CN113403213A - 一种利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株利用木糖生产三乙酸内酯的重组解脂耶氏酵母菌株及其应用。所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2‑吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌。进一步优化发酵过程，开发了解脂耶氏酵母利用木糖产三乙酸内酯的最佳生产工艺，并使其产量达到目前报道摇瓶中的最高水平，产量在3g/L～6g/L之间，为后续开发廉价碳源生产高价值平台化合物三乙酸内酯提供底盘菌株奠定了基础。

Description

一种利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌及应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株利用木糖生产三乙酸内酯的重组解脂耶氏酵母菌株及其应用。

背景技术：

三乙酸内酯是一种联系生物转化与化学催化的“桥梁化合物”，含有2-吡喃酮结构，可以通过水解、催化加氢等方式转化成各种高价值中间体或终端产品，如乙酰丙酮、γ-己内酯，因此被确定为潜在的生物可再生平台化学品，是一种有价值的商业化合物合成前体，在材料、化工等传统领域需求量大。此外，由于三乙酸内酯具有无毒无害，低腐蚀性的特点，因此也被广泛应用于食品、医药等生命健康领域。

目前，三乙酸内酯的生产方法主要包括化学合成法和生物发酵法，化学法主要是依靠石油裂解、乙酸热解等，该法依赖化石资源，能耗大，环境污染大，生产成本高，且随着化石能源的耗竭，三乙酸内酯价格上涨。生物法主要包括植物提取法和微生物发酵法。植物提取法主要从植物非洲雏菊中提取，该法来源少，需要占用大量的农田耕地种植，加之提取产率低，工艺复杂，不能满足年需几千万吨的工业需求。因此，以天然可再生资源为原料、利用基因工程为手段、以微生物发酵为途径生产三乙酸内酯的微生物生产法成为了当今的研究热点。该法原料价格低廉，生产成本低，无环境污染，副产物少，开发和利用生物质能源转化既符合我国国情，又符合可持续发展战略。相比于大肠杆菌和酿酒酵母，解脂耶氏酵母耐受性高、环境适应能力强，具有高通量聚酮合成前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A代谢流，是工业化生产三乙酸内酯的优势宿主。

木质纤维素来源于农林残渣、废弃物，是含量丰富、价格低廉的可再生资源，目前已有很多报道表明木质纤维素可生物转化为有价值的产品。木糖来源于木质素降解，是木质素的主要糖成分，占木质纤维素生物量的30-40％。木糖的高效快速生物转化是实施经济可行的木质纤维素水解物生物转化工艺的先决条件。目前，已有很多研究表明木糖可转化成木糖醇、2,3-丁二醇、异丁醇聚羟基丁酸酯等生物燃料和化学品，应用前景广阔。

解脂耶氏酵母存在完整的木糖代谢途径，但该途径关键基因在天然条件中处于沉默表达，解脂酵母不能在以木糖作为唯一碳源的培养基中自然生长，主要是由于木糖代谢途径的三个关键酶木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶的活性过低。因此需要利用基因工程手段来增强三个关键酶的活性，从而增强菌株的木糖代谢能力。然而，利用基因工程方法在解脂耶氏酵母中构建木糖代谢途径来异源合成三乙酸内酯的方法还未见报道。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将通过基因工程手段构建一株能够利用木糖的解脂耶氏酵母，并提供该菌株以木糖为碳源生产三乙酸内酯的方法。

本发明提供的技术方案之一，是一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌；

进一步地，2-吡喃酮合成酶编码基因、木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因的表达方式可以是质粒表达，也可以是基因组整合表达；

优选地，所述质粒表达采用的表达载体为PYLXP’质粒；

进一步地，所述2-吡喃酮合成酶编码基因为植物源基因，包括但不限于来源于非洲雏菊(Gerbera hybrida)的2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；

进一步地，所述木糖还原酶编码基因为内源基因yl.xyl1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

进一步地，所述木糖醇脱氢酶编码基因为内源基因yl.xyl2，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

进一步地，所述木酮糖激酶编码基因为内源基因yl.xyl3，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；

进一步地，所述出发菌株可以是解脂耶氏酵母po1g、解脂耶氏酵母po1f等；

优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母po1f。

本发明提供的技术方案之二，是上述解脂耶氏酵母基因工程菌在生产三乙酸内酯中的应用；

本发明提供的技术方案之三，是采用上述解脂耶氏酵母基因工程菌生产三乙酸内酯的方法，具体如下：

将工程菌种子液按1-5％接种量接入含木糖发酵培养基中，25-32℃，200-250rpm，发酵5-7天；

优选地，在发酵初始添加PBS控制发酵体系的pH在5-7.5左右；

优选地，在发酵24h左右，添加终浓度为1-3mg/L的浅蓝菌素；

进一步地，采用质粒表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：35-50g/L木糖，1-2g/LYNB，0.5-2g/L硫酸铵，0.4-1g/L CSM-LEU，其余为水；

进一步地，采用基因组整合表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：木糖35-50g/L，Tryptone 15-25g/L，Yeast Extract 5-15g/L，其余为水，pH约为5-7.5；

进一步地，采用基因组整合表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：玉米秸秆水解液25-35mL,Tryptone 15-25g/L,Yeast Extract 5-15g/L，其余为水，pH5-7.5；

优选地，在上述培养基中添加1-10g/L的甘油。

本发明的优点：

本发明开发了能够高效代谢木糖生产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌(解脂耶氏酵母中生产三乙酸内酯代谢途径如图1所示)，确定了三乙酸内酯异源生产的优势途径，实现了对木糖的有效应用。确定了解脂耶氏酵母菌株整合方式，成功构建了利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母整合菌株，在通用YPX培养基中，三乙酸内酯也可达较高产量，进一步优化发酵过程，开发了解脂耶氏酵母利用木糖产三乙酸内酯的最佳生产工艺，并使其产量达到目前报道摇瓶中的最高水平，产量在3g/L～6g/L之间，为后续开发廉价碳源生产高价值平台化合物三乙酸内酯提供底盘菌株奠定了基础。

附图说明：

图1：解脂耶氏酵母中生产三乙酸内酯代谢途径。

图2：qPCR测定yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3表达量。

图3：解脂耶氏酵母转化子发酵验证。

图4：Yali01曲线发酵。

图5：整合菌株PCR验证

由于整合的片段过长，不易做PCR，因此分成了几段长度比较短的片段进行PCR验证：A1片段包括leu△up、ura3、部分gh2ps基因；A2片段包括部分gh2ps基因、部分yl.xyl3；A3片段包括部分yl.xyl3、部分yl.xyl2；A4片段包括部分yl.xyl2、yl.xyl1、leu△down；A1-A4同时出现时说明线性质粒是完整存在的。

图6：Yali02曲线发酵结果。

图7：优化发酵条件后Yali02发酵曲线。

图8：Yali02利用木质纤维素产TAL发酵曲线。

图9：添加甘油时Yali02利用木质纤维素产TAL发酵曲线。

具体实施方式:

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

下面实施例中所使用的实验操作方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。

表1本发明所涉及引物序列

引物名称	引物序列5’-3’
		gh2ps-F	5’-ccgaccagcactttttgcagtactaaccgcaggggtcatatagcagtgatgatgtgg-3’
gh2ps-R	5’-ggggacaggccatggaactagtcggtaccttagttgccgttggccactgc-3’
		yl.xyl1-F	5’-ccgaccagcactttttgcagtactaaccgcagtccttcaagctcgcctccgg-3’
yl.xyl1-R	5’-ggggacaggccatggaactagtcggtaccttaggcgaaaatgggaagg-3’
		yl.xyl2-F	5’-ccgaccagcactttttgcagtactaaccgcagtcttctaacccgtcatttg-3’
yl.xyl2-R	5’-ggggacaggccatggaactagtcggtaccctactcctcctcgggaccg-3’
		yl.xyl3-F	5’-ccgaccagcactttttgcagtactaaccgcagtatctcggactggatctttcg-3’
yl.xyl3-R	5’-ggggacaggccatggaactagtcggtaccttatttctccaggcaggcg-3’

实施例1:基于甘油作为木糖代谢“响应开关”的机制研究

为探究甘油在解脂耶氏酵母代谢木糖过程中的调控机制，将含有空质粒PYLXP’的解脂耶氏酵母po1f培养于含有亮氨酸缺陷型木糖发酵培养基(木糖40g/L，YNB1.7g/L，硫酸铵1.1g/L，CSM-Leu 0.69g/L，其余为水)的250mL摇瓶中，同时添加3‰纯甘油，30℃，250rmp/min，培养至对数生长期时提取菌体，qPCR测定未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中解脂耶氏酵母胞内木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3的表达量。

选择β肌动蛋白作为内参基因，测定这三种基因的mRNA相对表达量。测定结果见图2，显示相比于空白对照组，实验组中yl.xyl1基因表达量提高了9.8倍，yl.xyl2基因表达量提高了7.6倍，yl.xyl3基因表达量5.2倍。

同时，测定未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中菌体的生长情况，结果显示，未添加甘油的空白组菌体不生长，不消耗木糖，添加甘油的实验组菌株OD₆₀₀达到10-12，木糖消耗量为6-7g/L。

上述结果证明了甘油可作为“响应开关”激活解脂耶氏酵母的木糖代谢途径，提高菌株代谢木糖的能力。

实施例2：利用木糖产三乙酸内酯合成途径的构建

为进一步增强解脂耶氏酵母代谢木糖生产高价值化学品三乙酸内酯的能力，向解脂耶氏酵母po1f中导入优化的2-吡喃酮合成酶基因gh2ps、木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3表达盒，得到解脂耶氏酵母重组菌株Yali01，基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

(1)质粒构建

所述优化的gh2ps基因由公司合成，yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3均来自解脂耶氏酵母po1f基因组。分别以gh2ps-F/gh2ps-R、yl.xyl1-F/yl.xyl1-R、yl.xyl2-F/yl.xyl2-R、yl.xyl3-F/yl.xyl3-R为引物扩增得到优化的核苷酸序列gh2ps(SEQ ID NO.1)、yl.xyl1(SEQ ID NO.2)、yl.xyl2(SEQ ID NO.3)yl.xyl3基因(SEQ ID NO.4)。PYLXP’载体骨架带有亮氨酸筛选标记和氨苄青霉素抗性基因，将扩增得到的四个基因片段连至表达载体PYLXP’上，得到含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3四个目的基因的表达盒。

(2)解脂耶氏酵母转化

采用“醋酸锂/单链DNA/PEG4000”化学转化法将含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3四个目的基因的表达盒转至宿主解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母重组菌株Yali01。

1)酵母感受态细胞的制备：

①活化菌种。-80℃保存的菌种在固体YPD培养基上划线，30℃培养1天。

②挑取酵母单菌落在固体YPD培养基上划线传代，30℃培养1天。

③在超净台中将90μL 50％PEG4000、5μL 2mol/L醋酸锂、5μL鲑鱼精(95℃煮沸5min)

加至1.5mL干净无菌离心管中，旋涡震荡15s，混匀，制成100μL混合体系。

④刮取适量YPD平板上解脂酵母菌落接至混合体系中，旋涡震荡15s混匀，制备酵母感受态细胞

2)酵母转化

①在超净台中往制得的酵母感受态细胞中加入8μL目的质粒，旋涡震荡混匀；

②将转化体系置于30℃水浴锅中水浴，每隔10min取出来震荡15s，共4次，再转到39℃水浴锅中水浴10min；

③在超净台中加入92μL无菌水至转化体系中，震荡15s混匀，制得200μL体系；

④将以上200μL混合液涂布至亮氨酸缺陷型筛选平板上，30℃培养3天。

3)解脂耶氏酵母转化子发酵验证

从转化平板上挑取若干酵母转化子接至3mL亮氨酸缺陷型种子培养基中(木糖40g/L，YNB1.7g/L，硫酸铵5g/L，CSM-Leu0.69g/L，其余为水。)，培养2-3天，待其OD₆₀₀值长至12左右时按2％接种量接至含有10mL亮氨酸缺陷型发酵培养基(40g/L木糖，1.7g/L YNB，1.1g/L硫酸铵，0.69g/L CSM-LEU，3g/L甘油，其余为水)的50mL摇瓶中，30℃，250rpm培养5天。收集发酵液，分析生物量、TAL产量。测定结果见图3，选择三乙酸内酯产量最高的重组菌株5#(命名为Yali01)做后续发酵。

实施例3：解脂耶氏酵母重组菌株Yali01发酵生产三乙酸内酯

(1)重组菌培养

首先将实施例2中得到的重组菌Yali01接至含有3mL亮氨酸缺陷型种子培养基(木糖20g/L；YNB1.7g/L；硫酸铵5g/L；CSM-Leu0.69g/L，其余为水。)的试管中，在30℃，250rpm的摇床中培养2-3天，按2％接种量接种至含有30mL亮氨酸缺陷型发酵培养基的250mL三角瓶中，在摇床里培养7天，摇床条件设置为30℃，250rpm，每隔24h取样分析。

发酵培养基各组分及含量如下：40g/L木糖，1.7g/L YNB，1.1g/L硫酸铵，0.69g/LCSM-LEU，3g/L甘油，其余为水。

(2)发酵液检测

使用酶标仪或紫外分光光度计测定发酵液OD₆₀₀值。根据校准曲线换算成干细胞重量(DCW)，监测细胞生长；使用高效液相色谱法测定三乙酸内酯产量、残糖含量。

(3)结果

未表达2-吡喃酮合成酶基因gh2ps解脂耶氏酵母宿主不能合成三乙酸内酯，导入2-吡喃酮合成酶基因gh2ps，过表达解脂酵母内源性木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3表达盒得到重组菌Yali01，以木糖为唯一碳源，摇瓶发酵生产得到1.2g/L三乙酸内酯，发酵结果如图4所示，实现了解脂耶氏酵母以木糖为唯一碳源发酵生产三乙酸内酯，为解脂耶氏酵母利用木糖生产乙酰辅酶A衍生物奠定了基础。

实施例4：利用木糖产三乙酸内酯解脂耶氏酵母整合菌株构建

为了获得一株能够稳定利用木糖高效生产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌，将在实验中已经证明有利于菌株生长及发酵的基因gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3整合至解脂酵母基因组中，构建能够直接利用木糖产三乙酸内酯的解脂酵母整合菌株Yali02。

1)质粒构建

将实施例1中的四个基因gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3连到整合载体pΔleu2loxP(pΔleu2loxP质粒构建方法见：Coupling metabolic addiction with negativeautoregulation to improve strain stability and pathway yield.MetabolicEngineering 61(2020)79–88)上，得到含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3的整合质粒，基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。Avr II，Not I双酶切整合质粒，纯化回收线性化的整合片段leu△up-ura3-gh2ps-yl.xyl3-yl.xyl2-yl.xyl1-leu△down。

2)同源重组整合

将整合片段leu△up-ura3-gh2ps-yl.xyl3-yl.xyl2-yl.xyl1-leu△down转化至解脂耶氏酵母po1f中并涂布于URA3缺陷型筛选平板上，只有整合成功的菌株能够在URA3缺陷型筛选平板上生长。将URA3平板上生长的若干阳性菌落挑至营养丰富的YPD平板中，传代培养3-5代，然后将YPD平板上长的单菌落挑至URA3缺陷型木糖筛选平板中，能够在该筛选平板上生长的单菌落为整合成功的菌株，从而达到筛选整合成功的解脂酵母菌的目的。提取酵母基因组，PCR验证基因是否整合成功，电泳结果如图5所示，整合成功菌株命名为Yali02。

实施例5：整合菌株Yali02利用木糖发酵生产三乙酸内酯

将整合菌株Yali02种子液按2％接种量接至含有30mL YPX发酵培养基的250mL摇瓶中进行曲线发酵，30℃，250rpm。每隔24h取样分析生物量、三乙酸内酯产量、木糖含量，分析方法与实施例3相同，发酵曲线如图6所示，在未优化发酵条件时整合菌株Yali02能够积累1.8g/L三乙酸内酯，为进一步降低生产成本提供了重要参考。

YPX培养基成分为：木糖40g/L，Tryptone 20g/L，Yeast Extract 10g/L，3g/L甘油，其余为水，pH约为6.0，发酵过程不控制。

实施例6：优化发酵培养基提升整合菌株Yali02的三乙酸内酯产量

为进一步提高三乙酸内酯的产量，在发酵初始添加终浓度0.2M的PBS，使用PBS缓冲液控制发酵过程pH值在6.0以上，在发酵24h时添加浅蓝菌素(脂肪酸合成酶抑制剂，抑制副产物脂肪酸合成)使其终浓度为1.5mg/L，发酵72h时，若pH降至6.0以下则添加少量氢氧化钠。评价pH值调控和副产物抑制对三乙酸内酯积累的影响。

具体的发酵方法和培养基同实施例5所述，同时设置不添加甘油的培养基作为对照，每隔24h取样分析，分析方法与实施例3相同。

同时添加浅蓝菌素和pH缓冲液时，与实施例5未添加浅蓝菌素和pH缓冲液时比，TAL产量提高172％，达到4.9g/L(发酵曲线如图7a所示)，说明在发酵过程中浅蓝菌素和PBS缓冲液对TAL产量有较大的促进作用。

同时添加浅蓝菌素和pH缓冲液以及甘油的实验组，相较只添加浅蓝菌素和pH缓冲液而未添加甘油的对照组(4.42g/L，图7b)，TAL产量提高10.9％。

本发明所用0.2M的PBS(pH6.0)配方如下(100ml)：0.2M NaH₂PO₄ 87.7ml、0.2MNa₂HPO₄ 12.3ml。

实施例7：整合菌株Yali02利用木质纤维素水解液发酵生产三乙酸内酯

将整合菌株Yali02接至含有30mL木质纤维素发酵培养基的250mL摇瓶中进行曲线发酵，30℃，250rpm，发酵初始添加PBS缓冲液使其终浓度0.2mol/L，发酵24h时添加终浓度1.5mg/L的浅蓝菌素和PBS，发酵72h时，若pH降至6.0以下则添加少量氢氧化钠。

同时，测定培养基中未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中菌体发酵情况，每隔24h取样分析生物量、三乙酸内酯产量，分析方法与实施例3相同。如图8所示未添加甘油的对照组三乙酸内酯产量2.8g/L，而如图9所示添加甘油的实验组能够积累3.1g/L三乙酸内酯，为进一步开发廉价碳源生产高价值三乙酸内酯奠定了基础。

木质纤维素水解液培养基成分为：玉米秸秆水解液30mL,Tryptone 20g/L,YeastExtract 10g/L，3‰甘油，其余为水，pH7.0左右；

玉米秸秆水解液的制备方法：

收集玉米秸秆，将其粉碎过80目筛网后得到残渣粉，将残渣粉与2％的稀硫酸溶液按照固液比1:10混合，置于高压反应釜中，经100℃高温水解100min后得到废渣与水解液的混合物，真空抽滤2-3次，除去废渣即得玉米秸秆水解液。

以上是本发明公开和提出的技术方案，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。本领域技术人员在遵循本发明的原理基础上，还可以对本发明进行诸多改善和修改，这些改进和润色也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京化工大学

<120> 一种利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌及应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 非洲雏菊（Gerbera hybrida）

<400> 1

atggggtcat atagcagtga tgatgtggag gtgatccgcg aggctggccg cgcacaagga 60

ctggctacta tcctggccat tggaaccgcc acaccaccaa attgcgtggc tcaagccgat 120

tacgcagact attatttccg ggtaactaaa tcagagcaca tggtcgatct gaaggagaag 180

tttaaaagga tttgcgaaaa gactgccatt aaaaagcgat atctcgccct cacggaagat 240

tatctccagg aaaacccaac catgtgtgag ttcatggctc cctcattgaa cgctcgccag 300

gatctcgtgg ttaccggggt ccccatgctt ggcaaggagg ccgccgtcaa agccatcgac 360

gaatggggtt tgccaaagtc aaaaattacc catctgattt tctgcactac cgccggggta 420

gacatgcccg gtgcagacta ccagctggtg aagctgctgg gtctttcccc atctgtgaag 480

cgctatatgc tgtaccagca gggctgtgca gctggtggta ctgtgctgcg cctggctaag 540

gacttggcag agaacaataa ggggtcacgg gtgctgatcg tctgctccga gattacagcc 600

atcctgtttc acggaccaaa cgagaatcac ctcgactcac tggtggctca agctctgttc 660

ggcgacggtg ctgccgcgct gatagtgggg tcagggcccc atctggctgt ggaacggccc 720

atctttgaga ttgttagcac agatcagacc atcttgcccg acactgagaa agcgatgaag 780

cttcacttga gggagggggg tctcacgttc cagctccata gggacgtgcc actgatggtt 840

gcaaaaaaca tcgaaaacgc tgccgagaaa gcgctgtctc cattggggat tacagactgg 900

aactctgtgt tttggatggt tcaccctgga gggagagcaa tcctggatca ggtggagcgc 960

aaactgaacc ttaaagagga caaactgaga gccagcagac acgtgctgag cgagtatgga 1020

aacttgattt ctgcttgcgt gctttttatc atcgacgagg tgcgcaagcg ctccatggcc 1080

gaaggtaaga gcactaccgg ggaggggctg gattgtggag tgctctttgg atttggtcca 1140

ggtatgaccg tcgaaactgt tgtactccga tccgttcgag tgaccgctgc agtggccaac 1200

ggcaactaa 1209

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> 解耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica) po1f

<400> 2

atgtccttca agctcgcctc cggaaagtcc atgcccaagg tcggattcgg cctgtggaag 60

gtcccccgtg acaagaccgc cgacaccgtc tacggagcca tcaagaacgg ttacagactg 120

tttgacggcg ccttcgacta ccagaacgag cgagaggccg gcgaaggtat ccgacgagcc 180

atcaaggatg gcctggtcaa gcgagaggac atcttcatca ccaccaagtt gtggaacacc 240

ttccactcaa aggagcacgc tctgcagatc gccaaggagc agaacgagtg gtggggactc 300

gactacatcg atctctacct catccacttc cccatcccca tgcagtacat tcccatctcc 360

gagaaggagt gggctggatg gaccaacgcc actgactcgg gtcctaaccc tctggccaag 420

atccctaccc gagagacctg ggaggctctc gaggagctag ttgataccgg aatcgccaag 480

tccattggtg tctccaactt caccgcccag aacatttacg acgtccagac ctacaacaag 540

caccccattt ctgctctgca gattgagcac cacccctacc tggtgcagcc ccagctgacc 600

cagctcgcaa aggacaacaa catccaggtc actgcctact cttctttcgg ccccgcctcc 660

tttgtggaga ttggcatgga ccagaaggtc cctcctcttt tcgagaacga gaccatcacc 720

aagatcgcca aggctcacaa caagaccccc tcccaggttc tgctgcgatg ggctacccag 780

cgaggcattg ccgtcatccc caagtccaac aacgtcgagc gacaaactca gaacctcgaa 840

tctctggact ttgacctgac cgaggccgag attaaggaga tctccaacct caacaagaac 900

ctgcgattca acgatcccgg tgtctacgct aaccttccca ttttcgccta a 951

<210> 3

<211> 1074

<212> DNA

<213> 解耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica) po1f

<400> 3

atgtcttcta acccgtcatt tgttcttcga aagccattgg atctcgtctt tgaggatcgg 60

cccgacccca agatccagga cccccactcc gtcaaggtgg cagtcaaaaa gaccggagtt 120

tgcggctcgg atgtccacta ctatctgcat ggaggaatcg gcgacttcat tgtcaaggct 180

cccatggttc taggccatga aagtgccgga gaggtggttg aggttggtcc tgaagtcaag 240

gacctcaagg tgggagatcg agtggctctc gagcccggag tgccgtctcg attgtcacag 300

gagtacaagg agggacgata caacctgtgt ccttgcatgg tgtttgctgc cacccctccc 360

tacgacggta ctctgtgtcg tcactacatc attcccgagg acttttgtgt caagctgcct 420

gatcatgtgt ctctcgagga gggagctctt gtggagcctc tgtccgtggc tgtccactgc 480

aacaagctgg ccaagaccac tgcccaggac gtggttattg tgtttggagc tggcccagtc 540

ggactgctag ccgtgggagt ggccaatgcc tttggatcat ctaccattgt gtgtgttgat 600

cttgttcccg agaagctgga gctcgccaag aagttcggtg ccactcatac gtttgtaccc 660

actaagggag acagtcccaa cgagtctgct gacaagatcc gagctctgat caagggcgct 720

ggtctctctg actcgcccaa tgtggctttg gagtgcaccg gagctgagcc ttctattcag 780

actgctgttt ctgtgctggc cacttccggt cgacttgtgc aggtcggcat gggcaaggat 840

gacgtcaact tccctatcac caaatgcatt gtaaaggaga ttaccgtgct cggatcgttc 900

cgatactgcc atggtgacta tcccctggct gttcagctgg ttgcttctgg caagattgac 960

gtcaagaagc tggtgaccaa ccggttcacc ttcaaggagg ctgagcaggc gtacaagacg 1020

gcggccgagg gcaaggccat caagatcatc attgacggtc ccgaggagga gtag 1074

<210> 4

<211> 1623

<212> DNA

<213> 解耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica) po1f

<400> 4

atgtatctcg gactggatct ttcgactcaa cagctcaagg gcatcattct ggacacaaaa 60

acgctggaca cggtcacaca agtccatgtg gactttgagg acgacttgcc gcagttcaac 120

accgaaaagg gcgtctttca cagctctaca gtggccggag aaatcaatgc tcctgtggca 180

atgtgggggg cagctgtgga cttgctgata gagcgtctgt caaaggaaat agacctttcc 240

acgatcaagt ttgtgtcggg ctcgtgccag caacacggct ctgtttatct caacagcagc 300

tacaaggagg gcctgggttc tctggacaaa cacaaagact tgtctacagg agtgtcatcc 360

ttactggcgc tcgaagtcag ccccaattgg caggatgcaa gcacggagaa ggagtgtgcg 420

cagtttgagg ctgcagtcgg cggtcccgag cagctggctg agatcactgg ctctcgagca 480

catactcgtt tcaccgggcc ccagattctc aaggtcaagg aacgcaaccc caaggtattc 540

aaggccacgt cacgggtcca gctcatatcc aactttctag catctctgtt tgccggcaag 600

gcgtgcccct ttgatcttgc tgacgcctgt ggaatgaatc tgtgggacat ccagaatggc 660

cagtggtgca agaaactcac agatctcatc accgatgaca cccactcggt cgagtccctc 720

cttggagacg tggaaacaga ccccaaggct ctactgggca aaatctcgcc ctatttcgtc 780

tccaagggct tctctccctc ttgtcaggtg gcacagttca caggcgacaa cccaggcact 840

atgctggctc tccccttaca ggccaatgac gtgattgtgt ctttgggaac atctacgacc 900

gccctcgtcg taacaaacaa gtacatgccc gaccccggat accatgtgtt caaccacccc 960

atggagggat acatgggcat gctgtgctac tgcaacggag gtctagcacg agagaagatc 1020

cgagacgagc ttggaggctg ggacgagttt aatgaggcgg ccgagaccac caacacagtg 1080

tctgctgacg atgtccatgt tggcatctac tttccactac gagaaatcct tcctcgagca 1140

ggtccctttg aacgacgttt catctacaac agacaaagtg aacagcttac agagatggct 1200

tctccagagg actcactggc aaccgaacac aaaccgcagg ctcaaaatct caaggacacg 1260

tggccgccac aaatggacgc cactgccatc attcaaagcc aggccctcag tatcaaaatg 1320

agactccaac gcatgatgca tggcgatatt ggaaaggtgt attttgtggg aggcgcctcg 1380

gtcaacactg ctatctgcag cgtaatgtct gccatcttaa aaccaacaaa gggcgcttgg 1440

agatgtggtc tggaaatggc aaacgcttgt gccattggaa gtgcccatca cgcctggctt 1500

tgcgacccca acaagacagg ccaggtacag gttcacgaag aagaggtcaa atacaagaat 1560

gtggacacag acgtgctact caaggcgttc aagctggccg aaaacgcctg cctggagaaa 1620

taa 1623

Claims (10)

1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌。

2.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，2-吡喃酮合成酶编码基因、木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因的表达方式为质粒表达或基因组整合表达。

3.如权利要求2所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述质粒表达采用的表达载体为PYLXP’质粒。

4.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

木糖还原酶编码基因为内源基因yl.xyl1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

木糖醇脱氢酶编码基因为内源基因yl.xyl2，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

木酮糖激酶编码基因为内源基因yl.xyl3，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，出发菌株为解脂耶氏酵母po1f。

6.权利要求1所述一种解脂耶氏酵母基因工程菌在生产三乙酸内酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，采用上述解脂耶氏酵母基因工程菌生产三乙酸内酯的方法，具体如下：

将工程菌种子液按1-5％接种量接入含木糖发酵培养基中，25-32℃，200-250rpm，发酵5-7天。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在发酵初始添加PBS控制发酵体系的pH在5-7.5；在发酵24h左右，添加终浓度为1-3mg/L的浅蓝菌素。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，采用质粒表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：35-50g/L木糖，1-2g/L YNB，0.5-2g/L硫酸铵，0.4-1g/L CSM-LEU，其余为水；

采用基因组整合表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：木糖35-50g/L，Tryptone15-25g/L，Yeast Extract 5-15g/L，其余为水，pH为5-7.5；

采用基因组整合表达获得的工程菌的发酵培养基组成为：玉米秸秆水解液25-35mL,Tryptone 15-25g/L,Yeast Extract 5-15g/L，其余为水，pH5-7.5。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，培养基中添加1-10g/L的甘油。

Images