CN113265343B - 一种重组多形汉逊酵母的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种重组多形汉逊酵母菌株的构建方法及其应用，方法包括构建靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体；将表达载体导入多形汉逊酵母菌株，敲除菌株中的OpFAA1基因。本申请还提供了一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株的构建方法。构建的重组多形汉逊酵母菌株在多种碳源条件下均能够有效地积累脂肪酸。在此基础上通过增加细胞内NADPH供给，进一步提高单位生物量脂肪酸产量。同时，过表达MmCAR、npgA、ADH5、FaCoAR，并敲除基因OPFAA1或/和OpHFD1，首次在多形汉逊酵母中实现脂肪醇合成。进一步地，在高产脂肪酸菌株中游离表达JeOleT实现了α‑烯烃的合成，拓展了其在细胞工厂应用的应用潜力。

Description

一种重组多形汉逊酵母的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种产脂肪酸、脂肪醇和α-烯烃的重组多形汉逊酵母的构建方法、优化及其应用。

背景技术

脂肪酸及其衍生物(脂肪醇、脂肪酸烷基酯和烷烃等)在能源、医药和化妆品等领域具有广泛应用潜力。由脂肪酸衍生的生物燃料和油脂化合物，由于其更高的能量密度、与现有燃料更加相似的储藏运输特性和燃烧性能等，使其逐渐成为目前汽油、柴油和航空燃料最主要的替代产品。游离脂肪酸还广泛用于生产肥皂、表面活性剂和润滑油等化工产品。除此之外，脂肪醇是目前去污剂、护肤品等化妆品和医药领域的主要生产原材料。2016年，脂肪醇全球市场超过了37亿美元，并且还在持续增长。但是，随着脂肪酸及其衍生物市场需求量不断增大，从天然动植物提取脂肪酸及其衍生物势必会对动植物生存、生物多样性以及生态效应造成不可逆转的影响。因此，目前急需一种更加高效的和环境友好的脂肪酸及其衍生物的生产模式。

以微生物作为细胞工厂制造脂肪酸及其衍生物是对传统化学合成方法的有效补充，正日益成为工业生物技术领域不可或缺的组成部分。近年来，以模式微生物作为宿主构建的脂肪酸以及衍生物生产菌株取得了重要进展。以大肠杆菌为宿主，通过多基因优化实现了批式补料发酵脂肪酸产量8.6g/L(Xu et al.Nat.Comm.,2013,4:1409.)；以酿酒酵母为宿主，通过全面的代谢途径改造以及优化关键基因的来源及表达强度，实现摇瓶水平脂肪酸产量超过1g/L，批式补料达到了10.4g/L(Zhou et al.Nat.Comm.,2016,7:11709.)。同时，Feng等认为脂肪醇的积累可能与细胞内的磷脂代谢相关，并通过敲除相关基因首次将酵母脂肪醇产量提高到330mg/L，批式补料下达到1.1g/L(Feng et al.Metab.Eng.,2015,27:10-19.)。最近，Jay D.Keasling等通过整合多种合成生物学策略，成功将酵母脂肪醇摇瓶发酵产量提高到1g/L以上，并在批式补料条件下达到6g/L，基本与脂肪酸产量相当，推进了酵母脂肪醇的工业化生产(d’Espaux L et al.Metab.Eng.,2017,42:115-125.)。

但是，目前脂肪酸及其衍生物的生产原料还主要以葡萄糖为主。但是，传统的生物质或者粮食原料受到耕地面积、地理气候等因素制约。甲醇是重要的一碳化合物，由于其低廉的价格和稳定的供应，有望成为继生物质糖类外另一重要原料。而且，甲醇的生物转化将促进我国煤炭资源洁净利用，实现重要能源产品和精细化学品的高效生产，并最终推动我国生产模式转型。

多形汉逊酵母是一种重要的甲基营养型酵母，具有广泛的底物谱，能够天然利用木糖和甲醇等碳源，而且能够耐受50℃以上高温，这些优良特性使其成为一种潜在的优良微生物细胞工厂。但是，目前以汉逊酵母为底盘细胞生产脂肪酸及其衍生物的领域还是一片空白。因此，本发明旨在构建汉逊酵母脂肪酸以及衍生物的高产菌株，一方面填补领域空白，另一方面探索汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力与前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种产脂肪酸、脂肪醇和α-烯烃的重组多形汉逊酵母的构建方法、优化及其应用。

本发明的第一方面，提供一种产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株的构建方法，能够显著增加脂肪酸的积累量，脂肪酸积累量在1500mg/L以上。

所述构建方法包括：构建具有SEQ ID NO：1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pHpgRNA42；将所述sgRNA表达载体pHpgRNA42导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpFAA1基因。

可选地，所述多形汉逊酵母菌株整合有Cas9蛋白。

可选地，所述构建方法还包括：构建具有SEQ ID NO：2所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pHpgRNA43；将所述sgRNA表达载体pHpgRNA43导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpPOX1基因。

在一个具体实施方式中，敲除编码脂酰辅酶A合成酶的基因OpFAA1和编码脂酰辅酶A氧化酶的基因

进一步地，上述技术方案的具体步骤是：以无缝敲除基因OpFAA1为例，本发明对汉逊酵母的基因组编辑主要依托自主构建的CRISPR/Cas9系统完成。首先，构建靶向基因OpFAA1的sgRNA表达载体pHpgRNA42，其中20bp靶向序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；接着，构建供体DNA分子，分别扩增基因OpFAA1编码区上下游各1000bp序列，通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；将gRNA表达载体pHpgRNA42和供体DNA以各500ng的量，电击转化进入整合有Cas9蛋白的重组汉逊酵母，于SD平板37℃静置培养2～3天；转化子经液体SD培养基培养后，通过PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。敲除基因OpPOX1(20bp靶向序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)以及下文中的其它基因组编辑工作均遵循相似流程。

进一步地，鉴定了OpFAA1基因和OpPOX1基因在汉逊酵母中的序列(分别如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列)以及功能。

进一步地，在以20g/L葡萄糖为底物的基础盐培养基中，接种敲除了OpFAA1基因和OpPOX1基因的重组多形汉逊酵母菌株，进行脂肪酸发酵，初始接种OD₆₀₀为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，37℃，220rpm，发酵时间为72～96h。进一步地，发现并鉴定出汉逊酵母所产脂肪酸种类包括C16-1、C16、C18-2、C18-1和C18。

进一步地，在以20g/L木糖为底物的基础盐培养基中，接种敲除了OpFAA1基因和OpPOX1基因的重组多形汉逊酵母菌株，进行脂肪酸发酵，初始接种OD₆₀₀为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，37℃，220rpm，发酵时间为72～96h。发现重组汉逊酵母能够转化木糖合成脂肪酸，获得与葡萄糖中相似的脂肪酸产量及种类。

进一步地，在以10g/L甲醇为底物的接种敲除了OpFAA1基因和OpPOX1基因的重组多形汉逊酵母菌株，进行脂肪酸发酵，初始接种OD₆₀₀为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，37℃，220rpm，发酵时间为72～96h。结果证明重组汉逊酵母能够以甲醇为唯一碳源和能量来源进行生长和代谢，并能够生产450mg/L以上脂肪酸，脂肪酸种类同葡萄糖和木糖。

根据本申请的第二方面，提供一种在汉逊酵母中增加NADPH供给的方法，在多形汉逊酵母中过表达来源于酿酒酵母的异柠檬酸脱氢酶2(由基因ScIDP2编码)，和/或敲除了编码琥珀酰辅酶A合成酶的OpLSC2基因，从而提高脂肪酸产量。

可选地，使所述重组多形汉逊酵母菌株过表达由ScIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2包括：将来源于酿酒酵母的ScIDP2基因整合至所述汉逊酵母，优选整合至汉逊酵母的OpFAA1位点。

敲除多形汉逊酵母菌株中的OpLSC2基因包括：构建具有SEQ ID NO：5所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pHpgRNA60；将所述sgRNA表达载体pHpgRNA60导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的LSC2基因。

在一个具体实施方式中，上述技术方案的实施步骤是：

(1)基因ScIDP2的过表达

①含有基因ScIDP2表达载体构建。质粒pHp30：以来源于酿酒酵母的ScLEU2基因为筛选标记，含有来源于乳酸克鲁维酵母的自主复制序列panARS。表达盒pHpGAP-ScIDP2-HpGAPt，通过融合PCR扩增获得，并使用Gibson Assembly的方法连接到上述载体骨架上。完整质粒经测序验证后转化进入上述构建的高产脂肪酸汉逊酵母菌株。

②基因ScIDP2的基因组整合表达。具体流程与上述本发明第一方面内容一致，其中构建的供体DNA由融合PCR方法获得，包括两侧同源臂各1000bp以及表达盒pHpGAP-ScIDP2-HpGAPt。整合位点为OpFAA1，故构建的sgRNA表达载体为pHpgRNA42，实现基因ScIDP2整合的同时，敲无缝除基因OpFAA1。

(2)基因OpLSC2的无缝敲除

具体流程与上述本发明第一方面内容一致，其中构建的sgRNA表达载体为pHpgRNA60，20bp靶向序列如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。进一步地，鉴定了其在汉逊酵母中的序列(如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列)以及功能。

本发明的第三方面，提供了根据本申请第一方面所述的构建方法或根据本申请第二方面所述的方法构建得到的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株。

本申请的第四方面，提供了一种生产脂肪醇汉逊酵母菌株的构建方法，包括：以上述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株为出发菌株，使其过表达羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA。

可选地，将密码子优化后的MmCAR和npgA基因整合至所述产脂肪酸的重组汉逊酵母菌株的OpPOX1位点，以过表达羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA。

可选地，使所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株进一步过表达醇脱氢酶ADH5。

可选地，使所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株进一步过表达脂酰辅酶A还原酶FaCoAR。

在一个具体实施方式中，借助CRISPR/Cas9系统，将脂肪醇合成途径的4个关键基因，羧酸还原酶MmCAR以及辅因子npgA，醇脱氢酶ADH5，脂酰辅酶A还原酶FaCoAR的编码基因，整合至OpPOX1位点。其中，MmCAR和npgA按照汉逊酵母密码子偏好性进行优化，优化后的序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

进一步地，为了提高脂肪醇产量，将基因OpHFD1进行了无缝敲除，其催化脂肪醛到脂肪酸的逆向反应。

具体流程与上述本发明第一方面内容一致，其中构建的sgRNA表达载体为pHpgRNA66，20bp靶向序列如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。同时，鉴定了基因OpHFD1在汉逊酵母中的序列(如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列)以及功能。

作为一个具体实施方式，本申请提供了一种高产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株的构建方法，出发菌株为NCYC 495leu1.1，并敲除脂酰辅酶A合成酶(由基因FAA1编码)和脂酰辅酶A氧化酶(由基因POX1编码)。所述重组多形汉逊酵母菌株在含有20g/L葡萄糖的基础成分培养基中发酵72～96h，摇瓶水平脂肪酸产量达到1.5g/L，脂肪酸种类包括C16-1、C16、C18-2、C18-1和C18。高产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株过表达来源于酿酒酵母的异柠檬酸脱氢酶2(由ScIDP2编码)，并且敲除了琥珀酰辅酶A合成酶(由LSC2编码)，能够进一步提高脂肪酸产量。鉴定了基因FAA1，POX1和LSC2的序列和功能，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示。该构建方法包括使羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA，醇脱氢酶ADH5，脂酰辅酶A还原酶FaCoAR过表达，并实现一次性完成体内自组装，整合至POX1位点。

作为一个具体实施方式，本申请提供了一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，对基因羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA进行了人工密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。敲除基因FAA1和脂肪醛脱氢酶HFD1能够促进重组汉逊酵母脂肪醇合成。该构建方法鉴定了基因HFD1的序列和功能，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

根据本申请的第五方面，提供了根据本申请第四方面所述的构建方法构建得到的脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株。

根据本申请的第六方面，提供了一种α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，该构建方法以本申请第一方面所述构建方法构建的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株为出发菌株，使其过表达脂肪酸脱羧酶，其中，对该过程关键基因脂肪酸脱羧酶JeOleT进行了密码子优化，将进行密码子优化后的JeOleT基因构建于游离表达载体，并以组成型启动子pHpTEF1启动基因表达，密码子优化后的JeOleT基因具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。在高产脂肪酸的菌株中，游离表达基因JeOleT，实现汉逊酵母中13碳和15碳α-烯烃的首次合成。

根据本申请的第七方面，提供了根据本申请第六方面所述的构建方法构建得到的α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株。

根据本申请的第八方面，提供了根据本申请第一方面或第二方面所述的构建方法、本申请第三方面所述的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株、本申请第四方面所述的构建方法、本申请第五方面所述的脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株，本申请第六方面所述的构建方法、以及本申请第七方面所述的α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株细胞大规模培养(细胞工厂)中的应用。

根据本申请第九方面，提供了根据本申请第一方面或第二方面所述的构建方法、本申请第三方面所述的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株、本申请第四方面所述的构建方法、本申请第五方面所述的脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株，本申请第六方面所述的构建方法、以及本申请第七方面所述的α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株在脂肪酸和/脂肪醇和/α-烯烃的合成中的应用。

在本申请中，Gibson assembly技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在T5 exonuclease(Epicentre),Phusion DNA polymerase(New England Biolabs(NEB))and Taq DNAligase(NEB)Taq ligase的催化下，仅需反应15min即可进行转化，完成定向克隆。

在本申请中，密码子进行优化，也就是序列优化。不同物种间密码子偏好性不同，外源基因表达如果不进行密码子优化可能会影响转录效率。具体优化过程借助计算机技术完成。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请提供了一种产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株的构建方法，通过该方法构建重组多形汉逊酵母菌株能够显著增加脂肪酸的积累量，敲除脂酰辅酶A合成酶(由基因FAA1编码)和脂酰辅酶A氧化酶(由基因POX1编码)能够有效地积累脂肪酸，在含有20g/L葡萄糖的基础成分培养基中发酵72～96h，摇瓶水平脂肪酸产量达到1.5g/L，脂肪酸种类包括C16-1、C16、C18-2、C18-1和C18。在此基础上，通过过表达来源于酿酒酵母的异柠檬酸脱氢酶2(由ScIDP2编码)和敲除琥珀酰辅酶A(由LSC2编码)合成酶能够增加细胞内NADPH供给，进一步分别提高了60％和35％的单位生物量脂肪酸产量。

2)本申请还提供了一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，通过过表达脂肪醇合成关键基因羧酸还原酶MmCAR以及辅因子npgA，醇脱氢酶ADH5，脂酰辅酶A还原酶FaCoAR，并敲除基因FAA1，和/或脂肪醛脱氢酶HFD1，首次在多形汉逊酵母中实现脂肪醇合成，拓展了其在细胞工厂应用的应用潜力。

3)本申请还提供了一种α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，通过在高产脂肪酸的汉逊酵母中，游离表达脂肪酸脱羧酶JeOleT，首次在多形汉逊酵母中实现α-烯烃合成，进一步拓展了其产物谱。

4)本申请提供的构建方法可以应用于脂肪酸和/脂肪醇和/α-烯烃的合成。

附图说明

图1示出了汉逊酵母CRISPR/Cas9系统中sgRNA构建过程示意图。

图2a-2d示出了高产脂肪酸汉逊酵母菌株构建。

图3示出了代谢工程改造策略促进汉逊酵母脂肪酸积累和脂肪醇合成示意图。

图4示出了以20g/L葡萄糖为唯一碳源的基础培养基，汉逊酵母脂肪酸发酵情况。

图5a-5b示出了以20g/L木糖为唯一碳源的基础培养基，汉逊酵母脂肪酸发酵情况。

图6a-6b示出了以10g/L甲醇为唯一碳源的基础培养基，汉逊酵母脂肪酸发酵情况。

图7a-7c示出了过表达异柠檬酸脱氢酶ScIDP2基因对脂肪酸发酵过程的影响。

图8示出了过表达ScIDP2和敲除OpLSC2对单位生物量脂肪酸产量的影响。

图9示出了脂肪醇合成关键基因体内自组装整合至OpPOX1位点。

图10a-10c示出了基因OpFAA1敲除重组汉逊酵母合成脂肪醇。

图11a-11c示出了基因OpHFD1敲除重组汉逊酵母合成脂肪醇。

图12示出了基因OpFAA1和OpHFD1双敲除重组汉逊酵母合成脂肪醇。

图13示出了α-烯烃合成汉逊酵母菌株合成α-烯烃的气相色谱图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

高产脂肪酸汉逊酵母菌株构建

(1)基因编辑CRISPR/Cas9系统构建

出发菌株多形汉逊酵母(Ogataeapolymorpha NCYC 495leu1.1)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC 2.2412)。实验室前期自主构建了整合CAS9基因的重组汉逊酵母495-3(基因型MATa,leu1.1,pGAP-hCAS9-AOX1t)，并以此为宿主菌株进行高产脂肪酸以及衍生物菌株的构建。其中，菌株495-3的具体构建方法如下：首先，以引物pGAP-Fw-EcoRI(CGCCGCgaattcTTTTTGTAGAAATGTCTTGG)和pGAP-Rv-XhoI(CCGTCGctcgagTGTGTTTTGATAGTTGTTCA)扩增来源于毕赤酵母的pGAP启动子，以EcoR I和Xho I分别对载体pPICZ A和pGAP进行酶切连接，获得重组载体pPICZA-pGAP。扩增人源的CAS9基因(引物Cas9-Fw-SacII：ATTGATccgcggATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC和Cas9-Rv-SacII:ATTGATccgcggTCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGG)，并利用Sac II位点连接于pPICZ A-pGAP。将获得的表达载体进行单酶切后，转化汉逊酵母495，以单交换的方式整合于汉逊酵母基因组(如图1所示)。获得的正确转化子命名为495-3。

sgRNA表达载体构建过程如图1所示，本发明中使用的所有sgRNA表达载体除20bp靶向序列不同以外，其余部分完全相同。简单来说，首先使用引物p267(tttagggctaTCTTTTCTACGGGGTCTG)和p268(GCGGCGGCCGCCAGCTTT)扩增载体骨架；接着，分别扩增sgRNA-1和sgRNA-2并将二者以融合PCR的方式连接形成完整的sgRNA表达盒。其中sgRNA-1使用引物p101(gtagaaaagaTAGCCCTAAAGACACC GTTG)和p127(ATCTGAGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTC)，sgRNA-2使用引物pX(GAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCTCAGATxxxGTTTTAGAGCTAGAAATAG，其中xxx为可替换20bp靶向序列)和p10(agaaagctggcggccgccgc GTTTGGATCAACAGACGAC)；最后，sgRNA片段和载体骨架片段使用Gibson Assembly的方法进行克隆连接，获得的重组载体测序后进行应用。本发明中涉及的sgRNA表达载体包括pHpgRNA42(靶向基因OpFAA1)，pHpgRNA43(靶向基因OpPOX1)，pHpgRNA60(靶向基因OpLSC2)和pHpgRNA66(靶向基因OpHFD1)。

供体DNA构建如图2a-2d所示。总体来说，分别扩增靶向基因编码区上下游各1000bp序列作为同源臂，之后通过融合PCR的方式将各个片段进行组装，获得完整的供体DNA分子用于电击转化实验。

(2)高产脂肪酸菌株构建

脂肪酸的合成与分解代谢过程如图3所示，目前并没有汉逊酵母产脂肪酸的相关报道。通过序列比对，我们找到了汉逊酵母中的脂酰辅酶A合成酶和脂酰辅酶A氧化酶。区别是，汉逊酵母脂酰辅酶A合成酶只有一种，即OpFAA1基因。

因此，为了实现汉逊酵母产脂肪酸，我们利用上述构建的CRISPR/Cas9系统(图1和图2a-2d)，分别将OpFAA1和OpPOX1基因进行单独敲除和双敲除。依靠汉逊酵母本身的同源重组能力，我们分别挑选出OpFAA1基因单敲除菌2株(y23-2和y23-3)和OpPOX1基因单敲除菌1株(y24-5)(图2a-2d)。同时，在OpFAA1基因单敲除菌y23-3的基础上，实现了OpFAA1和OpPOX1基因双敲除(y23-24-1和y23-24-2)(图2a-2d)，供后续脂肪酸产量分析。

实施例2

重组汉逊酵母脂肪酸发酵

(1)培养基

YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉；

SD培养基：20g/L葡萄糖，6.7g/L YNB，需要时补加必需的氨基酸成分；

发酵培养基(基础成分培养基)：(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，KH₂PO₄ 14.4g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，加入约900mL ddH₂O，调节pH为5.6，定容至950mL，115℃灭菌30min。灭菌后，补加1mL维生素溶液和2mL微量金属溶液，使用时添加必需氨基酸。向发酵培养基中添加不同种类碳源，包括20g/L葡萄糖、10g/L甲醇和20g/L木糖等，用于脂肪酸发酵。

(2)实验流程及条件

菌株活化，挑取3个单菌落于3/15mL YPD培养基中，或者SD培养基中，37℃，220rpm震荡培养24h；种子液培养，将活化后的菌液按1％(v/v)转接于20/100mL YPD培养基中，或者SD培养基中，37℃，220rpm震荡培养16～18h；接种，按初始OD₆₀₀＝0.1接种于发酵培养基，装液量为20mL/100mL锥形瓶，37℃，220rpm条件下进行发酵。定点取样或者终点取样，用于生物量(以600nm处的吸光值表示)和产量分析。

(3)以葡萄糖为底物的脂肪酸合成

成功构建了汉逊酵母OpFAA1和OpPOX1基因的无缝敲除菌株，我们首先在含20g/L葡萄糖的基础培养基条件下进行脂肪酸的发酵实验。实验结果如图4所示。一方面，发酵72h结束，四种重组汉逊酵母的生物量存在显著差异，OpFAA1和OpPOX1基因敲除菌株能够显著提高生物量浓度，特别是OpPOX1基因敲除菌株(24-5)，发酵终点的OD₆₀₀能够达到30以上，而且双敲除菌株(23-24)的生物量也维持在30左右。具体机制目前还不是特别清楚，推测与OpPOX1基因产生H₂O₂有关。

另一方面，脂肪酸产量也存在差异。OpFAA1基因敲除能够显著增加脂肪酸的积累量，无论是单敲除还是双敲除，脂肪酸积累量均在1500mg/L以上。但是，OpPOX1基因的敲除对于脂肪酸的生产没有明显作用，与出发菌株相似，维持在100mg/L左右的水平。而且，单敲除OpFAA1基因和双敲除菌株相比，发酵终点的脂肪酸产量没有显著差别，没有观察到脂肪酸重复利用的现象。汉逊酵母产脂肪酸种类主要是C16-1，C16，C18-1，C18-2和C18，其中以C16，C18-1，C18-2三种脂肪酸为主。

(4)以木糖为底物的脂肪酸合成

木质纤维素是目前全球范围内存储量最大的可再生能源作物，因其在土地利用、粮食安全以及环境保护等方面的优势成为极具发展潜力的原料类型。多形汉逊酵母天然能够利用葡萄糖和木糖，使其成为木质纤维素生物炼制的关键菌株。因此，本研究尝试以木糖为底物进行脂肪酸发酵，为进一步实现汉逊酵母发酵木质纤维素原料生产脂肪酸及其衍生物奠定基础。在含有20g/L木糖作为唯一碳源的基础盐培养基中，汉逊酵母细胞生长略慢于葡萄糖，但最终的生物量相似(图5a)。区别是，基因OpFAA1和OpPOX1在葡萄糖中对细胞生长和生物量浓度的促进作用，在木糖培养基中没有观察到，工程菌株与野生型菌株保持一致或略低。至于脂肪酸产量，野生型和菌株24-5脂肪酸维持在较低水平，而敲除了OpFAA1基因的菌株23-3和23-24依然能够积累较高浓度的脂肪酸，与在葡萄糖中相似，均维持在1g/L左右(图5b)。

(5)以甲醇为底物的脂肪酸合成

正如背景技术所提及，作为甲醇酵母的代表菌株之一，多形汉逊酵母的甲醇利用是其区别于其他酵母的重要特性。而且，以葡萄糖，或木糖，为唯一碳源的脂肪酸生产取得了比较理想的结果，说明我们成功构建了汉逊酵母脂肪酸的高产菌株。但是，我们更加关注的汉逊酵母能否将甲醇直接转化为脂肪酸，这对于甲醇的生物转化研究具有重要意义。因此，我们在含有10g/L甲醇的基础培养基中进行了脂肪酸的发酵实验(图6a和b)。只敲除了基因OpFAA1的重组汉逊酵母在甲醇中的生长要明显慢于葡萄糖和木糖，最终生物量能达到8左右。同时，重组汉逊酵母确实能够实现甲醇到脂肪酸的生物转化过程，而且发酵终点的脂肪酸浓度达到470mg/L左右，脂肪酸种类和占比与葡萄糖和木糖中一致。这一结果证实了汉逊酵母作为宿主细胞进行甲醇生物转化的应用潜力，也进一步拓展了甲醇生物转化的底物和产物谱。

实施例3

NADPH供给对脂肪酸合成的影响

脂肪酸的生产过程极度消耗NADPH，当以葡萄糖为底物时，尽管细胞能够依靠磷酸戊糖途径提供NADPH，仍然可能供给不足。因此，我们额外引入了其它NADPH供给途径，包括过表达细胞质的异柠檬酸脱氢酶ScIDP2基因，以及敲除琥珀酰辅酶A合成酶OpLSC2基因(图3)。

(1)过表达异柠檬酸脱氢酶2(ScIDP2)

细胞质中的柠檬酸或异柠檬酸会在异柠檬酸脱氢酶Idp2p催化下形成α-酮戊二酸，同时伴随NADPH的生成(图3)。因此，过表达ScIDP2基因是一种常用增加胞内NADPH供给的策略。但是，在汉逊酵母中并没有胞质ScIDP2基因，我们首先考虑过表达来源于酿酒酵母的ScIDP2基因。为了增加表达强度，利用强组成型启动子pGAP来启动ScIDP2基因表达，并以游离方式转化进入23-3菌株中，获得菌株y30(图7a)。在以葡萄糖为唯一碳源的基础培养基中，游离表达ScIDP2基因会导致细胞前期生长缓慢，但最终的生物量与对照菌株基本保持一致。而脂肪酸产量要明显的高于出发菌株，提高了50％以上(图7b-7c)。说明ScIDP2基因在汉逊酵母中能够正常发挥功能，增加的NADPH供给提高了脂肪酸的产量。

由于y30前期生长缓慢，考虑由于ScIDP2基因表达强度太高，影响了细胞生长。所以，进一步的实验将ScIDP2基因整合到汉逊酵母OpFAA1位点(即，将基因OpFAA1原位替换为基因ScIDP2，实现基因OpFAA1敲除的同时过表达基因ScIDP2)，并分别以启动子pTDH3和pAOX1启动基因表达(图7a)，获得的整合菌株即为JQ01和JQ02。在以葡萄糖为唯一碳源的基础培养基中，JQ01和JQ02的细胞生长和脂肪酸产量均与出发菌株没有差别，甚至略低于出发菌株，可能单拷贝整合基因表达强度不足。

(2)敲除琥珀酰辅酶A合成酶2(OpLSC2)

在酿酒酵母中，敲除OpLSC2基因能够迫使异柠檬酸从线粒体进入细胞质，结合过表达的ScIDP2基因，进一步增加NADPH生成(图3)。因此，我们在过表达ScIDP2基因的基础上，进一步敲除OpLSC2，考察脂肪酸产量的变化情况(图8)。单独敲除基因OpLSC2，不会使菌株积累脂肪酸；通过比较菌株23-3和YX02(菌株YX02为在菌株23-3的基础上进一步敲除OpLSC2基因)，在敲除OpFAA1基因的基础上进一步敲除基因OpLSC2使单位OD的脂肪酸产量提高了60％。甚至高于过表达IDP2的菌株30(提高了35％)。但是，奇怪的是，当同时敲除OpLSC2和过表达ScIDP2，单位OD的脂肪酸产量没有进一步提高，甚至比23-3还略低，说明二者敲除在胞内存在拮抗作用。

实施例4

脂肪醇合成汉逊酵母菌株构建

(1)脂肪醇合成菌株构建

根据实验室前期构建的高产脂肪醇酿酒酵母的结果(Zhou etal.J.Am.Chem.Soc.,2016,138(47):15368-15377.)，我们选取脂肪醇合成途径的4个关键基因，羧酸还原酶MmCAR以及辅因子npgA，醇脱氢酶ADH5，脂酰辅酶A还原酶FaCoAR进行表达(图3)，希望能够实现汉逊酵母合成脂肪醇。同时，将其中关键基因MmCAR和npgA进行了密码子优化(核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示)。借助实验室前期构建的汉逊酵母CRISPR/Cas9系统，将上述4个基因以完整表达盒整合至OpPOX1位点，实现1基因～4基因的一次性体内自组装(图9)。获得的转化子验证成功后用于后续脂肪醇合成。

(2)基因OpFAA1敲除菌株产脂肪醇

上述构建成功的含有1基因～4基因脂肪醇合成途径的重组汉逊酵母，进一步敲除其OpFAA1基因，使其在高效转化脂肪酸合成脂肪醇。将验证正确的菌株在含有20g/L葡萄糖的基础成分培养基中进行脂肪醇发酵实验，发酵96h结束，分别测定生物量、脂肪酸和脂肪醇。实验结果如图10a-10c所示：

首先，生物量，整合基因数量的增加不会对最终生物量产生影响，而且整合菌株要略高于对照。但在过程生长来看，整合菌株要明显慢于对照菌株，主要是由于组成型表达的合成基因造成的代谢负担。

其次，脂肪酸，敲除OpFAA1基因后的菌株均能产生较高产量的脂肪酸，特别是随着整合基因数量的增加，脂肪酸积累呈现递增的趋势，这可能与其较慢的生长过程相关。脂肪酸种类同实施例2。

最后，脂肪醇，与预期一致，对照菌株和单独表达MmCAR基因的菌株，无脂肪醇检出。而MmCAR与npgA共同表达检出少量脂肪醇(1mg/L以下)。进一步整合ADH5基因，产量提高了近3倍，说明乙醇脱氢酶在这一过程中发挥了关键作用。但是整合FaCoAR基因，没有进一步提升脂肪醇产量，可能由于较强的脂肪酸合成能力，导致细胞内脂酰CoA含量较低，也可能由于未进行密码子优化的FaCoAR基因活力较差，需要进一步优化。值得注意的是，统计结果只是以C16-OH为准，C18-2-OH&C18-1-OH，由于脂肪酸峰干扰，无法定量，故未做统计。

(3)基因OpHFD1敲除菌株

为了提高脂肪醇产量，将基因OpHFD1进行了无缝敲除，其催化脂肪醛到脂肪酸的逆向反应。敲除后能够有效阻止脂肪醛被重新氧化，增加脂肪醇合成的前体物质供给。

实验结果如图11a-11c所示，对于生物量，对照菌株与整合菌株基本一致。脂肪酸产量方面，与敲除OpFAA1基因不同，只敲除OpHFD1基因不会导致脂肪酸的大量积累，而且整合菌株产量明显低于对照菌株。对于脂肪醇合成，对照菌株和只表达MmCAR基因的菌株均只检测到很微量的脂肪醇，可以认为是背景合成。随着整合基因数量增加，脂肪醇产量呈现增长趋势，除了之前发现的ADH5基因发挥重要作用以外，在该部分实验中FaCoAR基因也发挥功能，使脂肪醇产量提高了70％。说明未优化的FaCoAR基因在汉逊酵母中也是有活性的，脂肪酸不再大量积累使得胞内脂酰CoA的含量增加，促使FaCoAR基因将其转化为脂肪醇。图11a-11c中结果依然是只统计了C16-OH的结果，但是没有了脂肪酸峰的干扰，可以在3片段和4片段整合的菌株中定量检测到C18-2-OH&C18-1-OH，产量在0.2～0.4mg/L左右。该部分产量明显低于OpFAA1基因敲除菌株，主要是由于缺少脂肪酸转化脂肪醇的途径，后续实验可以将基因OpFAA1和OpPOX1进行双敲除，并进一步优化脂肪醇合成基因，将能够实现汉逊酵母脂肪醇产量的大幅度提升。

(4)基因OpHFD1和基因OpFAA1双敲除菌株产脂肪醇

根据上述结果，我们尝试在脂肪醇合成菌株中进行基因OpFAA1和OpHFD1的双敲除，希望进一步提高脂肪醇产量。双敲除菌株能够大幅度提高脂肪醇产量，比较图12和图10c，图11c，脂肪醇产量提高了4倍。特别是在整合了3个基因(MmCAR，npgA和ADH5)的双敲除菌株中，脂肪醇产量达到12mg/L，达到了迄今为止的最高产量，证明了汉逊酵母作为细胞工厂生产脂肪醇的巨大潜力。

实施例5

α-烯烃合成汉逊酵母菌株构建

长直链α-烯烃能够被广泛应用于生产表面活性剂和润滑油等，而且由于其高能量密度有望成为高品质燃料。前期成功构建了高产脂肪酸和脂肪醇的汉逊酵母菌株，因此，该实施例进一步转化脂肪酸合成α-烯烃，拓展汉逊酵母作为细胞工厂的底物谱。

在前期构建的高产脂肪酸汉逊酵母y23-3的基础上，进一步表达来源于Jeotgalicoccus的脂肪酸脱羧酶JeOleT，催化脂肪酸生成α-烯烃(图3)。基因JeOleT由强组成型启动子pTEF1启动表达，存在于游离表达载体pHp83以增加其拷贝数及最终酶活性，该游离载体含有自主复制起点panARS和营养缺陷型筛选标记ScLEU2。将载体pHp80转化进入菌株y23-3，验证正确的转化子用于α-烯烃发酵实验，发酵条件同实施例2，在含有20g/L葡萄糖的基础成分培养基中，初始接种OD为0.1，37℃，220rpm培养96h。发酵结束后取5mL发酵液，离心去上清后，用2mL ddH₂O重悬后冻干。使用氯仿：甲醇＝2：1作为萃取剂，添加1mg/L十六烷作为内标物，气相色谱检测α-烯烃产量。

实验结果如图13所示，表达了JeOleT的汉逊酵母菌株成功检测到α-烯烃的合成，由气相色谱图显示，13碳的和15碳的α-烯烃分别在17.47min和19.82min出峰，与标准品一致。并且进一步进行GC-MS检测确定该峰确为目标产物，确定了汉逊酵母能够通过表达脂肪酸脱羧酶实现α-烯烃的合成，为综合利用汉逊酵母作为底盘细胞合成脂肪酸以其衍生物奠定基础。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

                         序列表

<110>  中国科学院大连化学物理研究所

<120>  一种重组多形汉逊酵母的构建方法及其应用

<130>  DD190759I

<141>  2020-07-01

<160>  11

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

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attgatccta acgataagcg                                                   20

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<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

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acgtgggtgc gaccaagtgg                                                   20

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gctgctgcct tgctgggcgg atctgcttcg gacgtgcaac cagacgccca ttttaccgac      2040

ttgggaggag actcgctgtc ggctctgtcg ttcaccaatc tgttgcacga gatcttcgac      2100

attgaggttc cagtgggcgt gattgtgtct ccagctaacg atctgcaagc tctggctgac      2160

tacgttgaag ctgcccgcaa accgggctct tcgagaccta ccttcgcttc tgtgcatggc      2220

gcctcgaacg gccaagtgac cgaagttcac gctggcgatc tgtctctgga caaattcatc      2280

gacgccgcta ctctggccga ggctccaaga ctgccagctg ccaacaccca agtgcgcact      2340

gtgctgttga ccggagccac cggctttctg ggcagatatc tggctctgga gtggctggag      2400

agaatggatc tggtggacgg caagctgatc tgtctggttc gcgccaaatc tgataccgag      2460

gctcgcgcca gactggacaa gacctttgac tcgggcgacc cagagctgtt ggctcactac      2520

cgcgctctgg ctggagacca cttggaagtg ttggccggcg ataaaggcga ggccgacttg      2580

ggattggata gacagacttg gcagagactg gccgacaccg ttgacttgat tgtggaccca      2640

gccgctctgg ttaaccacgt gctgccttat tcgcagctgt ttggacctaa cgctctggga      2700

actgccgagc tgctgagact ggctctgacc tcgaagatca aaccatactc gtacacttcg      2760

accatcggcg tggccgacca gattcctcca tcggccttca ccgaggatgc cgacatcaga      2820

gtgatttcgg ccactagagc cgtggacgac tcttacgcca atggctactc gaactcgaag      2880

tgggccggag aggttctgct gcgcgaagct catgatctgt gcggactgcc agttgctgtg      2940

ttccgctgcg acatgattct ggctgacacc acttgggctg gacagttgaa cgtgccagac      3000

atgttcactc gcatgatctt gtcgctggct gccactggaa tcgccccggg ctcgttctat      3060

gagctggctg ctgacggcgc cagacagaga gcccattacg acggcttgcc agtggagttc      3120

atcgctgagg ccatctcgac cttgggcgct cagtctcaag acggatttca cacctaccac      3180

gtgatgaacc cttacgacga cggcattgga ctggacgagt ttgttgactg gctgaacgaa      3240

tcgggctgcc caattcagcg cattgccgac tacggagact ggttgcagag attcgagacc      3300

gccttgagag ctctgccaga tagacagcgc cactcttctt tgctgccact gctgcacaac      3360

taccgccagc cagaaagacc agtgcgcggc tctatcgccc caactgacag atttagagcc      3420

gccgtgcaag aggctaagat cggcccagac aaagacattc cacacgtggg cgccccaatt      3480

atcgtgaagt acgtgtcgga tctgagactg ttgggactgc tgggaggagg atctgctgct      3540

gtgaagctgt cgcaagccaa gtcgaagctg taa                                   3573

<210>  8

<211>  1056

<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

<400>  8

atggtgcaag atacctcttc ggcttcgacc tcgcctattc tgactcgctg gtacatcgac      60

accagaccat tgaccgcctc tactgctgct ttgcctttgt tggagactct gcaaccagcc      120

gaccagatct ctgtgcagaa gtattaccac ttgaaggaca agcatatgtc gctggcctcg      180

aatctgctga agtatctgtt cgtgcaccgc aactgtcgca tcccatggtc gtctatcgtt      240

atctcgcgca ccccagaccc acaccgcaga ccatgctata tccctccttc tggctcgcaa      300

gaggactcgt tcaaggacgg ctacaccgga atcaatgtgg agttcaacgt gtcgcaccaa      360

gcctcgatgg tggctatcgc cggaaccgcc ttcaccccta actcgggcgg cgactctaag      420

ctgaagccag aggtgggcat cgacatcact tgcgtgaacg aacgccaagg cagaaatggc      480

gaagaacgct cgctggagtc gctgcgccag tacattgata tcttctcgga ggtgttctct      540

accgctgaga tggccaacat tcgcagattg gacggcgttt cttcgtcttc tctgtctgcc      600

gatcgcttgg tggattacgg ctacagactg ttctacactt actgggctct gaaggaggcc      660

tacatcaaga tgactggcga ggccttgctg gctccttggt tgcgcgagtt ggagttctct      720

aacgtggttg ctccagccgc tgtggctgag tcgggcgatt cggctggcga ctttggcgag      780

ccttataccg gcgtgcgcac cactctgtat aaaaatctgg tggaagatgt gcgcattgag      840

gtggccgctc tgggcggaga ttatctgttc gctaccgccg ccagaggagg aggaatcgga      900

gcctcttcta gaccgggcgg cggaccagac ggatcgggca tcagatcgca agacccatgg      960

cgccctttta aaaagctgga catcgagaga gatatccagc catgcgccac cggcgtgtgt      1020

aactgcttgt cgggcggcgg ctcttcgaag ttgtaa                                1056

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

<400>  9

ggtctgctag agaaaacccg                                                  20

<210>  10

<211>  1497

<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

<400>  10

atgtctctgg ttgctctagg agaaattccc gaggctgtta acaagcttcg tctcaacttc      60

actgctcgtc cgcgcaagtc tcaaaccttt gtaaaggcgc agttgctctc cctgaaagat      120

gcgcttcaga aacaccagga cagcatcgtt tcggctctac tccacgattt ccaccgttcg      180

ccccaggaga cgctggttgc cgagtttggc ccgctgctgg gcgagctcgc ctatctggct      240

ggccacctct cgtcgctgct tgccccggaa actcccgagg caatgcccgt cgcgttcagc      300

gtcgcttcgt gcaagatcga gaaagagccg ttgggcacaa ttctggtgat gtcgccattc      360

aatttcccgc tgctgcttgc cctgagcccg ctggcaggtg caattgcagc cggaaacaac      420

gttgtgctca aattgccggg cgacagatgc cctgaattct gcagagtgct gtctcgtgtt      480

ctggcagaag ctctggatcc agaaatactg gtggtcgtta gtggcggtct ggaagaggcc      540

caggcggtgc tgaagcagaa atacgacaag atcgtattca cgggctctac cgcagtgggg      600

aaaatagtgc acgccaaggc ggccgagtcg ctaactccga ctctgctgga gctgggcggg      660

aaatcgccag cactcatcac ctcgggctgc tcagacatcc aaacagcact cgccagactt      720

ttctggggca agttttgcaa tgcgggccag gtctgcgtgt cgccggacta cctgctcgtc      780

caggactccg tgtacgacaa agtggtggca gaaatgttgg ctgtgctaca aaaaacgtac      840

caggtctcag aaacatcaga ctatacgcat ctcatcaaca gcagctcatt ctatcgtctg      900

gtaggtctgc tagagaaaac ccgcggtaag ctgctgtttg ggggtgcgcg agacccggaa      960

acaaatttcc tggccccaac ggtggtcacg gacgtggatt gggacgaccc gttgatggag      1020

tctgagatat ttggccctat tttgccggtt ctcaggtact cgtcgctggc agaagctgtt      1080

caaacgattc agaagtacca tgacacccca ctggccacgt acatattctc tgacaagcag      1140

gaggaagtcg agttggtgga caggatccgg tccggagctc ttttggtcaa cgaaactctg      1200

gtgcacgccg gcatccatac gtgtccgttt ggtggcgttg ggacgtctgg aacaggcaat      1260

taccacggaa agtactcgat cgagtctttt acacacaaaa aggtgatttt caaacagccg      1320

tactggtacg aggtagccct gaaagacaga tatgctccgt actccagagc caagagcaat      1380

tggctgatgt ttgtctatag gctgcccagc atcagaaggg tccgctacaa cgagctagct      1440

acggtgttgg ctgttctgct tgccgggctc gtgggctatt ttataggaaa gcggtag         1497

<210>  11

<211>  1269

<212>  DNA

<213>  An artificial sequence

<400>  11

atggccaccc tgaagagaga caagggcctg gacaacaccc tgaaggtgct gaagcagggc      60

tacctgtaca ccaccaacca gagaaacaga ctgaacacct cggtgttcca gaccaaggct      120

ttgggaggga aacctttcgt ggtggtgacc ggcaaggagg gcgccgagat gttctacaac      180

aacgacgtgg tgcagagaga gggcatgctg ccaaagagaa tcgtgaacac cctgttcggc      240

aagggcgcca tccacaccgt ggacggcaag aagcacgtgg acagaaaggc cctgttcatg      300

tcgctgatga ccgagggcaa cctgaactac gtgagagagc tgaccagaac cctgtggcac      360

gccaacaccc agagaatgga gtcgatggac gaggtgaaca tctacagaga gtcgatcgtg      420

ctgctgacca aggtgggcac cagatgggcc ggcgtgcagg caccacccga agacatcgag      480

agaatcgcca ccgacatgga catcatgatc gactcgttca gagcgctagg aggagcgttt      540

aaaggataca aggcctcgaa ggaggccaga aggcgagtag aagattggtt agaggagcag      600

atcatcgaga ccagaaaggg caacatccac ccaccagagg gcaccgccct gtacgagttc      660

gcccactggg aggactacct gggcaaccca atggactcga gaacctgcgc catcgacctg      720

atgaacacct tcagaccact gatcgccatc aacagattcg tgtcgttcgg cctgcacgcc      780

atgaacgaga acccaatcac cagagagaag atcaagtcgg agccagacta cgcctacaag      840

ttcgcccaag aagtccgccg ctattatcca ttcgtgccat tcctgccagg caaggccaag      900

gtggacattg atttccaggg tgtaactatt cctgcgggtg ttgggttagc gctggacgtg      960

tacggcacca cccacgacga gtcgctgtgg gacgacccaa acgagttcag accagagaga      1020

ttcgagacct gggacggctc gccattcgac ctgatcccac agggcggcgg cgactactgg      1080

accaaccaca gatgcgccgg cgagtggatc accgtgatca tcatggagga gaccatgaag      1140

tacttcgccg agaagatcac ctacgacgtg ccagagcagg acctggaggt ggacctgaac      1200

tcgatcccag gctacgtgaa gtcgggcttc gtgatcaaga acgtgagaga ggtggtggac      1260

agaacctaa                                                              1269

Claims (19)

1.一种产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：构建具有SEQ ID NO：1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体；

将所述sgRNA表达载体导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpFAA1基因；

所述多形汉逊酵母菌株整合有Cas9蛋白。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：构建具有SEQID NO：2所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体；

将所述sgRNA表达载体导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpPOX1基因。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：使所述重组多形汉逊酵母菌株过表达异柠檬酸脱氢酶2。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，使所述重组多形汉逊酵母菌株过表达异柠檬酸脱氢酶2包括：将来源于酿酒酵母的ScIDP2基因整合至所述多形汉逊酵母菌株。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：敲除多形汉逊酵母菌株中的OpLSC2基因。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpLSC2基因包括：

将sgRNA表达载体导入多形汉逊酵母菌株，敲除多形汉逊酵母菌株中的OpLSC2基因；

sgRNA表达载体具有SEQ ID NO：5所示的靶向核苷酸序列。

7.根据权利要求1、2或5任一项所述的构建方法，其特征在于，OpFAA1基因为SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列；

OpPOX1基因为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

OpLSC2基因为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组多形汉逊酵母菌株在基础成分培养基中发酵后，碳源包括葡萄糖、木糖和甲醇中的一种或多种的组合；脂肪酸种类包括C16-1、C16、C18-2、C18-1和C18。

9.一种产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株，其特征在于，所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株通过权利要求1至8中任一项所述的方法构建。

10.一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：以权利要求1~2任一项所述的构建方法得到的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株为出发菌株，使其过表达羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA；

或将密码子优化后的MmCAR和npgA基因整合至所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株，以过表达羧酸还原酶MmCAR及其辅因子npgA；

其中，密码子优化后的MmCAR基因为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

密码子优化后的npgA基因为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：使所述重组多形汉逊酵母菌株过表达醇脱氢酶ADH5。

12.根据权利要求10~11任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：敲除所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株中的OpHFD1基因；

敲除所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株中的OpHFD1基因包括：

将sgRNA表达载体导入所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株，敲除所述产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株中的OpHFD1基因；

sgRNA表达载体具有SEQ ID NO：9所示的靶向核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，OpHFD1基因为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

14.一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株，其特征在于，所述脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株通过权利要求10至11中任一项所述的方法构建。

15.一种α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：以权利要求1所述的构建方法得到的产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株为出发菌株，使其过表达脂肪酸脱羧酶；

将进行密码子优化后的JeOleT基因构建于游离表达载体，并以组成型启动子pTEF1启动基因表达；

其中，密码子优化后的JeOleT基因为SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

16.一种α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株，其特征在于，所述α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株通过权利要求15所述的方法构建。

17.权利要求1~8、10~11、15中任一项所述的构建方法、权利要求14所述的脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株或权利要求16所述的α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株在细胞大规模培养中的应用。

18.权利要求10~11中任一项所述的构建方法、权利要求14所述的脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株、权利要求16所述的α-烯烃合成重组汉逊酵母菌株在脂肪醇的合成中的应用。

19.权利要求1~8、15中任一项所述的构建方法在脂肪酸的合成中的应用。

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