc ttcgccgacg aattgcccca 420
aattttaccc ctaaagctct gggaacttac actgatattc aacagaggat tattatcaaa 480
cacttcaagt cctggttaga tgaagcatcc aaatccccta acaccccaat cccgcttcgt 540
ctactttgca gggatatgaa cttggatact tctcagactg tgttcgttgg tccatacttg 600
gatggagaat cgagaaagag atttaatgtt gattacaatt acttcaatgt tgggttaatg 660
aaacttcctg ttgatttacc gggttttgcc ttcagaaatg ctagattagc agttgggaga 720
ttagttgaca ccctttcggt ttgtgtggaa caaagcttaa acaagatgaa aaacgaagaa 780
gaacccacat gcttgattga tttctggatg caggaaaatt taagagagat taacgaagct 840
aagatcaatg gattacaaaa gccatttcag tacagtaaca aggaacttgg aggttacctg 900
ttcgacttcc tctttgctgc tcaagatgct tctacttctg ctctgttatg ggcaatcgtg 960
cttctagatt ctcacccaca agttctggag aaagttcggt cggatgtagc gagattctgg 1020
tcgccagaat ctgaggagcc gctgacggcg gaaatgctca gggaaatgaa gtacctggaa 1080
gcggtggcgc gtgagataat cagaatcaga gctccggcga caatggtgcc acatattgcc 1140
ggcgaagaat tccggttaac cgaagattac gttatcccaa aaggaacaat tgtgttcccg 1200
tcggtttttg attcatcatt tcagggtttt cctgaaccgg agaaatttga accggaccgg 1260
ttcatggagg agagacaaga ggagcgggtt tacaaaaaga actttctagc atttggtgct 1320
gggccccatg cgtgtgtcgg ccagaagtat gctattaacc acttgatgct tttcattgct 1380
atgtttacgg ctctgattga tttcaagaga cacaaaaccg acggctgcga tgacatctcg 1440
tatattccaa ccattgctcc aaaggatgat tgcaaagttt tccttgcaca caggtgcaca 1500
cgatga 1506
<210> 3
<211> 1521
<212> DNA
<213> 来自烟草的C22-去饱和酶基因CYP710A11(Nicotiana attenuata)
<400> 3
atggcatcca tttgggtcat tctatcccca tggacacctt atttcttctc cttcatagct 60
cttctacttc ttcttgaaca gatctcttac ctgaaaaaga agcgttttat tcctggtcca 120
actctagtct tccctttcct cggcaacgtg atttctttaa tcaccaatcc caccaaattc 180
tggcaagacc aaacctcttt cgccaagtct acacgccatg gcttctgtgc taactacatc 240
atcggtaagt tcattctctt tattcactcc actgaccttt cccacaaagt cttcaccaat 300
gtccgtcctg acgctttcca cctcatcggt cacccttttg ggaaaaggct atttggcgag 360
cataacttga tttacatgtt tggtcaagaa cataaagacc atcgccgtcg aatggcccct 420
aattttaccc ctaaagctct tgctacttac actgttatcc aacaaaagat tattatcaag 480
cactttcagt cctggttgga cgaagcatcc aaatccccta acaaaccaat cacacttcgc 540
ctcctttgtc gcgatatgaa cttggatact tctcagactg tcttcgtcgg cccatactta 600
aacgaaggtt ccagaaagcg gttcaatgtt gactacaatt acttcaatgt tgggttaatg 660
aaactccctg ttgatttacc cggtttcgcc ttcagagacg ctaggttagc tgttggcaga 720
ctagttgata cgctttccgt ttgtgcagca cagagccaaa agaagatgcg aggtgacgaa 780
gaacccacgt gcttaattga tttttggatg caggagtatt tcagagagat tcaggaagct 840
aagattaatg gttcacaaaa gccgtttgag tataccggca aggaacttgg tggctactta 900
tttgacttcc tctttgcggc tcaagatgct tctacttctt ctctgttatg ggcagtggtg 960
cttttggaat ctcacccgca agttctggag agagtccggt cggaagtggc gaaattctgg 1020
tcgccagaat ctgagaagcc gttgacggcg gagatgctta gggaaatgaa gtacctggag 1080
gcggtggcgc gtgaggttgt caggatcaga actccggcga ctttggtgcc gcacattgcc 1140
ggcgaagaat tccggttaac tgatgattat gttattccaa aggggactat tgttttcccg 1200
tcggtttttg actcgtcttt ccaggggttt cctgaaccgg agaagtttga cccggaccgg 1260
tttatggagg agaggcaaga ggaacgagtt tacaagaaga actacctagc atttggagct 1320
gggccccatg gatgtgtggg acagaggtac gcaataaacc atttgatgct cttcattgcg 1380
ttgtttacgg ctctgattga tttcaagagg cacaaaacgg acggctgtga tgatatcgcg 1440
tatattccaa ccattgctcc aaaggatgat tgcaaagtgt tcctttcaca gaggtgcact 1500
cgattcccat ctttttcata a 1521
<210> 4
<211> 1137
<212> DNA
<213> 来自小立碗藓的C-22去饱和酶基因CYP710A11(Physcomitrella patens)
<400> 4
atgttcgggg aagagcataa agatttgcgc cgccgactcg cgccgttatt cacgactaag 60
tcgttgggcg tgtacatatc aatccaagag aagacacaga aggagcatat tgccaagtgg 120
atggccattg caaaggatct tggcgatgac ccaattcgcg tacgcatgct ctgcagaaac 180
atgaatctgg agacctccca gaacgtcttt gtgggcccat acctcacgcc ggatatgcgc 240
agacagttcg acgaggacta caaaaacttc aacaccgggc tcatgagctt gcccatcaac 300
ctcccagcct tttcattcta taaagctacg cgatcggtga gaaatatcca aaacatgctc 360
acaaaatgcg caacagctag caaagcaagg atggcgatgg gagaaaaccc ttcttgtctg 420
atggacttct ggatgatcga aactgtgcgg gaacttcggg acgctgaagc cgcaaacact 480
cctccccctc cccattcttc cgactacgaa attggctgcc acctctttga cttcctcttc 540
gcagctcaag acgcatccac atcctccctg gtctgggcga taaccctgat cgaatcgcat 600
ccctacgtgc tggagaaact acgagaagag cttttgtgtc tacgtcctga tcctttggcg 660
ccctacactc cagaatcatt gcgggagatg aagtataccg aaatggtggt gaaggaggta 720
ctacgctacc gacctccagc aaccctggtt cctcacattg ccaacacgga cttcgccttg 780
acggacacat acaccgttcc caaaggcacc attgtcttcc cttctttgct ggattcatcg 840
ttccagggct tcaaggaccc tgaagtcttc gatccagagc gattctcccc agaacgaatg 900
gaggatctag tgtacaagaa gaactggttg ttgttcggag ctgggccgca tcaatgcatc 960
ggacaacgat acgccatcaa ccagcttatg cttttcatct ccctcttctt cacacaggtg 1020
gatgtaaagc gagctagaaa gccagggtgt gacgatctgg tgtacacacc caccattgca 1080
cccaaagacg aaggcctagt ttatctttcc ccccggattg taaaacaaaa agattaa 1137
<210> 5
<211> 1395
<212> DNA
<213> 来自解脂亚罗酵母的基因Arh1(Yarrowia lipolytica)
<400> 5
atgatccgat cagttcgcca cctatcgact ctcagatcga ctcctcgtgt cgctgtcgtt 60
ggagcaggcc ctgcaggctt ctacactgcg caccggttgc tcaagctcca gccagacacc 120
aagatcgacc tttttgaaag cctgcctgtg ccttacggac tggctagaca tggagtagca 180
ccggatcatc cggaggtaaa gaactgccag gacacgttcg acgaggttgg aaacgacccc 240
cgtgtccagt tctttggcaa cgtgactgtc ggagacaccc tacctgtgtc caagctcaga 300
gacaactaca atgctgtggt tctatcttac ggcacccata cagataggaa gctaggtatt 360
cccggagagg acctgcccgg tgtcatttct gcacgaacgt ttgtcaattg gtacaatggt 420
caccccgagc atgaaagtct caaccctcct ctccacaagg ccgaaacagt gacaattgtg 480
ggaaacggaa acgtggctct ggatattgct cgcatcctgc tatcccctct cgaccacctc 540
aagtctacag atatcacaca gcaggcgtac gagacgctca agacgtccaa ggttaagcgg 600
gtgcgaatca tggcccgacg aggactgcta gagtctgcat tcacaatcaa ggagatccga 660
gaactcttca agctgcccga tacaggcttt gtcgcgtttc ctcatacgaa atgggacgat 720
gtgctagctg cccacaagag ctacaagcgt cctctttctc gaattgtcaa gctcatcgag 780
gagtacaatc tcaaggccaa gcagagggac cctgctcatg catccaccct caaacaatgg 840
tcattagact accttctttc acccaaggag gtgatcgcga accccgacga ccccgaactc 900
gtcaagactc ttatcgctac ggaaaacaaa cttgtttctg ctgacggctc tggacgaatc 960
ggagtggagc ctactggtgt taccgagagc ttcgacaccg acctgatctt caccagtatc 1020
ggatatgcat ctactcctct ggagggcatt ccttttgacg accgaaaaag cgtcattccg 1080
tcttctagag gccgagtaac tgacaatggg gtctacgctg caggatgggt caagaacgga 1140
cccaccggtg tgattgccac cactatggca gactcatttg acacagcaca ggctatttcc 1200
gacgatataa ccgccggcaa gcttgatggt gccaagtctg gttccgataa cctcacccag 1260
tatcttgagg atgccatttc atgggaccag tggaagaagc tggaggccca tgaacacagc 1320
cagggtgatg ccgcaggtaa gcccagagaa aaggtcaaca atgttgccaa gatgttggag 1380
attgctcgac agtga 1395

Claims (6)

1.重组解脂亚罗酵母发酵生产豆甾醇的方法，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母是通过插入24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2和C22-去饱和酶基因CYP710A11，并过表达基因Arh1得到的重组解脂亚罗酵母工程菌；所述24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2来自小立碗藓、序列如SEQ ID NO.1所示；所述C-22去饱和酶基因CYP710A11来自番茄序列如SEQID NO.2所示、来自烟草序列如SEQ ID NO.3所示、或来自小立碗藓序列如SEQ ID NO.4所示；所述的Arh1基因来自解脂亚罗酵母，其序列如SEQ ID NO.5所示；
取所述重组解脂亚罗酵母的种子液以体积比2%的接种量接种至含有50mL液体YPD培养基的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养48h后，将培养基中的菌体置于50mL无菌离心管中，8000-12000rpm离心5min，去上清，收集细胞转移至装有50mL含有以重量体积比计0.35%植物油和0.001-0.01%神经酰胺的培养基的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下进一步发酵96h，收集细胞进行豆甾醇提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母的构建方法包括以下步骤：
（1）构建含有24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因SMT2的工程菌
合成经密码子优化后的小立碗藓24-亚甲基甾醇C-甲基转移酶基因PpSMT2，以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述基因PpSMT2，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-PpSMT2，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母菌株中，获得重组解脂亚罗酵母菌株YL-PpSMT2，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（2）构建含有C-22去饱和酶基因的工程菌
分别合成经密码子优化后的来自番茄、烟草和小立碗藓的C-22去饱和酶基因序列SlCYP710A11、NaCYP710A11和PpCYP710A1，经密码子优化后分别以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述C-22去饱和酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SlCYP710A11、ploxpura3loxp-NaCYP710A11和ploxpura3loxp-PpCYP710A1，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入步骤（1）得到的YL-PpSMT2中，获得的重组菌株分别记为YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(3)工程菌的Arh1基因的过表达
获取解脂亚罗酵母的全基因组后，得到目的基因Arh1，将基因Arh1连接到载体pJN44的多酶切位点上，得到质粒pJN44-Arh1；所得质粒通过酶切验证后分别转入步骤(2)的重组菌株YL-PpSMT2-SlCYP710A11、YL-PpSMT2-NaCYP710A11和YL-PpSMT2-PpCYP710A1中，得到高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母YL-PpSMT2-SlCYP710A11-Arh1+、YL-PpSMT2-NaCYP710A11-Arh1+和YL-PpSMT2-PpCYP710A1-Arh1+，所得重组菌株经菌落PCR验证正确。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述菌落PCR验证的反应体系如下：
10mM上游引物1μL，10mM下游引物1μL，菌液模板1μL，Premix Taq 10μL，ddH2O 7μL，反应体系20μL；
PCR程序：
预变性 94℃ 4min，变性 94℃ 30s，退火 54℃ 30s，延伸 72℃ 1min30s，终延伸 72℃ 10min，保温 4℃，32个循环。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法还包括对所得重组解脂亚罗酵母去除ura3标记的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物油选自葵花籽油、大豆油或牡丹籽油。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养基还含有以重量体积比计葡萄糖2%，酵母粉1%和蛋白胨2%。
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