CN114214219A - 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌，该基因工程菌为含有甲酸脱氢酶基因FDH、1,5‑二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO与磷酸核酮糖激酶基因PRK的重组酿酒酵母菌，且其经过了敲除FFAs分解代谢途径的相关基因的底盘微生物改造。该基因工程菌安全无毒性，能够使微生物利用二氧化碳及其衍生物甲酸发酵生产FFAs，且环境友好，生产成本较低，应用前景广阔。

Description

一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌及其应用。
背景技术
近年来，大量的化石燃料燃烧和过量的温室气体排放已严重影响环境和气候。大气中的CO2浓度在过去的40,000年中一直稳定在200-280ppm，但在最近50年中，浓度急剧上升至近400ppm，这种非线性增长仍在持续，到2050年，二氧化碳水平很可能会达到500ppm，与1900年的水平相比，这可能将导致全球平均温度上升2℃，如此严重的全球温度变化将不可避免地增加冰川崩解的风险并造成负面的连锁效应。随着合成生物学技术的不断发展，科学家渐渐开辟了一条为人类活动提供绿色环保替代品的道路(利用微生物生产生物燃料及化学品)，以期达到碳中性的社会生产与发展模式。例如在汽油中不断的提升生物乙醇的混合比例，从而降低温室气体的排放并一定程度的减少了对化石燃料的需求。
基于第三代生物炼制概念的提出，旨在利用大气中的CO2和可再生能源，例如光、废水中的无机化合物、光伏电池和风能等可持续资源产生的电能来进行生物生产。与第一代和第二代生物炼制相比，第三代生物炼制极大地降低了原料加工成本，对食品和水源供应的安全威胁降低很多。因此，研究人员在第三代生物炼制(CO2利用)方面已经取得了较大的进展，例如，已经验证了多种天然和合成的CO2固定途径，并建立光能电能的能量捕获技术，部分微生物固碳技术已成功应用并在商业化模式下进行运转，例如lanza Tech公司与宝钢集团合作建立的利用钢厂废气CO、CO2等气体进行生物乙醇的生产。以CO2为原料的微生物制造的关键挑战是有效地固定大气中的二氧化碳和有效地捕获可再生能源用于生物生产。自养微生物可以利用CO2维持细胞生长，但是它们可能无法在工业条件下定向地高效地生产燃料或化学物质。为了实现CO2微生物利用的目标，已经利用合成生物学的基因编辑手段将自养生物进行改造以进行化学品的生产，另外也将CO2固定途径整合到了异养微生物细胞工厂中进行CO2的利用。因此本发明旨在利用CO2与CO2的衍生产物甲酸来生产乙酰辅酶A衍生产物。
游离脂肪酸(FFAs)可以按照碳链长度，偶数与奇数碳含量以及直链与支链等多种方式进行分类。在化学中，特别是在生物化学中，脂肪酸是具有长脂族链的羧酸，其为饱和或不饱和的。大多数天然存在的脂肪酸具有4到28个偶数个直链的碳原子。脂肪酸通常在生物体中不以独立形式存在，而是以三大类酯形式存在：甘油三酸酯，磷脂和胆固醇酯。无论哪种形式，脂肪酸都是饮食动物重要的燃料来源，它们是细胞的重要结构成分。脂肪酸可用于肥皂与一些化妆品的生产，也用作润滑剂。脂肪酸还可以通过其甲酯转化为脂肪醇和脂肪胺，它们是表面活性剂，清洁剂和润滑剂的前体。脂肪酸与较简单的醇(例如甲酯，乙酯，正丙酯，异丙酯和丁酯)形成的酯可用作化妆品和其他个人护理产品中的润肤剂，并用作合成润滑剂。脂肪酸与更复杂的醇(例如山梨糖醇，乙二醇，二甘醇和聚乙二醇)进行酯化用于个人护理和水处理，或用作合成润滑剂或金属加工液等。
FFAs的生产方法主要有化学法和微生物发酵法。化学法是通过是通过烯烃的加氢羧化反应合成的，但该耗能较大，且前体不易获得。与化学法相比，微生物发酵法生产FFAs是目前较具前景的方法，其在代谢工程技术和合成生物学技术的推动下，发展潜力越来越大，优势日益明显。
因此，目前存在的问题是需要发明一种新的方法，旨在利用CO2与CO2的衍生产物甲酸根来生产FFAs，并进一步地提高FFAs的产量。
发明内容
本发明的目的之一是针对现有技术的不足提供一种基于甲酸根生产游离脂肪酸的基因工程菌，该基因工程菌在微生物发酵过程中能够利用甲酸根来提升FFAs产量，利用二氧化碳及其衍生物甲酸，减少碳排放并降低生产成本。
本发明的目的之二是提供上述基因工程菌在生产FFAs中的应用。
为此，本发明提供了一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌。
根据本发明，其利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的途径如下：
(1)葡萄糖在微生物体内转化为游离脂肪酸合成前体物质乙酰辅酶A，并经过菌株本身具有的脂肪酸合成途径合成游离脂肪酸；
(2)甲酸盐在发酵时进行添加后，转入微生物体内，在外源表达的甲酸脱氢酶的作用下转化为CO2，同时产生游离脂肪酸生产所需要的还原力；
(3)甲酸根转化为的CO2以及细胞内本身由葡萄糖转化产生的CO2，在外源表达1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶及磷酸核酮糖激酶的作用下转化为游离脂肪酸合成的前体物质乙酰辅酶A；
(4)来源于甲酸根及葡萄糖的乙酰辅酶A经过游离脂肪酸合成途径最终转化为游离脂肪酸。
根据本发明的一些实施方式，所述利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌为异源表达外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH和过表达卡尔文循环模块中关键基因的重组酿酒酵母菌。
在本发明的一些实施例中，所述外源性编码甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase)的基因FDH包括来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的基因FDH1或来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)且经过密码子优化的基因FDH1、来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae N10)的基因FDH2或来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae N10)且经过密码子优化的基因FDH2、来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的基因FDH3或来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)且经过密码子优化的基因FDH3、来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)的基因FDH4或来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)且经过密码子优化的基因FDH4，以及分别基于上述基因FDH1-4的不引起所述甲酸脱氢酶功能改变的基因取代(突变体)。
在本发明的另一些实施例中，所述卡尔文循环模块中的关键基因包括编码1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RuBisCO或经过密码子优化的编码1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RuBisCO，和/或编码磷酸核酮糖激酶的基因PRK或经过密码子优化的编码磷酸核酮糖激酶的基因PRK。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造获得的重组酿酒酵母菌，所述底盘微生物改造包括游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因的敲除。
本发明中，所述游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因包括编码脂肪醛脱氢酶的基因hfd1、编码脂肪酰基辅酶A氧化酶的基因pox1、编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa1和编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa4。
本发明还提供了如本发明上述基因工程菌在生产游离脂肪酸中的应用。
根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产游离脂肪酸。
在本发明的一些实施例中，将所述基因工程菌进行发酵培养，并在发酵阶段添加含甲酸根的化合物，生产游离脂肪酸；优选地，含甲酸根的化合物为甲酸盐。
在本发明的一些优选的实施例中，在摇瓶发酵中，通过添加20g/L葡萄糖并在24小时加入2-7.2g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸。
在本发明的另一些优选的实施例中，在5L发酵罐发酵中，通过葡萄糖连续补料并每12小时添加5g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸。
本发明对酿酒酵母从三个方面来进行改造，包括FFAs合成菌株的底盘微生物改造(包括FFAs分解代谢途径的阻断)、甲酸利用途径的构建以及甲酸利用关键酶的筛选与卡尔文关键固碳基因的引入，最后构造一株高效利用甲酸及CO2来生产乙酰辅酶A衍生产物游离脂肪酸的重组酿酒酵母。本发明中所提出的方法是首次利用甲酸钠盐作为辅助碳源来提升菌株FFAs生产的方法，该方法可以大幅度提升菌株FFAs产量。最终本发明所构建的重组酿酒酵母可以在含有葡萄糖的基础培养基中添加甲酸钠盐的情况下，FFAs发酵浓度达到10.1g/L。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出表达不同来源的甲酸脱氢酶基因FDH的菌株，在24小时添加3g/L甲酸钠时甲酸的消耗情况；其中，A菌：pg1；B菌：pg1-FDH1；C菌：pg1-FDH2；D菌：pg1-FDH3；E菌：pg1-FDH4；F菌：pg1-FDH4-TB1；G菌：pg1-FDH4-TB2；H菌：pg1-FDH4-TB3；I菌：pg1-FDH4-TB4；J菌：pg1-FDH4-TB5；K菌：pg1-FDH4-TB6；
图2示出表达不同来源的甲酸脱氢酶基因FDH的菌株，在24小时添加3g/L甲酸钠时对FFAs产量的影响；其中，A菌：pg1；B菌：pg1-FDH1；C菌：pg1-FDH2；D菌：pg1-FDH3；E菌：pg1-FDH4；F菌：pg1-FDH4-TB1；G菌：pg1-FDH4-TB2；H菌：pg1-FDH4-TB3；I菌：pg1-FDH4-TB4；J菌：pg1-FDH4-TB5；K菌：pg1-FDH4-TB6；
图3示出将高效地FDH进行有序组合后，在24小时时添加8g/L甲酸钠时甲酸消耗情况；其中，L菌：pg1-FDH3-FDH4；M菌pg1-FDH3-FDH4-TB1；N菌：pg1-FDH4-FDH4-TB1；O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；
图4示出将高效地FDH进行有序组合后，在24小时时添加8g/L的甲酸钠对FFAs产量的影响；其中，L菌：pg1-FDH3-FDH4；M菌pg1-FDH3-FDH4-TB1；N菌：pg1-FDH4-FDH4-TB1；O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；
图5示出将FDH组合最优菌株与卡尔文循环关键基因进行组合后，在24小时时添加8g/L的甲酸钠对FFAs产量的影响；其中，O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；P菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1&Yc3-CBBm；
图6示出重组酿酒酵母利用葡萄糖、CO2和甲酸根发酵放大生产游离脂肪酸的产量；
图7为重组酿酒酵母利用葡萄糖、CO2和甲酸根高效合成游离脂肪酸的途径示意图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“内源性基因”是指宿主菌或宿主菌相同种属的细胞自身基因组内的基因，例如，本发明中用于构建基因工程菌的宿主菌为酿酒酵母菌CEN.PK 113-5D，其内源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH可以为来自酿酒酵母菌CEN.PK 113-5D的编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1和FDH-2。
本发明所述用语“外源性基因”是指在构建基因工程菌过程中通过基因工程技术导入宿主菌的其他物种或细胞的基因，也可以是人工优化、改造或合成的基因，例如，外源基因FDH1、FDH2、FDH3、FDH4。
本发明所述用语“FDH3+4”是指外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH3+FDH4。
本发明所述用语“TB”是指基于基因FDH1-4的不引起相应的甲酸脱氢酶功能改变的基因取代所获得的突变体，例如，FDH4-TB1是基于基因FDH4的不引起相应的甲酸脱氢酶功能改变的基因取代所获得的第1突变体，FDH4-TB2、FDH4-TB3、FDH4-TB4、FDH4-TB5、FDH4-TB6以此类推。
类似地，本发明所述用语“FDH3+4+4-TB1”是指外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH3+FDH4+基于基因FDH4的不引起相应的甲酸脱氢酶功能改变的基因取代所获得的第1突变体。
类似地，本发明所述用语“FDH4-TB1+4”是指基于基因FDH4的不引起相应的甲酸脱氢酶功能改变的基因取代所获得的第1突变体+外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH4。
同样地，本发明所述用语“FDH4+4-TB1+3”是指外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH4+基于基因FDH4的不引起相应的甲酸脱氢酶功能改变的基因取代所获得的第1突变体+外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH3。
本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的菌株，如酿酒酵母等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为重组微生物。
本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
本发明所述用语“甲酸脱氢酶”指编码基因为FDH，帮助甲酸能够有效地催化转化为CO2同时产生还原力的酶。
本发明中所述“Δ”代表敲除基因的意思。
Ⅱ.实施方案
现有的以微生物为宿主利用甲酸与CO2的技术中，大都是通过基因编辑手段对微生物进行底盘的改造使其具备该功能，对于进一步的提升微生物利用甲酸及CO2的方法及利用甲酸与CO2进行微生物化学品的生产有待探索。鉴于此，本发明人对于以微生物为宿主利用甲酸与CO2的技术提升微生物发酵生产乙酰辅酶A衍生产物FFAs的方法进行了一定的研究，具体研究过程如下：
本发明选择基因操作技术成熟且具有较高鲁棒性的酿酒酵母来进行甲酸与CO2的利用生产FFAs。甲酸根可以作为辅助碳源，其在甲酸脱氢酶的作用下可以转化为二氧化碳，并且伴随着还原力(NAD(P)H)的产生。FFAs的生产强度与菌体胞内还原力的供给强度相关，因此增强菌株胞内还原力的供给对FFAs的生产有着较强的促进作用。同时，胞内原位产生的CO2通过卡尔文循环中关键的固碳酶进行再次的利用，提升了CO2的利用率并推动胞内代谢流的流动。
本发明主要对酿酒酵母从以下三个方面进行改造：(1)FFAs合成菌株的底盘微生物改造，使其具备生产FFAs的能力；(2)甲酸根利用关键酶的筛选和组合异源表达外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH)的基因构建甲酸根利用途径；(3)卡尔文循环关键基因的导入；从而利用CO2提升FFAs产量，最后提出一种可以提高酿酒酵母发酵中FFAs产量的方法。
因此，为实现本发明的技术方案，本发明提供了一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌，其也可以理解为一种利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌。
根据本发明，利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的途径如下(如图7所示)：
(1)葡萄糖在微生物体内转化为游离脂肪酸合成前体物质乙酰辅酶A，并进一步合成游离脂肪酸；
(2)甲酸盐在发酵时进行添加后，转入微生物体内，在外源表达的甲酸脱氢酶的作用下转化为CO2，同时产生游离脂肪酸生产所需要的还原力；
(3)甲酸根转化为的CO2以及细胞内本身由葡萄糖转化产生的CO2，在外源表达1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶及磷酸核酮糖激酶的作用下转化为游离脂肪酸合成的前体物质乙酰辅酶A；
(4)乙酰辅酶A经过游离脂肪酸合成途径最终转化为游离脂肪酸。
具体地，本发明第一方面的实施方式所涉及的利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌为底盘微生物改造获得的合成游离脂肪酸的重组酿酒酵母菌。
本发明中，所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的保藏编号为CEN.PK113-5D(BioVector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心-NTCC典型培养物保藏中心)。该菌株为食品级菌株，安全、无毒性。
根据本发明的一些实施例，所述底盘微生物改造包括游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成游离脂肪酸的基因工程菌为敲除了脂肪酸降解途径中关键酶的重组酿酒酵母菌；这可以进一步理解为，本发明中的合成游离脂肪酸的基因工程菌为阻断了FFAs分解代谢途径的重组酿酒酵母菌。经过底盘改造后的基因工程菌可以生产游离脂肪酸(FFAs)。
在本发明的一些具体的实施例中，所述游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因包括编码脂肪醛脱氢酶的基因hfd1、编码脂肪酰基辅酶A氧化酶的基因pox1、编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa1和编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa4。
在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因hfd1、pox1、faa1及faa4的核苷酸序列如SEQ No.1-4所示。
在一些例子中，例如，可以敲除游离脂肪酸降解途径的蛋白基因hfd1、pox1、faa1及faa4，用于构建敲除质粒的相关引物如表1所示，相应序列如SEQ No.5-12
表1构建敲除质粒的相关引物(基因hfd1、pox1、faa1及faa4)
Figure BDA0003449612000000071
本发明第二方面的实施方式所涉及的利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌为异源表达外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH的重组酿酒酵母菌。
本领域技术人员应该了解的是，由于酿酒酵母自身含有编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1与FDH-2，因此本发明中所述的基于甲酸根生产游离脂肪酸的基因工程菌中所含的编码甲酸脱氢酶基因FDH实际包括内源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1和FDH-2，以及外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH。
例如，本发明中来自于保藏编号为CEN.PK 113-5D的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1与FDH-2的核苷酸序列分别如SEQ No.33和SEQNo.34所示。
需要说明的是，含有编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1与FDH-2原始酿酒酵母菌株基本上不利用甲酸根，异源表达外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH后，甲酸根利用速率大幅度增加。
为了提高游离脂肪酸的产量，本发明中异源表达的外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH是经过甲酸脱氢酶筛选获得的；在一些例子中，例如，可以在重组酿酒酵母菌中表达外源性甲酸脱氢酶FDH，该工作由北京六合华大基因科技有限公司协助完成，用于构建重组质粒的相关引物如表2所示，相应的序列如SEQ No.13-32所示。
表2构建FDH重组质粒的相关引物(外源基因FDH1、FDH2、FDH3、FDH4、FDH4-TB1、FDH4-TB2、FDH4-TB3、FDH4-TB4、FDH4-TB5、FDH4-TB6)
Figure BDA0003449612000000081
具体地，所述外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH包括来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的基因FDH1或来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)且经过密码子优化的基因FDH1、来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae N10)的基因FDH2或来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccaeN10)且经过密码子优化的基因FDH2、来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的基因FDH3或来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)且经过密码子优化的基因FDH3、来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)的基因FDH4或来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)且经过密码子优化的基因FDH4，以及分别基于上述基因FDH1-4的不引起所述甲酸脱氢酶功能改变的基因取代(突变体)。
优选地，所述外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH包括来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)且经过密码子优化的基因FDH1、来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae N10)且经过密码子优化的基因FDH2、来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)且经过密码子优化的基因FDH3、来源于假单胞菌101(Pseudomonassp.strain 101)且经过密码子优化的基因FDH4，以及分别基于上述基因FDH4的不引起所述甲酸脱氢酶功能改变的基因取代(突变体)。
进一步优选地，所述外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH在该基因工程菌中被表达；例如，在一些优选的例子中，本发明中所述利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌中，来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)且经过密码子优化的基因FDH3、来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)且经过密码子优化的基因FDH4及其突变体的甲酸脱氢酶基因FDH4-TB1被表达。
在本发明的一些具体的实施例中，所述外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH1(EGenBank:AFR99163.1)、FDH2(GenBank:AB072394.1)、FDH3(GenBank:ABE69165.2)、FDH4(主要登录号：P33160)、FDH4-TB1、FDH4-TB2、FDH4-TB3、FDH4-TB4、FDH4-TB5、FDH4-TB6皆为密码子优化后的基因，其核苷酸序列分别如SEQ No.35至SEQ No.44所示。
在本发明的一些进一步具体的实施例中，将上述对FFAs合成有积极作用的外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH在质粒上进行组合构建表达，以达到更高效的FFAs的生产。
本发明中所述合成FFAs的基因工程菌中所含的FDH基因属于外源性基因，其中FDH3基因来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)，FDH4基因来源于假单胞菌101(Pseudomonas sp.strain 101)，FDH4-TB1基因为在FDH4基因的基础上进行了点突变的基因。通过FDH3基因、FDH4基因及FDH4-TB1基因在质粒上进行理性组合，由此来对甲酸进行高效地利用，促进FFAs的积累。
在一些例子中，例如，在重组酿酒酵母菌种表达进行甲酸利用的FDH-3基因、FDH4基因及FDH4-TB1基因，用于构建重组质粒的相关引物如表3所示，相应的序列如SEQ No.47-54所示。
表3构建FDH重组质粒的相关引物(外源基因FDH3、FDH4、FDH4-TB1)
Figure BDA0003449612000000091
Figure BDA0003449612000000101
本发明的第三方面的实施方式所涉及的利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌中还含有卡尔文循环关键基因，所述卡尔文循环关键基因包括用于胞内CO2再利用的基因1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO及磷酸核酮糖激酶基因PRK。
本发明中所述合成FFAs的基因工程菌中所含的卡尔文循环关键酶基因属于外源性基因，其中卡尔文循环关键基因RuBisCO来源于脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrifican(L8))，PRK基因来源于甘蓝(Spinacia olerace)，所述基因皆为密码子优化后的基因。由此来对胞内CO2进行再利用，促进FFAs的积累。所述卡尔文循环关键基因RuBisCO及PRK在该基因工程菌中被表达，由此进行胞内CO2的再利用生产游离脂肪酸合成前体乙酰辅酶A，促进FFAs的积累。
在本发明的一些具体的实施例中，所述的脱氮硫杆菌Thiobacillusdenitrifican(L8)的保藏编号ATCC 25259，相应地，其密码子优化后的基因RuBisCO的核苷酸序列如SEQ No.45所示。
在本发明的另一些具体的实施例中，所述的Spinacia olerace为甘蓝，相应地，其密码子优化后的基因PRK的核苷酸序列如SEQ No.46所示。
在一些例子中，例如，在重组酿酒酵母菌种表达进行胞内CO2再利用的1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO及磷酸核酮糖激酶基因PRK，用于构建重组质粒的相关引物如表4所示，相应的序列如SEQ No.55-58所示。
表4构建重组质粒的相关引物(外源基因RuBisCO及PRK)
Figure BDA0003449612000000102
本发明所述基于甲酸根生产游离脂肪酸的基因工程菌采用以下方法制备：
(1)构建高效合成FFAs的重组酿酒酵母菌，并进行FDH的广泛筛选与组合：
步骤A，在酿酒酵母菌中敲除脂肪酸降解途径基因，阻断FFAs分解代谢途径；
所述脂肪酸降解途径基因是脂肪醛脱氢酶基因hfd1、脂肪酰基辅酶A氧化酶基因pox1、长链脂肪酰基辅酶A合成酶基因faa1和长链脂肪酰基辅酶A合成酶基因faa4；
步骤B，向步骤A获得的合成FFAs的重组酿酒酵母菌中分别导入不同来源甲酸脱氢酶基因FDH；
所述甲酸脱氢酶基因FDH(外源)来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、假单胞菌101(Pseudomonas sp.(strain 101))、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae N10)，皆为密码子优化后的；
步骤C，将步骤B中筛选出的具有高活性的FDH进行理性组合并构建重组质粒，之后将构建的重组质粒分别导入步骤A获得的合成FFAs的重组酿酒酵母菌中；
(2)在合成FFAs的重组酿酒酵母菌中进行卡尔文循环关键酶RuBisCO基因及PRK基因的表达：
步骤M，在酿酒酵母菌中敲除脂肪酸降解途径基因，阻断FFAs分解代谢途径；
所述脂肪酸降解途径基因是脂肪醛脱氢酶基因hfd1、脂肪酰基辅酶A氧化酶基因pox1、长链脂肪酰基辅酶A合成酶基因faa1和长链脂肪酰基辅酶A合成酶基因faa4；
步骤N，分别向步骤M获得的合成FFAs的重组酿酒酵母菌中导入不同来源且具有高效催化甲酸作用的甲酸脱氢酶基因FDH组合、来源于脱氮硫杆菌的1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO以及来源于菠菜的磷酸核酮糖激酶基因PRK，其基因皆为密码子优化后的；
所述甲酸脱氢酶基因FDH来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、假单胞菌101(Pseudomonas sp.(strain 101))的一种及几种；
对比含有不同来源的甲酸脱氢酶基因FDH组合以及结合来源于脱氮硫杆菌的1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO以及来源于菠菜的磷酸核酮糖激酶基因PRK的高效合成FFAs的重组酿酒酵母菌的FFAs产量，获得最佳高效合成FFAs的重组酿酒酵母菌。
上述步骤M和N的筛选优化的结果表明：(1)外源导入博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)来源的FDH基因与假单胞菌101(Pseudomonas sp.(strain 101))来源的FDH基因及其突变体的基因工程菌合成FFAs的效果最好。(2)外源导入来源于脱氮硫杆菌的1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO以及来源于菠菜的磷酸核酮糖激酶基因PRK的基因工程菌合成FFAs的效果最好。
上述合成FFAs的重组酿酒酵母菌的制备方法中，在步骤A中，敲除脂肪酸降解途径基因，阻断FFAs分解代谢途径；在步骤B中构建并强化甲酸利用及FFAs合成途径；在步骤C中，打通利用甲酸来合成FFAs途径；亦即，通过步骤A、B和C构建高效合成FFAs的重组酿酒酵母菌，并打通利用甲酸来合成FFAs途径。在步骤M和N中，对具有高效催化甲酸的甲酸脱氢酶FDH基因组合的合成FFAs的重组酿酒酵母菌进行筛选，进一步加强甲酸利用途径，同时外源引入高效的卡尔文循环来进行CO2的再利用，进一步地增强FFAs的合成。通过上述四个方面的改造和优化制备得到的高效利用二氧化碳及其衍生物甲酸生产FFAs的重组酿酒酵母菌是产FFAs最佳的重组酿酒酵母菌。
这可以理解为，本发明通过外源引入来源不同的甲酸脱氢酶FDH基因，将甲酸转化为CO2的同时提供了产物FFAs合成所需的还原力，随后通过将初步筛选的高效的甲酸脱氢酶基因进行组合，并将卡尔文循环中的关键固碳酶基因进行了异源的表达，将胞内产生的CO2进一步利用转化为FFAs合成的前体物质乙酰辅酶A，同时阻断了FFAs的分解代谢途径，最终得到高效利用二氧化碳及其衍生物甲酸进行FFAs合成的重组酿酒酵母菌。
通过上述方法构建的基因工程菌为含有甲酸脱氢酶基因FDH、1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO及磷酸核酮糖激酶基因PRK的重组酿酒酵母菌，且其经过了敲除FFAs分解代谢途径的相关基因的底盘微生物改造；该基因工程菌还含有用于提高甲酸利用效率的甲酸脱氢酶FDH的组合，并且该基因工程菌表达1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因RuBisCO及磷酸核酮糖激酶基因PRK。该重组酿酒酵母菌高效利用二氧化碳及其衍生物甲酸合成FFAs的途径如图6所示。
研究结果表明，该基因工程菌安全无毒性，能够高效利用二氧化碳及其衍生物甲酸合成FFAs，且培养基成分简单(例如，可以使用本领域常规培养基)，批次稳定，生产成本较低。
本发明中酿酒酵母菌培养专用培养基包括：
(1)YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，添加酵母粉10，葡萄糖20，116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。该培养基主要用于酿酒酵母在试管培养，固体平板培养。
(2)SC-Ura培养基(g/L)：酵母氮基1.7，硫酸铵5，氨基酸混合物(缺尿嘧啶Ura，组氨酸His，亮氨酸Leu)1.655，组氨酸0.086，亮氨酸0.173，葡萄糖20，116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。该培养基主要用于重组酿酒酵母在发酵是的种子培养。
(3)SC-Ura-His培养基(g/L)：酵母氮基1.7，硫酸铵5，氨基酸混合物(缺尿嘧啶Ura，组氨酸His，亮氨酸Leu)1.655，亮氨酸0.173，葡萄糖20，116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。该培养基主要用于重组酿酒酵母在发酵是的种子培养。
(4)5-FOA培养基：酵母氮基1.7，硫酸铵5，氨基酸混合物(缺尿嘧啶Ura，组氨酸His，亮氨酸Leu)1.655，尿嘧啶0.05，组氨酸0.086，亮氨酸0.173，5-氟乳清酸(5-FOA)1，葡萄糖20，对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。116℃灭菌25min。该培养基主要用于重组酿酒酵母敲除后进行质粒丢失的培养基。
(5)摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，硫酸铵5，磷酸二氢钾14.4，七水硫酸镁0.5，维生素溶液0.1％，微量元素0.1％。(维生素溶液配制：称取生物素2.5mg溶解至加有1mL0.1M NaOH加入约35mL去离子水中，用1M HCl将PH值调至6.5，然后依次加入以下维他命元素，D-泛酸钙，盐酸硫胺，盐酸吡哆醇，烟酸，对氨基苯甲酸各0.05克，后用1M氢氧化钠调节PH至6.5后加入肌醇1.25克，调节PH值至6.5，然后定容至50mL，进行过滤除菌，在发酵培养体系中加体积比的千分之一；微量元素配制：在烧杯中加入80mL去离子水，并加入一个磁力转子，将烧杯置于可加热的磁力搅拌器上，并将pH计置于烧杯中，开始搅拌，并保持PH计置于溶液中，之后将下列化学试剂逐次加入，七水硫酸铁0.3克，七水硫酸锌0.45克，二水氯化钙0.45克，四水氯化锰0.1克，六水氯化钴0.03克，五水硫酸铜0.03克，钼酸钠0.04克，硼酸0.1克，碘化钾0.01克，乙二胺四乙酸二钠1.5克，加入时需慢慢加入，每次加入后，用2M氢氧化钠将pH值调为6左右，过夜搅拌，之后对溶液再次调节PH值，调为4，然后定容到100mL，将溶液转移至玻璃瓶中，进行高压灭菌，在发酵培养体系中加体积比的千分之一)。
(6)发酵放大初始培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵5，磷酸二氢钾3，七水硫酸镁0.5，维生素溶液0.1％，微量元素0.1％。
(7)发酵放大补料培养基：葡萄糖600，硫酸铵15，磷酸二氢钾9，七水硫酸镁1.5，维生素溶液0.3％，微量元素0.3％。
上述培养基适用于原酿酒酵母和改造后的基因工程菌。
本发明所涉及的上述利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌在利用二氧化碳及其衍生物甲酸根在生产游离脂肪酸中的应用，可以理解为上述利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌在利用二氧化碳及其衍生物甲酸根生产游离脂肪酸的方法。
根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产FFAs。
在本发明的一些实施例中，将所述基因工程菌进行发酵培养，并在发酵阶段添加含甲酸根的化合物，生产游离脂肪酸；优选地，含甲酸根的化合物为甲酸盐。
在本发明的一些优选的实施例中，在摇瓶发酵中，通过添加20g/L葡萄糖并在24小时加入2-7.2g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸，产量达790mg/L。
在本发明的另一些优选的实施例中，在5L发酵罐发酵中，通过葡萄糖连续补料并每12小时添加5g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸，产量达10.1g/L。
本发明中的检测方法及仪器：
(1)采用PTC-200型PCR仪(MJ RESEARCH.INC.美国)进行PCR扩增和检测。
(2)采用Micropul serTM型电转仪(BIO-Rad，美国)进行电转化操作。
(3)采用LC20-AT高效液相色谱仪(HPLC，岛津，日本)检测发酵液中的甲酸浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6mL/min，进样体积10μL，检测器为紫外和示差检测器。
(4)使用870型酶标仪(Thermo)通过测定样品的在600nm波长下的吸光值来测量发酵过程中的生物量。
(5)使用GCMS-QP2010SE(岛津，日本)检测发酵液中的FFAs浓度。
Ⅲ.实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法并采用常规的实验设备。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
在构建强化合成FFAs的重组酿酒酵母菌，并结合二氧化碳及其衍生物甲酸利用途径后，通过以下实施例对高效利用二氧化碳及其衍生物甲酸生产FFAs的重组酿酒酵母菌中的甲酸及CO2利用途径进行筛选优化。
实施例1：敲除质粒的构建
该实施例中所用到的引物如前文中表1所示。
首先通过网站(https://www.atum.bio/eCommerce/cas9/input)设计基因敲除所需的gRNA，将gRNA设计在引物上，以Pstg.Ura质粒为模板扩增带有尿嘧啶(Ura)筛选标记的片段gRNA-hfd1，gRNA-pox1，gRNA-faa1，gRNA-faa4，将这四个片段依次与质粒pLacZ-SalI进行连接，测序得到正确的质粒pCas9-hfd1、pCas9-pox1、pCas9-faa1、pCas9-faa4。随后按照酿酒酵母菌基因传统Cas9的敲除方法进行各基因的敲除。
实施例2：重组质粒的构建
该实施例中所用到的引物如前文中表2所示。
由公司合成外源基因FDH1，FDH2，FDH3，FDH4，FDH4-TB1，FDH4-TB2，FDH4-TB3，FDH4-TB4，FDH4-TB5，FDH4-TB6，且分别将其连接于质粒Psp-GM1上，待实验筛选后将高效的FDH以各自的质粒为模板进行扩增后，通过酶切连接集成于Psp-GM1质粒上，经测序得到正确的质粒Psp-GM1-FDH3-FDH4、Psp-GM1-FDH3-FDH4-TB1、Psp-GM1-FDH4-FDH4-TB1、Psp-GM1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1。
实施例3：酿酒酵母基因传统Cas9的敲除方法
对于酿酒酵母菌的基因敲除，一般采用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术，利用该方法可以高效地进行基因的敲除，且用时较短。此种敲除方法的敲除原理主要是基于酿酒酵母菌的同源重组，gRNA可以特异性地识别需要进行敲除的基因，同时将Cas9切割蛋白引导至此处发挥Cas蛋白的切割功能，随后通过供体的引入以及菌株自身发挥同源重组的作用，供体将目标基因进行替换从而实现基因敲除的目标。
在酿酒酵母菌的敲除质粒上分别含有以下几个特别重要的原件：氨苄青霉素抗性基因，Cas9蛋白基因，大肠复制子，酿酒酵母复制子。下面是具体的敲除方法：
①首先是相应基因敲除质粒的构建，通过PCR扩增带有各自基因gRNA的Ura片段，依次连接至敲除质粒pLacZ-SalI上，测序正确后待用；
②通过引物搭桥直接进行PCR，制备基因敲除供体(一般为所敲除基因起始密码子前60bp与终止密码子后60bp，供体为120bp)；
③将上述①中质粒与②中供体按照上述酿酒酵母菌电转方法一起转入酿酒酵母菌感受态中，在YPD加山梨醇的培养基中孵育5小时，后转与Sc-Ura培养基中培养24小时，之后涂布于Sc-Ura的平板上；
④挑选平板上长出的单菌落进行富集培养后，进行基因组的提取，通过验证引物进行PCR验证并进行测序；
⑤通过验证引物及测序验证已成功敲除的菌体在5-FOA平板上进行划线，此步是将构建的带有Ura筛选标记的敲除质粒进行丢失，以便进行下一轮基因敲除及异源基因的表达；
⑥挑选⑤中的平板上的单菌落，同时在Sc-Ura与YPD平板上划线，在Sc-Ura平板上没有生长，在YPD平板上正常生长的菌株即为丢掉敲除质粒的菌株，确定无误后可保菌待用并进行后续实验；
最后成功得到FFAs生产的底盘菌株，Δhfd1Δpox1Δfaa1Δfaa4的底盘菌株。
实施例4：重组菌株的构建
(1)感受态细胞的制备
将-80℃保存的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK 113-11C的甘油菌划线于YPD平板上进行活化，之后接于YPD液体培养基中，过夜培养后，以初始OD600为0.3左右接种到50mL YPD培养基中。在30℃摇床培养约5小时，当OD600达1.2-1.6之间取出用于制备感受态细胞。
将菌液装入50mL试管中，4℃、3000rpm冷冻离心3min收集菌体后，用20mL水洗一遍细胞，再用20mL山梨醇洗一遍细胞，之后加入16mL山梨醇以及2mL10xTE缓冲液(100mMTris-HCl，10mM的EDTA，用HCl调pH至7.5)及1M的醋酸锂2mL，在30℃摇床培养30分钟，之后加入1M二硫苏糖醇200μL，在30℃摇床培养15分钟，在4℃、3000rpm冷冻离心3min收集菌体后，用1M山梨醇20mL洗两遍，最后将酿酒酵母细胞重悬与200μL 1M的山梨醇中，用于电转化。
(2)酿酒酵母菌感受态细胞的电转化
在制备的酿酒酵母菌感受态细胞中加入2μL构建成功的重组质粒，轻柔的混匀，之后将混合液移入预冷的0.2cm电击杯中，电击条件为：1.5kv，电击。电击完毕后立即加入1mL1M山梨醇，轻柔的混匀后吸出放入50mL离心管中，加入3mL YPD及2mL山梨醇，然后置于30℃复苏1小时。复苏完成之后吸取一定量的菌液涂布于对应缺陷平板上，30℃培养48小时左右，将长出的单菌落接种到5mL的对应缺陷的培养基的试管中，过夜培养之后，进行甘油菌的保存，将保存的甘油菌放置在-80℃冰箱中存放。
实施例5：重组菌株的摇瓶发酵验证
将-80℃保存的重组菌株的甘油菌划线于对应缺陷的平板上进活化，之后接于对应缺陷的液体种子培养基中，30℃、200rpm摇床培养12-14小时。待种子培养完成之后将种子液按照固定的初始OD600的接种量接种到配好的30mL无菌发酵培养基中，在24小时加入终浓度为8g/L的甲酸钠，在30℃、200rpm摇床条件下培养48h左右。
实施例6：发酵条件优化
按照实施例5重组菌株发酵验证的实验方法，通过改变甲酸钠的添加时间及添加量，进行菌株的培养与产量测定，以筛选最适的甲酸钠添加条件。甲酸钠添加浓度设定是1g/L、2g/L、3g/L、6g/L和8g/L。甲酸钠添加时间的设定发酵24、48小时。该部分实验选择了部分含有FDH的重组菌株pg1、pg1-FDH1、pg1-FDH2、pg1-FDH3及pg1-FDH4作为研究对象。
实施例7：代谢物及产物检测方法
(1)生物量测定
取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用酶标仪测定其在600nm波长下的吸光值，选用96孔板进行吸光值的测定，装液量是200μL。
(3)葡萄糖浓度、甲酸浓度测定
用HPLC检测发酵液中的葡萄糖、甲酸浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6mL/min，进样体积10μL，检测器为紫外和示差检测器。
根据上述的发酵方法和检测方法对各重组菌株进行发酵验证及产物测定，结果如图1-4所示。
图1为表达不同来源的甲酸脱氢酶基因FDH的菌株，在24小时添加3g/L甲酸钠时甲酸的消耗情况，其中，A菌：pg1；B菌：pg1-FDH1；C菌：pg1-FDH2；D菌：pg1-FDH3；E菌：pg1-FDH4；F菌：pg1-FDH4-TB1；G菌：pg1-FDH4-TB2；H菌：pg1-FDH4-TB3；I菌：pg1-FDH4-TB4；J菌：pg1-FDH4-TB5；K菌：pg1-FDH4-TB6；结果显示：
菌株A的甲酸消耗速率为5.16mg/L/h；
菌株B的甲酸消耗速率为15.69mg/L/h；
菌株C的甲酸消耗速率为3.13mg/L/h；
菌株D的甲酸消耗速率为39.48mg/L/h；
菌株E的甲酸消耗速率为40.70mg/L/h；
菌株F的甲酸消耗速率为36.23mg/L/h；
菌株G的甲酸消耗速率为28.98mg/L/h；
菌株H的甲酸消耗速率为13.92mg/L/h；
菌株I的甲酸消耗速率为11.22mg/L/h；
菌株J的甲酸消耗速率为2.37mg/L/h；
菌株K的甲酸消耗速率为3.92mg/L/h。
图2为表达不同来源的甲酸脱氢酶基因FDH的菌株，在24小时添加3g/L甲酸钠时对FFAs产量的影响；其中，A菌：pg1；B菌：pg1-FDH1；C菌：pg1-FDH2；D菌：pg1-FDH3；E菌：pg1-FDH4；F菌：pg1-FDH4-TB1；G菌：pg1-FDH4-TB2；H菌：pg1-FDH4-TB3；I菌：pg1-FDH4-TB4；J菌：pg1-FDH4-TB5；K菌：pg1-FDH4-TB6；结果显示：
菌株A的FFAs产量为304.64mg/L；
菌株B的FFAs产量为405.84mg/L；
菌株C的FFAs产量为457.94mg/L；
菌株D的FFAs产量为512.52mg/L；
菌株E的FFAs产量为505.07mg/L；
菌株F的FFAs产量为535.51mg/L；
菌株G的FFAs产量为483.43mg/L；
菌株H的FFAs产量为362.98mg/L；
菌株I的FFAs产量为359.42mg/L；
菌株J的FFAs产量为324.76mg/L；
菌株K的FFAs产量为327.42mg/L。
图3为将高效地FDH进行有序组合后，在24小时时添加8g/L甲酸钠时甲酸消耗情况；其中，L菌：pg1-FDH3-FDH4；M菌pg1-FDH3-FDH4-TB1；N菌：pg1-FDH4-FDH4-TB1；O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；结果显示：
菌株L的甲酸消耗速率为55.31mg/L/h；
菌株M的甲酸消耗速率为61.84mg/L/h；
菌株N的甲酸消耗速率为58.87mg/L/h；
菌株O的甲酸消耗速率提升至95.92mg/L/h。
图4为将高效地FDH进行有序组合后，在24小时时添加8g/L的甲酸钠对FFAs产量的影响；其中，L菌：pg1-FDH3-FDH4；M菌pg1-FDH3-FDH4-TB1；N菌：pg1-FDH4-FDH4-TB1；O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；结果显示：
菌株L的FFAs产量为595.00mg/L；
菌株M的FFAs产量为569.33mg/L；
菌株N的FFAs产量为551.74mg/L；
菌株O的FFAs产量提升至608.47mg/L。
图5为将FDH组合最优菌株与卡尔文循环关键基因进行组合后，在24小时时添加8g/L的甲酸钠对FFAs产量的影响；其中，O菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1；P菌：pg1-FDH3-FDH4-FDH4-TB1&Yc3-CBBm；结果显示：
菌株O的FFAs产量为608.47mg/L
菌株O的FFAs产量提升至741.32mg/L。
图6为重组酿酒酵母利用葡萄糖、CO2和甲酸根发酵放大生产游离脂肪酸产量图；其中所使用的菌株为P菌；结果显示：
菌株在168小时的发酵结束后，FFAs的总产量达到10.1g/L。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌
<130> RB2102351-FF
<160> 58
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码脂肪醛脱氢酶的基因hfd1）
<400> 1
atgtcaaacg acggctcaaa aatattgaat tataccccag tgtctaaaat agatgaaata 60
gttgaaatct caagaaattt cttctttgag aaacaattga aattgtccca cgaaaataac 120
ccaaggaaaa aagatctaga attcaggcag ttgcagttga aaaaactcta ttatgccgtc 180
aaagatcatg aggaagaact gatcgatgct atgtacaagg actttcatcg gaacaaaatt 240
gaatcggttc tgaatgaaac gaccaaactt atgaacgata tacttcacct aattgagatt 300
ttaccaaaat tgatcaaacc tcggagagta tctgattctt ctcctccatt tatgtttggt 360
aaaacaatcg tggagaaaat atcaaggggc agtgtcttga ttattgctcc tttcaatttt 420
cccctacttt tagcatttgc cccattggca gcagctcttg ctgcaggtaa caccattgtt 480
ctgaagccaa gtgaactaac accacacact gctgtagtta tggaaaattt gttaaccaca 540
gctggtttcc ctgatggatt gattcaagta gttcagggag ctatagatga aactacaaga 600
ctactagatt gtggaaaatt tgacctaata ttctacacag gttctccccg tgtcggatca 660
atagttgctg agaaagcagc aaaaagtcta acaccttgtg tacttgaact tggtggtaaa 720
tcacctacct ttattacaga aaatttcaaa gcaagtaaca taaaaattgc tttgaaaagg 780
attttttttg gagctttcgg aaattctggc cagatttgtg tttcaccaga ttatttgtta 840
gtacataaat ctatctatcc aaaggtcatt aaagagtgtg aatcggtact aaatgaattt 900
tatccaagct ttgatgaaca aacagatttc actcgtatga ttcatgagcc tgcttacaaa 960
aaggccgttg caagtataaa ctcaactaac ggctccaaga ttgtgccttc aaaaatttct 1020
attaattcag atactgagga tctatgcctt gtaccaccaa ccatagttta taacattggt 1080
tgggatgatc ctttgatgaa acaggaaaac tttgctcctg tattgcccat cattgagtac 1140
gaggatcttg atgagaccat taacaagata atagaagaac atgacactcc attggtgcaa 1200
tacatattct ctgatagcca aactgaaata aatcgtatct tgacgcgctt aagatctggt 1260
gactgtgttg tcggtgatac agtgattcat gtaggaatta ccgacgctcc atttggaggg 1320
atcggtactt caggttatgg taactatggt ggatattatg gattcaatac ctttagtcat 1380
gaaagaacaa ttttcaaaca accatattgg aatgatttta ccctttttat gagataccct 1440
ccaaatagcg cacaaaagga aaagctcgtc cgttttgcga tggaaagaaa accttggttt 1500
gacagaaatg gcaataacaa gtgggggtta cgccaatatt tttcattatc tgccgccgtt 1560
attttaatta gtaccattta cgctcattgt tcttcctga 1599
<210> 2
<211> 2247
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码脂肪酰基辅酶A氧化酶的基因pox1）
<400> 2
atgacgagac gtactactat taatcccgat tcggtggttc tgaatcctca aaaatttatc 60
cagaaagaaa gggcggattc caaaatcaaa gttgaccaag ttaacacatt tttagagtca 120
tccccggaga ggagaactct gacgcacgcc ttaatagacc aaatagtgaa tgatcctata 180
ttgaagactg acacggacta ttacgatgct acaaaactgc aagagagaga aattactgcc 240
aaaaaaatag ctaggcttgc tagttatatg gagcacgata tcaaaacagt gcgcaaacac 300
tttcgcaaca ctgacctgat gaaagagttg caagcaaatg atccagacaa agcttcgcct 360
ttaacaaaca aagacctttt tatattcgat aagagattat cacttgtagc aaatattgat 420
cctcaattgg gtacgcgcgt gggtgtacac ttggggctat ttggtaattg tatcaagggc 480
aatggtactg atgagcaaat ccggtattgg ttgcaggaga gaggtgccac tttgatgaaa 540
ggtatatatg gctgttttgc aatgactgag ttaggacatg gttccaatgt tgcccagctg 600
cagactaggg ctgtgtacga taagcaaaat gatactttta taattgatac acctgatcta 660
actgccacca aatggtggat tggtggggct gcccattctg ccacgcacgc tgccgtgtac 720
gccagattga tcgttgaagg taaagactac ggtgtaaaaa cattcgttgt tcctctgaga 780
gacccttcga ctttccaact gttagctggt gtttccatag gggatattgg agcgaagatg 840
ggtcgtgacg gtattgataa tggctggatc cagttcagaa acgtagttat ccctagagaa 900
tttatgctaa gtagatttac caaagttgtc cgttctccag atggttcagt caccgtcaaa 960
actgagccac aattggatca aatttctggt tatagtgcat tgttaagtgg tagagttaac 1020
atggtcatgg attcatttag gtttggctcc aaatttgcta ctattgctgt acgttacgcg 1080
gttggtcgtc agcaattcgc acctagaaag ggattgtctg aaacacaatt aatcgactat 1140
ccccttcacc aatatcgtgt tttaccacaa ttgtgtgttc catatttggt gtcacctgta 1200
gcttttaagt taatggacaa ctattattcc actttggacg agttatacaa cgcttcctca 1260
tctgcagaca aagctgctct ggttaccgtg agtaaaaagt tgaagaattt atttattgat 1320
agcgccagct tgaaagccac caatacttgg ttaattgcta cactgattga tgagttgaga 1380
cagacttgcg gaggacatgg gtattcacag tataacggat ttggtaaagg ctatgacgac 1440
tgggtggttc agtgcacatg ggagggtgat aataatgttt tatctttaac ttcagcaaaa 1500
tcaatattga aaaaatttat cgattcagcc acaaagggta gatttgacaa cacactggat 1560
gtggactcat tctcttactt aaaacctcag tacataggat ctgtggtttc tggagaaaca 1620
aagagtagtt taaaggagtt gggtgattat actgaaattt ggtctatcac cttaatcaaa 1680
ttattggcac atattggtac tttagttgaa aaatcaagaa gtattgatag cgtttctaag 1740
cttttagtct tagtatccaa atttcatgcc ttgcgctgca tgttgaaaac ctattacgac 1800
aagttaaact ctcgcgattc acatatttcc gatgaaatta caaaggaatc aatgtggaat 1860
gtttataagt tattttcctt gtattttatt gacaagcatt ccggagaatt ccaacaattc 1920
aagattttca ctcctgatca gatctctaaa gttgtgcagc cacaactatt ggctcttttg 1980
ccaattgtga ggaaagactg tataggtgtg acagactcct ttgaattacc tgacgcgatg 2040
ttaaattctc ctataggtta ctttgatggc gatatctatc acaattactt caatgaagtt 2100
tgccgcaata atccagtgga ggcagatggg gcagggaagc cttcttatca tgcgctgttg 2160
agcagcatgc tcggtagagg tttcgaattt gaccaaaagt taggtggtgc agctaatgcg 2220
gaaattttat cgaaaataaa caagtga 2247
<210> 3
<211> 2103
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa1）
<400> 3
atggttgctc aatataccgt tccagttggg aaagccgcca atgagcatga aactgctcca 60
agaagaaatt atcaatgccg cgagaagccg ctcgtcagac cgcctaacac aaagtgttcc 120
actgtttatg agtttgttct agagtgcttt cagaagaaca aaaattcaaa tgctatgggt 180
tggagggatg ttaaggaaat tcatgaagaa tccaaatcgg ttatgaaaaa agttgatggc 240
aaggagactt cagtggaaaa gaaatggatg tattatgaac tatcgcatta tcattataat 300
tcatttgacc aattgaccga tatcatgcat gaaattggtc gtgggttggt gaaaatagga 360
ttaaagccta atgatgatga caaattacat ctttacgcag ccacttctca caagtggatg 420
aagatgttct taggagcgca gtctcaaggt attcctgtcg tcactgccta cgatactttg 480
ggagagaaag ggctaattca ttctttggtg caaacggggt ctaaggccat ttttaccgat 540
aactctttat taccatcctt gatcaaacca gtgcaagccg ctcaagacgt aaaatacata 600
attcatttcg attccatcag ttctgaggac aggaggcaaa gtggtaagat ctatcaatct 660
gctcatgatg ccatcaacag aattaaagaa gttagacctg atatcaagac ctttagcttt 720
gacgacatct tgaagctagg taaagaatcc tgtaacgaaa tcgatgttca tccacctggc 780
aaggatgatc tttgttgcat catgtatacg tctggttcta caggtgagcc aaagggtgtt 840
gtcttgaaac attcaaatgt tgtcgcaggt gttggtggtg caagtttgaa tgttttgaag 900
tttgtgggca ataccgaccg tgttatctgt tttttgccac tagctcatat ttttgaattg 960
gttttcgaac tattgtcctt ttattggggg gcctgcattg gttatgccac cgtaaaaact 1020
ttaactagca gctctgtgag aaattgtcaa ggtgatttgc aagaattcaa gcccacaatc 1080
atggttggtg tcgccgctgt ttgggaaaca gtgagaaaag ggatcttaaa ccaaattgat 1140
aatttgccct tcctcaccaa gaaaatcttc tggaccgcgt ataataccaa gttgaacatg 1200
caacgtctcc acatccctgg tggcggcgcc ttaggaaact tggttttcaa aaaaatcaga 1260
actgccacag gtggccaatt aagatatttg ttaaacggtg gttctccaat cagtcgggat 1320
gctcaggaat tcatcacaaa tttaatctgc cctatgctta ttggttacgg tttaaccgag 1380
acatgcgcta gtaccaccat cttggatcct gctaattttg aactcggcgt cgctggtgac 1440
ctaacaggtt gtgttaccgt caaactagtt gatgttgaag aattaggtta ttttgctaaa 1500
aacaaccaag gtgaagtttg gatcacaggt gccaatgtca cgcctgaata ttataagaat 1560
gaggaagaaa cttctcaagc tttaacaagc gatggttggt tcaagaccgg tgacatcggt 1620
gaatgggaag caaatggcca tttgaaaata attgacagga agaaaaactt ggtcaaaaca 1680
atgaacggtg aatatatcgc actcgagaaa ttagagtccg tttacagatc taacgaatat 1740
gttgctaaca tttgtgttta tgccgaccaa tctaagacta agccagttgg tattattgta 1800
ccaaatcatg ctccattaac gaagcttgct aaaaagttgg gaattatgga acaaaaagac 1860
agttcaatta atatcgaaaa ttatttggag gatgcaaaat tgattaaagc tgtttattct 1920
gatcttttga agacaggtaa agaccaaggt ttggttggca ttgaattact agcaggcata 1980
gtgttctttg acggcgaatg gactccacaa aacggttttg ttacgtccgc tcagaaattg 2040
aaaagaaaag acattttgaa tgctgtcaaa gataaagttg acgccgttta tagttcgtct 2100
taa 2103
<210> 4
<211> 2085
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa4）
<400> 4
atgaccgaac aatattccgt tgcagttggc gaagccgaca atgagcatga aaccgctcca 60
agaagaaata tcagggttaa agacaagcct ttgattagac ccataaactc ctcagcatct 120
acactgtacg aattcgccct ggaatgtttt accaaaggtg gtaagagaga cggtatggca 180
tggagagata ttatagatat acatgagacg aaaaaaacca tagtcaagag ggtggatggt 240
aaggataagc ccatcgaaaa aacatggttg tactacgaac tgactcccta cataaccatg 300
acatacgagg agatgatctg cgtaatgcac gacattggac gtgggctgat aaagattggt 360
gttaaaccta acggtgagaa caagttccac atctttgcct ctacatctca caagtggatg 420
aaaacttttc ttggttgcat gtcacaaggt attcctgtgg tcaccgcgta cgacactttg 480
ggtgagagcg gtttgattca ctccatggtg gaaacggatt ccgtcgccat tttcacggac 540
aaccagctgt tgtccaaatt agcagttcct ttgaaaaccg ccaagaacgt aaaattcgtc 600
attcacaacg aacccatcga tccaagtgac aaaagacaaa atggtaagct ttacaaggct 660
gccaaggatg ctgttgacaa aatcaaggaa gttagaccgg acataaaaat ctacagtttc 720
gatgaaatta ttgagatagg taaaaaggcc aaggacgagg ttgaattgca tttccccaag 780
cctgaagatc cagcttgtat catgtacact tctggttcca ctggtacacc aaagggtgtg 840
gtattgacac attacaacat tgtagctggt attggtggtg tgggccataa cgttatcgga 900
tggattggcc caacagaccg tattatcgca ttcttgccat tggctcatat ttttgaatta 960
atctttgaat tcgaagcgtt ctactggaat ggtatcctag ggtacgccac tgtcaagact 1020
ttaaccccaa cttctacacg taattgccaa ggtgacctga tggagtttaa acctaccgta 1080
atggtaggtg ttgccgcagt ttgggaaaca gtgagaaaag gtatcctggc caagatcaac 1140
gaattgcccg gttggtctca aacgcttttc tggactgtct atgctttgaa agagagaaat 1200
ataccatgca gcggcttgct gagtgggttg atcttcaaga gaatcagaga agcaaccggt 1260
ggaaacttaa ggtttattct gaacggtggg tctgcaatca gcatagacgc ccaaaaattc 1320
ctctccaacc ttctatgtcc tatgctcatt ggatatgggc taactgaggg tgtggctaat 1380
gcctgtgtcc tggagcctga acattttgat tacggtattg ctggtgacct tgtcggaact 1440
attacagcta aattggtgga tgtcgaagat ttgggctatt ttgccaagaa taaccaaggt 1500
gaattgctgt taaagggtgc acccatctgt tctgaatact ataagaatcc tgaagaaact 1560
gctgcggcct ttaccgatga tggctggttc cgtaccggtg atatcgctga atggaccccc 1620
aagggacaaa ttaagatcat tgatagaaag aaaaatttgg tcaagacctt aaacggtgag 1680
tacattgcat tggaaaaatt agaatccatt tacagatcaa atccttacgt ccaaaacatc 1740
tgtgtctacg ctgatgaaaa caaagttaag cctgtcggta ttgtggtccc taacttagga 1800
cacttgtcta agctggctat cgaattaggt ataatggtac caggtgaaga tgtcgaaagc 1860
tatatccatg aaaagaagct acaggatgcc gtttgcaaag atatgctgtc aactgccaaa 1920
tctcaaggct tgaatggtat tgaattatta tgtggcattg ttttctttga agaagaatgg 1980
actccagaaa acggtcttgt tacatccgcc caaaaattaa agagaagaga tattctagcg 2040
gctgtcaagc cagatgtgga aagagtttat aaagaaaaca cttaa 2085
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> （引物Hfd1-gUra-F）
<400> 5
aaaggtctct gatcaggtaa ctatggtgga tattagtttt agagctagaa atagcaagt 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> （引物Hfd1-gUra-R）
<400> 6
aaaggtctct aaacttaact acagcagtgt gtggtgatca tttatctttc actgcggag 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> （引物Pox1-gUra-F）
<400> 7
aaaggtctct gatcattgcc gcaataatcc agtgggtttt agagctagaa atagcaagt 59
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> （引物Pox1-gUra-R）
<400> 8
aaaggtctct aaactgatca tttatctttc actgcggag 39
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> （引物Faa1-gUra-F）
<400> 9
aaaggtctct gatcaaagct aaaggtcttg atatcgtttt agagctagaa atagcaagt 59
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> （引物Faa1-gUra-R）
<400> 10
aaaggtctct aaactgatca tttatctttc actgcggag 39
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> （引物Faa4-gUra-F）
<400> 11
aaaggtctct gatcaaataa accttaagtt tccacgtttt agagctagaa atagcaagt 59
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> （引物Faa4-gUra-R）
<400> 12
aaaggtctct aaactgatca tttatctttc actgcggag 39
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> （引物FDH1-F）
<400> 13
ttacaaggat ccatgacaaa ggttttggcc gttttgtacc 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> （引物FDH1-R）
<400> 14
ttagctagct tatttttcag cttcaccact acctggagtt 40
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> （引物FDH2-F）
<400> 15
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgtacg 37
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> （引物FDH2-R）
<400> 16
ttagctagct taaacagcct ttttaaactt agcagcttc 39
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> （引物FDH3-F）
<400> 17
caaggatcca tgaagatcgt tttggttttg 30
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> （引物FDH3-R）
<400> 18
ttagctagct tacttcttgt catgtttacc ataa 34
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-F）
<400> 19
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-R）
<400> 20
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB1-F）
<400> 21
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB1-R）
<400> 22
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB2-F）
<400> 23
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB2-R）
<400> 24
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB3-F）
<400> 25
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB3-R）
<400> 26
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB4-F）
<400> 27
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB4-R）
<400> 28
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB5-F）
<400> 29
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB5-R）
<400> 30
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB6-F）
<400> 31
caaggatcca tggcaaaagt tttgtgtgtt ttgta 35
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB6-R）
<400> 32
atcttagcta gcttaaacag cctttttaaa cttagcagct tc 42
<210> 33
<211> 1131
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码甲酸脱氢酶的基因FDH-1）
<400> 33
atgtcgaagg gaaaggtttt gctggttctt tacgaaggtg gtaagcatgc tgaagagcag 60
gaaaagttat tggggtgtat tgaaaatgaa cttggtatca gaaatttcat tgaagaacag 120
ggatacgagt tggttactac cattgacaag gaccctgagc caacctcaac ggtagacagg 180
gagttgaaag acgctgaaat tgtcattact acgccctttt tccccgccta catctcgaga 240
aacaggattg cagaagctcc taacctgaag ctctgtgtaa ccgctggcgt cggttcagac 300
catgtcgatt tagaagctgc aaatgaacgg aaaatcacgg tcaccgaagt tactggttct 360
aacgtcgttt ctgtcgcaga gcacgttatg gccacaattt tggttttgat aagaaactat 420
aatggtggtc atcaacaagc aattaatggt gagtgggata ttgccggcgt ggctaaaaat 480
gagtatgatc tggaagacaa aataatttca acggtaggtg ccggtagaat tggatatagg 540
gttctggaaa gattggtcgc atttaatccg aagaagttac tgtactacga ctaccaggaa 600
ctacctgcgg aagcaatcaa tagattgaac gaggccagca agcttttcaa tggcagaggt 660
gatattgttc agagagtaga gaaattggag gatatggttg ctcagtcaga tgttgttacc 720
atcaactgtc cattgcacaa ggactcaagg gggttattca ataaaaagct tatttcccac 780
atgaaagatg gtgcatactt ggtgaatacc gctagaggtg ctatttgtgt cgcagaagat 840
gttgccgagg cagtcaagtc tggtaaattg gctggctatg gtggtgatgt ctgggataag 900
caaccagcac caaaagacca tccctggagg actatggaca ataaggacca cgtgggaaac 960
gcaatgactg ttcatatcag tggcacatct ctggatgctc aaaagaggta cgctcaggga 1020
gtaaagaaca tcctaaatag ttacttttcc aaaaagtttg attaccgtcc acaggatatt 1080
attgtgcaga atggttctta tgccaccaga gcttatggac agaagaaata a 1131
<210> 34
<211> 711
<212> DNA
<213> （来自酿酒酵母的编码甲酸脱氢酶的基因FDH-2）
<400> 34
atggtggtca tcaataagca attaatggtg agtgggatat tgccggcgtg gctaaaaaat 60
gagtatgatc tggaagacaa aataatttca acggtaggtg ccggtagaat tggatatagg 120
gttctggaaa gattggtcgc atttaatccg aagaagttac tgtactacga ctaccaggaa 180
ctacctgcgg aagcaatcaa tagattgaac gaggccagca agcttttcaa tggcagaggt 240
gatattgttc agagagtaga gaaattggag gatatggttg ctcagtcaga tgttgttacc 300
atcaactgtc cattgcacaa ggactcaagg ggtttattca ataaaaagct tatttcccac 360
atgaaagatg gtgcatactt ggtgaatacc gctagaggtg ctatttgtgt cgcagaagat 420
gttgccgagg cagtcaagtc tggtaaattg gctggctatg gtggtgatgt ctgggataag 480
caaccagcac caaaagacca tccctggagg actatggaca ataaggacca cgtgggaaac 540
gcaatgactg ttcatatcag tggcacatct ctgcatgctc aaaagaggta cgctcaggga 600
gtaaagaaca tcctaaatag ttacttttcc aaaaagtttg attaccgtcc acaggatatt 660
attgtgcaga atggttctta tgccaccaga gcttatggac agaagaaata a 711
<210> 35
<211> 1197
<212> DNA
<213> （来自布氏乳杆菌且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶的基因FDH1）
<400> 35
atgacaaagg ttttggccgt tttgtaccca gacccagttg acggttttcc accaaaatac 60
gttagagacg acattccaaa aattacccac tacccagacg gttccacagt tccaacccca 120
gaaggtattg attttaagcc aggtgaatta ttgggttctg tttctggtgg tttgggtttg 180
aaaaagtatt tggaatctaa gggtgttgaa tttgttgtta cttctgataa agaaggtcca 240
gattctgttt ttgaaaaaga attgccaact gctgatgttg ttatttctca accattttgg 300
ccagcttatt tgactgctga tttgattgat aaggctaaaa agttgaagtt ggctattact 360
gctggtattg gttctgatca tgttgacttg aatgctgcta atgaacataa cattactgtt 420
gctgaagtta cttatagtaa ctctgtttct gttgctgaag ctgaagttat gcaattgttg 480
gctttggtta gaaattttat cccagctcat gatattgtta aggctggtgg ttggaatatt 540
gctgatgctg tctctagagc ttatgatttg gaaggtatga ctgttggtgt tattggtgct 600
ggtagaattg gtagagctgt tttggaaaga ttgaagccat ttggtgttaa gttggtttat 660
aatcaaagac atcaattgcc tgatgaagtt gaaaatgaat tgggtttgac ttatttccca 720
gatgttcatg aaatggttaa agttgttgat gccgttgttt tggctgcccc tttgcatgct 780
caaacctatc atttgtttaa tgatgaagtc ttggctacta tgaagagagg tgcttatatt 840
gttaataact ccagaggtga agaagtagat agagatgcta tagttagagc tttaaattca 900
ggtcaaatcg gtggttacag tggtgatgtt tggtatccac aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa ctatgccaaa tgaagctatg actccacaca tgtcaggtac taccttgtct 1020
gctcaagcta gatatgctgc tggtgccaga gaaatattag aagatttttt ggaagacaag 1080
cctattagac cagaatactt gattgcccaa ggtggttcat tggctggtac tggtgctaaa 1140
tcatatacag ttaaaaaggg tgaagaaact ccaggtagtg gtgaagctga aaaataa 1197
<210> 36
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自母牛分枝杆菌且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶的基因FDH2）
<400> 36
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaatatt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agagaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtta cttctgataa agacggtcca 240
gattctgttt ttgaaagaga attagttgac gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaaa atttgaagtt ggcattaacc 360
gctggtattg gtagtgatca tgttgatttg caatctgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttatagtaa ttctatctct gtcgctgaac atgttgttat gatgattttg 480
tctttggtta gaaactactt gccatctcac gaatgggcca gaaagggtgg ttggaatatt 540
gctgattgcg tttctcatgc ttacgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttggtgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actcaaagac atagattgcc tgaatctgtt gaaaaagaat tgaatttgac ctggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaatgttcc tttgcatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaaca ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatata 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg tcgctagagc tttggaatct 900
ggtagattgg ctggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc taaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gctcaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgctcat 1140
tcctattcaa aaggtaatgc tacaggtggt tcagaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 37
<211> 1095
<212> DNA
<213> （来自博伊丁假丝酵母且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶的基因FDH3）
<400> 37
atgaagatcg ttttggtttt gtacgacgct ggtaaacatg ctgccgacga agaaaaattg 60
tacggttgta ccgaaaataa attgggtatt gccaactggt tgaaagacca aggtcacgaa 120
ttgattacta cttctgataa agaaggtgaa acttccgaat tagataaaca tattccagat 180
gcagatatca taatcacaac tccattccat ccagcttata ttactaaaga aagattggat 240
aaggccaaaa atttgaaatt ggttgttgtc gctggtgttg gttcagacca tattgattta 300
gattatatca accaaaccgg taaaaagatc agtgttttgg aagttactgg ttctaatgta 360
gtatcagttg ctgaacatgt tgttatgact atgttggttt tggtaagaaa ctttgttcca 420
gctcacgaac aaattattaa tcatgactgg gaagttgctg ctattgctaa agatgcttat 480
gatattgaag gtaaaaccat tgccactatt ggtgccggta gaataggtta tagagtttta 540
gaaagattgt tgccattcaa cccaaaagaa ttgttgtatt acgattacca agctttgcct 600
aaagaagcag aagaaaaagt tggtgcaaga agagttgaaa acattgaaga attggttgct 660
caagctgata tagtcacagt taatgctcca ttgcatgccg gtactaaagg tttgattaat 720
aaagaattgt tatccaagtt caagaagggt gcttggttgg ttaatactgc tagaggtgct 780
atttgtgtcg ctgaagatgt cgctgctgct ttggaatctg gtcaattgag aggttatggt 840
ggtgatgttt ggtttcctca acctgctcct aaggatcatc cttggagaga tatgagaaac 900
aagtatggtg ctggtaatgc tatgactcct cattatagtg gtactacatt ggatgctcaa 960
actagatatg ctgaaggtac taaaaacatc ttggaatctt ttttcaccgg taagtttgat 1020
tatagaccac aagatattat cttgttgaac ggtgaatatg tcactaaagc ttatggtaaa 1080
catgacaaga agtaa 1095
<210> 38
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶的基因FDH4）
<400> 38
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actgatagac atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 39
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB1）
<400> 39
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
acttctagaa atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 40
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB2）
<400> 40
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
acttcaagac atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 41
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB3）
<400> 41
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actgcaagaa atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 42
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB4）
<400> 42
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actgctagac atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 43
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB5）
<400> 43
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actcaaagaa atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 44
<211> 1206
<212> DNA
<213> （来自假单胞菌101且经过密码子优化的编码甲酸脱氢酶突变的基因FDH4-TB6）
<400> 44
atggcaaaag ttttgtgtgt tttgtacgat gacccagttg acggttatcc aaagacttat 60
gctagagatg atttgccaaa aattgaccac tatccaggtg gtcaaacttt gccaacacca 120
aaagcaattg attttactcc aggtcaattg ttaggttctg tatccggtga attgggtttg 180
agaaaatatt tggaatcaaa cggtcatact ttggttgtca cttcagataa agatggtcca 240
gattctgtat ttgaaagaga attggttgat gctgatgttg ttattagtca accattttgg 300
ccagcctatt tgactccaga aagaattgct aaagctaaga atttgaagtt ggctttaact 360
gccggtattg gttcagatca tgttgacttg caaagtgcta ttgatagaaa tgttactgtt 420
gctgaagtta cttattgtaa ctctatttct gtcgctgaac atgtcgttat gatgatcttg 480
tctttggtta gaaattactt gccatctcat gaatgggcta gaaaaggtgg ttggaatatt 540
gctgattgtg tttctcatgc ttatgatttg gaagctatgc atgttggtac tgttgctgct 600
ggtagaattg gtttggctgt tttgagaaga ttggctccat ttgatgttca tttgcattat 660
actcaaagac atagattgcc tgaatctgtt gaaaaggaat tgaatttgac ttggcatgct 720
acaagagaag atatgtatcc agtttgcgat gttgttactt tgaattgtcc tttacatcca 780
gaaacagaac acatgattaa tgatgaaact ttgaagttgt tcaagagagg tgcttatatt 840
gttaatactg ctagaggtaa gttgtgtgat agagacgctg ttgctagagc cttagaatct 900
ggtagattgg ccggttatgc tggtgatgtt tggtttcctc aaccagctcc aaaggaccat 960
ccatggagaa caatgccata taatggtatg acaccacata tttcaggtac tactttgact 1020
gcacaagcta gatatgctgc tggtactaga gaaattttag aatgtttttt cgaaggtaga 1080
ccaataagag acgaatattt gattgttcaa ggtggtgctt tggctggtac aggtgcccat 1140
tcttattcca agggtaatgc tacaggtggt tctgaagaag ctgctaagtt taaaaaggct 1200
gtttaa 1206
<210> 45
<211> 1350
<212> DNA
<213> （来自脱氮硫杆菌且经过密码子优化的编码1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RuBisCO）
<400> 45
atggaccaat ctgctagata cgctgacttg tctttgaagg aagaagactt gatcaagggt 60
ggtagacaca tcttggttgc ttacaagatg aagccaaagt ctggttacgg ttacttggaa 120
gctgctgctc acttcgctgc tgaatcttct actggtacta acgttgaagt ttctactact 180
gacgacttca ctaagggtgt tgacgctttg gtttactaca tcgacgaagc ttctgaagac 240
atgagaatcg cttacccatt ggaattgttc gacagaaacg ttactgacgg tagattcatg 300
ttggtttctt tcttgacttt ggctatcggt aacaaccaag gtatgggtga catcgaacac 360
gctaagatga tcgacttcta cgttccagaa agatgtatcc aaatgttcga cggtccagct 420
actgacatct ctaacttgtg gagaatcttg ggtagaccag ttgttaacgg tggttacatc 480
gctggtacta tcatcaagcc aaagttgggt ttgagaccag aaccattcgc taaggctgct 540
taccaattct ggttgggtgg tgacttcatc aagaacgacg aaccacaagg taaccaagtt 600
ttctgtccat tgaagaaggt tttgccattg gtttacgacg ctatgaagag agctcaagac 660
gacactggtc aagctaagtt gttctctatg aacatcactg ctgacgacca ctacgaaatg 720
tgtgctagag ctgactacgc tttggaagtt ttcggtccag acgctgacaa gttggctttc 780
ttggttgacg gttacgttgg tggtccaggt atggttacta ctgctagaag acaataccca 840
ggtcaatact tgcactacca cagagctggt cacggtgctg ttacttctcc atctgctaag 900
agaggttaca ctgctttcgt tttggctaag atgtctagat tgcaaggtgc ttctggtatc 960
cacgttggta ctatgggtta cggtaagatg gaaggtgaag gtgacgacaa gatcatcgct 1020
tacatgatcg aaagagacga atgtcaaggt ccagtttact tccaaaagtg gtacggtatg 1080
aagccaacta ctccaatcat ctctggtggt atgaacgctt tgagattgcc aggtttcttc 1140
gaaaacttgg gtcacggtaa cgttatcaac actgctggtg gtggttctta cggtcacatc 1200
gactctccag ctgctggtgc tatctctttg agacaatctt acgaatgttg gaagcaaggt 1260
gctgacccaa tcgaattcgc taaggaacac aaggaattcg ctagagcttt cgaatctttc 1320
ccaaaggacg ctgacaagtt gttcccaggt 1350
<210> 46
<211> 1059
<212> DNA
<213> （来自甘蓝且经过密码子优化的编码磷酸核酮糖激酶的基因PRK）
<400> 46
atgtctcaac aacaaactat cgttatcggt ttggctgctg actctggttg tggtaagtct 60
actttcatga gaagattgac tagtgtcttc gggggtgctg ctgaaccacc aaagggtggt 120
aacccagact ctaacacttt gatctctgac actactactg ttatctgttt ggacgacttc 180
cactctttgg acagaaacgg tagaaaggtt gaaaaggtta ctgctttgga cccaaaggct 240
aacgacttcg acttgatgta cgaacaagtt aaggctttga aggaaggtaa ggctgttgac 300
aagccaatct acaaccacgt ttctggtttg ttggacccac cagaattgat ccaaccacca 360
aagatcttgg ttatcgaagg tttgcaccca atgtacgacg ctagagttag agaattgttg 420
gacttctcta tctacttgga catctctaac gaagttaagt tcgcttggaa gatccaaaga 480
gacatgaagg aaagaggtca ctctttggaa tctatcaagg cttctatcga atctagaaag 540
ccagacttcg acgcttacat cgacccacaa aagcaacacg ctgacgttgt tatagaagtg 600
ctgccaactg aattgatccc agacgacgac gaaggtaagg ttttgagagt tagaatgatc 660
caaaaggaag gtgttaagtt cttcaaccca gtttacttgt tcgacgaagg ttctactatc 720
tcttggatcc catgtggtag aaagttgact tgttcttacc caggtatcaa gttctcttac 780
ggtccagaca ctttctacgg taacgaagtt actgttgttg aaatggacgg tatgttcgac 840
agattggacg aattgatcta cgttgaatct cacttgtcta acttgtctac taagttctac 900
ggtgaagtta ctcaacaaat gttgaagcac caaaacttcc caggttctaa caacggtact 960
ggtttcttcc aaactatcat cggtttgaag atcagagact tgttcgaaca attggttgct 1020
tctagatcta ctgctactgc tactgctgct aaggcttaa 1059
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物FDH3+4-F）
<400> 47
cgcgagctct taaacagcct ttttaaactt agc 33
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> （引物FDH3+4-R）
<400> 48
gcggccgcat ggcaaaagtt ttgtgtgttt tg 32
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物FDH3+4-TB1-F）
<400> 49
acaaggatcc atggcaaaag ttttgtgtgt ttt 33
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> （引物FDH3+4-TB1-R）
<400> 50
ttagctagct taaacagcct ttttaaactt agcagc 36
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB1+4-F）
<400> 51
cgcgagctct taaacagcct ttttaaactt agcagc 36
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物FDH4-TB1+4-R）
<400> 52
gcggccgcat ggcaaaagtt ttgtgtgttt tgtac 35
<210> 53
<211> 37
<212> DNA
<213> （引物FDH4+4-TB1+3-F）
<400> 53
gcgcgtccat tcgccattat tcagttttct gactgag 37
<210> 54
<211> 54
<212> DNA
<213> （引物FDH4+4-TB1+3-R）
<400> 54
ttggcgcgcc tttatccagc aatttagcaa attttgactc tatgtcaatc tcgt 54
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物RuBisCO-F）
<400> 55
cacataaaca aacaaaatgg accaatctgc tagatacgct ga 42
<210> 56
<211> 47
<212> DNA
<213> （引物RuBisCO-R）
<400> 56
gaacacccaa cttttctctc caacctggga acaacttgtc agcgtcc 47
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物PRK-F）
<400> 57
tcaagatacc agcctaaaaa tgtctcaaca acaaactatc gt 42
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> （引物PRK-R）
<400> 58
cataactaat tacatgatta agccttagca gcagtagcag t 41

Claims (10)

1.一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌，其利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的途径如下：
(1)葡萄糖在微生物体内转化为游离脂肪酸合成前体物质乙酰辅酶A，并经过菌株本身具有的脂肪酸合成途径合成游离脂肪酸；
(2)甲酸盐在发酵时进行添加后，转入微生物体内，在外源表达的甲酸脱氢酶的作用下转化为CO2，同时产生游离脂肪酸生产所需要的还原力；
(3)甲酸根转化为的CO2以及细胞内本身由葡萄糖转化产生的CO2，在外源表达1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶及磷酸核酮糖激酶的作用下转化为游离脂肪酸合成的前体物质乙酰辅酶A；
(4)来源于甲酸根及葡萄糖的乙酰辅酶A经过游离脂肪酸合成途径最终转化为游离脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述利用甲酸根助力合成游离脂肪酸的基因工程菌为异源表达外源性编码甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)的基因FDH和过表达卡尔文循环模块中关键基因的重组酿酒酵母菌。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源性编码甲酸脱氢酶的基因FDH包括来源于布氏乳杆菌的基因FDH1或来源于布氏乳杆菌且经过密码子优化的基因FDH1、来源于母牛分枝杆菌的基因FDH2或来源于母牛分枝杆菌且经过密码子优化的基因FDH2、来源于博伊丁假丝酵母的基因FDH3或来源于博伊丁假丝酵母且经过密码子优化的基因FDH3、来源于假单胞菌101的基因FDH4或来源于假单胞菌101且经过密码子优化的基因FDH4，以及分别基于上述基因FDH1-4的不引起所述甲酸脱氢酶功能改变的基因取代。
4.根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述卡尔文循环模块中的关键基因包括编码1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RuBisCO或经过密码子优化的编码1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RuBisCO，和/或编码磷酸核酮糖激酶的基因PRK或经过密码子优化的编码磷酸核酮糖激酶的基因PRK。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造获得的重组酿酒酵母菌，所述底盘微生物改造包括游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因的敲除。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述游离脂肪酸分解代谢途径的相关基因包括编码脂肪醛脱氢酶的基因hfd1、编码脂肪酰基辅酶A氧化酶的基因pox1、编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa1和编码长链脂肪酰基辅酶A合成酶的基因faa4。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌在生产游离脂肪酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产游离脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌进行发酵培养，并在发酵阶段添加含甲酸根的化合物，生产游离脂肪酸；优选地，含甲酸根的化合物为甲酸盐。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在摇瓶发酵中，通过添加20g/L葡萄糖并在24小时加入2-7.2g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸；在5L发酵罐发酵中，通过葡萄糖连续补料并每12小时添加5g/L甲酸盐，生产游离脂肪酸。
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